TW201201833A - Designer peptided-based PCV2 vaccine - Google Patents

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Description

201201833 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於以胜肽為基礎抗第二型豬環狀病主 (porcine circovirus type 2 ; PCV2)疫苗及在仔緒短效但高 力價第二型豬環狀病毒移行抗體存在下之抗第二型豬環、& 病毒感染疫苗之製程相關的技術。 依據各種實施例的發明設計疫苗配方，包含一個依據 開放閱讀框架2 (open reading frame 2 ; 0RF2)轉譯外稍蛋 白設計的胜狀，此胜狀可隨意的連結到一個人工設計的輔 助型T抗原決定位（artificial T helper epitope)以加強它的b 細胞免疫原性，此抗原決定位可包含PCV2開放閱讀框架i (open reading frame 1 ; ORF1)及開放閱讀框架 3 (open reading frame 3 ; 0RF3)的胜肽混合，製備成獸醫學上可 接受的運輸系統作為疫苗配方。 【先前技術】 豬環狀病毒(porcine circovirus type; PCV2)最早於 1974 年於遭受類似小核糖核酸病毒污染的豬腎細胞株(PK15)中 被發現（1)。1998年具抗原性、遺傳性明確的PCV由豬隻 組織中被分離出來，並被命名為第二型豬環狀病毒(Porcine cirvovirus type 2 ; PCV2)。PCV2與豬隻臨床疾病具關聯性。 豬離乳後多系統消耗性综合症（Postweaning multisystemic wasting syndrome ; PMWS)，是一種由 PCV2 引起的豬隻新興且對經濟造成重大影響的疾病。然而’證 據顯示PMWS症狀的出現需別的病原例如赭小病毒 4 201201833 (Porcine parvovirus ; PPV)的共同感染或免疫刺激物壓 力或輔助因子的存在。這些症狀使7 ilM5週齡的緒隻衰 弱，伴隨有消耗、呼吸衰竭、淋巴結腫大、下痢、蒼白及 黃疸。肉眼及組織病理病變影響多器官系統，包括 肺炎、淋巴結病、肝炎、腎炎、心肌炎、腸炎、皮膚炎及 胰臟炎（1、3)等。 由回顧性的調查研究顯示’ 1973年即可由豬隻血清中 憤測到PCV2特異性抗體(4)。PMWS的確診乃依據由 染組織病灶中偵測PCV2特異性核酸或抗原。病毒可由二 臟、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、唾液腺、淋巴結、曱狀腺、 胸腺、胃腸道、糞便、胰臟、睪丸及腦被分離出來（丨、5)。 主要的傳染途徑不明，但是證據顯示PCV可以透過垂 直或水平傳播。PCV2冒由新生但未感染猪隻的眼睛、鼻 腔、糞便檢體中被偵測到。由流產的豬隻死胎組織中分離 到PCV2 ’證實可透過垂直傳播。由自然感染及實驗感染公 緒***中偵測到PCV2核酸’證實公緒可透過***傳播 PCV2給未感染PCV2的女豬及仔豬⑺。 PCV2是一種小型無封套病毒，帶有環狀單股DNA (single-strand DNA ; ssDNA)基因體。基因體包含六個可轉 譯出假設蛋白（putative proteins)的開放閱讀框架（0pen reading frames ; ORFs) (2)及四個與非致病性的第一型豬環 狀病毒(Porcine cirvovirus type 1 ; PCV1)類似的 ORFs 具有 相當程度的相似性的ORFs (6)。只有由ORF1、ORF2及 ORF3轉譯出來的蛋白質可由被PCV2感染的細胞中被偵測 到。ORF1可轉譯出具312個胺基酸的複製蛋白，另外也引 201201833 起一個具168胺基酸的剪切變異，皆為Pcv2複製過程必 需的（7)。結構性外鞘蛋白（capsid)由〇RF2轉譯⑻；〇RF3 負責轉譯非病毒複製必需但是在PCV2引發細胞凋亡 (apoptosis)及致病性扮演重要角色的高度保留性蛋白（9)。 只有暴露於表面由pCV2 〇RF2轉譯的外鞘蛋白可引起 宿主免疫系統β細胞的保護性抗體反應（1〇)。與觀察結果 一致’利用PEPSCAN圖譜研究確認PCV2對於β細胞優 勢免疫特異性抗原決定位在PCV2外鞘蛋白的65_87、 113-139、169-183 及 193-207 胺基酸序列（11)。除了對 β 細胞的抗原決定位之外，對於τ細胞優勢免疫抗原決定位 包含輔助型Τ細胞的優勢免疫抗原決定位亦為決定一個病 毒抗原性重要的因子。輔助型τ細胞的優勢免疫抗原決定 位激發保護型的輔助型τ細胞(Th)傳遞訊息給Β細胞產生 抗體。以20個胺基酸的胜肽偵測pcv2的τ細胞優勢免疫 抗原決定位及淋巴球增生實驗顯示，與B細胞優勢免疫抗 原決定位對外鞘蛋白位置（n)相比，輔助型τ細胞的優勢 免疫反應位在非結構蛋白QRF1及0RF3高度保留區，然 而0RF2並不會轉譯出優勢免疫的線性Th抗原決定位 (12)。 在胜肽疫苗中，Th決定位的存在對於免疫系統調控合 成胜肽的免疫原性是相當關鍵的因子。Th抗原決定位為具 免疫優勢且混雜的，可高度且廣泛地與不同型別的MHC 反應（13)。因此，外鞘蛋白上缺少免疫優勢Th位可幫助限 制PCV2次單位外鞘蛋白的免疫原性。胜肽次單位免疫原 的免疫原性可透過與標地B細胞抗原決定位共價連結來加 6 201201833 強對於外來混雜的Th位選擇性，包括可透過組合化學方式 來增強混雜的Th抗原決定位（14、15、16)。另外，疫苗對 於豬隻的免疫保護性及疫苗保護豬隻免於遭受病毒感染效 果可被病毋眾^的Th抗原決定位影響，且這些可透過與不 同蛋白的B細胞抗原蚊位混合形成交叉保護性(17)。 一保濩仔豬抵抗PCV2相關疾病（例如pMWS)的低成 本南特異性疫苗是相當必要的。傳統疫苗以不活化全pcv2 病毒為基礎。《而，PCV2在細胞培養中無法複製達到高力 價’使傳統疫苗成本高且保護力低。非傳統性疫苗則是以 重組PCV2 ORF2抗原為基礎。pcv2 〇RF2外勒次單位蛋 白已被許多表現系統表現出來，包括昆蟲細胞的桿狀病毒 表現系統(3、10)。以昆蟲細胞表現的重組pcV2外鞘蛋白 疫备大多使用於免疫仔豬。此種重組抗原通常含有宿主細 胞及載體抗原，因此造成疫苗非特異性免疫反應，且可能 成厭重的不良反應’包括過敏性反應。 其他不活化PCV2病毒疫苗及次單位外鞘蛋白疫苗包 括重組病毒溶解物或純化蛋白，這些疫苗的問題為在於對 正常田間仔豬的保護力低。因田間仔豬通常帶有母體移行 抗體（maternally-derived antibodies ; MDA)，因此這些疫苗 通常被試驗於無特定病原（specific-pathogen-free ; SPF)仔 豬或剖腹產禁食初乳（cesarean-derived colostrums deprived; CDCD)仔豬。移行抗體的力價低且持續時間短而 無法提供足夠保護力’但仍足以干擾疫苗反應。移行抗體 的影響可以藉由施打高劑量的重組ORF2外鞘蛋白所克服 (18)。以桿狀病毒表現糸統表現重組全長〇rf2抗原分泌到 201201833 培養液中的技術於US2009/0022749A1中揭露（19)。這個系 統可部分克服低產率及純度的問題；但是，這個***及立 他生物性表現系統仍然存有全長PCV2抗原疫苗有限的免 疫原性、成本高、再現性低、低產率、品管過程複雜的問 題。因此，開發一個經過合理設計合成的具免疫原性的胜 肽PCV2疫苗是相當必要的。以胜肽為基礎的疫苗可被設 計成含有外鞘特異性的B細胞抗原決定位、有效的外來Th 抗原決定位及由其他PCV2蛋白而來的PCV2 Th抗原決定 位組成疫苗配方，刺激抗外鞘蛋白抗體反應，用以精準的 抵抗PCV2在仔豬的感染。 這個經過合理設計的病毒疫苗免疫原性胜肽起源於利 用連接到一個固體的支撐物的方法抗原決定位定位方法確 認具免疫優勢的抗原決定位。抗原決定位定位方法利用針 對特定病毒蛋白的高度相關區域連續重疊的胜肽，找出可 與免疫糸統產生反應的免疫原性區域。通常抗原決定位定 位方法利用短片段的胜肽精準的找出線性的決定位。 PEP SCAN為一種快速的抗原決定位定位方法，利用合 成上百條重疊的胜肽序列。分析這些胜肽對於抗體的結合 能力或對T細胞的刺激增生反應。這個方法可有效率的找 出線性的B細胞及τ細胞抗原決定位。然而，這些對於疫 苗開發相當重要的病毒或蛋白質的免疫優勢B細胞抗原决 疋位通常是長且為不連續片段，因此不易以PEPSCAN方 法找出（20)。 找出帶有長片段且不連續抗原決定位的免疫原性 pCV2胜肽’利用可控制的且可再現的固態胜肽合成技術合 8 201201833 成毫克或公斤級的產量是相當必要的。此PCV2外鞘免疫 原合成的可控制工業級製程，加上被明確定義的胜肽產 品，可提供PCV疫苗配方一個低成本工業級製程及良好的 品官架構。 參考文獻： 1. 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GenBank Accession Number AAN62766 公開的 PCV2 外鞘 蛋白的一群免疫優勢B細胞抗原決定位。特別地，這群免 疫優勢B細胞抗原決定位被發現存在於PCV2外鞘蛋白 (胜肽Cap卜序列辨識號：i，詳見表1}之154個胺基酸的 長胜肽中。此胜肽被包含在以胜肽為基礎的疫苗作為主要 的免疫原，加上外來之PCV2來源的τ細胞抗原決定位， 來刺激對抗PCV2感染的保護性抗體及細胞媒介免疫反 應。此胜肽免疫原對於抗PCV2疫苗配方相當的重要。 本發明包含許多實施例的方法，包括可刺激免疫反應 保護仔豬免於PCV2感染的疫苗的胜肽製造、胜肽組成、 疫苗配方，以及偵測PCV2感染的檢測試劑的製造方法。 本發明包含许多針對疫苗配方的實施例，包含一段利 用PCV2 ORF外鞘蛋白設計出來同源的或類似的 Capl胜肽（序列辨識號：丨）。在這些配方中的pcv匸叩丄胜 13 201201833 肽優先地但隨意地被連結到一個人工組合成的T helper抗 原決定位（序列辨識號：2，詳見表1)來加強它的B細胞免 疫原性。此PCV2 Capl胜肽可被隨意的與帶有一群PCV2 Th抗原決定位（參照表1)的PCV2 ORF1(序列辨識號：3及 4)及ORF3(序列辨識號：5)胜肽混合。這個以胜肽為基礎 的PCV2疫苗配方可刺激仔豬產生PCV2特異性抗體來對 抗PCV2感染，包括帶有可能影響疫苗免疫反應移行抗體 的仔豬。此經過設計以胜肽為基礎的疫苗包含以胜肽組合 作為免疫原’可以化學方式合成進行工業級的量產’並可 輕易地控制產品品質。 在本發明_多實施例中，亦包含佐劑及/或傳輸載體及 疫苗配方中其他常見的組成分。 【實施方式】 胜肽抗原可用來偵測免疫反應，部分的胜肽抗原亦可 能會刺激免疫反應。許多的胜肽抗原可被用來靈敏且特異 性的偵測免疫反應’但是大多數情況下都不是被用來作為 免疫原用。胜肽免疫原在胜肽抗原中為特殊的一群，可被 用來刺激免疫反應如同偵測它們一樣。依據本發明的實施 例’用在此PCV2疫苗的胜肽抗原為帶有b細胞及輔助型 T細胞抗原決定位可共同引起保護性免疫反應的胜肽免疫 原’除此之外’還可用來偵測對PCV2感染的免疫反應。 其中一個偵測B細胞抗原決定位的方法是利用一群重 疊的、不同長度（通常為2〇到6〇個胺基酸或更長）的胜肽 序列。這些較長的胜肽是利用一連串獨立的固態胜肽合 14 201201833 成，而非利用快速同步的PEPSCAN合成技術。這些成套 且重疊的胜肽可用於抗體結合試驗及用於實驗上的免疫， 以找出具有最好免疫優勢決定位’且包括不連續結構B細 胞抗原決定位之長胜肽片段。