CN103805573A - 一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与三个T细胞表位串联基因TCE融合连接后重组至腺病毒载体获得的；本发明还涉及重组腺病毒rAd-ORF2-TCE在猪病毒性免疫疫苗中的应用。本发明提供的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能有效刺激机体产生高水平特异性抗体以及刺激机体产生T淋巴细胞增殖，血清中IFN-γ以及IL-2浓度均获得显著性提高，与单独PCV2的ORF2相比，动物机体的体液免疫和细胞免疫水平均获得显著性提高。

Description

一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）是断奶后仔猪***消耗综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathysyndrome，PDNS）、仔猪先天性震颤及猪呼吸道疾病等的主要致病因素。PCV2属于圆环病毒科，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2无囊膜，呈二十面对称体，直径约17nm，该病毒包含有11个开放读码框，其中0RF1和ORF2是2个最大的编码框。ORF1编码病毒的复制蛋白Rep和Rep，，这2种蛋白与病毒的复制密切相关。ORF2编码病毒的主要结构蛋白，该蛋白包含有病毒特异类型抗原表位，能够诱导保护性的免疫以抵抗PCV2的感染，因此衣壳蛋白（capsidprotein，Cap）已经广泛用于血清学诊断及作为最佳的目的抗原来设计疫苗以抵抗PCV2相关疾病。目前，PCV2相关疾病仍然是养猪业中流行最为广泛的疾病之一，造成了巨大的经济损失。尽管目前已经有多种商品PCV2疫苗上市，这些疫苗在很大的程度上有效控的控制PCV2感染，但是PCV2相关疾病依然流行,因为这些疫苗并不能完全阻止PCV2的感染和传播。因此有必要研究更为有效的疫苗来控制PCV2相关疾病。

表位疫苗是以抗原上某些特定表位为基础制备的疫苗，主要包括表达自身蛋白的亚单位表位疫苗、合成肽疫苗、重组表位疫苗、表位核酸疫苗等。目前该种类型的疫苗已经成为研制感染性疾病、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等疫苗的新设计方向。为了克服由于抗原表位结构简单，分子量小，单独使用时免疫原性较弱，且在体内容易被降解，很难引起较强的免疫应答而获得长期的免疫效果的缺陷，本研究通过基因工程的方法将Stevenson等已鉴定的PCV2ORF1和ORF3上3个具有免疫优性的T细胞表位基因进行串联后与保护性抗原基因ORF2融合表达，期望融合表达蛋白能够有效刺激机体产生高水平中和抗体以及能够增强靶动物的体液免疫和细胞免疫水平。

细胞免疫调节在清除病毒感染过程中发挥了重要的作用,近年来，PCV2ORF1和ORF3的具有免疫显性的T细胞表位已经被鉴定。Stevenson等研究PCV2T细胞抗原表位（T lymphocyte epitope，TCE）时,采用合成线性的含有20aa的多肽，通过动物试验测定它们诱导外周血液单核细胞中T淋巴细胞的增殖能力，筛选获得了3个具有免疫优势的多肽片段，分别是由PCV2ORF1编码的2个多肽(第81～100位和201～220位氨基酸),由PCV2ORF3编码的另一个多肽(第31～50位氨基酸)。另外Stevenson等（2007）的研究还发现T淋巴细胞反应主要是针对PCV2的ORF1和ORF3基因编码的非结构蛋白。目前大量研究结果表明，具有保护性抗原基因与多表位基因融合具有协同作用，能诱导更好的体液免疫和细胞免疫。因此，如何构建具有良好免疫原性的T细胞表位基因表达载体，生产更有效的疫苗来控制PCV2相关疾病是一个亟需解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与人工化学法合成的具有免疫显性的三个T细胞表位串联基因TCE（位于PCV2的ORF1基因81-100aa,201-220aa区域和位于PCV2的ORF3基因上31-50aa区域）融合连接后重组至腺病毒载体后获得，该重组腺病毒rAd-ORF2-TCE在提高T淋巴细胞增殖水平及特异性抗体表达的同时，还可以显著提高细胞因子IFN-γ、IL-2的含量，具有更好的免疫效果。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与TCE基因融合连接后重组至腺病毒载体获得的。

