KR20230124578A - 세포 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중국 햄스터 난소 세포(CHO)로부터 에타너셉트를 생산하는 방법으로서, N 생산 생물반응기를 가동시키기 전에, 20 μm 이상의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 재순환 접선 유동 여과(RTF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF) 세포 유지 장치를 사용하여 N-1 생물반응기 시스템을 가동시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
Description
기술분야
본 발명은 치료용 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 방법 분야에 관한 것이다.
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본 명세서와 동시에 제출되어 다음과 같이 확인되는 컴퓨터 판독 가능 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전체가 참조로 포함된다: 파일명이 "55498_Seqlisting.txt"인, 2021년 12월 21일에 생성된 4,255 바이트의 ASCII(텍스트) 파일.
치료용 단백질의 임상적 제조는 많은 비용이 소요되는 대규모 시도이다. 약학적 치료제로서 사용하기 위한 재조합 폴리펩티드의 생산은 일반적으로 생산 생물반응기의 접종에 충분한 세포 집단을 생성하도록 설계된 일련의 스케일-업 및 확장 단계로 구성된 원료 의약품 세포 배양 공정을 이용한다. 세포 배양 공정은 작업 세포 은행(WCB)으로부터 바이알을 해동하는 것과, 예를 들어 일련의 진탕 플라스크, 배양 백, 및/또는 확장 시드 생물반응기(예컨대, N-3, N-2 생물반응기(숫자는 생물반응기가 N, 최종, 또는 생산 생물반응기로부터 얼마나 많은 단계 앞에 있는지를 나타냄)) 등을 사용하여 배양을 확장하는 것에 의해 개시된다. 시드 배양 생물반응기에서의 성장 후, 배양물은 예를 들어 관류 생물반응기일 수 있는 N-1 생물반응기로 옮겨진다. N-1 관류 생물반응기에서, 배양물은 최종 배양 단계인 생산 생물반응기(N)의 접종에 충분한 세포 밀도를 생성하기 위해 새로운 배지로 관류된다. 생산 생물반응기는 재조합 폴리펩티드의 효율적인 생산을 극대화하도록 작동된다.
재조합 폴리펩티드의 효율적인 생산을 개선하기 위한 현재까지의 대부분의 시도는 N 생산 생물반응기 파라미터를 조작하는 것과 관련되어 있었다. 스케일-업 및 확장 단계에 사용되는 방법 및 시스템은 여전히 복잡하고, 노동 집약적이며, 다루기 어려워, 치료용 단백질 생산 시설을 확장하는 데 있어 여러 가지 문제가 발생한다. 그러나, 최종 치료용 단백질 제품의 비일관성뿐만 아니라 N 생산 가동에 대한 세포 역가 및 배양 생존력에 미치는 악영향으로 인해, 스케일-업 및 확장 단계에 대한 대안적인 방법 및 시스템은 달성하기 어려운 것으로 입증되었다. 더 많은 양의 치료용 재조합 단백질에 대한 수요가 증가함에 따라, 현재 프로토콜의 단점을 최소화하는 세포 확장 및 재조합 단백질 생산을 위한 대안적인 방법 및 시스템이 필요하다.
본 발명은 중국 햄스터 난소 세포(CHO)로부터 에타너셉트를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 N 생산 생물반응기를 가동시키기 전에 약 20 μm 이상(및 선택적으로 약 200 μm 이하; 예를 들어, 약 20 μm 내지 약 150 μm, 또는 약 20 μm 내지 약 95 μm)의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 재순환 접선 유동 여과(RTF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF) 세포 유지 장치를 사용하여 N-1 생물반응기 시스템을 가동시키는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 이러한 조건은 하기 식 1을 사용하여 약 20 μm 이상(및 선택적으로 약 200 μm 이하)의 η를 제공하며,
식에서 ε은 [U 3/L]이고, L은 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙의 길이이고, U는 [튜빙에서의 유량/튜빙의 단면적]이고, ν는 [세포 배양물 점도/세포 배양물 밀도]이다. 선택적으로, 조건은 중공 섬유 모듈의 경우 약 4 mL/min/섬유 내지 약 16 mL/min/섬유, 플랫 시트 필터 모듈의 경우 약 360 L/m2/hr 내지 약 720 L/m2/hr, 또는 적층판 모듈의 경우 약 1 L/m/채널 내지 약 4 L/m/채널로부터 선택되는 튜빙을 통한 유량; 약 1 내지 약 6 센티포아즈(예를 들어, 약 2 내지 약 6 센티포아즈)로부터 선택되는 세포 배양물 점도; 및/또는 약 1 g/L 내지 약 1.5 g/L로부터 선택되는 세포 배양물 밀도를 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 에타너셉트를 포함하는 에타너셉트의 제형을 추가로 제공한다. 다양한 양태에서, 제형은 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 100 mM의 염화나트륨, 25 mM의 인산나트륨, 25 mM의 L-아르기닌, 및 물; 동결건조 분말 형태의 25 mg의 에타너셉트, 40 mg의 만니톨, 10 mg의 수크로스, 및 1.2 mg의 트로메타민; 또는 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 120 mM의 염화나트륨, 25 mL의 L-아르기닌, 및 물을 포함한다. 본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 에타너셉트의 유효 용량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다양한 양태에서, 환자는 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 또는 판상 건선을 앓고 있다. 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 본원에 기재된 바와 같이 생산된 에타너셉트의 용도, 및 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 바와 같이 생산된 에타너셉트의 용도가 고려된다. 본원에 기재된 제형 및 제형의 사용 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
본 명세서에서 다양한 구현예가 "포함하는"이라는 표현을 사용하여 제시되지만, 다양한 상황에서 관련 구현예는 "~로 이루어진" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 표현을 사용하여 설명될 수도 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서는 특징을 "포함하는" 것으로 설명된 구현예가 해당 특징으로 "이루어진" 또는 해당 특징으로 "본질적으로 이루어진" 구현예를 포함하는 것으로 고려한다. 단수 형태는 하나 이상을 나타내며; "X", "하나 이상의 X" 및 "적어도 하나의 X"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "또는"은 문맥에서 명백하게 달리 요구하지 않는 한, 항목들을 대안적으로 또는 함께 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "및/또는"은 목록의 각 항목(개별적으로), 목록의 항목의 임의의 조합, 및 목록의 모든 항목을 함께 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 값의 범위를 설명할 때 본 명세서는 범위 내에서 발견되는 개별 값을 고려하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "약 20 μm 내지 약 200 μm의 세포 응집체 크기"는 40 μm, 60 μm, 100 μm 등일 수 있지만 이로 한정되지 않고, 이러한 값 사이의 임의의 값일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 범위에서, 범위의 양 끝점은 범위에 포함된다. 그러나, 해당 표현은 또한, 낮은 쪽 끝점 및/또는 높은 쪽 끝점이 제외된 동일한 범위를 고려한다.
