TW200938630A - Humanized antibodies specific for von willebrand factor - Google Patents

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TW200938630A
TW200938630A TW098102855A TW98102855A TW200938630A TW 200938630 A TW200938630 A TW 200938630A TW 098102855 A TW098102855 A TW 098102855A TW 98102855 A TW98102855 A TW 98102855A TW 200938630 A TW200938630 A TW 200938630A
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TW
Taiwan
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seq
antibody
binding fragment
anthropomorphic
vwf
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TW098102855A
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English (en)
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Elias Lazarides
Catherine Woods
Xiao-Min Fan
Samuel Hou
Harald Mottl
Stanislas Blein
Martin Bertschinger
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Glenmark Pharmaceuticals Sa
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Publication date
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Description

200938630 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 -[0001] 本發明一般關於具有馮威里氏因子特異性之擬人化抗 -體或其結合片段，尤有關於包含CDRs之具有馮威里氏因子特異 性之擬人化抗體或其結合片段，該CDRs對應至存在於鼠類 NMC-4 中之 CDRs 〇 【先前技術】 [0002] 血小板附著至血管創傷部位之調節涉及若干蛋白質之 © 協調良好之交互作用’且其在止血及血栓形成兩方面均扮演重要 角色。一種促成血小板附著之此類蛋白質為馮威里式因子 (vWF )，存在於血漿中之大型多體（multimeric )醣蛋白。假說 認為.vWF可經由其A1領域（domain)而與血小板受體GPIb_a 產生父互作用，藉此促進血小板滾動及附著（Μ〇α]^ et ai (1986) j Clin. Invest 78:1456-61)。在血小板滾動及附著之後，可形成導致 出血停止之血小板/纖維蛋白凝塊（platelet/flbrinplug);然而，過 度的血小板及/或凝血反應可能導致病理性血栓狀態。 [〇〇〇3] 假若現今針對抑制血小板活化（例如GpIIbIIIa、ADp ❹ 嗳體、環加氧酶（cyclo-oxygenase)或磷酸二酯酶拮抗劑 (phosphodiesterase antagonist))或凝血（例如凝血酶及Xa因子 抑制劑）之治療方式與出血併發症相關聯，則有需要開發出在不 嚴重削弱止血反應之情況下而能夠實質上抑制血栓形成之劑型。 【發明内容】 [0004] 本發明一般關於具有人類冯威里氏因子（VWF )特異性 之擬人化抗體或其結合片段、其製備及使用方法，包含vWp媒介 疾病或異常之治療方法。具有人類vWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段可包含來自非人類紐之蚊區（_plementa卿、 determining regions，CDRs)(例如老鼠 CDRs)及人類架構區（human 200938630 framework regions ) ° [0005] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 •段，包含如SEQroN0: 19中所示之重鏈變異區（heavy^hain • variableregion)序列及如SEQIDNO: 28中所示之輕鏈變異區 (light chain variable region)序列。 [0006] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含如SEQ ID NO: 237中所示之重鏈序列及如SEQ ID N〇: 238中所示之輕鍵序列。 [0007] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含：⑻重鏈及輕鏈互補決定區（CDRs)，其對應至存在於 鼠類抗體NMC-4重鏈及輕鏈變異區（分別為SEq ID N〇:丨及2) 中之CDRs ; (b)重鏈架構區及/或輕鏈架構區，前者對應至存在於 VH4-59衍生人類抗體（例如抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)) 之變異區中之架構區，後者對應至存在於人類抗體AAK94808(VL 018) (SEQ ID NO: 6)之變異區中之架構區。
[0008] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8 )，及/或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )。 © [0009] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，&#ίΚΧ)ί11:〇ϊ?8ΙΤϋΥ〇ν〇(3Ε(3Κ)ΝΟ:7)，ΪΚΊ)Κ2·· MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO: 8 ) , HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO·· 9 )，以及來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。 [0010] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列輕鏈CDRs其中一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) ' LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO·· 12)。 [0011] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列輕鏈 CDRs: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 200938630 10)、LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO·· 12)。在某些實施例中，擬人化抗體或 * 其結合片段可更包含：來自人類抗體AAK94808 (SEQIDNO:6) 、 之變異區之輕鏈架構區。 [0012] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含：重鏈 CDRs，HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7)、 HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)、及 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);及輕鏈001^，1^0111: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) ' LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。在某些實施 例中’擬人化抗體或其結合片段可更包含來自人類抗體AAK94808 (SEQ ID NO: 6)之變異區之輕鏈架構區、及/或來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。 [0013] 本發明提供具有VWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含下列重鏈變異區其中一者以上：H2(SEQIDNO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14) ' H5 (SEQ ID NO: 15) > H6 (SEQ ID NO: 16) ' H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、 H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。 〇 [0014] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含下列輕鏈變異區其中一者以上·· L5(SEQIDNO:23)、L4 (SEQ ID NO: 24) ' L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO·· 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。 [0015] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含(1)下列重鏈變異區其中一者以上：H2(SEQIDNO: 13)、 H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO·· 16)、 H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、 H12 (SEQ ID NO·· 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO·· 145)、或 H16 (SEQ ID NO]46);及(2)下 5 200938630 列輕鏈變異區其中一者以上:L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24) ' L6 (SEQ ID NO: 25) ' L7 (SEQ ID NO: 26) ' L8 (SEQ ID NO: -27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。
' [0016] 舉例而言，擬人化抗體或其結合片段可包含：L5 (SEQ ID NO: 23)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H4 (SEQ ID NO: 14); L5 (SEQ K) NO: 23)及 H5 (SEQ ID NO: 15); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H6 (SEQ ID NO: 16); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H7 (SEQ ID NO: 17); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H8 (SEQ ID NO: 18); L4 (SEQ ID NO: 24)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L6 (SEQ ID NO: 25)及 H2 (SEQ ❹ ID NO: 13); Lll (SEQ ID NO: 30)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L7 (SEQ ID NO: 26)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L8 (SEQ ID NO: 27)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L7 (SEQ ID NO: 26)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L6 (SEQ ID NO: 25)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L4 (SEQ ID NO: 24)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L10 (SEQ ED NO:29)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H12 (SEQ ID NO: 20); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H13 (SEQ ID NO: 21); L9 (SEQ ID NO: 28)及H14 (SEQ ID NO: 22); Lll ❹ （SEQ ED NO: 30)及 H9 (SEQ ID NO: 19);或 LI 1 (SEQ ID NO: 30) 及 H14 (SEQ ID NO·· 22)。 [0017] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含⑴下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGYD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)，及/或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);及(2)下列輕鏈 CDRs 其中 一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。在某些實施例中，擬人化抗體或其結合片段可更包含 來自人類抗體AAK94808 (SEQIDNOJ)之變異區之輕鏈架構 200938630 區、及/或來自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO: 4)之變異區之 重鏈架構區。 -[0018] 本發明提供如此處所述之結合至vWF之擬人化抗體或 .結合片段’其對vWF具有1〇_以下的親和力（Kd)，較佳為5nM 以下’ InM以下尤佳’最好為至少約〇2nM至約04ηΜ。本發 明亦提供如此處所述之可競爭結合至vWF之擬人化抗體或結合片 段’其具有100 nM以下的親和力（κ〇,較佳為50 nM以下，1〇 nM 以下尤佳’最好為至少約〇 2nM至約5.0nM。 [0019] 本發明亦提供結合至VWF之A1領域之擬人化抗體或 結合片段，其對vWF具有ΐ〇πΜ以下的親和力（Kd>較佳為5nM 以下’ 1 nM以下尤佳’最好為至少約〇 2 nM至約0.4 nM。本發 明亦提供可競爭結合至vWF之Α1領域之擬人化抗體或其結合片 段，其對vWF具有ΙΟΟηΜ以下的親和力（Ki)，較佳為50nM以 下，10nM以下尤佳，最好為至少約0 2nM至約5.0nM。 [0020] 本發明亦提供Fab片段熱穩定性溫度大於65。(：之擬人 化抗體或結合片段。 [0021] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含：HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7)，HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 〇 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9);及輕鏈 CDR1、輕鏈 CDR2 及 LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO·· 12)，附帶條件為 LCD1 及 /或LCD2至少其中一者分別不為SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) 或 YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)。 [0022] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含：HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ Π) NO: 7)，HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11)及 LCDR3 (QQYEKLPWT;SEQIDNO: 12);對應至人類抗體生殖細胞株族 (germlinefamily) VH4之架構區1，2,及3之架構區1，2,及3 ; 7 200938630 以及對應至人類抗體生殖細胞株族VK1之架構區1，2,及3之架 構區1，2,及3。 [] 本發明一般亦關於分離核酸（isolatednucleic acid)，豆 編，本發騎揭露之具有人類vWF特異性之擬人化抗體。在某些 實施例中，载體（vect〇r)可包含本發明所揭露之核酸；在另一實 施例中，寄主細胞（hostcell)可包含所揭露之核酸。 [0024]本發明一般亦關於具有vWF特異性之擬人化抗體之製 造方法，包含：培養本發明之寄主細胞，使得核酸被表現並產生 抗體。在某些實_巾，該方法更包含自寄主細胞培養液（cultoe)