這個方法已被利用於找出 CD4上非線性的決定位’用以阻斷即120醣蛋白結合 的疫苗中，以及被用於依據***病毒VP1蛋白G-H l〇0p 域區所設計的胜肽抗原（25) ° 其中一個發明的實施例為提供包含154個胺基酸序列 (序列辨識號：1，詳見表丨）的PCV2 0RF2外鞘蛋白胜肽， 包含了 一群的B細胞抗原決定位，可提供適當的抗體辨識 區域。這些抗原性胜肽經過經檢驗辨識及使用PCV2感染 仔豬的血清及酵素連結免疫吸附分析法（E L1S A)做適當調 整。任何的免疫分析方法皆可被使用’包括胜肽抗原的抗 體捕捉介面，例如’ ELISA’用來偵測並定量PCV2感染仔 豬血液、血清、或血漿檢體中可與特定PCV2外鞘蛋白片 段結合的抗體。 在一個特定實施例中，一個依據全長PCV2蛋白胺基 酸序列的約第4 7 -2 02個胺基酸殘基設計且經過最適化包含 154個胺基酸的PCV2抗原性胜肽，其包含對PCV2外鞘蛋 白具免疫原性及抗原性的位置，對於疫苗免疫產生保護性 抗體且以ELISA偵測抗體相當有用。此高度抗原性及免疫 原性的外鞘胜肽是由超過50條重疊長度約20到170個胺 基酸的胜肽經由PCV2感染仔豬陽性標準血清檢測組設 計、合成而來。檢測超過50條候選胜肽，PCV1 Capl抗原 性胜肽（序列辨識號：1)具有一群的免疫優勢B細胞抗原 201201833 決定位，且對於PCV2陽性血清具有最顯著且一致的免疫 原性。Capl胜肽在帶有此胜肽序列的疫苗試驗中，亦被證 明具有高度免疫原性。包含此PCV2 Cap 1抗原性/免疫原性 胜肽序列（例如’序列辨識號：〗）的疫苗生產及使用皆包含 在本發明不同的實施例領域中。 PCV2 Capl免疫原性/抗原性胜肽發明特定的實施例 中’將進一步的定義序列辨識號：1的免疫原性功能性同 源序列’對於PC V2變異及不同株具有相對應的序列及結 構性的成分。同源的PCV2 Cap 1抗原胜肽帶有與原始變異 PCV2外鞘蛋白第47_202個胺基酸相當相似的胺基酸殘 基。此同源序列已利用序列比對軟體例如ClustalW (produced by Julie D. Thompson, Toby Gibson of European Molecular Biology Laboratory, Germany and Desmond Higgins of European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK· Algorithmic)證實。表2顯示利用CulstalW比對十一個 由GenBank Accession numbers確定的PCV2變異株取得的 Capl抗原序列的結果。表2中Capl同源比對的原始PCV 株包含許多不同基因型2a、2b、2d、l/2a的病毒及其他由 台灣、中國、美國、加拿大、巴西、西班牙、德國及丹麥 的動物中分離到的分歧株。表2亦顯示Capl序列的同源 性，亦指出其中高變異性胺基酸的位置。具體的說，此同 源序列具備一個由PCV2外鞘蛋白大約第47到202個胺基 酸位置的胺基酸序列。 本發明的同源序列被進一步定義為至少有80%與序列 辨識號：1相同。在一個實施例中，變異株同源序列至少 201201833 有85%與序列辨識號：〗相同。在另一實施例中，變異株 同源序列至少帶有90%與序列辨識號：1相同。在另二實 施例中，變異株同源序列至少帶有95%與序列辨識號：1 相同。 本發明其他實施例提供P C V 2 C ap 1抗原性抗體的免疫 原性功能相似物。一個Capl胜肽免疫原性功能相似物，包 含序列辨識號：1的變異及保有與原始抗原性胜肽本質相 §的抗原性及免疫原性的同源序列。例如，此變異可以是 序列辨識號：1功能性相似物或帶有保留性取代胺基酸位 置的同源序列、整體電荷的改變、共價連結到另一個部分、 或小部分的增加、嵌入、刪除或保留性取代及/或任何相關 組合。因此，可結合到PCV2Capl抗原性胜肽（例如序列 辨識號：1)的抗體亦可結合到PCV2 Capl抗原性胜肽的免 疫原性功能性相似物，並具有相似的效力。在一實施例中， 此功能性相似物至少有50%與序列辨識號：i或其同源相 同。在另一貫施例中，此功能性相似物至少有80%與序列 辨識號：1或其同源相同。在另—實施例中，此功能性相 似物至少# 85%與序列辨識號：i或其同源相同。在另一 實施例中，此功能性相似物至少# 9G%與序賴識號：i 或其同源相同。 在上實把例中’包含PCV2 Capl抗原性胜肽的 C ap 1抗原性胜肽的功能性相似物被以保留性取代及以嵌 入f刪除的方式修改。在此實施射，S疫原性功能性相 ==由序觸概：1料而來，或者由序賴識號：1 同源序列以保留性取代方式修改而來。 17 201201833 保留性取代是當一個胺基酸被另一個帶有相似化學性 質的胺基酸取代。例如，非極化（疏水性）的胺基酸包括丙 氨酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、***酸、 色胺酸及甲硫胺酸，極化中性的胺基酸包括甘胺酸、絲胺 &、蘇氨酸、半胱氨酸、酪胺酸、天門冬氨酸及麩醯胺酸； 帶正電胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；帶負電胺基 酸包或天門冬胺酸及麩氨酸。 在另一貫施例中，免疫原性功能性相似物可被以在N 端或C端增加胺基酸的方式，及/或以嵌入胜肽中間方式修 改。在本發明各實施例中，胺基酸的增加皆位於胜肽的N 端或C端。增加的胺基酸數可以是1、2、3、4、5、6、7、 8、9、1〇、u、12、13、14、15、16、17、18、19 或 2〇 個胺基酸殘基。此增加的胺基酸序列並非出現於PCV2外 鞘蛋白中，且不會改變此胜肽對於pcv2外鞘蛋白的免疫 原性。非PCV2外鞘蛋白所增加的胺基酸包括，但不限於， 支曰加小片段帶電的序列（例如，離胺酸_離胺酸_離胺酸）、可 這成分支結構的胺基酸（例如，εΝ_離胺酸）或造成環狀結 構的胺基酸（例如，半胱氨酸）。在本發明一實施例中，非 PCV2 Cap 1所增加的胺基酸序列為$個胺基酸或更少。增 加的胺基酸可以是典型或非典型的胺基酸或其混合物。 在另一特定實施例中，免疫原功能性相似物可以透過 ，除胜肽N端、C段或中間的胺基酸而做修改。在不同的 貫施例中，由胜肽的N端或c端刪減胺基酸。刪除的胺基 酸數目可以是]、2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、u、12、 3 14 15、16、17、18、19或20個胺基酸殘基。在一 201201833 特定實施例中，刪除的鞍基酸數目為10個或更少。 在另一實施例中’包含PCV2Capl抗原性胜肽的PCV2 C ap 1抗原性胜肽的功能性相似物被以被改變電荷方式修 改。此種改變可能是胺基酸取代、增加、刪除或共價結合 到一個帶電分子的結果。此種電荷的改變可能造成胜肽比 未修改的胜肽更為鹼、更為酸或更為中性。在特定的實施 例中’可透過在C端或n端增加1 -5個離胺酸的方式使胜 狀更為驗性。在另一特定實施例中，可透過在N端增加3 個離胺酸的方式使胜肽更為鹼性。 經由非限制的例子’本發明胜肽之免疫原功能性相似 物可以在胺基酸末端帶有i到5個額外的胺基酸（典型或 非典型的）。例如，在PCV2 Capl胜肽胺基酸末端可增加離 胺酸-離胺酸-離胺酸序列來改變其電荷。 胜肽可谷易地使用標準技術合成，例如Merrifield固態 合成法及許多可行的改進方法。此胜肽亦可利用重組DNA 技術合成。此類方式，核酸分子轉譯出本發明不同實施例 的PCV2 Capl抗原性胜肽及PCV2 Capl抗原性胜肽之免疫 原功能性相似物。包含編碼PCV2 Capl抗原性胜肽及免疫 原功能性相似物核酸的載體，特別是表現載體，也包含在 本發明之實施例中。載體的宿主細胞亦包含在本發明之實 施例中。 本發明之實施例亦包含製造PCV2 Capl抗原性胜肽及 PCV2 Cap 1抗原性胜肽的免疫原性功能性相似物的方法。 例如，此方法包含培養帶有可表現PCV2 Capl抗原性胜肽 及/或PCV2 Capl抗原性胜肽的免疫原功能性相似物胺基 201201833 酸分子載體的宿主細胞，在此的條件下表現PCV2 Capl抗 原性胜肽及/或PCV2 Capl抗原性胜肽的免疫原功能性相 似物。此實施例可使用來自此細胞溶解物或分泌物之可控 制、被完整定義的免疫原。 本發明的其中一個實施例提供了以固態合成生產此胜 肽的方法。此實施例中的以化學方法生產被控制且定義品 質好的抗原，因此，可確保再現性、抗原性、免一原性及 產率。另外，製造此胜肽抗原過程中沒有使用生物危害物 質，可降低生物污染的風險。因特定位置免疫原高密度的 存在於選擇性抗原決定位，利用PCV2 Capl抗原性胜肽的 疫苗其安全性及免疫原性皆可被確認。 在一個實施例中’本發明的胜肽以合成法產生。使用 被定義的Capl合成胜肽可減少以胜肽做為抗原偵測及診 斷仔豬抗體的偽陽性結果。使用被定義為帶有B細胞及Th 抗原決定位的合成胜肽做為免疫原，可減少不必要因使用 由PCV2感染或由重組病毒感染的宿主細胞來源或由可能 共同純化出帶有PCV2病毒及/或重組蛋白的重組蛋白表現 系統抗原性物質做為疫苗的免疫原性成分的存在下造成的 非PCV2特異性免疫反應。例如，由豬隻來源的血清可能 帶有對針宿主細胞或對—大腸桿菌、酵母菌或桿狀病毒 的，體’目此在此類抗職㈣做⑽斷試驗時會出 現交又反應，疫苗中這些額外的免疫原成分引起的免疫反 應並無保護效果。相反的，豬隻接受本發明的pcv2 胜肽疫苗會引起集中的免疫反應，而不會有額外的抗體及 其他宿主細胞蛋白或表現載體，例如，大腸桿菌、酵母菌 20 201201833 戈才干狀病I，在以生物性方式純化PCV2抗原時被共同純 化出來的蛋白所引起的免疫反應。 此合成胜肽的實施例邡減少生產過程中雜質的干擾。 在長的δ成中，儘管嚴格的控管偶合的效率，胜肽類似物 亦可能在延長的步驟，包栝胺基酸嵌入、刪減、取代及未 完成的終止過程中產出，造成在標的胜肽的合成中帶有許 多胜肽類似物。儘管如此，在固態抗原免疫學診斷或做為 疫苗免疫原的免疫原性應用上，胜肽類似物在胜肽製備過 程中對於抗原性及免疫原性仍舊適當。 k 在合成胜肽免疫學應用25年的經驗中，我們發現對於 免疫活性保留的結構性變異的範圍遠超過利用小分子藥物 保留特殊藥物活性或在製造生物性藥品中製造出來的大分 子的必要活性及不必要毒性。這就是爲什麼胜肽類似物: 被设计或合成過程中不可避免之錯誤所產生帶有與標的胜 肽相似圖譜及免疫原特性之混合物’與標的胜肽的純化= 有相似的效率。設計的相似物及意外產出的類似混合物為 有效的，只要開發出好的Qc方法來監測製造過程及產: 評估過程，即可保證帶有這些胜肽最終產品的再現性及= 率。 人 在本發明的另一個具體例中，疫苗組成包含了 Th 肽。Th胜肽的存在可改善PCV2 Capl胜肽疫苗的免疫原 性。PCV2Capl胜肽（包含上述的同源物及類似物）可與 抗原決定位共價連結及/或混合。 、 在一個實施例中，Th胜肽帶有一群具免疫優勢由 及ORF3而來的PCV2 Th抗原決定位，以序列辨識號. 21 201201833 表示（如表1所示）’不與Capl免疫原連結，可被應用於增 強PCV2Capl胜肽疫苗的免疫原性。包括無共價連結之序 列辨識號：3-5自由胜肽，可改善此疫苗配方的免疫原性。 在另一個實施例中，pCV2 Capl胜肽（包含上述的同 源物及類似物）可透過或不透過一個間隔序列，與帶有一個 Th抗原決定位序列的胜肽共價連結。此實施例可促進免疫 原性’使其大於未共價連結Th抗原決定位之相同PCV2 Capl。在一個特定實施例中，包含Th抗原決定位的胜肽 被共價連結到PCV2胜肽的N端或C端。在另一個特定的 實施例中’此間隔序列帶有Lys-Lye-Lye-sNLsy序列（序列 辨識號：7) ’亦詳見表1。在一個實施例中，帶有Th抗原 決定位的胜肽被共價連結到PCV2 Capl胜肽的胺基酸末 端。