본 발명의 추가적인 특징 및 변형은 도면 및 상세한 설명을 포함하는 본 출원 전체로부터 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 모든 특징은 본 발명의 양태로서 의도된다. 마찬가지로, 본원에 설명된 본 발명의 특징은 특징의 조합이 본 발명의 양태 또는 구현예로서 명시되는지 여부에 관계없이, 본 발명의 양태로서 또한 의도되는 추가적인 구현예로 재조합될 수 있다. 전체 문서는 통합된 공개로서 관련되는 것으로 의도되며, (별도의 섹션에 설명된 경우에도) 본원에 설명된 특징의 모든 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 하며, 이는 이 문서의 동일한 문장, 단락,또는 섹션에서 특징의 조합이 함께 발견되지 않는 경우에도 마찬가지이다. 또한, 본 발명에 중요한 것으로 본원에 기재된 한정만이 그러한 것으로 간주되며, 중요한 것으로 본원에 기재되지 않은 한정이 없는 본 발명의 변형은 본 발명의 양태로서 의도된다.
도 1은 에타너셉트의 아미노산 서열을 제공한다. 이 서열의 약간(최대 10%)의 변형 및 결실이 가능할 수 있고 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 방법 및 기술은 예를 들어 서열, 글리코실화 패턴, 또는 기타 번역후 변형이 ENBREL®과 상이한 바이오시밀러 에타너셉트를 생산하는 데 사용될 수 있다.
도 2는 실시예에 기재된 데이터를 나타내는 그래프이다. 조건 #1(AML SSM 2019), 조건 #2(ATF A2B=0.125), 조건 #3(ATF A2B=0.25), 및 조건 #4(ATF A2B=0.375)에서 수행된 N-1 배양으로부터 접종된 N-0 배양에 대한 에타너셉트의 최종 역가(mg/L; y축)가 제공된다.
도 3a 및 3b는 세포 유지 장치에 작동가능하게 연결된 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템의 개략도이다. 도 3a의 예시적 구현예의 세포 유지 장치는 적어도 하나의 필터 모듈 및 펌프를 포함하는 교번 접선 유동 여과(ATF) 시스템이다. 도 3b는 적어도 하나의 필터 모듈 및 펌프를 포함하는 재순환 접선 유동 여과(RTF) 시스템에 작동가능하게 연결된 생물반응기의 예시이다. 세포 유지 장치 펌프가 필터 모듈을 통해 세포 배양물을 흐르게 하면서 배지가 생물반응기에 도입된다. 사용된 배지, 배양 폐기물, 재조합 단백질 등을 일반적으로 포함하는 무세포 채취물은 제거된다. 튜빙은 배지 소스를 생물반응기에, 생물반응기를 세포 유지 장치에, 그리고 세포 유지 장치를 채취물 수집 수단에 연결한다(개략도에서 화살표로 표시). 도 3a 및 3b의 개략도는 단지 본 발명의 대표적인 양태를 예시하기 위해 제공되며; 본 발명의 시스템 및 방법은 N-1 생물반응기 시스템 구성요소의 특정 배열에 의존하지 않는다.
도 2는 실시예에 기재된 데이터를 나타내는 그래프이다. 조건 #1(AML SSM 2019), 조건 #2(ATF A2B=0.125), 조건 #3(ATF A2B=0.25), 및 조건 #4(ATF A2B=0.375)에서 수행된 N-1 배양으로부터 접종된 N-0 배양에 대한 에타너셉트의 최종 역가(mg/L; y축)가 제공된다.
도 3a 및 3b는 세포 유지 장치에 작동가능하게 연결된 생물반응기를 포함하는 생물반응기 시스템의 개략도이다. 도 3a의 예시적 구현예의 세포 유지 장치는 적어도 하나의 필터 모듈 및 펌프를 포함하는 교번 접선 유동 여과(ATF) 시스템이다. 도 3b는 적어도 하나의 필터 모듈 및 펌프를 포함하는 재순환 접선 유동 여과(RTF) 시스템에 작동가능하게 연결된 생물반응기의 예시이다. 세포 유지 장치 펌프가 필터 모듈을 통해 세포 배양물을 흐르게 하면서 배지가 생물반응기에 도입된다. 사용된 배지, 배양 폐기물, 재조합 단백질 등을 일반적으로 포함하는 무세포 채취물은 제거된다. 튜빙은 배지 소스를 생물반응기에, 생물반응기를 세포 유지 장치에, 그리고 세포 유지 장치를 채취물 수집 수단에 연결한다(개략도에서 화살표로 표시). 도 3a 및 3b의 개략도는 단지 본 발명의 대표적인 양태를 예시하기 위해 제공되며; 본 발명의 시스템 및 방법은 N-1 생물반응기 시스템 구성요소의 특정 배열에 의존하지 않는다.