Ο 回收抗體；在某些實施例中’抗體係自寄主細胞培養基（medium) 加=回收；在某些實施例中，於培養之前，係以包含編碼重鏈變 異區之核酸之載體及包含編碼輕鏈變異區之核酸之載體it同感染 寄主細胞。 八' [^°15]本發明一般關於包含具有VWF特異性之擬人化抗體及 醫藥上可接受載劑（Ph_aceutically acceptable carrier)之組成物。 [0026]本發明亦提供包含如此處所述之第一擬人化抗體或其 結合片段、及結合至vWF之A1領域之第二抗體。在某些實施例 中，第二抗體為AJW200。 [0027]本發明一般亦關於在受試者（例如病患）上之vWF媒 介疾病或異常之治療方法，其係藉由給予該受試者有效治療量之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其片段。在某些實施例中，受試 者為人類；在某些實施例中，有效治療量足以抑制血小板聚集但 並不足以引發明顯之出血臨床症狀。 ^ [0028] β本發明亦提供使用如此處所述之擬人化抗體或其結合 片段作為樂劑；本發明亦提供使用如此處所述之擬人化抗體或其 結合片段以製備vWF齡疾減異f之處理細。在紐實施例 中，有效治療量足以抑制血小板聚集但並不足以引發明顯之出血 臨床症狀。 [002¾ 在某些實施例中，vWF媒介疾病或異常為血栓性疾病 或異常；在·實施射’血栓㈣常為心血f賴或例如局部 8 200938630 缺血=中風（ischemic stroke)之腦血管疾病；在某些實施例中， 心血笞疾病為動脈粥狀硬化症（ather〇scier〇sis)、血管再阻塞 -(restenosis)、心絞痛（angilia)、急性心肌梗塞（acutemy〇cafdial • infarction)急性冠狀動脈症或與糖 尿病（diabetes)相關聯之心血管異常；在某些實施例中，血栓性 疾病或異常為血管發炎、靜脈血栓、鐮刀形血球疾病、異體移植 排斥（xenograft rejection )、末梢企管疾病（pej^pheral vascular disease )、栓塞性企小板減少性紫瘋症(如〇她〇此 purpura)、囊腫纖維化（cystic fibrosis)、血管性失智症（vascuiar ❿ dementla)、雷諾氏症（Raynaud，s disease)、類風溼性關節炎 (rheumatoid arthritis)、或糖尿病；在某些實施例中，腦血管疾病 為血管性失智症（vasculardementia)、局部缺血性中風（ischemic stroke)、或再發性中風（recurrentstr〇ke)。 [0030] 在某些實施例中，具有vWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段缺乏效應子（effector)功能；在某些實施例中，擬人化 抗體包含源自於IgG4之Fc區。 [0031] 在某些實施例中，具有vWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段結合至馮威里氏因子之A1領域。 [0032] 在某些實施例中’具有vWF特異性之抗體結合片段為 ® Fab，Fab’，Fab’-SH，Fv，scFv, F(ab’)或雙鏈抗體（diabody )。 [0033] 在某些實施例中’具有vWF特異性之抗體結合片段不 為 Fab。 [0034] 在某些實施例中’具有vWF特異性之擬人化抗體為全 長抗體（fUll length antibody ) 〇 [0035] 在某些實施例中’擬人化抗體可包含HCDR1中之一個 以上之取代基’例如F27Q L29I，T30S及/或V34W取代基；在某 些實施例中’擬人化抗體可包含HCDR2中之一個以上之取代基， 例如S61P及/或A62S取代基；在某些實施例中，擬人化抗體可包 含LCDR1中之一個以上之取代基，例如S24Q，N30S及/或K31N 取代基；在某些實施例中，擬人化抗體可包含LCDR2中之一個以 200938630 上之取代基’例如Y50D，T51A，S53N, H55E及/或S56T取代基。 在某些實施例中’擬人化抗體可包含：〇)在HCDR1中之一個以 上之取代基，例如F27Q L29I, T30S及/或V34W取代基；（2)在 HCDR2中之一個以上之取代基，例如S61p及/或A62S取代基； (3)在LCDR1中之一個以上之取代基，例如S24q，N3〇s及/或K3m 取代基;及(4)在LCDR2中之一個以上之取代基，例如Y5〇D, T51A， S53N，H55E 及/或 S56T 取代基。 ’ 【實施方式】 [0047] 本發明提供具有人類馮威里氏因子（VWF)特異性之擬 人化抗體或其結合片段，包括具有對應於存在於鼠類抗體NMC-4 中之一個以上CDRs或部分CDRs之CDR區者;NMC-4抗體結合 vWF之A1領域上之GPIb-α結合部位（見例如Fujimura et ai，Bi〇〇d， 77:113-20,1991 ； Shima et al,J Nara Med Assoc., 36:662 1985) 〇 ^ 〇 發明之擬人化抗體可更包含修飾或未修飾人類架構區i例如對應 至人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區中之架構區的 重鏈架構區及對應至人類抗體AAK94808 (SEQ ID NO. 6)之變異 區中之架構_輕鏈雜區。有極㈣人_祕被視為顧^ CDRs之可能受體分子，包含對鼠類_€_4重鏈及輕鍵區所屬之 亞科（subfamily)展現高度同源性者；最令人意外地，在盔額 ^變之情況下而將NMC-4 CDRs移植至所選擇之重鏈變異區人類 ，構其中一者及輕鏈變異區人類架構其中一者上足以維持擬人化 抗體在阻斷vWF媒介血小板應答上之潛力。 1^048] 「喪合抗體」一詞包含變異區序列源自於一種而恆定區 2自於另-種之抗體，例如變異區序聰自於錢抗體 疋區序列源自於人類抗體之抗體。 [ΓΓ] 「擬人化抗體」一詞包含其巾已經將源自於另-哺乳動 物種別（例如老鼠）之生殖細胞株之CDR序列移植至人 f i之抗體。在人齡構序狀源自於另—哺 細胞株之CDR序列内可對架構區進行額外修改。 200938630 [0050] 「人類抗體」一詞包含具有其中架構區及CDR區兩者 係源^於人類生殖細胞株免疫球蛋白序列之變異區的抗體；此 •外，右抗體包含恆定區（constant region )，則恆定區亦源自於人類 •生殖細胞株免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包含未由人類 •生殖細胞株免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基（例如由體外（ώ vitro) j機或特定部位（site_speciflc)誘發突變（圆也明此咖）所 導入之突變），然而，如此處所使用之名詞「人類抗體」並不包含 已將源自於另-哺乳動物種別（例如老鼠）之生殖細胞株之cdr 序列移植至人類架構序列上的抗體。 [0051]如此處所使用者，若抗體之變異區係得自於利用人類生 〇 殖細胞株免疫球蛋白基@之系統，則人類抗體包含「源自於」特 ^生殖細胞株序列之重鏈或輕鏈變異區。此種系統包含利用相關 抗原使帶有人類免疫球蛋白基因之基因轉殖（加郎纪而此⑽）老 鼠免疫’或者利用相關抗原來篩選顯示於嗟菌體上之人類免疫球 蛋白基因庫。藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖細胞株 免疫球蛋白之胺基酸序列，並選擇在序列上最接近（最大相同％) 人類抗體序列之人類生殖細胞株免疫球蛋白序列，可如此識別出 「源自於」人類生殖細胞株免疫球蛋白序列之人類抗體。例如， 由於自然發生之體細胞突變或有意的導入定點突變（site_directed ❹ mutati〇n ) ’「源自於」特定人類生殖細胞株免疫球蛋白序列之人類 抗體可能含有相較於生殖細胞株序列之胺基酸差異；然而，在胺 基酸序列上，所選擇之人類抗體或其片段一般而言至少有與 由人類生殖細胞株免疫球蛋白序列所編碼者相同，且包含在與其 他種別之生殖細胞株免疫球蛋白胺基酸序列（例如鼠類生殖細胞 株序列）相較時將人類抗體識別為人類之胺基酸殘基。在某些情 況下’人類抗體之胺基酸序列可以有至少9〇〇/0、或甚至至少95%, 96%, 97%，98%，或 99%與由包含例如 80%，81%, 82%, 83%，84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%，98%，99%，及100%之生殖細胞株免疫球蛋白基因所編碼之 胺基酸序列一致性。 11 200938630 [0052] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段（例如 Fab，Fab’，Fab’-SH，Fv, scFv，F(ab，)2,雙鏈抗體或單鏈抗 體），包含如SEQIDN〇: 19中所示之重鏈變異區序列及如犯卩仍 N0: 28中所示之輕鏈變異區序列；本發明亦提供具有vWp特異性 之擬人化抗體或其結合片段，包含如SEq ID N〇: 237中所示之重 鏈序列及如SEQ ID NO: 238中所示之輕鏈序列。 [0053] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段’包含⑴下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2:
MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)，及/或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);及(2)下列輕鏈 CDRs 其中 一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN(SEQIDNO: 10)，LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11),及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 [0054] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含⑴下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ED NO: 7), HCDR2:
MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)，及/ 或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO·· 9);或(2)下列輕鏈 CDRs 其中 ⑩ 一者以上·· LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)，LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11),及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 [0055] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含⑴重鏈 CDRs，HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8), A HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);及(2)輕鏈 CDRs, LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11),及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 [0056] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含⑴重鏈 CDRs, HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ Π) NO: 7), 12 200938630 HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8), JSi HCDR3： DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);或(2)輕鏈 CDRs，LCDRl: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 [0057] 在某些實施例中’擬人化抗體或其結合片段可包含重鏈 變異區架構區，其中該架構區包含存在於來自人類VH4家族之抗 體中之重鏈架構序列（例如架構1 (FW1)、架構2 (FW2)、架構 3 (FW3)、及/或架構4 (FW4))。
❹ [0058] 在某些實施例中，擬人化抗體或其結合片段可包含輕鏈 變異區架構區’其中該架構區包含存在於來自人類¥]〇家族之抗 體中之輕鏈架構區序列（例如架構1 (FW1)、架構2 (FW2)、架 構3 (FW3)、及/或架構4 (FW4))。 [0059] 在某些實施例中，擬人化抗體或其結合片段可包含一個 以上（例如一、二、三、及/或四）存在於來自人類VH4家族之抗 體中之重鏈架構區序列（例如架構1 (FW1)、架構2 (FW2)、架 巧3 (FW3)、及/或架構4 (FW4))、以及一個以上（例如一、二 三、及/或四）存在於來自人類VK!家族之抗體中之輕鏈架構區序 列（例如架構1 (FW1)、架構2 (FW2)、架構3 (FW3)、及/或 架構4(FW4))。 〆 [0060] VH4家族的成員及其個別重鏈架構區丨，2及3包含：
4-〇4 (分別為 SEq π) NO: 147, 148 及 149)，4-28 (分別為 SE0ID NO: 150, 151 及（分別為 SEQn)N〇: 153，‘i54f 分別為卿D N〇:156,157及158), ‘3〇.4 (分別為SEQ仍 .159, 160 及 161),4-31 (分別為 SEQn)N〇: 162, 163 及 16
ίί 別為 SEQID N〇:165,166 及167)，4-39 (分別為 SEQID 4 61 及 17〇)，㈣(分別為卿① N〇: 171，172 及 173)， 另為 SEQ ID NO: m，175 及 176)及 4_b (分別為 N〇. 177, 178 及 179)。 =61] VK1家族的成員及其個別輕鏈架觀^2及3包含： C刀別為SEQE)NO: 180, 181及卿叫分別為SEQ][DN〇: 13 200938630 183, 184 及 185)，018 (分別為 SEQ ID NO: 186, 187 及 188)，08 (分 別為 SEQIDNO: 189, 190 及 191),A20(分別為 SEQIDNO: 192， .193 及 194)’A3〇 (分別為 SEQIDNO: 195, 196 及 197)，L14(分別為 SEQ 10 NO: 198, 199 及 200), L1 (分別為 SEQ ID NO: 201，202 及 203)，L15 (分別為 SEQ ID NO: 204,205 及 206)，L4 (分別為 SEQ ID NO, 207, 208 及 209)，L18 (分別為 SEQ ID NO: 210, 211 及 212), L5 (分別為 SEQ ID NO: 213, 214 及 215)，L19 (分別為 SEQ ID NO: 216, 217 及 218)，L8 (分別為 SEQ ID NO: 219,220 及 221)，L23 (分別為 SEQ ID NO: 222, 223 及 224)，L9 (分別為 SEQ ID NO: 225, 226 及 227)，L24 (分別為 SEQ ID NO: 228, 229 及 230), LI 1 (分別為 SEQ ID NO: 231，232 及 233)及 L12 (分別為 SEQ ID NO: 234, 235 及 236)。
[0062] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO： 8 )，及/或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )。
[0063] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDRl· GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: ❹ 8 )，及/或 HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )以及 來自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構 區。
[0064] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8),及/或 HCDR3:DPADYGNYDYALDY (SEQIDNO:9)以及 來自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構 區’其中該重鍵架構區不包含一個以上之鼠類殘基。
[0065] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含下列重鏈CDRs其中一者以上：HCDR1: GFSLTDYGVD 14 200938630 (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8),&/iHCDR3:DPADYGNYDYALDY(SEQIDNO:9)#& _ 來自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構 區，其中該重鏈架構區更包含一個以上之鼠類殘基。 ' [0066] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列重鏈CDRs其中一者以上:HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8 )，及 HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )。