在一個特定的實施例中，帶有Th抗原決定位的胜肽為 人工組合的Th抗原決定位序列序列辨識號：2(詳見表1) 透過Lys-Lye-Lye-sNLys間隔序列連結到胺基酸末端，如 序列辨識號：6表示（詳見表υ。 本發明各個實施例有關於保護豬隻抵抗PCV2。在一個 實施例中，疫苗包含一個免疫原性胜肽抗原及一個可被接 受的傳遞系統或佐劑。在各個實施例中，PCV2疫苗組成包 含一個胜肽抗原及一個獸醫界可接受的傳遞系統或佐劑， 此胜肽抗原包含一胺基酸序列，其係擇自於下列所組成之 族群： a) PCV2外鞘蛋白胺基酸序列約47到2〇2位置 b) 序列辨識號：1 ; c) (b)的同源物； 22 201201833 d) ⑻、⑻或⑷的抗原性及免疫原性功能性相似物； e) (a) (b)、（c)或（d)至少帶有一個保留性胺基酸取代、 胺基酸增加、及/或胺基酸刪減；以及 f) (a)-(e)的任意組合。 在PCV2疫苗的實施例中，胜肽抗原的電荷由增加或 減少1到5個胺基酸而改變。在pcv2疫苗的另一個實施 例中’此抗原性及免疫原性功能性同源物或類似物至少有 80°/〇與PCV2外鞘蛋白約第47至202胺基酸位置序列抗原 相同。在一特定的實施例中，胜肽抗原具有一胺基酸序列， 其係擇自於下列所組成之族群：序列辨識號：9、1 〇、11、 12、13、14、15、16、17、18、19 及 20。 在PCV2疫苗的另一個實施例，此胜肽抗原更包含了 一個Th抗原決定位共價連結到胜肽抗原的n端或C端。 在一個特定的實施例，此Th抗原決定位透過一個至少帶有 一個胺基酸的間隔序列共價連結到胜肽抗原。在一個特定 的實施例’此Th抗原決定位為序列辨識號：2。在一個特 定的實施例，此間隔序列為序列辨識號：7。在一個特定的 實施例，此胜肽抗原為序列辨識號：1或序列辨識號：6。 在各實施例中，任何免疫原性胜肽抗原的量皆可被用 來刺激動物的免疫反應。在一特定實施例，胜肽抗原的量 介於約0.1 pg到約100 mg。在另一特定實施例，胜肽抗原 的量介於約1 pg到約10 mg。在另一實施例，胜肽抗原的 量介於約1 Opg到約1 mg。 在PCV2疫苗的實施例，包含三組PCV2輔助型T抗 原決定位胜肽序列辨識號：3、4、5等量的混合。在一個 23 201201833 特定的實施例，此序列辨識號：3、4、5等量混合的量介 於約0.1 pg到約1 mg。在另一個特定的實施例，此序列辨 識號：3、4、5等量混合的量介於約1 pg到約1 〇〇 mg。 在各個實施例中，任何形式或任何量的傳遞系統或佐 劑皆可被使用。在一個特定的實施例，傳遞系統或佐劑為
MontanideTM ISA 50V2 (— 種由礦物油及 mannide oleate 組 成油包水形式的油性疫苗佐劑）、Tween® 80 (亦被稱為：聚 山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖單油酸酯）、cpG寡核:g： 酸、及/或其任何組合。 在另一個實施例’ PC V2疫苗組成包含一個胜肽抗原序 列辨識號：6及一個獸醫界可接受的傳遞系統或佐劑，胜 肽抗原的量介於約1 Opg到約1 mg。 本發明另一特定實施例指出保護具有或不具有母體 PCV2移型抗體仔豬抵抗PCV2感染的方法，包括給予包含 上述任何實施例組成的疫苗。 本發明之PCV2 Capl胜肽亦可被應用於利用具抗原效 量之胜肽於免疫分析法的捕捉介面（例如，ELISA檢測套組 的固態免疫吸附介面）偵測PCV2抗體。依據本發明的實施 例’任何相容的免疫分析方法皆可使用此胜肽。這些方法 對此技藝人士來說相當的熟悉且已揭示於許多標準的免疫 學手冊及文章中，例如，Harlow et al. 1988 (26)。這些眾所 皆知的免疫分析方法包括，ELISA、酵素免疫斑點分析、 免疫凝集反應、抗體-胜肽-抗體三明治分析、胜肽-抗體_ 胜肽三明治分析。在一個實施例，免疫分析法為利用固態 介面塗鍍PCV2 Capl胜肽的ELISA。 24 201201833 依據本發明的一個實施例，此胜肽可利用ELISA分析 法偵測母豬、女豬、公豬、閹公豬及仔豬的血清’以評估 仔豬的PCV感染，評估免疫前仔豬血清的母體移型抗PCV2 抗體，及評估免疫仔豬對於帶有PCV2 Capl抗原胜肽、全 長外鞘蛋白、或不活化PCV2病毒顆粒疫苗的免疫反應。 在一特定實施例中’ELISA分析法可被用來檢測豬隻 血液、血清或血漿檢體中抗PCV2抗體的存在，包含以下 步驟： i將PCV2 Capl胜肽結合到一個固相物質， ii使帶有此胜肽的固相物質與帶有抗體的豬隻血液、 血清或血漿檢體作用，使抗體結合到胜狀上，及 iii偵測結合到位於固相物質胜肽上的抗體。 以一個ELISA套組為例，將豬隻血清檢體以檢體稀釋 液稀釋後，與一個或多個PCV2 Capi胜肽接觸，作用一段 時間後，若存在有抗體的話，便會結合到帶有胜肽的固熊 介面。移除未結合的物質後（例如利用磷酸鹽緩衝= (phosphate-buffered-saline ; PBS)清洗），此二級 = 豬隻特異性IgG或蛋白質A、蛋白質G或蛋白質二 的抗體接觸。這些抗體或蛋白f A、蛋白fG或蛋: 結合到二級複合物上形成三級複合物。因為此二 蛋白質A、蛋白質G或蛋白f A/G被標定有受體分 此右上述結合成功’則此三級複合物則可被偵測到。受體 分子可以是酵素、放射性同位素、㈣物f、 分子、化學性冷光分子、生物素、抗生物素蛋白 = 或其類似物。對於ELISA分析來說，受體分子最好是酵素素 25 201201833 以下的例子有助於說明本發明，但不可用以限制本發 明的範圍。 26 201201833 Ι,ϋΊϋΛΗαΛΝνΜα^ΊΗΓΓΜΊΟΝΗΗΝΝ^σ^χαυ^ατΛ^Μίϊ.Ι.ΗΧΗΜΚΑΕ^άδάΙΧΗΗείείΑΝΛΑίιαλχτνΗνΜ ΧΑΪ^ααΊΙΑνΗΜϋΛΟΗαϋδχΙ^ΜυίϊκϊΗΛΜΛΜΗΙΗΛλδ^ΙΜΙΜΝ^ϋοϋ^ΑΛ^αδίΙΝ^ΗΗΗαΛνΜΜίϋΗΛΛΗνΜΛΙΙΛαΕΧΛΜΤΗ^荽-1赵㈣丧噼^遥41S w(^^铄 IdBu,}^ 咖親 ζ,Ιβο NAOd"1"1·鳔。长嵴磙鋰 3-1^1^1^韻α"^ί-40"·ΤΎ-^^^^--ί ^υ2ΉΟ 缌鹫壌阳學丨^-处-_培"-^^^lizAod-^^+i^ Φ 咖 ε」ΉΟ"2ΉΟ ,ΜΉΟ ζΛυίίΐϊ (9 : is-M-吹) (ς :餒^敢-欢) -:餒辑^-吹)(e :^ss-in -: 髂锞蒗-in (I :餒辕蒗-呤)
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LZ 201201833 w'li-^磙鯉^呦蜱»。犁邮»^±i'^lwf-K>N^^^^!irlQ.Buwt#^(NAodcl:K- A[xJzaalI>vEHSSA3a:aoo,LIC3suCMMkJM>>I>Ma;IH>H>H3[IJcuISQiH2se3e3c)i3c31t4azINkJHwwaAvssdxDSAdEHcc>i>J,>He3bJSST:HEH AJNaallAVISSASasaoOHIaJsCJDJf-esAMAM^IHAAUfcdlsI^zlelelsddAtJazISkJHwwaxssaJHHAHHVMA.IAotiHHSlHi SH >t,zaalI>VHSCJAoHae)aE-lIC3su<3M[w:3>M>>ieiIa;A>H3clJdISI^ZEHoooCMaJ>tJaaI2tMa;swa><:3:sDJHH>EH,LVMAH>-lcltJID2ST:a:EHvo ADUsaaTIIVSSoAociaDol.IICISodsJWAMAMDiIHAAlatJcuISIMZHSaclCLJcuAhaaTlNtlHwwaAvssdJ.cnAH.IVMAHADCIJ.LHSTIcivcnn AbJzaallAVE-lOTuAoCISaoaHIOJsoCLIsCIJwAMAMDilIDiAAWUJaJISIMZE-leJueJcuillAJaaaiLaHswaAvssdHiAEHiHMAHAobJHDiSIHEHHCQ AUJzaa^IAVISSASDiasoildsuCMMJwAMA^HIoiAAUUJDJISIKNHclooalCJAtJaalMtlHwsaAVSSCJHHAHHH^AEHAoJE-lHslciv 20 >.H§aTIA<,LS>SHS0J,Ids3ds3>M>MHIHAA3Jdw,I/IdMSS9ddT:JaNI§HwwaANMSd,IHAXXMM>I,5I,LHSlH,I δ Λ.3ΝααΊΙΛ<;Η2οΛ3Ηα30ΗΙί3Μυ<33α43Λ^ΛΜα:ΙΗ>-ιΛω[«αΛΕΗΊ<Ξ25333<3ί3Ί.3αΜΙ2ι^ρί;22αΛ2:55αιΕ-·α;ΛΧΕΗΜ^ΛΕ-ιΛ3ΙΗΗωΊΗΙ ζυ AtJNaaTIAVSWclAoQiaaaHICJSoDJstJwAMAMDiItfAAWJdASosHZStJuclOJal^LHazIZCIJcissaAVScncuioiAcuEHDiMAI.AaCXJ.LH---- S3 >.HNaa1IAVWS3>ela;ae)OHI<3cnoal3:tlUA^>MHIDi>H>Hw[IJdASHal2s3cl3aJcultJa2IZ[IJD2ssa><:ssQJHWA,IHcr;MIH>HclPLIIDSST;HEHωα Λ[«ζααΊΙΛνε;οο3ΛΕ}Ηα90ΕΗΙα48υα4Μ.3ωΛΜΛ>ία:ΙΗ>ΗΛω.3<3Λ5οίαιΝΜο3ωα4α1Ί.3α2ΙΝ[14οί22αΛ<:5ωαι,ΙΜΛΕΗΗοίΜΙΙ>Ηο.3ΗΗ5ΊΗΕ-ιζα AJZaaTIAVcosclAclDiaso.IIdsodsfcLJwAMAMHIaAAWtMdAOTccdNcooooddaJazIZfeawwaAVMcoCJJ.HAEHEHHKIEHAok.HHSTiaEHcon οετ 5 *秘画 Μ €
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痘病毒(T7/vac)(22)感染HTK細胞，再將pCR-〇rf2質體， 藉由 lipofectamineTM*轉染至 HTK 細胞中。經 pCR-orf2 質體共轉染之細胞，可以穩定地在HTK細胞的細胞核内表 現PVC鞘蛋白’因此，此細胞所產生之蛋白非常適合以ifa 分析法分析與偵測抗PCV2鞘蛋白抗體。 29 201201833 藉由免疫螢光分析法(IFA)測定抗PVC2抗體力價 藉由將受PCV鞘蛋白抗原質體轉染之細胞塗鍍於反應 盤上，形成帶有以原始PCV鞘蛋白作為抗原的反應盤，儲 存於-80°C。為了確保檢驗品質，一次產生1〇〇盤測試盤。 血清樣本以PBS稀釋’起始稀釋倍率為5〇倍，而後做2 倍連續稀釋。每次試驗中，具有一受pCV2感染之無特定 病原（SPF)豬的陽性對照組及未受感染之無特定病原（SPF) 豬的陰性對照組’藉此確定HTK細胞核中，具有由 pCR-orf2質體所表現之PCV2鞘蛋白。在細胞核内有螢光 訊號（第1B圖）’且血清稀釋高於1 : 50倍者，判定為 IFA力價>50 ’這表示該動物被PCV2感染或是被免疫後 再產生抗體。藉由IFA分析法，觀察特異性抗體與核内鞘 蛋白的結合，可與其他非特異性結合區分，以區別出偽陽 性樣品。 所有受自然感染之豬隻血清與受PCV Capl疫苗免疫 之猪隻血清的檢測，以早盲方式編瑪後測試。 2.以ELISA測定受PCV2自然感染與受Capl胜肽疫苗免 疫的豬隻 分別將溶於pH值9.5之10 mM碳酸氫鈉溶液之100 μί 2pg/mlPCV2鞘蛋白，即序列辨識號：1(PCV2鞘蛋白）塗鍍 於96孔反應盤中，於37°C反應1小時。 將此經該盤每孔加入250pL 3% ( w/w)溶於PBS溶液 的geltin溶液，於37。(：反應1小時’以避免非特異之結合， 之後，以含有0.05% Tween 20 (v/v)之磷酸緩衝液(PBS) 30 201201833 清洗3次。