치료 제품에 대한 수년간의 연구 개발에도 불구하고, 산업적 규모로 재조합 단백질을 효율적으로 생산하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 생산성을 높이거나, 제품의 일관성을 개선하거나, 출발 물질 비용이나 처리 시간을 줄이거나, 장비 비용을 줄이는 제조 개선은 상당한 경제적 이점이 있다. 제조 공정의 각 단계는 환자에게 전달되는 최종 제품에 영향을 미칠 가능성이 있지만, 생산 방법의 파라미터를 조정하는 궁극적인 효과는 특히 산업 규모 공정으로 확장할 때 예측이 불가능할 수 있다. 실제로, 재조합 단백질을 생산하는 시스템 및 방법은 세포 배양에 의해 생산되는 단백질의 양뿐만 아니라, 예를 들어 글리코실화 패턴과 관련하여 단백질 조성 자체에도, 잠재적으로 예측할 수 없는 방식으로 영향을 미친다. 또한, 하나의 재조합 단백질의 생산에 적합한 조건이 다른 재조합 단백질의 효율적이고 일관된 제조에 반드시 적합한 것은 아니다. 본 발명은 재조합 단백질 생산을 극대화하는 동시에 일관된 치료 제품을 생산하여 치료용 단백질의 산업적 규모 생산과 관련된 기술적 장애물을 극복하는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 에타너셉트를 생산하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다.
에타너셉트(Enbrel®, Immunex Corporation)는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75킬로달톤(p75) 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 구성된 이량체 융합 폴리펩티드이다(예를 들어, 미국 특허번호 9,518,111 참조). 에타너셉트의 Fc 구성요소는 인간 IgG1의 불변 중쇄 2(CH2) 도메인, 불변 중쇄 3(CH3) 도메인, 및 힌지 영역을 포함하지만, 불변 중쇄 1(CH1) 도메인을 포함하지는 않는다. 이는 934개의 아미노산으로 구성되며 대략 150킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다(Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.). 에타너셉트는 치료제의 활성 및 면역원성에 잠재적으로 영향을 미치는 N- 및 O-결합 올리고당을 둘 다 포함한다. 본 발명은 적어도 부분적으로는 N-1 생산 중의 특정 수준의 CHO 세포 응집 유지가 생산 단계 중의 역가의 증가로 이어진다는 놀라운 발견에 기초한다.
본 발명은 CHO 세포로부터 에타너셉트를 생산하는 방법에 관한 것이다. CHO 세포는 널리 알려져 있으며 예를 들어 문헌[Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; 및 Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016]에 추가로 설명되어 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)-결핍 돌연변이 세포주(Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 및 DG-44는 효율적인 DHFR 선별 및 증폭 가능한 유전자 발현 시스템을 통해 이들 세포에서 높은 수준의 재조합 단백질 발현이 가능하므로 바람직한 CHO 숙주 세포주이다(Kaufman R. J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). 또한, 이들 세포는 부착 또는 현탁 배양으로 조작하기 용이하고, 비교적 우수한 유전자 안정성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다.
본 발명의 방법은 N 생산 생물반응기를 가동시키기 전에 약 20 μm 이상 및 선택적으로 약 200 μm 이하의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 재순환 접선 유동 여과(RTF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF) 세포 유지 장치를 사용하여 N-1 생물반응기 시스템을 가동시키는 단계를 포함한다. 본 명세서는 약 20 μm 이상(및 선택적으로 약 200 μm 이하)의 세포 응집체 크기가 목적하는 제품 품질 특성을 유지하면서 N 생산 단계 동안 역가를 향상시키는 N-1 생산 조건을 제공함을 보고한 최초의 것이다. 다양한 양태에서, 세포 응집 크기는 약 20 μm 내지 약 150 μm(예를 들어, 약 40 μm 내지 약 125 μm, 약 50 μm 내지 약 100 μm, 약 20 μm 내지 약 40 μm, 약 20 μm 내지 약 60 μm, 약 20 μm 내지 약 75 μm, 약 20 μm 내지 약 80 μm, 약 20 μm 내지 약 120 μm, 또는 약 20 μm 내지 약 120 μm)이다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 약 20 μm 내지 약 95 μm의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행된다. 예를 들어, 다양한 양태에서, 상기 방법은 약 20 μm 이상, 약 30 μm 이상, 약 40 μm 이상, 약 50 μm 이상, 약 60 μm 이상, 약 70 μm 이상, 약 80 μm 이상, 약 90 μm 이상, 약 100 μm 이상, 약 120 μm 이상, 약 140 μm 이상, 약 160 μm 이상, 또는 약 180 μm 이상의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 방법은 약 200 μm 이하, 약 190 μm 이하, 약 180 μm 이하, 약 170 μm 이하, 약 160 μm 이하, 약 150 μm 이하, 약 140 μm 이하, 약 130 μm 이하, 약 120 μm 이하, 약 110 μm 이하, 약 100 μm 이하, 약 90 μm 이하, 약 80 μm 이하, 약 70 μm 이하, 약 60 μm 이하, 약 50 μm 이하, 약 40 μm 이하, 또는 약 30 μm 이하의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행된다. 본 명세서는 본원에 기재된 임의의 양 끝점 내의 범위를 명시적으로 고려한다. 세포 응집체의 크기를 측정하는 수단은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 자동화 세포 계수기는 Beckman Coulter(예: Vi-CELL), Roche(예:Cedex HiRes), 및 NOVA Biomedical(예: Bioprofile CDV)에서 제공되며 세포 계수, 세포 또는 응집체 크기 측정, 및 생존력 모니터링에 사용될 수 있다.
용어 "생물반응기"는 세포 배양물의 성장에 유용한 임의의 용기를 의미한다. 생물반응기는 세포의 배양에 유용하기만 하면 어떤 크기도 가능하다. 일반적으로, 생물반응기는 내부에서 성장하는 세포 배양물의 부피에 적합한 크기이다. 일반적으로, 생물반응기는 적어도 1리터일 것이며, 2, 5, 10, 50, 100, 200, 250, 500, 1,000, 1500, 2000, 2,500, 또는 5,000리터 이상, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. 생물반응기는 8,000, 10,000, 12,000, 18,000, 25,000리터 이상, 또는 그 사이의 임의의 부피일 수 있다. pH 및 온도를 포함하는(이로 한정되지 않음), 생물반응기의 내부 조건은 배양 기간 동안 제어될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 방법을 실시하는 데 사용하기에 적합한 생물반응기를 알고 있고 선택할 수 있을 것이다.