[0067] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段’包含下列重鏈CDRs其中一者以上:HCDR1: GFSLTDYGVD ❹ (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8)，及 HCDR3:DPADYGNYDYALDY (SEQIDNO:9)以及來 自人類抗體AAC18165.1(SEQIDNO: 4)之變異區之重鏈架構區。
[0068] 本發明亦提供具有VWT特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列重鏈CDRs其中一者以上:HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8),及 HCDR3:DPADYGNYDYALDY (SEQIDNO:9)以及來 自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構 區’其中该重缝架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 D [0069] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列重鏈CDRs其中一者以上:HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7 ), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS( SEQ ID NO: 8)，及 HCDR3:DPADYGNYDYALDY (SEQEDNO:9)以及來 自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO.4)之變異區之重鏈架構 區’其中該重鍵架構區更包含一個以上之鼠類殘基。 [0070] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列輕鏈CDRs其中一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ED NO: 12)。 [0071] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 15 200938630 片段，包含下列輕鍵CDRs其中一者以上：LCDRl: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID .NO: 11)，及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)、以及來自 人類抗體AAK94808 (SEQ ID NO: 6)之輕鏈架構區。 [0072] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段’包含下列輕鍵CDRs其中一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO:11)，A/^LCDR3:QQYEKLPWT(SEQIDNO:12)j^3^ 人類抗體AAK94808 (SEQIDNO: 6)之輕鏈架構區，其中該輕鏈 架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 © [0073] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含下列輕鏈CDRs其中一者以上：LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及/或 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)以及來自 人類抗體AAK94808 (SEQ ID NO: 6)之輕鏈架構區’其中該輕鏈 架構區更包含一個以上之鼠類殘基。
[0074] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含輕鏈 CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT ❹（SEQ ID NO· 12)。 [0075] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含輕鏈 CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)， LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11), A LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)以及來自人類抗體 AAK94808 ( SEQ ID NO: 6 ) 之輕鏈架構區。 [0076] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含輕鏈 CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)以及來自人類抗體 AAK94808 ( SEQ ID NO·· 6 ) 之輕鏈架構區’其中該輕鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 200938630 [0077] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含輕鏈 CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)，
，LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)以及來自人類抗體 AAK94808 ( SEQ ID NO: 6) *之輕鏈架構區，其中該輕鏈架構區更包含一個以上之鼠類殘基。
[0078] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含：重鏈 CDRs HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7)， HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8), A HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);輕鏈 CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID © NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12);以及非必須 地包含來自人類抗體AAK94808 ( SEQ ID NO: 6)之變異區之輕鏈 架構區及/或來自人類抗體AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4)之變異區 之重鏈架構區。 [0079] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段之胺基酸序列變異株（variant)，通常具有VWF特異性之擬人 化抗體或其結合片段之胺基酸序列變異株將包含重鏈及/或輕鏈架 構區之胺基酸序列，其分別有至少80%與例如SEQ ID NO: 19或 SEQ ID NO: 28中之重鏈及輕鏈變異區序列之重鏈或輕鏈的原始 ❹ 擬人化抗體之重鏈及/或輕鏈相同。較佳狀況為重鏈及/或輕鏈架構 區序列之胺基酸序列一致性為至少85%，至少90%更佳，最好至 少95%，尤其96%、更尤其97%、再更特別98%，最特別為99%， 包含例如 80%，81%, 82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%， 90%，91%，92%, 93%，94%，95%，96%, 97%, 98%，99%,及 100%。 此處將關於此序列之相同性及同源性（homology)定義為：在排 列序列及若有必要引進間隙（gap)以完成最大序列相同性之後， 候選序列中與具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段相同之 胺基酸殘基之百分比，如此，可藉由一般用以比較兩多胜肽之胺 基酸之位置相似性的標準方法來決定序列一致性。利用電腦程式 例如BLAST或FASTA ’針對其個別胺基酸之最佳匹配（沿著一 17 200938630 5兩列之全長’或者沿著一或兩序列之預定部分）而排列兩多 ^ μ該程式長1供内疋開放懲割（也色仙opening penalty )及内定 • 懲，（gappenalty)，且可結合電腦程式而使用例如pAM25〇 ^標準得分矩陣；見Dayh〇ffetal.，「蛋白質序列及結構之圖解集」 (Atlas of Protein Sequence and Structure, y〇l 5, supp. 3 (1978))^# 分矩陣’例如可以下列方式計算相同度（percentidentity) ··將相同 匹配之總數乘以100後，再除以匹配跨距（span)内之較長序列之 長度加上為排列兩序列而引進至較長序列中之間隙之數目的總 和° [0080] 因此’本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其 ©結合片段’其中該擬人化抗體或其結合片段包含重鏈變異區序 列:該重鏈變異區序列包含至少8〇%與SEQmNO: 19之架構區 相同之架構區、及/或具有至少8〇%與seq ID NO: 28之架構區相 同之架構區的輕鏈變異區序列。本發明亦提供具有vWF特異性之 擬人化抗體或其結合片段’其中該擬人化抗體或其結合片段包含 重鍵變異區序列，該重鏈變異區序列包含至少8〇%與SEQIDN〇: 237之架構區相同之架構區、及/或具有至少8〇%與SEQIDN〇: 238之架構區相同之架構區的輕鏈變異區序列。 [0081] 擬人化抗體可非必須地包含一個以上之取代基，例如在 ❹HCDR1中之F27Q L29I，T30S及/或V34W取代基；在某些實施例 中’擬人化抗體可包含一個以上之取代基，例如在HCDR2中之 S61P，及/或A62S取代基；在某些實施例中，擬人化抗體可包含一 個以上之取代基，例如在LCDR1中之S24Q，N30S及/或K31N取 代基’在某些實施例中’擬人化抗體可包含一個以上之取代基， 例如在LCDR2中之Y50D，T51A，S53N，H55E及/或S56T取代基。 在某些實施例中’擬人化抗體可包含：（1)一個以上之取代基’例 如在HCDR1中之F27Q L29I, T30S及/或V34W取代基；（2)—個 以上之取代基’包含在HCDR2中之S61P及/或A62S取代基；（3) 一個以上之取代基’包含在LCDR1中之S24Q,N30S及/或K31N 取代基；（4)一個以上之取代基，例如在LCDR2中之Y50D, T51A， 18 200938630 S53N，H55E及/或S56T取代基。 [0082] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片
.段’包含下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQIDNO: 13)、H4(SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)(編碼上述重鏈變異 區之多核苷酸分別由 SEQ ID NOs: 128, 129, 130,131，132, 133， 134, 135 ,136, 137, 138 及 139 加以提供）。 ’ [0083] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片
® 段’包含下列輕鏈變異區其中一者：L5(SEQIDNO:23)、L4(；SEQ
ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)(編碼上述輕鏈變異區之多核苷酸分別由12〇, 121，122, 123, 124, 125, 126,及 127 加以提供）。 ’ [0084] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段，包含：（1)下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQIDNO: 13)、 H4 (SEQ ID NO: 14) > H5 (SEQ ID NO: 15) ^ H6 (SEQ ID NO: 16) > H7 (SEQ ID NO: 17) > H8 (SEQ ID NO: 18) > H9 (SEQ ID NO: 19) ^ ❹ H12 (SEQ ID NO·· 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)(編碼上述 重鏈變異區之多核苷酸分別由SEQ ID NOs: 128,129,130,131， 132, 133, 134, 135，136, 137, 138 及 139 加以提供）；（2)下列輕鏈變 異區其中一者：L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ Κ) NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。 [0085] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片
段，包含：L5 (SEQ ID NO: 23)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L5 (SEQ ID NO· 23)及 H4 (SEQ ID NO 14); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H5 (SEQ ID NO·· 15); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H6 (SEQ Π) NO: 16); L5 (SEQ ID 19 200938630 NO: 23)及 H7 (SEQ ID NO: 17); L5 (SEQ ED NO: 23)及 H8 (SEQ ID NO: 18); L4 (SEQ ID NO: 24)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L6 (SEQ ID NO: 25)及 H2 (SEQ ID NO: 13); LI 1 (SEQ ID NO: 30)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L7 (SEQ ID NO: 26)及 H2 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO·· 28)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L8 (SEQ ID NO: 27)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L7 (SEQ ID NO: 26)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L6 (SEQ ID NO: 25)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L4 (SEQ ID NO: 24)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L5 (SEQ ID NO: 23)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L10 (SEQ ID NO:29)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H12 (SEQ ID NO: 20); L9 (SEQ ❹ ID NO: 28)及 H13 (SEQ ID NO: 21); L9 (SEQ ID NO: 28)及 H14 (SEQ ID NO: 22); LI 1 (SEQ ID NO: 30)及 H9 (SEQ ID NO: 19);或 LI 1 (SEQ ID NO: 30)及 H14 (SEQ ID NO: 22)。
[0086] 本發明提供如此處所述之結合至vWF之擬人化抗體或 結合片段’其對vWF具有l〇nM以下的親和力（Kd)，較佳為5nM 以下’ InM以下尤佳，最好為至少約〇.2nM至約0.4nM (例如 自約0.21，0.28或0.34至約0.25, 0.32或0.38 nM)。本發明亦提供 如此處所述之可競爭結合至VWF之擬人化抗體或結合片段’其對 vWF具有ΙΟΟηΜ以下的親和力（Ki)，較佳為50nM以下，l〇nM 〇 以下尤佳，最好為至少約0.2 nM至約5.0 nM (例如自約0.22, 0.28 或 0.34 至約 2.3, 3.5 或 4.7 nM)。 [0087] 本發明亦提供結合至VWF之A1領域之擬人化抗體或 結合片段’其對VWF之A1領域具有10nM以下的親和力（Kd), 較佳為5 nM以下’ 1 nM以下尤佳，最好為至少約0.2 nM至約0.4 舰（例如自約0.21, 〇_28或〇·34至約0.25, 0.32或0.38 nM)。本發 ，亦提供可競爭結合至vWF之A1領域之擬人化抗體或其結合片 段，其對vWF具有ΙΟΟηΜ以下的親和力（Ki)，較佳為5〇nM以 下，1〇nM以下尤佳’最好為至少約〇.2nM至約5·0ηΜ (例如自 約 0.22, 0.28 或 0.34 至約 2.3, 3.5 或 4.7 nM)。 [〇〇88] 本發明亦提供Fab片段之熱穩定性溫度大於65。(：之擬 200938630 人化抗體或結合片段，較佳為大於70°C，大於75°C尤佳，最好大 於80°C。分析Fab片段熱穩定性係使用微差掃描熱量量測法 ， （differential scanning calorimetry measurement )，而識別出在全長