本发明首要的问题是阐明PCV-ORF2与TCE基因至腺病毒载体后的成功表达及其免疫学活性。因此，腺病毒穿梭载体的成功构建成为本研究是否成功的关键和前提条件。我们在总结前人研究的基础上，将重叠延伸PCR法将PCV-ORF2基因与TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合，取得两个基因同时高效表达的效果。

本发明的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，采用重叠延伸PCR法将ORF2基因与TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合，得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，再重组至腺病毒载体。该融合基因重组腺病毒后转染AD293细胞，在该细胞中融合表达，使猪圆环病毒的ORF2基因的免疫原性加强，能够有效提高动物机体体液免疫和细胞免疫水平。

本发明的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，具体的一种构建过程可如下述：以细胞培养物中抽提的PCV2基因组DNA作模板，PCR扩增出ORF2基因，以人工化学法合成TCE基因，然后分别将这两个基因克隆到pMD18-T Simple Vector中并鉴定；再采用重叠延伸PCR法将ORF2和TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，获得重组腺病毒转移载体pShuttle-CMV-ORF2-TCE。将获得的转移载体pShuttle-CMV-ORF2-TCE经线性化后，转化携带腺病毒载体骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞，再抽提同源重组质粒，转化DH5a感受态细胞，再抽提无内毒素同源重组质粒，线性化后在脂质体介导下转染AD293细胞得所述重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，重组腺病毒rAd-ORF2-TCE经过至少3轮噬斑纯化。获得的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE作为在猪圆环病毒相关疾病的疫苗。

本发明将PCV2的主要免疫原性蛋白ORF2与TCE基因融合后在腺病毒中成功表达，获得的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE免疫小鼠试验，结果表明该重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能有效刺激机体产生高水平特异性抗体以及刺激机体产生T淋巴细胞增殖，血清中IFN-γ以及IL-2浓度均获得显著性提高，与单独PCV2的ORF2相比，动物机体的体液免疫和细胞免疫水平均获得显著性提高。

附图说明

图1是本发明实施例转移载体的构建过程；

图2是ORF2-linker的扩增结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000;1：阴性对照；2-4：ORF2-linker基因的PCR产物；

图3是linker-TCE基因的扩增结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000；1：阴性对照；2-4：TCE-linker基因的PCR产物；

图4是ORF2-TCE的扩增结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000;1-4：ORF2-TCE基因的PCR产物；5：阴性对照；

图5是重组质粒pMD18-T-ORF2-TCE的BglⅡ、HindⅢ双酶切鉴定结果，其中M：DNA分子质量标准DL2000；1-3：pMD18T-ORF2-TCE的双酶切产物；4：重组质粒pMD18-T-ORF2-TCE；

图6是重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE的BglⅡ、HindⅢ双酶切鉴定，其中M：DNA分子质量标准DL5000；1-2：重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE；3-4：pShuttle-CMV-ORF2-TCE的双酶切产物；

图7是本发明实施例重组载体的构建过程；

图8是重组质粒pAd-CMV-ORF2-TCE的PacⅠ酶切鉴定，其中M1:DNA分子质量标准DL15000；1-4：pAd-ORF2-TCE的PacⅠ酶切产物；5-6：重组质粒pAd-ORF2-TCE；

图9是pAd-CMV-ORF2-TCE转染AD293细胞后出现的CPE，其中A:有CPE的AD293细胞；B:正常AD293细胞；

图10是重组腺病毒rAd-CMV-ORF2-TCE的一步法RT-PCR鉴定，其中M：DNA分子质量标准DL2000；2，3代表第2代病毒；5，6代表第5代病毒；8，9代表第10代病毒。2，5，8以P1和P4为引物，3，6，9以P3和P4为引物；2，5，8是0RF2-TCE一步法RT-PCR扩增产物；3，6，9是TCE基因一步法RT-PCR扩增产物；

图11是rAd-CMV-ORF2-TCE表达产物的Western blot鉴定，其中1-2：重组腺病毒rAd-ORF2-TCE转染的AD293细胞；3：感染无外源基因的重组腺病毒转染的AD293细胞；M：预染彩虹低分子标准蛋白Maker;