생물반응기를 "가동시킴"은 세포 배양, 즉 다세포 유기체 또는 조직 외부에서의 세포의 성장 및 번식을 제공하기 위해 생물반응기 시스템 내의 조건을 유지하는 것을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)] 참조. 포유류 세포는 현탁 배양되거나 고체 기질에 부착된 상태에서 배양될 수 있다. 마이크로담체를 포함하거나 포함하지 않고, 회분식, 유가식, 연속식, 반연속식, 또는 관류식으로 작동되는 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 보틀, 진탕 플라스크, 또는 교반 탱크 생물반응기가 포유류 세포 배양에 사용될 수 있다. 포유류 세포의 유가 배양은 영양분을 함유하는 농축 공급 배지를 배양물에 연속적으로 또는 주기적으로 공급하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Chu and Robinson (2001), Current Opin. Biotechnol. 12: 180-87] 참조. 관류 기반 시스템에서, 배지는 배양물에 연속적으로 공급되고 배양물로부터 연속적으로 제거된다. 배지 및 원치 않는 세포 배양 생성물(예를 들어, "무세포 채취물")이 제거됨에 따라, 세포는 세포 유지 장치, 예를 들어 교번 접선 유동(ATF) 및 재순환 접선 유동 여과(RTF) 시스템과 같은 접선 유동 여과(TFF) 시스템을 통해 유지된다. RTF는 생물반응기에서 세포를 유지하면서 세포 배양물을 단방향으로 막 표면에 평행하게 이동시켜 소비된 배지를 제거할 수 있도록 하는 재순환 수단, 가장 일반적으로는 연동 펌프의 사용에 의존한다. ATF 시스템은 한 방향으로만 흐르지 않고 모듈을 통해(예를 들어, 중공 섬유 필터 모듈을 통해) 전후로 세포 배양물을 이동시키는 펌프를 제외하고는 RTF 시스템과 유사하다. 예를 들어, 문헌[미국 특허번호 6,544,424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63] 참조. ATF의 이점은 교번 유동에 의해 유도되는 필터의 세정 효과이다. 선택적으로, 본 발명의 방법은 ATF 관류 시스템을 사용하여 N-1 생물반응기를 가동시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 중공 섬유 필터가 RTF 또는 ATF 시스템에 사용된다(필수 사항은 아님). 세포 배양 배지, 세포(전체 및 용해물), 가용성 발현 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질, 폐기물 등을 포함하는 세포 배양물이 필터에 도입될 때, 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)에 따라, 중공 섬유 재료는 내강측(내측)에 (세포 자체 외에도) 특정 세포 배양 성분을 유지할 수 있고 중공 섬유 재료의 기공 크기 또는 분자량 컷오프에 따라 특정 성분이 필터를 통과할 수 있도록 할 수 있다(투과액). 남아 있는 물질(잔류물)은 생물반응기로 되돌려 보내진다. 새로운 관류 세포 배양 배지를 생물반응기에 첨가하고 투과액을 소정의 간격으로 또는 연속적으로 필터에서 제거하여 목적하는 또는 일정한 생물반응기 부피를 유지한다. 투과액("무세포 채취물"이라고도 함)은 폐기되거나, 저장 탱크, 백, 또는 토트에 보관되거나, 여과, 응집, 원심분리 및/또는 다른 다운스트림 정제 방법 등과 같은 다른 단위 작업으로 직접 옮겨질 수 있다. 다양한 양태에서, 섬유는 약 0.5 mm 내지 약 1 mm의 내경을 가지며, 임의의 적합한 길이(예를 들어, 약 30 cm 내지 약 110 cm)를 가질 수 있다. 미세여과용 중공 섬유는 일반적으로 0.1 μm 내지 10 μm 범위의 기공 크기 또는 500 kDa 이상의 분자량 컷오프를 가지며, 단백질이 투과액을 통과할 수 있도록 하는 데 사용될 수 있다. 한외여과 중공 섬유는 일반적으로 0.01 μm 내지 0.1 μm 범위의 기공 크기 또는 300 kDa 이하의 분자량 컷오프를 가지며, 목적하는 단백질을 잔류물에 유지하고 생물반응기로 되돌려 보내는 데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어 채취를 위해 재조합 단백질 생성물을 농축하는 데 사용될 수 있다. 이러한 필터는 Xampler UFP-750-E-4MA, Xampler UFP-30-E-4MA(GE Healthcare, Pittsburgh, Pa.), 및 Midikros TC Modules T02-E030-10, T02-050-10, T02-E750-05, T02-M10U-06(Spectrum Laboratories, Inc, Dominguez, Calif.)과 같이 상업적으로 입수가능하다.
세포 배양물은 필터를 통해 또는 필터를 따라(예를 들어, 중공 섬유의 내강측을 통해) 세포 배양물을 통과시키는 펌핑 시스템에 의해 생물반응기에서 필터 모듈로 유입될 수 있다. 세포 펌핑 시스템의 예는 연동 펌프, 이중 다이어프램 펌프, 저전단 펌프(Levitronix™ pumps, Zurich, Switzerland), 및 교번 접선 유동 시스템(ATF™, Repligen, Waltham, MA)을 포함한다. 투과액은 연동 펌프를 사용하여 필터로부터 추출될 수 있다. 실제로, 바람직한 구현예에서, 관류는 교번 접선 유동 시스템을 사용하여 달성된다.