IgG之上下文（context)中之Fab片段的中點熔融溫度，此類熱量 量測法為熟悉此項技藝者所已知，且可根據例如Garber and Demarest (2007)，BBRC 355:751-7加以實施。令人意外地，吾人已 發現本:發明之擬人化抗體具有大於親代（parent)非擬人化抗體之 Fab片段熱穩定性溫度’該親代非擬人化抗體通常為鼠類抗體，尤 其是鼠類抗體NMC-4。本發明亦提供Fab片段熱穩定性溫度大於 親代非擬人化抗體之具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 ❹段。 [0089] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段’包含下列尚度變異區（hypervariableregion)胺基酸序列：
HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7)，HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9) ； A LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12) ’附帶條件為LCD1及/或LCD2至少其中一者分 別不為 SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)或 YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)。令人意外地，缺乏顧心礼⑶幻及/或LCDR2之擬人 ❹化NMC-A抗體保有對於vWF之毫微莫耳（nanom〇iar)結合親和 力。 [0090] 在某些實施例中’擬人化抗體可更包含人類抗體重鏈架 構區；在某些實施例中，重鏈架構區對應至存在於4_59衍生人類 抗體中之重鏈架構區；在某些實施例中，存在於4_59衍生人類抗 體中之重鏈架構區更包含一個以上之鼠類殘基；在某些實施例 中，存在於4-59衍生人類抗體中之重鏈架構區不包含一個以上之 鼠類殘基。 1^!}]在某些實施例中，擬人化抗體可更包含人類抗體輕鏈架 巧區，在某些實施例中，輕鏈架構區對應至存在於018衍生人類 抗體中之輕鏈架構區；在某些實施例中，存在於018衍生人類抗 21 200938630 體中之輕鏈雜區更包含-個以上之鼠類絲；在某些實施例 中，存在於018衍生人類抗體中之輕鏈架構區不 .鼠類殘基。 e w ^ [0092] LCDR1及/或LCDR2可由人類來源獲得。在某些實施 例中，LCDR1及/或LCDR2可由相同抗體（例如一人類抗體）而 獲得；在其他實施例中，LCDR1及/或LCDR2可由不同抗體（例 如兩人類抗體）而獲得。若LCDR2係得自人類來源，其較佳為 DASNLET (SEQ ID NO: 118)。 [0093] 本發明亦提供具有VWF特異性之擬人化抗體或其結合 片段’包含.HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7)，HCDR2 ❹（MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8)，HCDR3 ’ (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ED NO: 10)，LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11)及 LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQIDNO·· 12);對應至人類抗體生殖細胞株序列 (germline sequence)4-59中之架構區1，2,及3之重鏈架構區1，2, 及 3，其中重鏈架構區 1 為 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 171) ’ 重鏈架構區 2 為 WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 172)，且重鏈架構區3為 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: q 以及對應至存在於人類抗體輕鏈生殖細胞株序列018中之架 構區1，2,及3之輕鏈架構區1，2,及3，其中輕鏈架構區1為 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO: 186)，輕鏈架構區 2 為 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO: 187)，且輕鏈架構區 3 為 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188)。 [0094] 本發明提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片 段，包含：HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7)，HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11)及 LCDR3 22 200938630 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12);對應至人類抗體生殖細胞株序列 4-34中之架構區1，2,及3之重鏈架構區1,2,及3,其中重鏈架構 •區 1 為 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO: 165)， 重鏈架構區 2 為 WIRQPPGKGLEWIG(SEQIDNO: 166)，且重鏈 ' 架構區 3 為 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 167);以及對應至存在於人類抗體輕鏈生殖細胞株序列018 中之架構區1,2,及3之輕鏈架構區1，2,及3，其中輕鏈架構區1 為 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 186)，輕鏈架構 區 2 為 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187)，且輕鏈架構區 3 為 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: ❹ 188)。 [0095] 本發明亦提供具有vWF之A1領域特異性之擬人化抗 體或其結合片段，包含：HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7；)， HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO·· 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11)及 LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12);對應至存在於來自人類抗體生殖 細胞株族（germline family) VH4之抗體中之架構區1,2,及3的 重鏈架構區1,2,及3 ;以及對應至存在於來自人類抗體生殖細胞 ❹株族VK1之抗體中之架構區1，2,及3的輕鏈架構區1，2,及3。 [0096] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-04中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 147)，FW2: WVRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 148)及 FW3: RVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149) )。 [0097] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-28中之架構區1，2,及3的架構區1, 2,及3 (例如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 150) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 151)及 FW3: 23 200938630 RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 152) )〇 • [0098] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-30.1中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 153) ，FW2: WIRQHPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 154)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 155) )〇 [0099] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-30.2中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 © (例如 FW 1: QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 156) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 157)及 FW3: RVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 158) )。 [00100] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-30.4中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ Π) NO: 159) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 160)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: ❹ 161)。 [00101] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-31中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 (^jWFWl:QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS(SEQIDNO: 162)，FW2: WIRQHPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 163)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 164) )。 [00102] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-34中之架構區1, 2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO: 165) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 166)及 FW3: 24 200938630 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 167) )〇 • [00103] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-39中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 168) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 169)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 170) )。 [00104] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-59中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及3 ❹ （例如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 171) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 172)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 173) )〇 [00105] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-61中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 174) ，FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 175)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 〇 176)) = [00106] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於重鏈變 異生殖細胞株序列4-b中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3(例 如 FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS (SEQ IDNO: 177)， FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 178)及 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 179))。 [00107] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 (kappachain)變異生殖細胞株序列〇12中之架構區1,2,及3的 架構區 1，2,及 3 (例如 FW1:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 180), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 181) 25 200938630 及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 182))〇 • [00108] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕键 (kappa chain)變異生殖細胞株序列〇2中之架構區1，2,及3的架 構區 1, 2,及 3(例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ IDNO: 183)，FW2:WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO: 184)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 185))。 [00109] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列018中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 〇 (例如 FWl· DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 186)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188))。 [00110] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鍵 變異生殖細胞株序列08中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 189)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 190)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: ❹ 191))。 [00111] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列A20中之架構區1，2,及3的架構區1,2,及 3 (例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 192)， FW2: WYQQKPGKVPKLLIY (SEQ ID NO: 193)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 194))。 [00112] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列A30中之架構區1,2,及3的架構區1,2,及 3(例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 195), FW2: WYQQKPGKAPKRLIY (SEQ ID NO: 196)及 FW3: 26 200938630 GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 197))。 ’ .