图12是间接免疫荧光试验检测结果，其中A:重组腺病毒转染的AD293细胞；B:正常细胞；

图13是免疫小鼠后抗体检测水平，其中上标字母“a”表示在同一时期与其他组比较抗体增长水平差异显著（P<0.05）；

图14是小鼠外周血CD3+T淋巴细胞动态变化结果，其中同一组上标不同字母表示差异显著（P<0.05）；

图15是小鼠外周血CD4+T淋巴细胞动态变化结果，其中同一组上标不同字母表示差异显著（P<0.05）；

图16是小鼠外周血CD8+T淋巴细胞动态变化结果，其中同一组上标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

一、重组腺病毒rAd-ORF2-TCE转移载体的构建

参照NCBI已发表的PCV2ORF2基因序列与人工合成的TCE的基因序列，应用软件Primer5.0设计了以下两对引物，由上海英俊公司合成，用于扩增目的基因片段。

P1（如SEQ ID NO.2所示）:5-GAAGATCTATGACGTATCCAAGGAGGCG-3为ORF2上游引物，划线部分为BglⅡ酶切位点；

P2（如SEQ ID NO.3所示）:5-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACC GCCACCAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3为ORF2下游引物，划线部分为编码15个氨基酸的疏水性多肽(Gly4Ser)3linker序列；

P3（如SEQ ID NO.4所示）:5-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTG GCGGCAGCATGTGCCACATCGAGAAAGC-3为TCE上游引物，划线部分与P2的linker序列反向互补；

P4（如SEQ ID NO.5所示）：5-CCCAAGCTTTTAGGGAAAATGCAGAAGCG-3为TCE下游引物，其中划线部分为HindⅢ酶切位点。

以细胞培养物中抽提的PCV2基因组DNA作模板，PCR扩增出ORF2基因，以人工合成的TCE的基因序列，通过PCR法获得TCE基因，然后分别将这两个基因克隆到pMD18-T Simple Vector中并鉴定。采用重叠延伸PCR法将ORF2和TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合得融合基因ORF2-TCE SEQ ID NO.1，核苷酸序列如下：

ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACGCACGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTATCAGGCGAACCACAGTCAAAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCCGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTATGGGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCTGCCACATCGAGAAAGCGAAAGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGTGGCAAGTGGTGGGATGGTTACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTATGGCTGGGGTGGCCCCAGGTGGCCCCACAATGACGTGTACATTGGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCTAA

ORF2-TCE融合基因经限制性内切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，获得pShuttle-CMV-ORF2-TCE。具体过程如图1和下述。

1、ORF2-TCE融合基因的扩增

以P-ORF2，P-TCE为模板，对扩增的PCR产物电泳，得到分别为744bp（699+45），198bp的条带，见图2，3。以ORF2-linker,TCE-linker为模板，采用重叠延伸PCR法将ORF2和TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合得融合基因ORF2-TCE并进行PCR扩增,电泳，得到条带为942bp，见图4。

2、ORF2-TCE基因的T/A克隆

BglⅡ、HindⅢ双酶切重组质粒pMD18-T-ORF2-TCE，结果获得大小约为2692bp及942bp的两个片段，见图5。

3、重组腺病毒转移载体pShuttle-CMV-ORF2-TCE的构建

BglⅡ、HindⅢ双酶切鉴定重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE结果均获得大小近7500bp和942bp的两个片段，见图6。

二、重组腺病毒载体pAd-CMV-ORF2-TCE构建和重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的获取

将获得的转移载体pShuttle-CMV-ORF2-TCE经线性化后，转化携带腺病毒载体骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞，再抽提同源重组质粒，转化DH5a感受态细胞，再抽提无内毒素同源重组质粒，线性化后在脂质体介导下转染AD293细胞得所述重组腺病毒rAd-ORF2-TCE。具体过程见图7及下述。

1、重组腺病毒载体pAd-CMV-ORF2-TCE的构建

菌液PCR鉴定检测到大小约为942bp的基因片段,抽提同源重组质粒pAd-CMV-ORF2-TCE，用PacⅠ酶切得到约23kb、4.5kb两个片段见图8,与预期的酶切片段大小相符，重组腺病毒载体pAd-CMV-ORF2-TCE构建成功。