본 발명의 방법은 상기 개시된 바와 같은 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 사용하여 N-1 생물반응기 시스템을 가동시키는 단계를 포함한다. 조건의 예는 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙의 길이, 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙을 통한 유량, 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙의 단면적, 세포 배양물 점도, 및/또는 세포 배양물 밀도를 포함한다. 본 발명의 다양한 양태에서, 이러한 조건은 하기 식 1을 사용하여 약 20 μm 이상(및 선택적으로 약 200 μm 이하)의 η를 제공하며,
[식 1]
식 1에서, ε은 [U 3/L]이다. L은 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙의 길이이고; U는 [생물반응기와 RTF 또는 ATF를 연결하는 튜빙에서의 유량/생물반응기와 RTF 또는 ATF를 연결하는 튜빙의 단면적]이다. 식 1에서, ν는 [세포 배양물 점도/세포 배양물 밀도]이다. 일부 예에서, 생물반응기와 세포 유지 장치를 연결하는 단일 튜브가 있고, 생물반응기의 포트로부터 세포 유지 장치의 포트까지 해당 튜빙의 길이가 이용된다(예를 들어, 예시를 위한 도 3a 참조). 다른 예에서, 생물반응기와 세포 유지 장치를 연결하는 다수의 튜브가 있고(예를 들어, 예시를 위한 도 3b 참조); 이러한 배열에서, 식 1에 사용되는 튜빙의 길이는, 세포 유지 장치를 포함하지 않고 생물반응기 출구 포트에서 시작하여 생물반응기 입구 포트에서 끝나는 회로에서 튜빙의 가장 긴 세그먼트이다. 단지 예시를 위해, 도 3b의 개략도에서, 생물반응기와 세포 유지 장치에 대한 입구를 연결하는 튜빙을 나타내는 굵은 선이 식 1에서 사용될 것이다. 이들 파라미터 중 하나 이상의 조정이 나머지 파라미터에 영향을 미칠 것이라는 것은 이해될 것이다. 본 발명의 다양한 양태에서, 튜빙을 통한 유량은 (i) 중공 섬유 모듈의 경우 약 4 mL/min/섬유 내지 약 16 mL/min/섬유, (ii) 플랫 시트 필터 모듈의 경우 약 360 L/m2/hr 내지 약 720 L/m2/hr, 또는 (iii) 적층판 모듈(예를 들어, MilliporeSigma에서 판매하는 PROSTAK® 모듈)의 경우 약 1 L/m/채널 내지 약 4 L/m/채널로부터 선택되고/되거나; 세포 배양물 점도는 약 1 내지 약 6 센티포아즈(예를 들어, 약 2 내지 약 6 센티포아즈)로부터 선택되고/되거나; 세포 배양물 밀도는 약 1 g/L 내지 약 1.5 g/L로부터 선택된다.
세포 배양 배지는 시험관내 세포 배양에서 포유류 세포와 같은 동물 세포의 성장에 적합한 배지이다. 세포 배양 배지 제형은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 세포 배양 배지는 완충제, 염, 탄수화물, 아미노산, 비타민, 및 미량 필수 원소로 구성된다. 세포 배양 배지는 혈청, 펩톤, 및/또는 단백질을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 무혈청 및 한정 배양 배지를 포함한 다양한 조직 배양 배지가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 다음 세포 배양 배지 중 임의의 하나 또는 조합이 사용될 수 있다: RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, 햄 F12 배지, Iscove의 변형된 Dulbecco 배지, McCoy 5A 배지, Leibovitz L-15 배지, 및 무혈청 배지, 예컨대 특히 EX-CELL™ 300 시리즈(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.). 세포 배양 배지에는 배양될 세포의 요구 사항 및/또는 목적하는 세포 배양 파라미터에 따라, 추가적인 또는 증가된 농도의 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등과 같은 성분이 보충될 수 있다.
세포 배양 배지는 무혈청, 무단백질, 및/또는 무펩톤일 수 있다. "무혈청"은 우태 혈청과 같은 동물 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. "무단백질"은 트랜스페린, 단백질 성장 인자 IGF-1, 또는 인슐린과 같은 외인성 첨가 단백질이 없는 세포 배양 배지에 적용된다. 무단백질 배지는 펩톤을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. "무펩톤"은 동물 및/또는 식물 단백질 가수분해물과 같은 외인성 단백질 가수분해물을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 세포 배양 배지로부터 혈청 및/또는 가수분해물을 제거하는 것은 로트별 변동성을 줄이고 여과와 같은 처리 단계를 강화하는 장점을 갖는다. 그러나, 혈청 및/또는 펩톤이 세포 배양 배지로부터 제거되면, 세포 성장, 생존력, 및/또는 단백질 발현이 감소되거나 최적보다 못할 수 있다. 이와 같이, 무혈청 및/또는 무펩톤 세포 배양 배지는 아미노산, 미량 원소 등에 대해 고도로 농축될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 5,122,469 및 5,633,162 참조.
아미노산, 무기 염, 탄수화물, 지질, 비타민, 완충제, 및 미량 필수 원소를 함유하는 한정 세포 배양 배지 제형은 복잡하다. 원하는 특성을 갖는 세포 배양을 유지하는 데 필요하고 유익한 성분을 확인하는 작업이 진행 중이다. 특정 숙주 세포의 요구에 부합하도록 또는 목적하는 성능 파라미터에 부합하도록 보충되거나 강화되는 한정 기본 배지 제형은 개발 중인 한정 배지에 대한 한 가지 접근 방식이다.
배지 성분 및 세포 자체를 포함하는 세포 배양물 점도는 선택적으로 약 1 내지 약 6 센티포아즈(예를 들어, 약 2 내지 약 6 센티포아즈)이다. 세포 배양물 점도는 "콘 플레이트(cone-and-plate)" 점도계와 같은 임의의 적합한 점도계를 사용하여 특성화될 수 있다. 배지 성분 및 세포 자체를 포함하는 세포 배양물 밀도는 선택적으로 약 1 g/L 내지 약 1.5 g/L로부터 선택된다. 세포 배양물 밀도는 예를 들어 트리판 블루 배제법을 사용하는 Roche Cedex HiRes와 같은 자동화 세포 계수기를 사용하여 특성화될 수 있다.
본 발명의 방법은 2개 이상의 별개의 단계에서 세포를 배양하는 더 큰 생산 공정의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 N-1 생산 단계 전에 하나 이상의 성장 단계에서 배양되고, N-1 생산 단계에서 배양된 다음, 단백질 생산을 극대화하는 조건하에 (N) 생산 단계로 옮겨질 수 있다. 각각의 단계는 자체 생물반응기 용기 또는 세포 배양에 적합한 다른 용기에서 수행될 수 있다. 둘 이상의 단계가 공통 용기에서 수행될 수 있다. 이러한 일례에서, 성장 단계 및 생산 단계는 동일한 생물반응기 용기에서 수행된다. 포유류 세포에 의한 단백질의 상업적 생산 공정에서, 최종 생산 단계에 앞서 상이한 배양 용기에서 수행되는 일반적으로 다수의, 예를 들어 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 성장 단계가 존재한다. 본 발명의 방법은 적어도 N-1 성장 단계 동안 이용될 수 있지만, 선행 성장 단계(예를 들어, N-2 또는 N-3)에서도 이용될 수 있다.