[00113] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鍵 變異生殖細胞株序列L14中之架構區1, 2,及3的架構區1，2,及 '3(例如 FW1: NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 198)， FW2: WFQQKPGKVPKHLIY (SEQ ID NO: 199)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 200))= [00114] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鍵 變異生殖細胞株序列L1中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及3 ❹ （例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 201)， FW2: WFQQKPGKAPKSLIY (SEQ ID NO: 202)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 203))。 [00115] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鍵 變異生殖細胞株序列L15中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及 3(例如 FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 204)， FW2: WYQQKPEKAPKSLIY (SEQ ID NO: 205)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: ❹ 206))。 [00116] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鍵 變異生殖細胞株序列L4中之架構區1，2,及3的架構區1,2,及3 (例如 FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 207)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 208)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 209))。 [00117] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L18中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及 3 (例如 FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ED NO: 210)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 211)及 FW3: 27 200938630 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 212))。 .[00118] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L5中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 •(例如 FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 213), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 214)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 215))。 [00119] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L19中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及 ❹ 3(例如 FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 216)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 217)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 218))。 [00120] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L8中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 (例如 FW1·· DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 219)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 220)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: ❹ 221))。 [00121] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L23中之架構區1, 2,及3的架構區1，2,及 3 (例如 FW1: AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 222)， FW2: WYQQKPAKAPKLFIY (SEQ ID NO: 223)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 224))〇 [00122] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L9中之架構區1, 2,及3的架構區1, 2,及3 (例如 FW1: AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC (SEQ ID NO: 225)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ Π) NO: 226)及 FW3: 28 200938630 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC (SEQ ID NO: 227))。 [00123] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L24中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及 3(例如 FW1: VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC (SEQ ID NO·· 228)， FW2: WYQQKPGKAPELLIY (SEQ ID NO: 229)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC (SEQ ID NO: 230))。 [00124] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L11中之架構區1,2,及3的架構區1，2,及3 ❹ （例如 FW1: AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 231)， FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 232)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 233))。 [00125] 擬人化抗體或其結合片段可包含對應至存在於卡帕鏈 變異生殖細胞株序列L12中之架構區1，2,及3的架構區1，2,及 3(例如 FW1: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 234), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 235)及 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (SEQ ID NO: Q 236)) 〇
[00126] 本發明亦提供具有vWF之A1領域之特異性的擬人化 抗體或其結合片段，包含：HCDR1: GFSLTDYGVD (；SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8),^. HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9), LCDR1： SASQDINKYLN (SEQ Π3 NO: 10)，LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12);對應於存在下列人類抗體中之架 構區1, 2及3之重鏈架構區1，2及3-4-04(分別為SEQ ID NO: 147, 148 及 149)，4-28 (分別為 SEQ ID NO: 150, 151 及 152), 4-30.1 (分 別為 SEQ ID NO: 153, 154 及 155), 4-30.2 (分別為 SEQ ID NO: 156, 157 及 158)，4-30.4 (分別為 SEq π) NO: 159, 160 及 161), 4-31 (分 29 200938630 別為 SEQ ID NO. 162, 163 及 164)，4-34 (分別為 SEQ ED NO: 165， 166 及 167), 4-39 (分別為 SEQ ID NO: 168, 169 及 170)，4-59 (分別 .為 SEQ ID N0‘ 171，172 及 173)，4-61 (分別為 SEq jj) N〇: 174, 175 .及176)或抑（分別為SEQK> NO: 177, 178及179);及對應於存在 下列人類抗體中之架構區1，2及3之輕鏈架構區i，2及3 —〇12 (分 別為 SEQ ID NO: 180, 181 及 182)，02 (分別為 SEQ ID NO: 183, 184 及 I85)，018 (分別為 SEQ ID NO: 186, 187 及 188)，08 (分別為 SEQ ID NO. I89, 19〇 及⑼)，a2〇 (分別為 seq id NO: I92, I93 及 I94)， A30 (分別為 SEQ ID NO: 195, 196 及 l97)，LH (分別為 SEQ ID NO: I98, 199 及細)，LI (分別為 SEQ Π) NO: 201，202 及 2〇3), U5 (分 〇 別為 SEQID N0: 204, 2〇5 及 206)，L4 (分別為 SEq n) NO: 207， 208 及 209)，L18 (分別為 SEQ ID NO: 210, 211 及 212)，L5 (分別為 SEQ ID NO: 213, 214 及 215)，L19 (分別為 SEQ ID NO: 216, 217 及 218)，L8 (分別為 SEQ ID NO: 219, 220 及 221)，L23 (分別為 SEQ ID NO: 222, 223 及 224)，L9 (分別為 SEQ ID NO: 225, 226 及 227), L24 (分別為 SEQ ID NO: 228, 229 及 230), LI 1 (分別為 SEQ ID NO: 231， 232 及 233)及 L12 (分別為 SEQ ID NO: 234, 235 及 236)。 [00127] 本發明亦提供如此處所述之具有VWF之A1領域之特 異性的擬人化抗體或其結合片段，其保留與親代非擬人化抗體或 ❹ 包含來自親代非擬人化抗體及人類Fc區之嵌合抗體相同之活性。 親代非擬人化抗體通常為鼠類抗體，尤其為鼠類抗體丽匸_4 ;包 含來自親代非擬人化抗體之散合抗體通常為包含來自鼠類抗體 (尤其來自鼠類抗體NMC-4)之變異區及人類FC區之抗體，較 佳狀況為以本發明所述之人類Fc區作為人類Fc區。 [00128] 親代非擬人化抗體及嵌合抗體之如此處所述之擬人化 抗體或其結合片段的活性’可藉由例如實施例1中所述判定ec5〇 而以瑞斯特黴素（ristocetin)誘導血小板凝集活性加以量測。當如 此處所述之擬人化抗體或其結合片段之活性與EC%活性相同:或 有高達50%、較佳為高達30%、20% (例如更高或更低）不同於 親代非擬人化抗體或嵌合抗體之EQo活性時，如此處所述之擬人 30 200938630 化抗體或其結合片段可被視為保留著與親代非擬人化抗體或嵌合 抗體相同之活性。 • [00129] 在本發明之較佳實施例中，如此處所述之擬人化抗體 或其結合片段更包含來自人類抗體之重鏈架構區，其中人類重鏈 架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 [00130] 在本發明之再一較佳實施例中，如此處所述之擬人化 抗體或其結合片段更包含來自人類抗體之輕鏈架構區，其中人類 輕鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 [0(H31] 「人類重鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基」或「人 類輕鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基」係指不包含一個以上 0僅存在ϋ鼠類巾之魏絲的人類重鏈或輕鏈架構區，例如不包 含回復突變（backmutation)至僅存在於鼠類且不存在於人類中之 殘基。由此定義，並不排除包含亦存在於鼠類中之人類殘基之人 類重鏈或輕鏈架構區；由此定義，亦不排除殘基已突變至一般人 類（例如大多數人類架構區共同之殘基）、但亦存在於鼠類中之人 類重鏈或輕鏈架構區。 [00132]在本發明來自人類抗體之重鏈或輕鍵架構區更包含一 ，以上乳類殘基之實施例情況中，其通常包含個以下之氣類殘 較佳為9個以下，更佳為8個以下，7個以下又更佳，最佳為 ❹6 ^下’ 5個以下尤佳，4個以下更佳，3個以下又更佳，2個以 下最佳，1個尤其最理想。 本發明提供編碼具有VWF 4寺異性之擬人化抗體或其 了口 口去又之分離（1S〇lated)核酸，其包含如SEQIDNO: 19中所 j之重鏈變異區序列及如SEQIDNa 28巾所述之輕鏈變異區序 本發日月提供編瑪具有爾特異性之擬人化抗體或其 之分軸酸，其包含如SEQlDN〇:237中所述之重鏈序 列及如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈序列。 心本發明亦提供編瑪具有VW特異性之擬人化抗體或 —a从之分離嫌，其包含：軸韩在城類抗體觀^ 200938630 中之CDRs之CDR區；對應至存在於人類抗體丨（SEq ID NO: 4)之變異區中之架構區的重鏈架構區；及對應至存在於人 •類抗體AAK94808 (SEQIDNO: 6)之變異區中之架構區的輕鏈架 構區。 [00136] 本發明亦提供編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之分離核酸’其包含：HCDR1: GFSLTDYGVD ( SEQ ID NO: 7 ) ' HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO: 8 ) > HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )、以及來自人類 抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。例示 性人類重鏈架構區之核苷酸序列揭露於SEQ ID NO: 116中。 ❹ [00137] 本發明亦提供編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或