對PCV2免疫螢光分析法（IFA)呈陽性及陰性反 應之豬血清，以包含20% ( v/v )正常羊血清、1 % ( w/w ) geltin 和 0.05% (v/v) Tween 20 之 PBS 溶液稀釋 20 倍。 將100 μ L稀釋後之樣品加入反應盤中，置於37°C反應60 分鐘。 接著，反應盤以含有0.05% (v/v) Tween 20之PBS溶 液清洗6次，以除去非特異性之結合。用帶有山葵過氧化 氫酶之山羊柷豬IgG抗體來偵測反應盤中抗體/胜肽複合 物，右疋有陽性樣品，反應盤中會有抗體/胜肽複合物。使 用以含有1% (v/v)正常山羊血清，〇 〇5% ( 丁^⑶2〇 之PBS /合液稀釋帶有山葵過氧化氫酶之山羊抗豬抗 體，每孔加入lOO^L的山葵過氧化氮酶之山羊抗緒砂， 置於37〇C反應30分鐘。然後，以含有〇.〇5%(ν/ν) 20之PBS ^清洗6次，用以去除非特異性之結合，並與 脚 L 之包含 〇.〇4% ( w/w ) η，”，·—』，——e (TMB)$ :12/〇(v/v)之過氧化氫檸檬酸納溶液的呈色液，於 3體Si過:Γί養15分鐘。此呈色劑是藉由呈色來偵測抗 Λ 氧晦整合物ϋ色反應最終以 100//L 之 1 瓜ι奋'夜終止’測量其在波長450nm (Α450)之吸光 值。 夕π η 數依偵測動物血清中抗PCV2抗體的目的 差異:⑻稀釋1:20倍:其目的是為了確認 並依方法作V2自然感染’測量其在45Gnm之吸光值’ 稀釋1:ia倍錢 =*3品:^光值，訂定其臨界值’或⑻ 、以文··人10倍連續稀釋至1: 10000倍： 31 201201833 其目的是為了測定豬隻在接受PCV2胜肽疫苗免疫後，所 產生之抗體力彳貝南低。其力價之計算是以線性回歸分析其 吸光值後，以Log 10表示。 以此方法診斷動物是否受PCV2感染之結果與高度特 異性之IFA(實施例1)相互確認後比較，兩種方法具有言声 正相關’其相關係數為0.782 (表3)。 ο & 3·以特異性血清學確認最佳之Pcv2鞘蛋白胜肽作為 及診斷之用 …汶菌 以PCV2分離株（i〇10_Stoon)(2)和台灣pcv2分離 Cyc08之基因體為基礎之病毒開放閱讀框架預測蛋 白質序列，交叉比對分析兩者之序列後所得到之開放閱, 框架2 (ORF2)序列做為胜肽抗原，進行免疫學測試。為= 確認動物在遭受PCV2感染後，相關蛋白質抗原對於;和 B細胞之抗原性，設計了超過7 〇段相互重叠之胜肽、，其^ 基酸序列長度介於20個到大於170個胺基酸。較俨^ b 細胞抗原決定位的胜肽後經過一系列血清學確效後而確 認。再以測試較短和較長胜肽之抗原性方法建立抗原決定 位圖譜，即可以同時找出線性及三級結構之抗原決定位('= 25)。一組，24個經由IFA分析法確認具有抗pc鞠蛋白 抗體之血清樣品以實施例所示之IFA測試來確認胜肽的抗 原性。這些血清用來筛選可引起較強免疫和具較強及: 同抗原性之胜肽，做為疾病診斷和預測具產生保護性抗體 之抗原。這些PCV2確認反應組的血清是收集間: 染魏之豬隻血清以及未受PCV2感染之正常= 32 201201833 特定病原豬隻之血清組合而成，其各別之抗PCV2鞘蛋白 免疫螢光抗體力價如表3所示。 表3、已受PCV2感染及未受PCV2感染之血清樣品， 以ELISA與IFA分析法這兩種方法所檢測出之抗體力價的 相關性。 豬血清編號 宿主特徵 IFA分析法之抗 以Capl為抗原之ELISA 體力價 分析（450 nm吸光值） RS 3 無特定病原 <50 0.251 RS 4 無特定病原 <50 0.204 RS 6 無特定病原 <50 0.134 RS 8 無特定病原 <50 0.284 RS 9 無特定病原 <50 0.285 RS 10 無特定病原 <50 0.192 RS 12 無特定病原 <50 0.179 RS 13 無特定病原 <50 0.171 RS 15 無特定病原 <50 0.233 NS 5 正常血清 <50 0.123 NS 6 正常血清 <50 0.140 NS 9 正常血清 <50 0.245 RS 28 田間 200 0.259 RS 24 田間 400 0.354 RS 25 田間 800 0.528 RS 26 田間 800 0.479 RS 1 無特定病原 1600 0.794 33 201201833 RS 39 田間 1600 0.492 RS 7 無特定病原 3200 0.633 RS 16 無特定病原 3200 1.129 RS 42 受PCV2感染 3200 3.000 RS 43 受PCV2感染 3200 2.782 RS 41 受PCV2感染 6400 3.000 RS 45 受PCV2感染 12800 2.657 相關係數 0.782 標準血清組包含12個陽性免疫螢光抗體（力價大於1:50倍) 和12個陰性免疫螢光抗體（力價小於1:50倍）之豬血清，用 來確認以PCV2鞠蛋白（序列辨識號：1)為抗原，血清稀釋倍 數為1:21倍，以ELISA分析其在波長450 nm之吸光值與 ELISA之抗體力價間的相關性，其相關係數為0.782。 在重疊的胜肽中，較短的胜肽約有20個胺基酸，以 Applied Biosystems Inc.公司所製造之自動胜肽合成儀（型 號433)合成，較長的胜肽約自25至170個胺基酸，則是用 該公司所製造之其它型號機器（型號430a、431和433)以 Fmoc化學法所合成的。 每一段胜肽都是獨立合成，不會與其它片段相互污 染，其合成方式為，將Fmoc保護終端及側鏈之三效胺基 酸加入固態基質中反應，合成完畢之胜肽被切下後，再以 90%之三氟醋酸去除其側鏈之保護基。每段胜肽都以質譜 儀(MALDI-TOF)確認其胺基酸組成之正確性，另外，再以 高壓液相層析儀分析其内容物之組成及濃度。在合成較長 34 201201833 片段之胜肽時，广7 Λ , B，. B * 了加強控制胺基酸之聯結效率以外，胜 取二早期終時，常/會因為胺基酸的***、刪除、 這此相似胜肽對^生衫與原設計胜肽相似之序列。但 作為診斷試劑之抗原性，及作為疫苗之 免疫原性仍然有|虹 A ^ 品質管控方法σ ^。一般言，只要有一種足以鑑別的 可以監控胜肽製造過程和產品評估過程，就 可以進而保證最終產物之再現性及效力。 使用7Κ準血清組來測試這些不同長度之合成胜肽的抗 原欧取自自然感染之血清，對於PCV2鞘蛋白之反應， ^著胜肽^列增長而增強。使用表3下半部之血清進行大 里血/月^選’得到—個結果：-段包含154個胺基酸之 胜狀〒名為Capl”（序列辨識號：丨），做為elISA之抗 原。^上述表3之群組’此Capl胜肽也提供對ELISA分 析的冋專一性，並對經IFA檢驗為陰性之血清（序列辨識 就’ 1)的反應極低。事實上’被pCV2感染之血清只對於 154個胺基酸的Capl胜肽有強烈反應。因此，可合理認為 文PCV2感染豬隻之血清中出現主要的血清學反應，是因 為抗體可以辨識Capl上一連串之b細胞抗原決定位。此 外’ 154個胺基酸的抗原性與在鞘蛋白表面具連續或不連 續之抗原決弋位的較長胜肽相同。τ細胞與B細胞之抗原 決定位相連結所組成之抗原’是引發Β細胞產生抗體反應 所必要。 4.以PCV2鞘蛋白（Capl)胜肽疫苗免疫天竺鼠，可用來初 步評估疫苗之免疫性，並比較以Capl胜肽為抗原之 35 201201833 ELISA，和以天然鞘蛋白為基礎之免疫螢光分析法(ifa)戶 測得之抗體力價間之相關性 所 天竺鼠的免疫 本發明之一實施例’將含有Capl胜肽但不包含丁匕於 原決定位（例如，序列辨識號：1)，或於N端以共價鍵辞几 式，將間隔序列（序列辨識號：7)與外來之τ細胞抗原夫^ 位（如：UBITh®3)(序列辨識號：2)連結在—起（序列 號：6)，再以市售疫苗佐劑ISA 50V2乳化成油包水之細7 疫苗顆粒。將天竺鼠區分為2組，分別免疫不同胜狀疫苗， 如表4所示。 這是一個初步在小動物身上所做的試驗，評估Capl胜 肽（序列辨識號：1)與τ細胞抗原決定位（序列辨識號：2) 共價結合，以一般油包水方式乳化製成疫苗，藉此獲得不 同抗體反應之血清測試組。未連結之Capl胜肽稱之為序列 辨識號：1(表1)。Capl胜肽在N端藉由一個間隔序列與外 來Th細胞抗原決定位相連結者，稱之為（序列辨識號：6)(表 1)。每組各有3隻9週齡無病毒之母天竺鼠，重約45〇克。 用來測試PCV2 Capl胜肽疫苗配方的免疫原性（表4)。 表4、藉由比較以ELISA分析之抗_Capl鞘蛋白抗體（力價 Logl 0)及以IFA分析測得之抗，蛋白抗體相互比較，以評 估PCV2 Capl疫苗於寄主中的免疫原性 36 201201833 ELISA IFA分析法 之抗體力價 初次免 初次免 疫後第 疫後第 0週 4週 組 別 免疫原 劑量 動物編號 稀 釋 100 倍 時之吸 光值 力 價 (LoglO) 初次免疫後 第4週 初次免疫：25 " 3963 0.050 4.108 g/0.25mL/肌肉注 3964 0.055 3.280 射 3965 0.051 3.347 PCV2 Capl 補強免疫：25 # 平均值 0.052 3.578 A (序列辨識號： 1) g/0.25mL/肌肉注 射 (與ISA 50V2等體 積混合） 標準偏差 0.002 0.376 100 初次免疫：25 β 3957 0.053 4.349 g/0.25mL/肌肉注 3958 0.056 4.404 射 3959 0.053 4.051 UBITh3®-KKK-s 補強免疫：25 平均值 0.054 4.268 B K-PCV2 CP1 (序列辨識號 6) g/0.25mL/肌肉注 射 (與丨SA 50V2等體 積混合） 標準偏差 0.001 0.155 400 每隻動物皆以肌肉注射方式進行免疫，在A組的實驗 37 201201833 中，我們將等體積PCV2 Capl (序列辨識號：1)溶於PBS 中，做為疫苗之水相溶液，再與等體積之油相Montanide ISA50V2 (Sepic，法國巴黎）佐劑，相互乳化成為油包水之 疫苗，此由Mannide油酸脂及礦物油所組成油性佐劑，常 用於豬隻疫苗。在B組的實驗中，此Capl胜肽序列，在 其N端做了些許修飾，即藉由一段Lys-Lys-Lys-sNLys(序 列辨識號：7)間隔序列來連結人工組成之UBITh3⑧Th抗原 決定位與Cap 1胜肽，以連結B細胞抗原決定位與 UBITh3®Th抗原決定位，此胜肽免疫原稱為序列辨識號： 6(表1) ’再以與A組相同的方式進行油包水乳化而成疫 苗。A和B兩組天竺鼠分別在第〇週(初次免疫）和第2週(補 強免疫）時，以肌肉注射方式注射劑量為25pg之疫苗，並 在初次免疫後第0週和第4週時採集血清，供ELISA和IF A 分析法測試用。如同下列所討論的，以ELISA和IFA分析 之結果為：未與間隔序列和人工合成之UBITh®3共價結 合之免疫原（序列辨識號：1)，即可刺激天竺鼠之免疫細胞 產生抗Cap 1抗體；另一方面，與間隔序列和人工合成之 UBITh®3共價結合之免疫原（序列辨識號：6)，則可以引 發天竺鼠產生更強烈之抗Capl抗體反應，由此可知，經過 修飾之抗原可以增加其免疫原性（表4)。 免疫原性評估 評估免疫原性的方法為於每孔添加10〇 pL，濃度 2pL/mL的PCV2 Capl(序列辨識號：1)，以其作為固相介 質抗原塗鑛於反應盤上，以進行ELISA分析。動物血清則 38 201201833 以10倍〜1G_倍連續稀釋❹彳試，陽性血清之力價則以 稀釋倍數的鑛，取對數(Logl())後表#。將各組陽性血清 混合在一起，再以Capl為基礎之EUSA和IFA分析法測 試之。將血清對於ELISA中之Capl胜肽抗原之反應與對 於IFA分析法中表現於HTK細胞内之天然pcv2勒蛋白之 反應，相互比較。（第1A和1B圖）。 結果 在A組的結果中顯示，25pg之pCV2 Capl胜肽（序列 辨識號：1)在佐劑的輔助下，不需與人工合成之Th抗原決 疋位（序列辨識號.2)結合，即具有免疫原性。