CHO 세포와 같은 포유류 세포는 예를 들어 약 30 ml의 배지를 갖는 100 ml 용기, 약 80 내지 약 90 ml의 배지를 갖는 250 ml 용기, 또는 약 150 내지 약 200 ml의 배지를 갖는 250 ml 용기에서와 같은 소규모 배양으로 배양될 수 있다. 대안적으로, 배양은 예를 들어 약 300 내지 약 1000 ml의 배지를 갖는 1000 ml 용기, 약 500 ml 내지 약 3000 ml의 배지를 갖는 3000 ml 용기, 약 2000 ml 내지 약 8000 ml의 배지를 갖는 8000 ml 용기, 및 약 4000 ml 내지 약 15000 ml의 배지를 갖는 15000 ml 용기와 같은 대규모일 수 있다. 예를 들어 단백질 치료제의 임상적 제조를 위한 대규모 세포 배양은 세포가 목적하는 단백질(들)을 생산하는 동안 일반적으로 수일, 또는 심지어 수 주 동안 유지된다. 이 기간 동안, 배양물에는 세포 배양의 생산 단계 과정 동안 소비되는 영양분 및 아미노산과 같은 성분을 함유하는 농축 공급 배지가 보충될 수 있다. 농축 공급 배지는 거의 모든 세포 배지 제형을 기반으로 할 수 있다. 이러한 농축 공급 배지는 세포 배양 배지의 성분 대부분을, 예를 들어 정상적인 양의 약 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 12x, 14x, 16x, 20x, 30x, 또는 50x로 함유할 수 있다. 농축 공급 배지는 유가 배양 공정에서 흔히 사용된다.
생산 단계는 대규모로 수행될 수 있다. 대규모 공정은 적어도 약 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10,000, 15,000, 또는 20,000리터의 부피로 수행될 수 있다. 성장 단계는 생산 단계보다 높은 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35℃ 내지 약 38℃의 제1 온도에서 수행될 수 있고, 생산 단계는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃, 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도에서 수행될 수 있다. 또한, 온도 변화와 동시에, 그 이전, 및/또는 이후에 카페인, 부티레이트, 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)와 같은 단백질 생산의 화학적 유도제가 첨가될 수 있다. 온도 변화 후에 유도제가 첨가되는 경우, 유도제는 온도 변화 1시간 내지 5일 후에, 선택적으로 온도 변화 1일 내지 2일 후에 첨가될 수 있다.
생산의 성장 단계(N-1 단계)의 기간은 예를 들어 7일 내지 14일의 범위일 수 있고, 생산(N) 생물반응기의 접종 전에 세포를 기하급수적 성장 상태로 유지하도록 설계될 수 있다.
세포 배양물로부터의 샘플은 임의의 분석 기술, 예컨대 당업계에 알려진 분석 기술을 사용하여 모니터링되고 평가될 수 있다. 배양 기간 동안 에타너셉트 품질, 배지 품질, 및 기타 특성을 포함한 다양한 파라미터를 모니터링할 수 있다. 연속 모니터링, 실시간, 또는 거의 실시간을 포함하여 바람직한 빈도로 간헐적으로 샘플을 채취하고 모니터링할 수 있다. 단백질 생성물 및 생산 공정의 특성을 정량적 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 N-1(또는 이전) 단계, 생산(N) 단계, 또는 정제 공정 중에 샘플을 채취할 수 있다. 제품 품질 속성의 검출은 질량 분석법, UV 및/또는 질량 분석법 검출을 포함한 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동 등을 사용하여 달성될 수 있다. 아미노산 처리 및 글리코실화와 같은 번역후 변형은 예를 들어 크기 배제 모드로 작동되는 ESI-MS 결합 폴리하이드록시에틸 아스파트아미드 컬럼을 사용하여 특성화될 수 있다(Brady et al., (2008) J Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509). 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용리액에 대한 실시간 모니터링은 레이저 광 산란 검출기 및 UV 흡광도를 사용하여 분획별 정규화된 LS/UV 비를 모니터링함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 미국 특허번호 US 20130303732 참조).