2、重组腺病毒载体pAd-CMV-ORF2-TCE的包装及鉴定

将PacⅠ线性化后的重组腺病毒pAd-CMV-ORF2-TCE转染AD293细胞，10d左右细胞出现明显的细胞病变(CPE)，而对照未见有明显变化（图9）。重组病毒液处理后，PCR扩增及从重组病毒液提取总RNA，反转录后，分别P1/P4和P3/P4为引物进行PCR扩增，分别扩增出与ORF2-TCE、TCE长度相符的片段既大小约942bp，198bp的片段，见图10。

3、Western blot：处理的病毒储液经SDS-PAGE电泳转印显色，重组腺病毒rAd-CMV-ORF2-TCE在约65ku处有一条明显的条带，而正常的AD293细胞对照则没有（图11所示），说明重组腺病毒在细胞中得到了表达。

4、间接免疫荧光试验：通过间接免疫荧光试验，接种pAd-CMV-ORF2-TCE的细胞发出明显的绿色荧光，而正常细胞对照则无，见图12。

5、重组腺病毒的TCID₅₀的测定用DMEM维持液将纯化后的第5代病毒作10倍梯度稀释，由10^-3稀释到10^-13，分别接种于长满AD293细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔100微升，同时设定8孔对照孔。5%CO2，37℃静置培养7d，观察病变，按Reed-Muench法，计算病毒TCID₅₀为10^10.2/ml。

6、动物试验：取SPF级PCV-2抗体阴性6-8周龄BALB/c小鼠,随机分成4组，每组15只。接种重组腺病毒病毒量为10⁸TCID₅₀，其中第1组为实验组接种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，第2组接种重组腺病毒rAd-ORF2，第3组接种腺病毒空载体，第4组注入DMEM培养基,均为肌肉注射。在初次免疫后第2周,加强免疫一次。分别于首次免疫后7天，14天，21天，28天，35天，42天采血,分离血清，用间接ELISA方法测定抗体效价检测PCV2特异性抗水平，流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的测定，双抗夹心ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ，IL-2的含量。分别见图13，14，15，16以及下表1和表2。结果表明，本发明重组腺病毒能有效刺激机体产生高水平特异性抗体以及刺激机体产生T淋巴细胞增殖，血清中IFN-γ以及IL-2浓度均获得显著性提高，与单独PCV2的ORF2相比，动物机体的体液免疫和细胞免疫水平均获得显著性提高。

表1.不同时期血清中IFN-γ的浓度

表2.不同时期血清中IL-2的浓度

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与三个T细胞表位串联基因TCE融合连接后重组至腺病毒载体获得的。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，所述ORF2基因以细胞培养物中抽提的PCV2基因组DNA作模板，PCR扩增获得；所述TCE基因是参照GeneBank发表的PCV2基因序列，以人工化学法合成。

3.如权利要求2所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，所述ORF2基因和TCE基因分别克隆到pMD18-T Simple Vector中并进行鉴定。

4.如权利要求3所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，其是采用重叠延伸PCR法将ORF2基因与TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合，得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，再重组至腺病毒载体获得的。

5.如权利要求4所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，重组腺病毒rAd-ORF2-TCE获得过程中，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经限制性内切酶消化后定向克隆至pShuttle-CMV，获得重组腺病毒转移载体pShuttle-CMV-ORF2-TCE。

6.如权利要求5所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，重组腺病毒获得过程中，将获得的转移载体pShuttle-CMV- ORF2-TCE经线性化后，转化携带腺病毒载体骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞，再抽提同源重组质粒，转化DH5a感受态细胞，再抽提无内毒素同源重组质粒，线性化后在脂质体介导下转染AD293细胞即得所述重组腺病毒rAd-ORF2-TCE。

7.如权利要求6所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其特征在于，所述重组腺病毒rAd-ORF2-TCE经过至少3轮噬斑纯化。

8.权利要求1-7任一项所述的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE在猪病毒性免疫疫苗中的应用。

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