在elisa分 析結果中顯示，以人工合成之Th抗原決定位與多個離氨酸 所組成之間隔序列修飾之Capl胜肽，其免疫原性約可以 提升為原來的5倍(4.268- 3.758= 0.69 LoglO力價）。此結果 確認以Capl胜肽為基礎之ELISA，在IFA中，同樣也可 以證實’將Th抗原決定位與pcV Cap 1胜肽結合之抗原（序 列辨識號.6)之免疫效果比單獨一段pcv Cap 1胜肽（即序 列辨識號：1)之效果要高4倍’抗體力價從100倍提升至 400倍。同樣的’豬隻以未與（序列辨識號：1)或與(序列辨 識號：6) UBITh3®Th抗原決定位（序列辨識號：2)共價結 合之PCV Capl胜肽皆可產生強烈的抗capl免疫反應，而 且後者因為Th抗原決定位而大幅提升免疫反應（實施例 5 ，表 5)。 此一較具免疫原性之嵌合胜肽（序列辨識號：6)則再繼 續與其它佐劑複合，測試其在天竺鼠身上之較高免疫反應 39 201201833 範圍。初次免疫適用劑量為400pg，再與CpG寡核苷酸佐 劑（序列辨識號：8)(27)混合而成，其CpG用量如表5所示， 第2週後施打第2劑，劑量為l〇〇Hg。運用CpG佐劑與高 劑量免疫，可以使其免疫原性大為增加，以ELISA測試， 其反應增加倍，同樣的，其力價也隨之增加；以IFA分 析法測試，其力價則增加16倍。與表4中的B組混合血清 抗體力價400倍比較起來’以高劑量抗原佐以CpG寡核^ 酸之免疫方式，在天竺鼠身上可以得到令人印象深刻的 1600倍高力價。 5.以不同劑量之PCV CAP 1胜肽疫苗測試其對於一般農場 飼養豬隻的免疫原性 仔豬免疫 80頭4週齡之田間（非無特定病原豬場)仔豬，分成8 組，每組10隻（如表5)。這些仔豬分別於第〇週和第4週， 以肌肉注射方式注射經1:1等體積乳化後之均質樣油包水 疫苗，其成分包含之Capl胜肽和Tween 80 ;或50〜 400pg與UBITh3人工合成Th抗原決定位（序列辨識號： 6)連結之Cap 1胜肽。而序列辨識號：6嵌合胜肽分別與或 不與CpG寡核苷酸序列（即序列辨識號：7)相互混合，且在 乳化成疫苗前，分別加入或不加入Tween 8〇(表5)。 在初次免疫前’以及初次免疫後第4和第6週時，分 別採集血清，供ELISA分析之用。各別血清皆以範例2或 201201833 3所述之方法檢測其抗體力價。此外，也將各組之血清混 合在一起，供日後ELISA測試。 結果 各組混合血清之ELISA免疫原性測試結果，如表5和 第2圖所示。結果顯示，所有組別之疫苗都有免疫原性， 即使是最低劑量（50pg)組別。各組的每隻仔緒皆產生免疫 反應，其ELISA力價在初次免疫後第4週及第6週分別為 1000倍或更高，各組混合血清，除了第8組以外，其力價 皆可超過10000倍，第8組於初次及補強免疫皆注射5(^g， 劑量並無增加。 表5、PCV2 Capl胜肽疫苗之免疫原性評估。疫苗成份依 Th細胞抗原決定位胜肽、胜肽劑量，佐劑配方而不同，以 肌肉注射免疫田間仔豬，其免疫原性以Capl ELISA進行評 估。 組 別 免疫原特徵 免疫原重量 (mg/ml) 額外佐劑§ 初次免疫後第0週 (稀釋100倍之 A450 nm) ELISA抗體力價 (Login) 初次免疫 後第4週 初次免疫 後第6週 1 UBITh3-KKK-s K-Capl* 初次免疫： 400pg/1.0mL 補強免疫： 100pg2/0.25mL CpG: 1.2:1$ 0.168 3.154 4.036 2 UBITh3-KKK -εΚ-Cap 1* 初次免疫· 200pg/2mL 補強7免疫：8 200pg/2mL 0.1% Tween 80 0.104 3.705 4.734 3 UBITh3- KKK -εΚ-Cap 1* 初次免疫： 200pg/2.0mL 補強免疫： 200pg/2mL 無 0.134 3.488 4.128 4 UBITh3- KKK 初次免疫： CpG: 1.2:1 和 0.096 3.045 4.116 41 201201833 -εΚ-Cap 1 * lOOpg/l.OmL 補強免疫： 100pg/lmL 0.1% Tween 80 5 UBIThS- KKK -εΚ-Cap 1* 初次免疫： 100pg/lmL 補強免疫： lOOpg/lmL 0.1 % Tween 80 0.120 3.027 4.576 6 UBITh3- KKK -εΚ-Capl * 初次免疫： 50pg/0,5mL 補強免疫： 50pg/0.5mL 0.1% Tween 80 0.090 3.603 4.203 7 UBITh3- KKK -εΚ-Cap 1* 初次免疫： 50pg/0.5mL 補強免疫： 50pg/0.58mL 無 0.153 3.157 4.650 8 Cap It 初次免疫： 50pg/0.5mL 補強免疫= 50pg/0.5mL 0.1% Tween 80 0.104 2.901 3.554 #使用混合之血清做分析 *序列辨識號：6 $序列辨識號：1 §所有疫苗皆以水相：油相（1:1)之比例乳化而成，胜肽 溶於PBS中，或是胜肽/CpG寡核苷酸懸浮於PBS中，作 為水相溶液，Montanide ISA 50V2作為油相溶液及主要佐 劑0 各別仔豬之血清，以實施1中之IFA分析法分析第0、 4、6和10週之血清樣品，評估其抗Capl抗體力價，大多 數動物之血清樣品在初次免疫後第10週，除了第3組有出 現6400超高倍力價以外，其餘抗體力價皆可以達到400〜 1600倍之間。此外，仔豬之注射部位並未出現任何不良反 應。 42 201201833 在這80頭仔豬中’有8頭在初次免疫前（即第〇週）即 發現有移行抗體的存在’如表6所示。移行抗體在台灣田 間豬場的仔豬常會被偵測到，它通常會抑制疫苗刺激宿主 產生抗PCV2 Capl之抗體。這8隻具有移行抗體的仔豬， 於初次免疫後第4週和第6週時，不論是哪一種劑量或配 方（表6)，其ELISA分析所測之抗體力價都有增加的趨勢。 因此，無論是否有移行抗體的干擾，這8隻仔豬都可以成 功地接受不同配方疫苗之免疫。此結果證實仔豬對此種疫 苗具有自然專一性免疫反應。 具有移行抗體之編號26、27、86和87仔豬，在初次 免疫後第10週之血清中，可以ELISA測到相當高之抗體 力價’分別是6400、3200、3200和3200倍。在其它PCV2 疫苗试驗中’包括F〇rt Dodge/Wyeth (現為Pfizer動物保健) 所生產之SUvaxyn®疫苗，它是一種PCV2不活化全病毒疫 田’另外一個是 B〇ehringer Ingleheim 所製造之 ingelvac CnxoFlex®疫苗，它是一種pcv2 〇RF2重組蛋白疫苗，在 其°式驗中’同樣具有移行抗體之仔豬，接受該疫苗免疫後 所產生之1FA分析法抗體力價很少有超過50〜100倍，只有 5 1〇/°仔豬可以達到400倍.因此，仔豬對於pcV2Capl胜 月;u几原之自然專—性免疫反應，可與傳統市售疫苗 加以區隔。 表6、仔豬在接受不同劑量之PCV2 Capl胜肽疫苗前之移 行抗體(MDA)力價 43 201201833 豬隻耳號 IFA分析法力價 (第〇週） 劑量（pg/劑） 疫苗的ELISA力價 (LoglO) 初次免疫 補強免疫 第4週 第6週 7 200 400 100 3.039 3.750 26 100 200 200 2.948 3.812 27 200 200 200 2.988 3.982 29 50 200 200 3.749 4.081 68 400 50 50 2.446 3.939 85 50 100 100 3.690 4.608 86 50 100 100 2.720 3.939 87 100 100 100 3.090 4.499 *移行抗體 在整個試驗期間，80頭接受不同劑量之PCV2 Cap 1胜 肽疫苗的仔豬，其存活率為93%，然而，有另外400頭飼 養在同一農場但未施打疫苗的仔豬，其存活率只有82%。 而該場總飼養頭數約5000頭，平均存活率約80%，疫苗組 之93%存活率與該場平均存活率80%比較起來，是非常大 的進步。此一顯著降低經濟損失效果（非原評估指標項目） 更證明PCV2 Capl胜肽疫苗之效果。 總而言之，此胜肽疫苗在單次免疫後第4週前，其 ELISA抗體力價就有顯著提升，在第6週後之二次補強注 射，其IFA分析法抗體力價在第3組可以高達6400倍，顯 示PCV2 Capl胜肽疫苗之良好免疫原性。所有八隻有移型 44 201201833 抗體之仔豬，無論接受什麼劑量或疫苗配方，皆可以對 Capl產生免疫反應。接受胜肽疫苗之80頭非無特定病原 (non-SPF)豬隻之存活率為93%，在同一楝房舍中之其它 400頭未免疫緒隻之存活率為82% ’而該農場5000頭豬之 平均存活率為80%，相較之下’就可以證明PCV2胜肽疫 苗對於經濟上的顯著效益。 6、藉由在疫苗配方中添加一系列PCV2 ORF1和ORF3上 之Th抗原決定定位以達到只需施打一劑CAP1胜肽PCV 疫苗 藉由在疫苗配方中額外添加一系列PCV2 0RF1和 ORF3序列上之τ細胞抗原決定位，可以增加Cap 1胜肽 PCV2疫苗之免疫原性（表1)。這些序列首先由Stevenson 等人（12)首度使用於誘導豬隻T細胞增生之實驗，將三段 短的T細胞抗原決定序列（序列辨識號：3、4、5)，以等莫 耳數比例混合在一起，然後，以莫耳數比1:1〜1:0.05的比 例，再與PCV2Capl胜肽（例如：序列辨識號：1或6)混合 成疫苗之水相溶液。經乳化後，將此一含有顯著免疫原性 PCV2Th細胞抗原決定位之PCV2Capl胜肽疫苗，施打於 仔豬身上測試並評估其單—注射後，pcv相關τ細胞反應 (包含細胞激素的產生）的免疫反應。 結果 如表7所不’仔豬接受含有PCV2 Th胜肽之低劑量 PCV2 Capl疫苗免疫後’ τ以顯著提升其心分析法之抗 45 201201833 體力價。在第10組中，給予一劑含有5〇#g與UBITh⑧3 (序 列辨識號.6)連結之capi胜肽抗原，並混合20//g之三段 PCV2Th胜肽免疫原（序列辨識號：3、4、5)，在第4週前， 其1FA分析法之抗體力價介於50〜400倍之間；與第9組 相較’同樣施打一劑，含200盹之序列辨識號：6 Capl免 疫原’但不包含三段額外pCV2 Th抗原決定位序列之疫 苗’其免疫螢光抗體力價在第4週前則介於<5〇〜50倍之 間。 因此’疫苗配方包含一串主要B細胞抗原決定位之 PCV2Th勒蛋白胜肽（序列辨識號：6)和等莫耳數之其他主 要PCV2 Th抗原決定位序列（序列辨識號：3、4、5)，不但 可以達到降低疫苗之總抗原量，同時可以兼顧平衡T細胞 與B細胞之反應’進而產生具有良好保護效果之抗體，達 到預防疾病感染及降低胜肽抗原劑量的目的。藉由額外加 入三段PCV2 Th抗原決定位免疫原來評估未與uBITh ®3 相連結之PCV2 Capl胜肽（序列辨識號：1)在含有或不含有 額外PCV2 Th抗原決定位免疫原下的免疫原性（表8)。結 果顯示’含有50 pg之序列辨識號：1胜肽與1〇盹之額外 二段PCV2 Th抗原決定位免疫原之組別，與1 〇〇或2〇〇 不含額外三段PCV2 Th抗原決定位免疫原之單獨高劑量序 列辨識號：1胜肽組別相比，前者反應較佳。此抗原組合 方式之免疫效果非常好’可以作為低成本低劑量之緊急疫 苗使用。 表7、在以PCV2 Capl胜肽疫苗合併或未合併pcV2 ORF2 46 201201833 和ORF3之Th細胞抗原決定位胜肽免疫後，針對PCV2鞘 蛋白之IFA分析法抗體力價的誘導。 