본 발명의 방법, 기술, 및 조성물은 재조합 단백질 제품을 생산하기 위한, 특히 에타너셉트를 생산하기 위한 다른 방법, 기술, 및 조성물과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 다른 방법, 기술, 및 조성물의 예는 미국 특허번호 7,915,225; 8,119,605; 8,410,060, 8,722,631; 7,648,702; 8,119,604; 8,828,947; 7,294,481; 7,476,722; 7,122,641; 6,872,549; 7,452,695; 7,300,773; 8,063,182; 8,163,522; 6,924,124; 7,645,609; 6,890,736; 7,067,279; 7,384,765; 7,829,309; 6,974,681; 6,309,841; 7,834,162; 8,217,153; 8,273,707; 7,781,395; 7,427,659; 7,157,557; 7,544,784; 7,083,948; 7,723,490; 8,053,236; 7,888,101; 8,247,210; 8,460,896; 8,680,248; 6,413,744; 7,091,004; 6,897,040; 6,632,637; 7,956,160; 및 7,276,477에서 확인되며, 이들 각각은 교시하거나 개시하는 모든 내용에 대해 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생산된 에타너셉트를 포함하는 제형을 추가로 제공한다. 제형은 액체 제형 또는 동결건조 제형일 수 있다. 일반적으로, 제형의 에타너셉트 농도는 수성 제형(예를 들어, 용매로서의 물)에서 약 40 mg/mL 내지 약 200 mg/mL이다. 더 바람직하게는, 에타너셉트 농도는 약 40 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 훨씬 더 바람직하게는 약 40 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 선택적으로 약 50 mg/mL이다. 제형에 사용하기에 적합한 부형제는 수크로스, 락토스, 글리세롤, 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 말토스, 이노시톨, 트레할로스, 및 글루코스와 같은 당류/폴리올류; 혈청 알부민(소 혈청 알부민(BSA), 인간 SA, 또는 재조합 HA), 덱스트란, PVA, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 폴리에틸렌이민, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 또는 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)와 같은 중합체; 다가 알코올(예를 들어, PEG, 에틸렌 글리콜, 및 글리세롤), 디메틸설폭사이드(DMSO), 및 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 비수계 용매; L-아르기닌, 프롤린, L-세린, 알라닌, 글리신, 라이신 하이드로클로라이드, 사르코신, 및 감마-아미노부티르산과 같은 아미노산; 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 및 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제; 및 염화나트륨, 염화칼륨, 및 시트르산나트륨과 같은 염을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
다양한 양태에서, 제형은 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 100 mM의 염화나트륨, 25 mM의 인산나트륨, 25 mM의 L-아르기닌, 및 물을 포함한다(또는 이로 구성된다). 대안적으로, 제형은 동결건조 분말 형태의 25 mg의 에타너셉트, 40 mg의 만니톨, 10 mg의 수크로스, 및 1.2 mg의 트로메타민을 포함한다(또는 이로 구성된다). 대안적으로, 제형은 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 120 mM의 염화나트륨, 25 mL의 L-아르기닌, 및 물을 포함한다(또는 이로 구성된다).
선택적으로, 제형은 전달 장치, 또는 보관 또는 선적을 위한 용기에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 구현예에서, 약 1 mL 또는 약 0.51 mL의 제형이 프리필드 시린지 또는 오토인젝터(예: SURECLICK® 오토인젝터)에 들어 있다. 제형이 동결건조 분말인 경우, 제형은 선택적으로 다회용 바이알에 들어 있다. 본 발명은 제형의 사용 설명서와 함께 본원에 기재된 제형을 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 키트는 용기, 예를 들어 일회용 용기(즉, 1회 용량 제형을 담는 용기)를 포함할 수 있다. 일회용 용기에는 단회 용량뿐만 아니라 용기로부터 환자에게 전체 단회 용량이 투여될 수 있도록 충분한 추가 용량이 포함될 수 있지만, 두 번째 용량을 투여하는 데 용기를 사용할 수 있을 만큼 많은 추가 용량은 포함되지 않는 것으로 이해된다. 용기(일회용 용기이든 다회용 용기이든)의 예는 바이알, 시린지, 및 오토인젝터를 포함한다. 적합한 오토인젝터의 예는 미국 특허번호 8,177,749, 8,052,645, 및 8,920,374, 및 국제 특허공개번호 WO 2014/0089393, WO 2016/033496, 및 WO 2016/033507에서 확인되는 것들을 포함하며, 각 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 에타너셉트 함유 조성물 및 제형, 뿐만 아니라 본원에 기재된 시린지, 오토인젝터, 키트 등은 치료를 필요로 하는, 즉 에타너셉트 치료에 반응하는 병태가 있는 환자를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 용어 "~를 필요로 하는 환자"는 이미 장애를 앓고 있는 대상체뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 대상체를 포함한다. "환자"는 예방적 또는 치료적 처치를 받는 인간 및 기타 포유류 대상체를 포함한다. 용어 "처치"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. "처치"는 질환의 완전 관해 또는 근절을 필요로 하지 않으며; 질환의 임의의 개선 및/또는 질환과 관련된 증상의 개선이 고려된다. 에타너셉트 치료에 반응하는 병태의 예는 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 및 건선(즉, 판상 건선)을 포함한다. 에타너셉트로 환자를 치료하는 방법은 예를 들어 미국 특허번호 7,915,225; 8,119,605; 8,410,060; 8,722,631; 및 8,119,604에 기재되어 있으며, 각 문헌은 그 전체가, 특히 상기 병태 및 투여 요법에 대한 설명과 관련하여, 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다. 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
RTF는 재조합 단백질 생산에는 효과적이지만, 노동 집약적이고, 복잡한 장비를 필요로 하고, 생산 문제가 발생할 수 있다. N-1 생산 단계 동안 ATF를 사용하여 CHO 세포에서 재조합적으로 에타너셉트를 생산하는 것을 검토하기 위한 연구를 수행하였다. N-1 생산 단계에서 RTF를 ATF로 대체한 초기 연구는 배양에 의해 궁극적으로 생산되는(N 생산 단계 후) 에타너셉트의 양을 감소시켰다. 놀랍게도, N-1 생산 단계에서의 CHO 세포 응집 수준은 N 단계 생산에서의 생성물 역가에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
2가지 유형의 관류 방법, 즉 재순환 접선 유동 여과(RTF) 및 교번 유동 여과(ATF)를 사용하여 N-1 관류 반응기를 가동시켰다. 다음의 2가지 유형의 세포 유지 장치를 사용하였다: RTF 관류에 대한 0.2 μm 기공 크기를 갖는 Sartorious Sartocon Slice Cassette 및 ATF 관류에 대한 GE Healthcare 0.45 μm 기공 크기 중공 섬유막. N-1 반응기 작업 부피는 2 L였다. 3가지 다른 ATF 이송 라인 내경을 시험하였다(0.375", 0.25" & 0.125"). 시스템은 생물반응기와 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙 길이, 튜빙 내 유량, 세포 배양물 점도, 및 세포 배양물 밀도를 동일하게 사용하였고; 조건 #2, #3, 및 #4에 대한 유일한 변수는 튜빙의 단면적(내경)이었다. 시스템 파라미터에 식 1을 적용하여 #2 및 #3에 대한 η를 결정하였다. 조건 1 및 4는 세포 응집에 영향을 미칠 만큼 충분한 난류를 생성하지 않았다. 실험 조건은 표 1에 요약되어 있다.
| 조건 # | 관류 시스템 | 식 I에 의해 결정되는 η |
| 1 | RTF | N/A (대조군) |
| 2 | 내경이 0.125"인 A2B 튜빙을 사용하는 ATF | 17 μm |
| 3 | 내경이 0.25"인 A2B 튜빙을 사용하는 ATF | 47 μm |
| 4 | 내경이 0.375"인 A2B 튜빙을 사용하는 ATF | N/A |
1 L 작업 부피의 N-0 반응기를 시험된 각각의 N-1 조건으로부터 접종원을 사용하여 접종하고, 표준 작동 파라미터를 사용하여 가동시켰다. 설계는 N-0 반응기 성능 및 생산성에 대한 세포 응집 속도의 잠재적 효과를 평가할 수 있도록 하였다.