組別 疫苗配方 動物編號 IFA分析法抗體力價 第0週 第2週 第4週 9 200 pg之序列辨識號：6胜肽 /2 mL (1 : l(v/v)與 ISA50V2 混合） 154-03 <50 <50 <50 154-07 <50 50 50 152-03 <50 <50 <50 152-10 <50 <50 <50 152-04 <50 <50 <50 10 50 pg之序列辨識號：6胜肽 +20 pg之序列辨識號：3、4、 5等重量混合/1 mL (1 : l(v/v)與 ISA50V2 混合） 139-01 <50 <50 200 139-02 <50 <50 50 139-05 <50 <50 200 139-13 <50 <50 200 139-15 <50 <50 200 139-03 <50 <50 400 139-04 <50 50 200 139-10 <50 <50 400 139-12 <50 <50 200 139-14 <50 <50 400 7. PCV2 Capl疫苗試驗證實可防止經PCV2感染豬隻的病 毒傳播及致病性 田間試驗的目的在於評估不同劑量及配方之Capl胜 肽疫苗對於產生具保護效果之免疫力的能力。無特定病原 47 201201833 (SPF)豬隻接受Capl疫苗免疫後’與除了 PCV2病毒以外 無其它特定病原豬隻飼養在同一欄舍中，藉由豬隻在自狀 悲下’相互傳染’來評估經施打疫苗後之動物對於疾病之 感受性及疫苗對於動物所提供之保護效力。 PCV2感染和無菌動物之飼養條件 用來進行此實驗之設施位於北台灣香山，為一轉殖動 物測試站（Transgenic Animal Testing Station; TATS)，此工 作站原本是用來測試基因轉殖豬在回歸田間設施前之安全 監控。此工作站是由台灣動物科技研究所管理（23)。動物 舍之管理皆依據 IS〇9〇〇i (SGS TW07/03565)和 IS0/IEC 17025: 2005之相關規定。這些基因轉殖豬都定期接受血清 學監控’以確保並維持其無特定病原狀態。其檢測項目包 括有豬盘病毒、假性狂犬病病毒、豬生殖道及呼吸道症候 群病毒、萎縮性鼻炎、黴漿菌性肺炎、***病毒、豬赤 病i、介癬、弓蟲、放線桿菌肺炎等，例行性檢查中皆未發 現任何疾病或病原。 此外’實施例1中所示之最近開發出的IFA分析法， 也在兩年前加入檢測項目，其檢測結果顯示，這一群豬已 廣泛受到PCV2感染，陽性率高達89.4%(47/52)°PCV2 為在這些無特定病原動物，惟一傳播的病原。 PCV2的免疫及感染條件 以IFA分析法確定母豬血清及初乳中無抗PCv2抗體 存在’藉此在一群只有PCV2感染的環境中挑選無微生物 48 201201833 感染之仔豬。這些經過確認後之母 週齡時被納入此試驗中。此時，所產下之仔豬，於四 為五組，第n〜13㈣疫苗免疫；^物錢之仔豬被分 組，每組5隻；第14組 亦為疫苗免疫組，每組15隻；而第15組為對照組，每組 6隻。疫苗免疫組以不同劑量之PcV2Capl胜肽疫苗以肌 肉注射方式進行初次免疫，如表8所示（1〇〇或2〇〇jIg之序 列辨識號.1胜肽，或50pg之序列辨識號：1胜肽+5〇#g 之序列辨識號：3、4、5胜肽等重量混合；或5〇吨之序列 辨識號：1胜肽+ 10pg之序列辨識號：3、4、5胜肽等重量 混合）。各組在初次免疫後第4週，接受相同疫苗之補強劑 量。分別在初次免疫後第2、6和週時以IFA分析法分 析抗體反應。參照表8，在第2週時，所有組別之IFA分 析法抗體力價仍處於一個基礎力價，儘管第6週與第1 〇週 之免疫原性不盡相同’但在第6週之前，所有免疫組皆可 以測到高抗體力價反應。對照組之抗體力價則一直維持在 基礎值。 將免疫組與對照組之無微生物豬隻放回一般豬舍，與 只帶有PCV2病毒的豬隻共同飼養，使其暴露於具有PCV2 病毒之環境中約2個月。於所有動物生長到體重約120公 斤（約5〜6月齡）時終止實驗，將動物犧牲並以肉眼檢查豬 隻屠體是否有PCV感染之病灶。 PCV2感染後之症狀非常細微，不易察覺，且許多病理 變化，在這2個月的曝露期間，已經消失。因此，在剖檢 過程，必須使用一種較為敏感的診斷方式來偵測受免疫曝 露於PCV2環境中之動物是否被感染，而不是使用在疫苗/ 49 201201833 攻毒試驗中所用之較直接的方式來診斷受PCV2感染後的 症狀。剖檢項目包括觀察淋巴節、肺臟及腎臟。除了對照 組動物在腎臟有受感染之病灶以外，其他動物很少有受感 染的證據。未免疫且受感染動物之腎臟表面會有白色點狀 和條狀斑點，這是腎臟纖維化的病兆，如第3A圖所示。 然而，這些顯示舊有病兆的歷史記號，在免疫組中並沒有 發現，如第3B圖所示-。 免疫組豬隻之病理學評比如表9所示，腎囊下之白點 是曾受過感染之指標之一。此試驗是以PCV2胜肽疫苗配 方盲性編號方式進行。 結果與結論 由表8中免疫組及對照組的IFA分析法抗體力價結果 顯示，免疫組動物，隨著時間增加其抗體反應也隨之增加， 在第10週前，會出現較高之免疫反應。不同配方之PCV2 Capl胜肽疫苗所產生之免疫反應不盡相同，最佳之疫苗配 方施打於第14組，也是各組中最大一組。 對照組中，6頭有3頭（50%)豬有發現曾受PCV2感染 的歷史病灶，即腎囊下有白色斑點。另一方面，30頭經免 疫豬隻中僅有2頭（6.7%)發現輕度腎臟病之病理變化（表 9)。這兩頭豬隻都出現在第14組，該組共有15頭豬。接 受疫苗免疫之動物中，除了上述兩頭有輕微腎臟病變外， 其餘經免疫豬隻的淋巴節及腎臟皆未發現任何病變。因 此，此試驗揭露多種可以有效提供具保護力之PCV2胜肽 疫苗配方及劑量。 50 201201833 表8、在以PCV2 Capl胜肽疫苗合併或未合併 和ORF3之Th細胞抗原決定位胜肽免疫後，各組ΙρΑ分析 法抗體力價之幾何平均 組 別 疫苗描述Μ 動物數目 _LFA分^法杭靡 .力價 第2週 第6週 篦1 0调 11 序列辨識號：1 (20(^g/2 mL) 5 10 48 12 序列辨識號：1 (l〇〇Hg/lmL) 5 10 60 〇〇 1 〇< 13 5(^g序列辨識號：1 + 5(^g序 列辨識號：3、4、5等比例混合 (1 mL) 5 10 100 1 V J 100 14 5〇Rg序列辨識號：1 + lOpg序 列辨識號：3、4、5等比例混合 (1 mL) 15 10 127 174 15 對照組 6 10 10 10 *所有配方皆以Montanide ISA 50V2為佐劑，並以等體積 比例混合乳化而成。 t疫苗分別在第0週和第4週時，以肌肉注射方式給予二劑 量。 表實驗豬隻中PCV2相關病變的觀察 組別 —1 丨丨· 疫苗描述* 動物數目 動物編號 分數t 11 序列辨識號：1 (20(^g/2mL) 5 154-03 0 154-07 0 152-03 152-10 0 0 51 201201833 152-04 0 135-01 0 135-02 0 12 序列辨識號：1 (10(^g/lmL) 5 135-03 0 135-10 0 135-14 0 135-04 0 135-11 0 13 5(^g序列辨識號：l+5(^g序列辨識 5 135-12 0 號：3、4、5等比例混合（1 mL) 135-13 0 135-15 0 14 50μ g序列辨識號：1 + 10以g序列辨 15 141-04 0 識號：3、4、5等比例混合（1 mL) 140-11 0 140-01 0 140-02 1 140-10 0 140-12 0 141-01 0 141-05 0 140-14 0 140-03 0 154-02 0 154-06 0 154-05 0 52 201201833 152-02 0 152-01 1 1 -4所有 30 2/3 0=6.7%被感染 140-04 0 139-11 2 146-03 2 15 對照組 6 146-11 1 146-12 0 146-10 0 5所有 6 3/6=50%被感染 *與表8相同的二劑量免疫。 t分數：0 =無病變；1 =輕微病變；2 =中度病變；3 =嚴重 病變 53 201201833 【圖式簡單說明】 第1A圖顯示本發明一實施例的成果。利用螢光染色方 法偵測結合到HTK細胞核膜内部的抗pcV2外顆蛋白抗 體。圖中顯示HTK細胞被T7多聚合酶重組牛痘病毒感染 (T7/vac)(22)及被以 lip〇fectamineTM 技術（invitrogen)共同轉 染pCR-orf2質體。重組外鞘蛋白被轉譯後傳送到核中 (23)。依據本發明的實施例，抗外勒蛋白抗體結合到被感 染的HTK宿主細胞核中，於此可透過免疫螢光方式被標定 的二次抗體所偵測到。此方法可透過原核細胞T7啟動子以 高度特異性偵測短暫停留於真核表現系統HTK細胞的全 長PCV2外鞘蛋白抗體。 第1B圖顯示依據圖1A描述的免疫螢光染色（IFA)機 制。可偵測到共同轉染的抗PCV2外鞘蛋白的抗體結合到 HTK細胞核内。 第2圖顯示帶有PCV2感染的一般場仔豬經過8次免 疫Capl胜肽PCV2疫苗後的免疫原性，劑量說明詳見表5。 免疫原性以PCV2 Capl胜肽ELISA法（力價以LoglO表示） 偵測。 第3A圖顯示未免疫豬隻感染PCV2的腎臟照片。 第3B圖顯示免疫而未被感染豬隻的腎臟照片，一為剖 面（左），一為完整臟器（右）。 【主要元件符號說明】 無 54 201201833 序列表 <110> 美國聯合生物醫學公司（United Biomedical, Inc., UBI) <120>設計胜肽之第二型豬環狀病毒疫苗 <150> PCT/US2010/041406 <151> 2010-07-08 <160> 20 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 154
<212> PRT <213> 第二型竊環狀病毒（Porcine circovirus-type 2)Cyc08 台灣株 <400> 1
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val 1 5 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Ser Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95 201201833
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr He Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr 工le Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140
Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> 麻疹病哥·-修飾的輔助型T細胞抗原決定位
<220> <221> MISC一FEATURE <222> (4)..(4) <223> S或T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> K或R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G或T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Η或T 201201833 <220> <221> MISC__FEATURE <222> (13)..(13)
<223〉K 或 R <400> 2 lie Ser lie Xaa Glu lie Xaa Xaa Val lie Val Xaa Xaa lie Glu Thr 1 5 10 15 lie Leu Phe <210> 3 <211> 20
<212> PRT <213> 藉環狀病_ (Porcine circovirus) <400> 3
Cys His lie Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gin Gin Asn Lys Glu Tyr 15 10 15
Cys Ser Lys Glu 20 <210> 4
<211> 20 <212> PRT <213> 緒環狀病毒（Porcine circovirus) <400〉 4
Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly Glu Glu Val Val Val lie Asp Asp 15 10 15
Phe Tyr Gly Trp 20 201201833 <210> 5
<211> 20 <212> PRT <213> 雜環狀病荷（Porcine circovirus) <400> 5
Pro Arg Trp Pro His Asn Asp Val Tyr lie Gly Leu Pro lie Thr Leu 15 10 15
Leu His Phe Pro 20 <210> 6 <211> 177 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>源β於PCV2 ORF2鞘蛋白（Capl鞘蛋fi)之B細胞抗原決定位胜肽透過問隔序列連結至人工 組成之抗原決定位（UBITh3®Th)
<220〉 <221> MISC_FEATURE <222> ⑷.·⑷ <223> S或T <220> <221〉 MISC—FEATURE <222> (7) . . (7) <223> K或R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> G或T 4 201201833 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (12)..(12) <223〉 H或T <220> <221> MI SC一FEATURE <222> (13)..(13) <223> K或R <220> <221> MOD一RES <222> (23)..(23) <223> AMIDATION <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)··(23) <223> (epsilonN)Lys <400> 6 lie Ser lie Xaa Glu 工le Xaa Xaa Val lie Val Xaa Xaa lie Glu Thr 15 10 15 lie Leu Phe Lys Lys Lys Xaa Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr 20 25 30
Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met 35 40 45
Met Arg Phe Asn lie Ser Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn 50 55 60
Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val 65 70 75 80
Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly 85 90 95 5 201201833
Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala 100 105 110
Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Pro 115 120 125
Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu 130 135 140
Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu 145 150 155 160
Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly 165 170 175
Thr <210> 7 <211〉 4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工問隔序列 <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4)
<223> AMIDATION <220> <2 21 > MISC_FEATURE <222> (4) ..(4) <223> (epsilonN)Lys 201201833 <400> 7
Lys Lys Lys Xaa 1 <210〉 8 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> CpG寡核苷酸 <400> 8 24 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt <210> 9 <211> 154
<212> PRT <213> f者環狀病毒（Porcine circovirus) - US <400> 9
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr lie Lys Arg Thr Thr Val 15 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val He Leu Asp 65 70 75 80 201201833
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ala 130 135 140
Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210〉 10 <211〉 154
<212> PRT <213> 銘環狀病毒（Porcine circovirus) - DK <400〉 10
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr lie Lys Arg Thr Thr Val 15 10 15
Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 8 201201833
He Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val He Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr He Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 no
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ala 130 135 140
Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 11 <211> 154
<212〉 PRT <213〉緒環狀病毒（Porcine circovirus) - DE <400> 11
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr lie Lys Arg Thr Thr Val 15 10 15
Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu 35 40 45 9 201201833
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Met Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140
Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 12 <211> 150
<212> PRT <213〉猪環狀病?5(Porcine circovirus) - ES <400> 12
Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Pro Val Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15
Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp Phe Leu Pro Pro 20 25 30
Gly Gly Gly Ser Asn His Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg lie 10 201201833 35 40 45
Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr Gin Gly 50 55 60
Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp Asp Asn Phe Val 65 70 75 80
Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser 85 90 95
Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr 100 105 110
Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro Asn Asn 115 120 125
Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ala Gly Asn Val Asp 130 135 140
His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 13 <211> 154
<212> PRT <213> 猪環狀病毒（Porcine circovirus) - CM <400> 13
Thr Arg Leu Ser Arg Thr lie Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val 15 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30 11 201201833
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Thr 130 135 140
Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 14 <211> 154
<212> PRT <213> 猪環狀病i5(Porcine circovirus) - CM <400> 14
Thr Arg Leu Ser Arg Thr lie Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val 1 5 10 15 12 201201833
Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Met Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 工le Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Thr 130 135 140
Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 15 <211> 154