조건 #1 내지 #4를 사용하여 가동된 N-1 관류 반응기는 목적하는 모든 세포 성장 배양 성능 파라미터를 충족하여, 전체 연구 과정(5일)에 걸쳐 95% 이상의 세포 생존력을 제공하였다. N-1 관류 반응기로부터 접종된 N-0 배양물도 정상적인 세포 생존력을 나타냈다. 그러나 놀랍게도, 조건 #2를 사용하여 N-1 배양물로부터 접종된 N-0 배양물은 조건 #1, #3, 및 #4를 사용하여 수행된 N-1 배양물로부터 접종된 배양물에 비해 훨씬 더 낮은 역가를 초래하였다. 임의의 이론에 구애됨이 없이, η = 17 μm가 되는 조건 #2의 관류 파라미터는 N-1 단계에서 세포 응집체의 파괴를 촉진하는 유해한 유체역학적 조건과 관련이 있었다. N-1 단계에서 세포 응집체의 파괴는 예기치 않게 N-0 배양 성능의 저하를 초래하였다. η 값이 증가하도록 파라미터를 조정하면 N-1 배양 응집 속도가 증가하였고, 이로 인해 놀랍게도 N-0 배양에서 역가가 향상되었다. 20 μm 이상의 η 값은 일관된 제품 품질 속성을 유지하면서 더 높은 역가를 발생시키는 세포 응집 수준을 유지할 만큼 관류 유동에서 충분히 큰 소용돌이에 해당한다. 실제로, 조건 #3 및 #4로부터 N-1 배양에 대해 채택된 N-0 배양은 배양 성능, 역가, 주 피크, 및 응집체 측면에서 RTF를 사용하는 N-1 배양과 비슷했다.
특허, 특허출원, 문헌 간행물 등을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 구현예에 중점을 두고 본 발명을 설명하였지만, 바람직한 화합물 및 방법의 변형이 사용될 수 있다는 점과 본 발명이 본원에 구체적으로 설명된 바와 달리 실시될 수 있는 것이 의도된다는 점은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구범위에 의해 정해지는 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 모든 변형을 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Amgen Inc.
<120> CELL CULTURE METHOD
<130> 01017/55498
<150> US 63/129,349
<151> 2020-12-22
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 1
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
Claims (17)
- 중국 햄스터 난소 세포(CHO)로부터 에타너셉트를 생산하는 방법으로서, 20 μm 이상의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 재순환 접선 유동 여과(RTF) 또는 교번 접선 유동 여과(ATF) 세포 유지 장치를 사용하여 N-1 생물반응기 시스템을 가동시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 200 μm 이하의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행되는, 방법．
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 20 μm 내지 150 μm의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행되는, 방법．
- 제3항에 있어서, 상기 방법은 20 μm 내지 95 μm의 세포 응집체 크기를 유지하는 조건하에 수행되는, 방법．
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템은 하기 식 1:
(식에서 ε은 [U 3/L]이고, L은 생물반응기와 RTF 또는 ATF 세포 유지 장치를 연결하는 튜빙의 길이이고, U는 [튜빙에서의 유량/튜빙의 단면적]이고, ν는 [세포 배양물 점도/세포 배양물 밀도]임)을 사용하여 20 μm의 η를 제공하는 튜빙 길이, 튜빙 단면적, 및 유량을 이용하는, 방법. - 제5항에 있어서, 식 1을 사용하여 η가 200 μm 이하인, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 유량은 (i) 중공 섬유 모듈의 경우 약 4 mL/min/섬유 내지 약 16 mL/min/섬유, (ii) 플랫 시트 필터 모듈의 경우 약 360 L/m2/hr 내지 약 720 L/m2/hr, 및 (iii) 적층판 모듈의 경우 약 1 L/m/채널 내지 약 4 L/m/채널로부터 선택되고; 세포 배양물 점도는 약 1 내지 약 6 센티포아즈로부터 선택되고; 세포 배양물 밀도는 약 1 g/L 내지 약 1.5 g/L로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 에타너셉트를 포함하는 제형.
- 제8항에 있어서, 상기 제형은 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 100 mM의 염화나트륨, 25 mM의 인산나트륨, 25 mM의 L-아르기닌, 및 물로 구성되는, 제형.
- 제8항에 있어서, 상기 제형은 동결건조 분말 형태의 25 mg의 에타너셉트, 40 mg의 만니톨, 10 mg의 수크로스, 및 1.2 mg의 트로메타민으로 구성되는, 제형.
- 제8항에 있어서, 상기 제형은 50 mg/mL의 에타너셉트, 1%의 수크로스(w/v), 120 mM의 염화나트륨, 25 mL의 L-아르기닌, 및 물로 구성되는, 제형.
- 제9항 또는 제11항에 있어서, 1 mL의 상기 제형이 프리필드 시린지 또는 SURECLICK® 오토인젝터에 들어 있는, 제형.
- 제9항 또는 제14항에 있어서, 0.51 mL의 상기 제형이 프리필드 시린지 또는 SURECLICK® 오토인젝터에 들어 있는, 제형.
- 제10항에 있어서, 상기 동결건조 분말이 다회용 바이알에 들어 있는 제형.
- 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 에타너셉트의 유효 용량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 환자는 류마티스 관절염, 다관절 소아 특발성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 또는 판상 건선을 앓고 있는, 방법.
- 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항의 제형 및 상기 제형의 사용 설명서를 포함하는 키트.
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