<212> PRT <213> f者環狀病毒（Porcine circovirus) - CN <400〉 15 13 201201833
Ala Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val 15 10 15
Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Leu Asp Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Phe Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr 工le Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Met Arg lie Gin Thr Ser 130 135 140
Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 16 <211> 154
<212> PRT 14 201201833 <213〉竊環狀病毒（Porcine circovirus) - BR <400> 16
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val 15 10 15
Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Leu Asp Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys He Ser He Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60
He Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val He Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr He Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 no
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Lys Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140
Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 15 201201833 <210> 17 <211> 154
<212> PRT <213> 銘環狀病瑪（Porcine circovirus) - US <400> 17
Ala Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val 15 10 15
Ser Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Leu Asp Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala lie lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val lie Lys Ala Thr Ala Gin Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Met Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140
Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 16 201201833 145 150 <210> 18 <211> 154
<212> PRT <213> 猪環狀病毒（Porcine circovirus) - CA <400> 18
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val 15 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys He Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60
He Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val He Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr He Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Met Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140 17 201201833
Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 19 <211> 154
<212> PRT <213> 猪環狀病i?(P〇rcine circovirus) - TW <400> 19
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val 15 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95
Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 100 105 110
Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 115 120 125 18 201201833
Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser 130 135 140
Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 <210> 20 <211> 154 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>竊環狀病毒（Porcine circovirus)-相同序列 <400> 20
Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Pro Val 15 10 15
Arg Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asn Asp 20 25 30
Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn His Arg Ser lie Pro Phe Glu 35 40 45
Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro 50 55 60 lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp 65 70 75 80
Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val 85 90 95 19 201201833 Asn Tyr Ser Ser 100
Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser 105 110
Arg Tyr Phe Thr 115
Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe 120 125
Gin Pro Asn Asn 130
Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser 135 140
Ala Asn Val Asp 145
His Val Gly Leu Gly Thr 150 20

Claims (1)

  1. 201201833 七、申請專利範圍： 1. 一種第二型豬環狀病毒疫苗組成物，包括一胜肽抗原 及獸醫上可接受之載體及佐劑，其中該胜肽抗原包括一胺 基酸序列，其係擇自於下列所組成之族群： a) — PCV2鞘蛋白之約第47個位置的胺基酸至約第 202個位置的胺基酸； b) 序列辨識號：1 ; c) (b)之類似物； d) 上述(a)至（c)之任意組合。 2. 如申請專利範圍第1項所述之第二型豬環狀病毒疫 苗組成物，其中該胜肽抗原包括序列辨識號：1之胺基酸 序列。 3. 如申請專利範圍第1項所述之第二型豬環狀病毒疫 苗組成物，其中該類似物包括一擇自於序列辨識號：9〜19 及20之胺基酸序列。 4. 如申請專利範圍第1至3項任一項所述之第二型豬環 狀病毒疫苗組成物，其中該胜肽抗原之帶電荷藉由增加或 删除1-5個胺基酸而改變。 5. 如申請專利範圍第1至4項任一項所述之第二型豬環 狀病毒疫苗組成物，更包括一與該胜肽抗原N端共價結合 之Th抗原決定位。 6. 如申請專利範圍第5項所述之第二型豬環狀病毒疫 苗組成物，其中該Th抗原決定位藉由一具有至少一個胺基 酸的間隔序列共價鍵結至該胜肽抗原的N端。 201201833 站、广直/，專利範圍第5至6項任—項所述之第二型緒環 :丙；史苗組成物，其中該巧抗原決定位為序列辨識號： L ° η 士申叫專利範圍第6或第7項任一項所述之第二型豬 壞狀9病毒疫苗組成物’其中該間隔序列為序列辨識號巧。 中μ專利範圍第1至8項任-項所述之第二型緒環 ^病毋疫苗組成物’更包括—混合3種pcv 2几抗原決定 辨識號：3、4、5)的等莫耳混合物。 卢狀1H申料利範^第1至9項任—項所述之第二型豬 ^狀病毒疫苗組成物，其中該胜肽抗狀總含量介於約 l〇Pg至約1 mg之間。 产业14專利範圍第9至1G項任-項所述之第二型緒 :狀病毋疫苗組成物，其中該序列辨識號：3、4及5之等 莫耳成合物的總含量介於約㈣至約1卿g之間。 —2·如申μ專利範圍第〗至“項任—項所述之第二型緒 =病毒疫苗組成物，其中該載體及佐劑係擇自於下列所 ί^ΓΓ〇Τίά6ΙδΑ5〇ν2'^ 早油駄及一 CPG寡核苷酸序列。 心/3 =中凊專利範圍第1至12項任一項所述之第二型緒 疫苗組成物’其中該胜肽序列為序列辨識號：】 或序列辨識號：6。 _ 4. Μ第—型豬壞狀病毒疫苗組成物，包括—序列辨 識號：6之胜肽抗原及獸醫上可接受之載體及佐劑，其中 該胜肽抗原的含量介於約1响至約img之間。 15.-種以疫苗注射麵仔豬不受pcv2感染之方法， 2 201201833 包含給予申請專利範圍第！幻4項任一項之疫苗，該仔猪 具有或不具有移行抗體干擾。 16.-種診斷第二型豬環狀病毒感染的方法 步驟， 4 a) 將-胜肽抗原魏於—固相物f中，其中該胜狀抗原 包括-胺基酸序列’其係擇自於下列所組成之族群： Ο - PCV2鞘蛋白之約第47個位置的胺基酸至約第 202個位置的胺基酸； ii)序列辨識號：1 ; 出）（ii)之類似物； iv)上述⑴至（iii)之任意組合； b) 將該塗鑛於固相物質中的胜肽，在有助於抗體結合 至胜肽的條件下暴露於含有抗體之豬血液、血清或血漿 中，以及 c) 偵測與該塗鍍於固相物質中胜肽結合之抗體的存在。
TW100123478A 2010-07-08 2011-07-04 設計胜肽之第二型豬環狀病毒疫苗 TWI508740B (zh)

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