其結合片段之分離核酸，其包含下列輕鏈CDRs—LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) > LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)、及來自人類 抗體AAK94808 ( SEQ ID NO: 6)之變異區之輕鏈架構區。例示性 人類輕鏈架構區之核苷酸序列揭露於SEQ Π)NO: 117中。 [00138] 本發明亦提供編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之的分離核酸，其包含下列重鏈變異區其中一者：H2 (SEQ ID NO: 13) > H4 (SEQ ID NO: 14) > H5 (SEQ ID NO: 15) > H6 ❹（SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、 H14 (SEQ Π) NO·· 22)、H15 (SEQ ED NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。 [00139] 本發明亦提供編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之分離核酸，其包含下列輕鏈變異區其中一者：L5 (SEQ ID NO: 23) ' ΙΑ (SEQ ID NO: 24) > L6 (SEQ ID NO: 25) > L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 LI 1 (SEQ ID NO: 30)。 [00140] 本發明亦提供編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之分離核酸，其包含⑴下列重鏈變異區其中一者：H2 32 200938630 (SEQ ID NO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 • (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、 H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ED NO: 146);及(2)下列輕鏈變異區其中一者：L5 (SEq ID N〇: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ Π) NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。 [00141] 本發明亦提供包含編碼載體（vector) GS264之分離核 酸序列之輕鏈，載體GS264已在2008年1月23日向QJSMZ申請 〇寄存於微生物中，其寄存號碼（accessionNo.)為DSM21059。 [00142] 本發明亦提供包含編碼載體GS265之分離核酸序列之 重鏈’載體GS265已在2008年1月23日向DSMZ申請寄存於微 生物中’其寄存號碼（accessionNo.)為DSM21060。 [00143] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段’其係由編碼載體GS264之核酸序列之輕鏈及編碼載體 GS265之核酸序列之重鏈所編碼。 [00144] 本發明提供包含分離核酸之載體，該分離核酸編碼具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人化抗體或其結 〇 合片段包含如SEQ ID NO: 19中所述之重鏈變異區序列及如SEQ ID NO: 28中所述之輕鏈變異區序列。 [00145] 本發明提供包含分離核酸之載體，該分離核酸編碼具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人化抗體或其結 合片段包含如SEQ ID NO: 237中所述之重鏈序列及如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈序列。 [00146] 本發明提供包含分離核酸之載體，該分離核酸編碼具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人化抗體或其結 合片段包含：對應至存在於鼠類抗體胃^中之cdr^cdr 區，對應至人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區中之 架構區的重鏈架構區；及對應至人類抗體人^948〇8( SEq仍N〇: 33 200938630 6)之變異區中之架構區的輕鏈架構區。 [00147] 本發明亦提供包含核酸之載體，該核酸編碼具有vWF .特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體或其結合片 段包含 HCDR1: GFSLTDYGVD ( SEQ ED NO: 7 )，HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO: 8 )，HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9)，以及來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。 [00148] 本發明亦提供包含核酸之載體，該核酸編碼具有VWF 特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體或其結合片 段包含輕鏈 CDRs—LCDR1: SASQDINKYLNiSEQIDNO: 1〇>、 ❹ LCDR2: YTSSLHS (SEQ HD NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)、及來自人類抗體 AAK94808 ( SEQ ID NO: 6) 之變異區之輕鏈架構區。 [00149] 本發明亦提供包含核酸之載體，該核酸編碼具有VWF 特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體或其結合片 段包含下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQIDNO: 13)、H4(SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ HD NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ED NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 ❹（SEQ ID NO: 145)、或 HI 6 (SEQ ID NO: 146)。
[00150] 本發明亦提供包含核酸之載體，該核酸編碼具有VWF 特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體或其結合片 段包含下列輕鏈變異區其中一者:L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。 [00151] 本發明亦提供包含核酸之載體，該核酸編碼具有VWF 特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體或其結合片 段包含⑴下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQIDNO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 34 200938630 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、 • (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146);及(2)下列輕鏈 變異區其中一者：L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 LI 1 (SEQ ID NO: 30)。 [00152] 本發明亦提供包含分離核酸之載體，該分離核酸包含 編碼載體GS264之分離核酸序列之輕鏈，載體GS264已在2008 年1月23曰向DSMZ申凊寄存於微生物中，其寄存號碼(accessi〇n No.)為 DSM21059。 ® [00153] 本發明亦提供包含分離核酸之載體，該分離核酸包含 編碼載體GS265之分離核酸序列之重鏈，載體GS265已在2008 年1月23曰向DSMZ申請寄存於微生物中，其寄存號碼( accession
No.)為 DSM21060。 [00154] 本發明提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸編 碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體 或其結合片段包含如SEQ ID NO·· 19中所述之重鏈變異區序列及 如SEQ ID NO: 28中所述之輕鏈變異區序列。 [00155] 本發明提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸編 ❹碼具有溯7特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗體 或其結合片段包含如SEQ ID NO: 237中所述之重鏈序列及如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈序列。 [00156] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合#段，喃擬人化抗 體或其結合段包含：對應至存在於鼠類抗體_^_4内之CDRs 之CDR區；對應至存在於人類抗體丨（seqidn〇:4) 之變異區十之架構區的重鏈架構區；及對應至存在於人類抗體 ==808 (SEQIDN0:6)之變異區中之架構區的輕鏈架構區。 L £丄本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞’該分離核酸 、，石〜、vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗 35 200938630 體或其結合片段包含：HCDRl: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7)、 HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO: 8 ) ' HCDR3: .DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )、以及來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。 [00158] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗 體或其結合片段包含下列輕鏈CDRs —LCDR1: SASQDINKYLN (SEQIDNO: 10)、LCDR2:YTSSLHS(SEQIDNO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)、及來自人類抗體 AAK94808( SEQ ID NO: 6)之變異區之輕鏈架構區。 © [00159] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗 體或其結合片段包含下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQ ID NO: 13) > H4 (SEQ ID NO: 14) ' H5 (SEQ ID NO: 15) Ή6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)>H12 (SEQ ID NO: 20)>H13 (SEQ ID NO: 21)Ή14 (SEQ ID NO: 22) 、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。 [00160] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗 Q 體或其結合片段包含下列輕鏈變異區其中一者：L5(SEQ ID NO: 23) 、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO·· 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 LI 1 (SEQ ID NO: 30)。 [00161] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，而該擬人化抗 體或其結合片段包含下列重鏈變異區其中一者：H2(SEQ ID NO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ Π) NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)Ή12 (SEQ ID NO: 20)>H13 (SEQ ID NO: 21)Ή14 (SEQ ID NO 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146);及(2)下 36 200938630 列輕鏈變異區其中一者：L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ K) NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: -27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ED NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 30)。 [00162] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼載體GS264之核酸序列之輕鏈，載體GS264已在2娜年1 月23日向DSMZ申請寄存於微生物中，其寄存號碼(accessi〇n N〇 ) 為 DSM21059。 [00163] 本發明亦提供包含分離核酸之寄主細胞，該分離核酸 編碼載體GS265之分離核酸序列之重鏈，載體GS265已在2008 年1月23日向DSMZ申請寄存於微生物中，其寄存號碼( accession
No.)為 DSM21060。 [00164] 本發明亦提供具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段之製造方法，包含培養本發明之寄主細胞，俾能表現核酸 及製造抗體；本發明之擬人化VWF抗體或其結合片段之製造方法 可更包含自寄主細胞培養液回收抗體。在某些實施例中，抗體可 自寄主細胞培養基加以回收；在某些實施例中，於培養之前，係 以包含編碼重鏈變異區之核酸之載體及編碼輕鏈變異區之核酸之 載體共同感染寄主細胞。 Ο [00165]本發明提供包含具有VWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段之組成物’該擬人化抗體或其結合片段包含如SEQm N0: 19中所述之重鏈變異區序列及如SEQ ID NO: 28中所述之輕 鏈變異區序列。 [00166] 本發明提供包含具有vWp特異性之擬人化抗體或其 結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含如SEqID NO: 19中所述之重鏈變異區序列、如SEqIDN〇: 28中所述之輕 鏈變異區序列、及醫藥上可接受之載劑（carrier)。 [00167] 本發明提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含如seqid N〇: 237中所述之重鏈序列及如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈序 37 200938630 列。 [00168] 本發明提供包含具有VWF特異性之擬人化抗體或其 -結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含如犯卩仍 NO: 237 t所述之重鏈序列、如SEQ Π) NO: 238中所述之輕鏈序 列、及醫藥上可接受之載劑 (carrier) ° [00169] 本發明提供包含具有人類馮威里氏因子（vWF)特異 性之擬人化抗體或其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合 片段包含：對應至存在於鼠類抗體NMC4中之CDRs之CDR區； 對應至人類抗體AAC18165.1 (SEQIDN0..4)之變異區中之架構 區的重鏈架構區；對應至人類抗體AAK94808 (SEQIDNO: 6)之 ❹變異區中之架構區的輕鏈架構區；及醫藥上可接受之載劑 (carrier) ° [00170] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含；^^^^^ GFSLTDYGVD ( SEQ ID NO: 7 ) ' HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQIDNO: 8) ' HCDR3： DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )、來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區、以及醫藥 上可接受之載劑。 Q [00171] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或
其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含下列輕鏈 CDRs—LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) > LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID 1^〇:12)、及來自人類抗體人^：94808 (3£(3辽)1^〇:6)之變異區 之輕鏈架構區、以及醫藥上可接受之載劑。 [00172] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含：重鏈 CDRs，HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7)、HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)、及 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO·· 9);及輕鏈 CDRs，LCDR1: 38 200938630 SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)、LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12);(非必須） -來自人類抗體AAK94808(SEQIDNO: 6)之變異區之輕鏈架構區 及/或來自人類抗體AAC18165.1 (SEQIDNO: 4)之變異區之重鏈 架構區；以及醫藥上可接受之載劑。 [00173] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含下列重鏈 變異區：H2 (SEQ ID NO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18) Ή9 (SEQ ID NO: 19) Ή12 (SEQ ID NO: 20) > HI3 (SEQ ID NO:
❹ 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)以及醫藥上可接受之載劑。 [00174] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含下列輕鏈 變異區：L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10(SEQH)NO: 29)或 Lll (SEQIDNO: 30)以及醫藥上可接 受之載劑。 [00175] 本發明亦提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體或 〇 其結合片段之組成物，該擬人化抗體或其結合片段包含：下列重 鏈變異區其中一者一H2(SEQIDNO: 13)、H4(SEQIDNO: 14)、 H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、 H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、 H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或H16 (SEQ ID NO: 146);下列輕鏈變異區其中一者一L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、LI0 (SEQ ID NO: 29)或Lll (SEQ ID NO: 30);以及醫藥上可接受之載 劑。 [00176] 亦提供包含如此處所述之第一擬人化抗體或其結合片 39 200938630 段及結合SvWF之A1領域之第二抗體的組成物。 [00177]本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之vW媒介 疾n常（例如刻、板疾病或異f)之治療方法，該方法包含 受ΐ者有效治療量之具有vWF縣性之擬人化抗體或其結 二i ί含⑯SEQH)N〇: 19中所示之重鏈變異區序列及如 SEQ ID NO: 28中所示之輕鏈變異區序列。 [00178]本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之vwp媒介 疾病或，常（例如血小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 ^予該受財有錄療量之具有爾特異性之擬人化抗體或其結 σ片段，，、包含如SEQH)NO:237中所示之重鏈序列及如 NO: 238中所示之輕鏈序列。
[00179] 本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之vWF媒介 疾病或ΐΐ (例如到、板疾病或異常）之治療松，該方法包含 給予該文试者有效治療量之具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段’其包含：對應至存在於鼠類抗體Ν^_4中之CDRs2 CDR區；對應至人類抗體从〇18165丨（seqidn〇:4)之變異區 中之架構區的重鏈架構區；對應至人類抗體AAK94808 (SEQid NO: 6)之變異區中之架構區的輕鏈架構區。 [00180] 一本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之乂響媒介 疾病或異常（例如血小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 給予該受試者有效治療量之具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段，其包含:HCDR1: GFSLTDYGVD( SEQ ID NO: 7 )、HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO: 8 ) > HCDR3: DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 )、及來自人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區之重鏈架構區。 [00181] ▲•小板疾病或異常可為心血管疾病或例如局部缺血性 中風之腦jk管異常。在某些實施例中，心血管疾病為動脈粥狀硬 化症（atherosclerosis )、血管再阻塞（restenosis )、心絞痛（angina )、 急性心肌梗塞（acute myocardial infarction)、急性冠狀動脈症（acute coronary syndrome)、或與糖尿病（diabetes)相關聯之心血管異常； 200938630 在某些K施例中’金栓性疾病或異常為血管發炎、靜脈血栓(ven〇us toombosis)、鐮刀形血球疾病、異體移植排斥（xen〇graft .rejection )、末梢血管疾病（peripheral vascular disease )、栓塞性血 小板減乂 性务、巍症（thrombotic thrombocytopenic purpura)、囊腫纖 維化（cystic fibrosis)、血管性失智症（vascuiardementia)、雷諾氏 症（Raynaud’s disease)、類風溼性關節炎（rheumat〇idarthritis)、 或糖尿病；在某些實施例中，腦血管異常可包含肇因於大腦動脈 梗塞（cerebral artery infarct)以及小間隙梗塞（smau iacunar infarct) 之局部缺血性中風及血管性失智症（vascular dementja )。擬人化 vWF抗體亦可用於預防再發性中風、或由腦血管發炎所引起之初 〇期中風。 [00182] 在某些實施例中’血小板疾病或異常可包含癌症。
[00183] 本發明亦提供在一受試者（例如人類）中2vWp媒介 疾病或異常（例如血小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 給予該受試者有效治療量之具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段，其包含：下列輕鏈CDRs—LCDR1: SASQDINKYLN
ID NO: 10)、LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)、及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)、及來自人類抗體 AAK94808( SEQ ID NO: 6)之變異區之輕鏈架構區。 ❹ [00184] 本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之VWF媒介 疾病或異常（例如血小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 給予該受試者有效治療量之具有VWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段，其包含：下列重鏈變異區其中一者-H2(SEQ ID NO: 13) > H4 (SEQ ID NO: 14) > H5 (SEQ ID NO: 15) ' H6 (SEQ ID NO: 16) Ή7 (SEQ ID NO: 17) > H8 (SEQ ID NO: 18) Ή9 (SEQ ID NO: 19)Ή12 (SEQ ID NO: 20)>H13 (SEQ ID NO: 21)Ή14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146)。 [00185] 本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之VWF媒介 疾病或異常（例如jk小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 給予該受試者有效治療量之具有¥^特異性之擬人化抗體或其結 41 200938630 合片段，其包含：下列輕鏈變異區其中一者一L5(SEQ ID NO·· 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ED NO: 29)或 Lll (SEQIDNO: 30)。 [00186] 本發明亦提供在一受試者（例如人類）中之VWF媒介 疾病或異常（例如血小板疾病或異常）之治療方法，該方法包含 給予該受試者有效治療量之具有vWF特異性之擬人化抗體或其結 合片段，其包含：下列重鏈變異區其中一者—H2(SEQIDNO: 13)、H4 (SEQ ID NO: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: ❹ ❹ 16) Ή7 (SEQ ID NO: 17) > H8 (SEQ ID NO: 18) Ή9 (SEQ ID NO: 19)Ή12 (SEQ ID NO: 20)>H13 (SEQ ID NO: 21)>H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或 H16 (SEQ ID NO: 146);下列輕鏈 變異區其中一者一L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)、L6 (SEQ ID NO: 25)、L7 (SEQ ID NO: 26)、L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ Π) NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 LI 1 (SEQ ID NO: 30)。 [00187] 在某些實施例中，具有vWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段缺乏效應子（effect〇r)功能；在某些實施例中，擬人化 抗體包含源自於IgG4之Fc區。 p〇188] 本發明提供具有馮威里氏因子（VWF)特異性之人類 ^體或其結合片段’其可以自ED⑽之約丨至約25〇倍之有效治療 量來提供，而不致引發明顯之出血臨床症狀。人類抗體或其结合 片段較佳地為具有人類vWF之A1領域特異性，具有vW]^寺生 其結合片段更佳地為具有vWF特異性之擬人化&體 /7 0 [00189]本發明亦提供一種vWF媒介疾病或異常之治療方 tit藉由奸-受試者（較佳狀況為人類）有效治療量的如 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段。該有效 ，係自約刪至約100 mg/kg，較佳為自約0 〇〇2至約2有〇 自約0.002至約10mg/kg，又更佳為自約_2至 、’·、. mg/kg’再更佳為自約〇 〇〇5至約〇 2吨化，最佳為自約讀 42 200938630 至約 0.1 mg/kg。 [00190]本發明亦提供—種ν·媒介疾病或異常之治 效治療量的如此處所述之擬人化抗體 .至約250倍’較佳為自EDl〇〇之約U約勘倍 至約100倍尤佳。 loot約1 Π. 明亦^ 一種爾媒介疾病或異常之治療方 法其係融將早-❹次小織（sub_dQse)之有效治 述之擬人化抗體或其結合片段施予需要此類處理之受試者 ο 亦提供一種vwp媒介疾病或異常之治療方 ΐ二效治療量的如此處所述之擬人化抗體或其結合 片段以皮下方式財需要此類處理之受試者來達成。 =019^]本發明亦提供一種vWF媒介疾病或異常之治療方 治療量的如此處所述之擬人化抗體或其結合 片段透過靜脈方式施予需要此類處理之受試者來達成。 亦提供一種vwp媒介疾病或異常之治療方 、續地或結合放射性治療法（例如照射或引進放射 ❿ ποδ^Γ^ (E<1 }，KUnische 0nk〇l〇gie, Springer-Verlag 台療量的如此處所述之擬人化抗體或其結合片段 通過靜脈方式施予需要此類處理之受試者來達成。 在實施或測試本發明時，雖然類似或等同於此處所述 可方法及材料均可使用，但以下仍說明較佳方法及材料。 擬人化馮威里氏因子抗體之製造 S) (vwf) 體或盆片、；：方法。具有vWF讎之擬人化抗 Λ/T :片段可猎由自非人類動物（例如老鼠）之VH及/或 一個以上cdrs或其部分至人類vh及/或vl區之-個 /、構區。非必要地’如此存在於¥11及/或π區中之人類架 43 200938630 構殘基’可藉由在為了維持結合親和力時所需 人類（例如老鼠）殘基加以替代。非必要地，存在$ CDRs^ 非人類胺基酸殘基可以人類殘基加以替代。 [00197] 如此處所述之架構及CDRs之分類（除了 HFR1及 ’ CDR1以外）係基於卡巴記數制（Kabatnumbering system)。在此 定義中’重鏈的 CDRs 包含殘基 31 -35 ( HCDR1 ：)，50-65 (： HCDR2 )， 及95-102( HCDR3 );輕鏈的CDRs被定義成由殘基24-34( LCDR1 )， 50-56 (LCDR2)，及 89-97 (LCDR3)所組成。將 VH (例如重鏈 架構區1 (HFR1)、重鏈架構區2 (HFR)、重鏈架構區3 (HFR3) 及/或重鏈架構區々(HFR4))中之架構區定義成由殘基l-3〇(HFRl) Ό 36_49 (HFR2)，66-94 (HFR3)，及 103-113 (HFR4)所組成，而 VL 中之架構區包含殘基 LFR1)，35_49(LFR2) 57_88(LFR3) 及 98-107 ( LFR4 ) ( Wu and Kabat, 1970 /•五;ζρ. 132:211)。然 而’基於CDRs之結構’ Chothia將CDR1-H定義成包含殘基26-32 (Chothia et al.，1992 «/·施/.所〇/. 227:799)，AbM (抗體模型化） 疋義為CDR1-H包含殘基26-35之Oxford Molecular’s AbM抗體模 型化軟體所使用之兩者之間的妥協，此為此處所述之利用_心4 之擬人化方法所用的定義。 [00198] 具有馮威里氏因子（vWF)特異性之擬人化抗體或其 ❹ 結合片段，可藉由下列方式加以製造：將來自NMC-4之重鏈互補 決定區（CDRs)轉移至對應於人類抗體AAC18165.1(SEQIDNO: 4)之變異區中之架構區的重鏈架構區；以及將來自nmc_4之輕 鏈CDRs轉移至對應於人類抗體AAK94808 ( SEQ ID NO: 6 )之變 異區中之架構區的輕鏈架構區。 [00199] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段亦可藉 由下列方式加以製造：將來自鼠類NMC-4之重鏈CDRs (例如 HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8)，及 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9))其中一者以上轉移至人類 架構區（例如來自AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區）。 200938630 [00200] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段亦可藉 由下列方式加以製造：將輕鏈CDRs (例如LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12))其中一者以 上轉移至人類架構區（例如來自AAK94808 (SEQIDNO:6)之變 異區）。 [00201] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段可藉由 下列方式加以製造:將來自鼠類NM04之重鏈CDRs(例如HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8),及 HCDR3: Ό DPADYGNYDYALDY(SEQIDNO: 9))其中一者以上轉移至人類 架構區（例如來自AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區）；及 將輕鏈 CDRs (例如 LCDRl·· SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)， LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11),及 LCDR3: QQYEKLPWT’ (SEQ ID NO: 12))其f 一者以上轉移至人類架構區（例如來自 AAK94808 ( SEQ ID NO: 6)之變異區）。
[00202] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段可藉由 下列方式加以製造：將包含存在於Nmc-4及人類架構區中之 CDRs之修飾重鏈變異區（例如H2 (SEq ID N〇: 13)、H4 (SEQID
❹ N0: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ Π) NO: 16)、H7 (SEQ ID
NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20) ^ H13 (SEQ ID NO: 21) > H14 (SEQ ID NO: 22) > H15 (SEQ ID NO: I45)、或 H16 (SEQ ID NO: 146))轉移至人類恆定區。 [00203] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段亦可藉 由下列方式加以製造：將包含存在於_〇4及人類架構區中之 CDRs之修飾輕鏈變異區（例如L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)>L6 (SEQ ID NO: 25)'L7 (SEQ ID NO: 26)>L8 (SEQ ID NO: 27)、L9 (SEQ ID NO: 28)、L10 (SEQ ID NO: 29)或 Lll (SEQ ID NO: 3〇))轉移至人類恆定區。 [00204] 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段可藉由 45 200938630 下列方式加以製造：將包含存在KNMC_4及人類架構區中之 CDRs之修飾重鏈變異區（例如H2 (SEQ ID NO: 13)、H4 (SEQ ID -N0: 14)、H5 (SEQ ID NO: 15)、H6 (SEQ ID NO: 16)、H7 (SEQ ID NO: 17)、H8 (SEQ ID NO: 18)、H9 (SEQ ID NO: 19)、H12 (SEQ ID NO: 20)、H13 (SEQ ID NO: 21)、H14 (SEQ ID NO: 22)、H15 (SEQ ID NO: 145)、或H16 (SEQ ID NO: 146))轉移至人類恆定區；以 及將包含存在於NMC-4及人類架構區中之CDRs之修飾輕鏈變異 區（例如 L5 (SEQ ID NO: 23)、L4 (SEQ ID NO: 24)'L6 (SEQ ID NO: 25) ' L7 (SEQ ID NO: 26) > L8 (SEQ ID NO: 27) > L9 (SEQ ID NO: 28)、L10(SEQIDNO: 29)或 Lll (SEQIDNO·· 30))轉移至人類恆 〇 定區。 [00205] 為嘗試更降低擬人化抗體之抗原性，可改變關於人類 胺基酸殘基之CDRs中之殘基（例如鼠類殘基）。舉例而言，擬人 化抗體可包含HCDR1中之F27Q L29I，T30S及/或V34W取代基 其中一者以上。在某些實施例中，擬人化抗體可包含11〇)112中之 S61P及/或A62S取代基其中一者以上；在某些實施例中，擬人化 抗體可包含LCDR1中之S24Q, N30S及/或K31N取代基其中一者 以上；在某些實施例中，擬人化抗體可包含一個以上之取代基， 例如 LCDR2 中之 Y50D, T51A，S53N，H55E 及/或 S56T 取代基。 〇 在某些實施例中，擬人化抗體可包含：HCDR1中之F27Q L29I， T30S及/或V34W取代基其中一者以上；HCDR2中之S61P及/ 或A62S取代基其中一者以上；LCDR1中之S24Q，N30S及/或 K31N取代基其中一者以上；及LCDR2中之Y50D，T51A, S53N， H55E及/或％6T取代基其中一者以上。 [00206] 考慮各種不同形式之擬人化抗體。舉例而言，擬人化 抗體可為例如Fab之抗體片段’其隨意地與一個以上之細胞毒素 (cytotoxic agnet)接合以產生免疫接合體（ijnmunoconjugate )。 或者’擬人化抗體或親和力熟化抗體可為完整（intact)抗體，例 如完整IgGl抗體。 [00207] 吾人已開發出各種不同的擬人化抗體之抗體片段之製 46 200938630 造技術。習知上，這些片段係透過完整抗體之蛋白水解消化而庐 得（見例如Morimoto et al.，J聲―〇/历_历_二 • MW喊 24:107-117 (1992);及 Brennan et al_, 5W衝e, 229:81 (1985));然而，如今這些片段可藉由重組寄主細胞來直接產生， 例如抗體片段可由以上所討論之抗體噬菌體基因庫（antib phage library)分離出來；或者，Fab，_SH片段可直接由五⑺" 回收並將其化學耦合以形成F(ab，）2片段（Carteretai， 及现 1〇: 163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab，）2 片 段可直接由重組寄主細胞培養中分離出來，而其他製 ❹ 之方法對，悉此項技藝者將為顯而易見。在其他實施例中，選定 之抗體為單鏈Fv片段（seFv)，見w〇 1993/16185 ;美國專利 二及美國室專利第挪，458號。抗體片段亦可為「線形 抗體」’例如在吴國專利第5,641，87〇中所述者。 ❹ [_)8]根據不同方法’可將具有期望之結合特異性（抗體— ^原結合雜）之抗體麵賴融合至免鋪蛋錄定領域序 ^°·，ΐ較佳地為利用纽球蛋白重鏈恆定領域，其紐 二二5'區及CH3區中之至少一部分，較佳地為使包含 ίίϊί所必須之部位之第—重娜定區（CH1)存在於至少一 鏈口(若ί 免疫球蛋白重鍵融合體之DNA及免疫球蛋白輕 率ί此f吏用之不等比率之三多胜肽鏈提供最佳化產 性;券而，多胜狀片段之相互比例之實施例中可提供彈 比率$具特二2之至少兩多胜肽鏈之表現導致高產率或是當 之編碼序列广日可在一表現載體中***該兩或三多胜肽鏈 細胞毒素(例如end免m ’該抗體嵌合至 位素（tt放性毋素包含其片段及/或變異株）)或放射性同 [〇〇21〇]本發明更考慮形成於抗體與具有核分解（nudedytic) 47 200938630 活性之化合物（例如核糖核酸酶或例如去氧核糖核酸酶之dna核 酸内切酶（DNase))之間的免疫球蛋白。 • [00211] 有多種放射性同位素可用於製造輻射接合 (radioconjugated)之擬人化 vWF 抗體，例子包含 At211，I131，I125, γ90, -Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 及 Lu 的放射性同位素。 ’ [00212] 抗體及細胞毒素之接合體可利用多種雙功能蛋白質搞 合劑加以製造，例如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸醋 (N-succinimidyl-3'(2-pyridyldithiol) propionate (SPDP) )、丁二醯亞 胺基_4-(N-馬來醯亞胺曱基)環己烷-1-羧酸酯 (succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) 〇 cyclohexane-1-carboxylate)、亞胺基四氫嗟吩（iminothiolane (IT))、 亞胺酯類（imidoesters)之雙官能基衍生物（例如二曱基亞胺酸酯 HC1 (dimethyl adipimidateHCl))、活性酯類（例如栓酸丁二醯亞 胺酯（disuccinimidyl suberate ))、搭類（例如戊二搭 (glutaraldehyde))、雙疊氮（bis-azido)化合物（例如雙（對疊氮 苯曱醢基）己二胺（bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine ))、雙重氮 (bis-diazonium )衍生物（例如雙-(對重氮苯醯基)-乙二胺 (bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二異氰酸酯類 (diisocyanates)(例如曱苯 2,6-二異氰酸酯（toluene ❹ 2,6-diisocyanate))、及雙活性氟（bis-active fluorine)化合物（例 如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯（l，5-difhioro-2,4-dinitrobenzene))。舉例 而言，可如Vitetta et al. 238: 1098 (1987)中所述般製備蓖 麻毒蛋白（ricin)免疫毒素。碳14標記之1-異氰硫苯基-3-曱基二 乙婦三胺五乙酸（1 -isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA))為例示之放射性核苷酸 (radionucleotide)接合至抗體之螯合劑，見WO 1994/11026。連 結劑可為在細胞中輔助細胞毒素藥劑之釋放的「可切割連結劑」 (cleavablelinker) ’例如可使用不耐酸連結劑、胜肽酶敏感性連 結劑、二曱基連結劑、或含二硫化物連結劑（Chariea/. Cancer 52: 127-131 (1992)) 〇 48 200938630 [00213] 或者，可例如藉由重組技術或胜肽合成來製造包含擬 人化vWF抗體及細胞毒素之融合蛋白。 .[00214]在又另一實施例中，可將擬人化VWF抗體接合至「受 體」（receptor)(例如卵白素（streptividin))，以用於腫瘤預標記 (pretargeting) ’其中係提供抗體_受體接合物予病人，接著利用清 除劑（clearing agent)而由循環中移除未結合之接合物，且接著提 供接合至細胞毒素（例如放射性核苷酸）之「配位子」（例如抗生 物素蛋白（avidin))。
[00215] 亦可藉由將擬人化vWF抗體接合至轉換前驅藥（例如 胜狀基化療劑（peptidyl chemotherapeutic agent)，見 WO ❹1981/01145 )成活性抗癌藥（見例如WO 198807378及美國專利第 4,975,278號）之如驅樂活化酶（enzyme )，而將 本發明之抗體使用於ADEPT中。 [00216] 可用於ADEPT之免疫接合體之酵素成分包含能夠以 此一將其轉換成更具活性及細胞毒性之方式作用於前驅藥上之任 何酵素。 =0217] 可使用之酵素包含但不限於：有助於將含磷酸鹽前驅 藥轉換成游離藥（free drug)之驗性鱗酸酶（phosphatase);有助 於將含硫酸鹽前驅藥轉換成游離藥之芳基硫酸酯酶 Q (ar^sulfatase)，有助於將無毒 5-敦胞嘴咬（5-fluorocytosine)轉 換成抗癌藥5-氟脲嘧咬（5-fluorouracil)之胞嘧咬脫胺酶（cytosine deaminase);有助於將含胜肽前驅藥轉換成游離藥之蛋白酶 (protease) ’例如錫桿菌屬（serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶 (thermolysin)、籽桿菌蛋白酶（subtilisin)、羧胜肽酶 (carboxypeptidase)及細胞自溶酶（cathepsin)(例如細胞自溶酶 B及L);可用以轉換包含(3_胺基酸取代基之前驅藥的〇_丙胺醯羧 胜肽酶（D-alanylcarboxypeptidase);有助於將醣化（glyCosylated) 剷驅樂轉換成游離藥之聽類斷裂酶（carbohydrate-cleaving enzyme) ’例如β-半乳糖酶（p_gaiact〇sidase)及神經胺糖酸酶 (neuraminidase);有助於將以β·内醯胺（p_iactam)來衍生之藥物 49 200938630 轉換成游離樂之β-内酿胺酶（P_lactamase);及有助於將以笨氧乙 醯基或苯乙醯基在其胺類氮上加以衍生之藥物轉換成游離藥之盤 '尼西林醯胺酶’例如分別為盤尼西林V醯胺酶及盤尼西林醯胺 酶。或者’可利用具有酵素活性之抗體（在此技藝中亦稱為『催 化性抗體』（abzyme))，將本發明之前驅藥轉換成游離活性藥（見
Massey，328:457-458 (1987))。可如此處所述來製備抗體_ 催化性抗體接合物’以將催化性抗體運送至踵瘤細胞族群。
[00218] 藉由此技藝中所熟知之技術，例如上述使用異質雙功 能（heterobifimctional)交聯劑，可使酵素共價結合至擬人化vWF 抗體。或者，可利用此技藝中所熟知之重組DNA技術，以建構至 少包含本發明之抗體之抗原結合區的融合蛋白，該抗原結合區係 連結至一適當酵素之至少功能上活性部分（見例如Neuberger et al.， 胸wre，312: 604-608 (1984))。 ’ [00219] 此處考慮抗體之其他變型。舉例而言，可將抗體連結 至各種非蛋白質類聚合物其中之一’例如聚乙二醇（p〇lyethylene glycol)、聚丙二醇（p〇iypr〇pyienegiyc〇i)、聚氧化稀烴類 (polyoxyalkylene)、或聚乙二醇及聚丙二醇之共聚合物；舉例而 吕’亦可使抗體陷入於藉由例如凝塊（coacervati〇n)技術或介面 聚合（例如分別為經甲基纖維素（hydroxymethylcellulose )或明膠 〇 -微膠囊（gelatin-microcapsule)及聚甲基丙烯酸曱酯 (poly-(methylmethacylate))微膠囊）而在膠體藥物傳遞系統（例 如脂質體、卵蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊）或巨 乳液中所製備之微膠囊内。此類技術揭露於及 />/^脚^奴如/&細(激（第16版，由〇31〇,入.所編著（1980))之 專書中。 [00220] 亦可將此處所揭露之擬人化vWF抗體配製成免疫脂 質體。藉由此技藝中已知之方法，製備包含抗體之脂質體，例如： Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985) ； Hwang et fl/.，fVoc. $α·. ί/似, 77:4030 (1980);美國專利第 4,485,045 及4,544,545號；及1997年10月23日公開之WO 1997/38731中 50 200938630 所述者。具有增強循環時間之脂質體則揭露於美國專利第 5,013,556 號中。 .[00221] 特別有用之脂質體可利用包含卵磷脂 (phosphatidylcholine)、膽固醇、及peg衍生磷脂醯乙醇胺 (PEG-derived phosphatidylethanolamine，I^G-PE )之脂質（lipid ) 成分並藉由逆相蒸發法加以產生。透過定義孔徑之過濾器來擠壓 脂質體’以產生具有期望直徑之脂質體。可透過二硫化物交換反 應’將本發明之抗體之Fab，片段接合至如Martin et al. ·/.所〇/. C/zem” 257: 286-288 (1982)中所述之脂質體。可隨意地將化療劑包 含於脂質體内。見 Gabiz〇n βα/.,乂 iVatoza/ 说，81(19): Ο 1484 (1989)。 載體、宿主細胞及重組方法 [00222] 本發明提供編碼具有VWF特異性之擬人化抗體及其 結合片段之分離核酸、載體、及包含該核酸之宿主細胞、及製造 抗體或其結合片段之重組技術。 [00223] 就抗體之重組製造而言，可將編碼該抗體之核酸分離 出來或將其***可複製載體中，以更進一步進行基因轉殖（放大 DNA)或用於表現。可利用習知方法（例如利用能夠特定地結合 ❹至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）以分離並定序 編碼單株抗體之DNA。可利用許多載體，載體組成通常包含但不 限於下列其中-者以上：訊息序列、複製之原點（Grigin〇f replication)、一個以上之標識基因（markergenes)、增強要素 (enhanced element)、啟動子（prom〇ter)、及轉錄終止序列 (transcription-termination sequence )。 (i)訊息序列組成 [00224] 如此處所述之擬人化vWF抗體不僅可直接以重組方 式製造:亦可為具有異源（heterologous)多胜肽之融合多胜肽形 式，其較佳為在成熟蛋白質或多胜肽之]^端（N_termi皿s)上具 特定斷裂雜。異源訊號序赚佳地可為由魅細胞所辨識及處 51 200938630 理（亦即由訊息胜肽酶加以斷裂）者。就未能辨識及處理原生擬 人化vWF抗體訊息序列之原核生物宿主細胞而言，可利用由例如 鹼性磷酸酶、盤尼西林酵素、Ipp、或耐熱性腸毒素π前導子 (enterotoxinΠleader)中所選擇出之原核生物訊息序列來取代訊 息序列；就酵母菌分泌而言’可藉由例如酵母菌轉化酶前導子、α_ 因子前導子（包含酵母菌屬（Sacc/wromyces·)及克魯維酵母菌屬
之α-因子前導子）、酸-磷酸酶前導子、白色念 珠鹵（C. 糖化酵素（glucoamylase)前導子、或WO 1990/13646中所述之訊息加以取代。在哺乳類細胞表現中，可使 用哺乳類細胞訊息序列以及病毒分泌前導子（viral secretory leader)，例如單純鮑療病毒（herpes simplex) gD訊息。 [00225] 此類前驅物區所用之DNA可在讀取架構（reading frame)中被接合（ligated)至編碼擬人化vwf抗體之DNA。 (ii) 複製組成之原點 [00226] 表現（expression)及選殖（d〇ning)載體兩者皆包含 月b夠使載體在一個以上之選取宿主細胞中複製之核酸序列。一般 而言，在選殖載體時，此序列可使載體獨立於宿主染色體DNA而 複製’且包含複製之原點或自發性複製序列（aut〇n〇m〇usly replicating sequences) ·’吾人已熟知許多細菌、酵母菌、及病毒之 ❹ 巧類序列。來自質體PBR322之複製原點適用於大多數革蘭氏陰性 菌’ 2m質體原點適用於酵母菌，且各種不同之病毒起源（SV4〇、 多瘤、腺病毒、VSV或BPV )有助於在哺乳動物細胞中選殖載 體。般而s ’哺乳動物表現載體（一般可使用SV40起源，僅因 為其含有早期啟動子）並不需要複製組成之原點。 (iii) 篩選基因組成 ， [00227] 表現及選殖載體可包含筛選基因，亦稱為篩選標記 (selectable marker )。代表性篩選基因編碼下列蛋白質：⑻賦予對 抗體或其他毒素（例如女比西林（ampicillin)、新黴素（)、 滅殺除癌（methotrexate)、或四環黴素）之抵抗性、⑼補充營養 缺陷型1乏（auxotrophic deficiency )、或(c)供應無法由複合培養基 52 200938630 (complexmedium)中得到之必須或期望營養者 ，例如編碼桿菌 (5<3α7//)之 D-丙胺酸（D-aianjne )消旋酶（racemase )之基因。 [^0228] _選方案之—例係细藥物以阻止宿主細胞之生長。 $些成功地以異源基因加以轉形（)之細胞製造提供抗 藥f生之蛋白質’因此在選擇律（select|〇n reg^men )中存活下來。 此種優勢k擇之貝加例係使用新徵素、徽紛酸（mycophenouc acid)、及濕徵素（hygr〇myCin)等藥物。 Ο ❹ [00229]哺乳動物之適當篩選標記之另一例為可辨識能夠佔有 擬人化vWF抗體編碼核酸之細胞者，例如DHpR、胸腺激酶 ^ thymidine kinase )、重金屬蛋白質 4 及 n ( metall〇thi〇nein I & n ) (較佳為靈長類重金屬蛋白質基因）、腺核芽脫胺酶（a— deaminase)、鳥胺酸去缓酶（〇m池inedecarb〇Xyiase)等。 [ 30]舉例而5，藉由在含有滅殺除癌（methotrexate,Mtx) 培養基中培養轉形體（transformant)，首先辨識出以DHFR篩選基 ，加以轉狀峨。當制野生抑脈時之適#宿主細胞為缺 乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢細胞株（CH〇 cdl丨丨加）。 或者’可藉纟在含有賴標記之選_ (像是胺基糖 f類抗體’例如康黴素（kanamycin)、新黴素、或〇418，見美國 ^ΐ4/65，199號）的培養基中之細胞生長，選擇以編碼擬又化 ^ 生型D職蛋白質、及另一筛選標記（例如胺基糖 ^ 3 酸轉移酶（amin〇glyC〇side3响维伽她誕^⑽
之序列宿主細胞（尤其是包含内生DHFR ^232]用於酵母菌中之適當篩選基因可為存在於酵母菌質體 基^^冲1 基因（StineheGmWfl/.，施細，282:39(1979))，trpl 中缺乏生長能力之酵母菌突變株（例 選才缺二结f ΡΕΡ41.加腦，知扣咏85: 12 (1997))提供筛 染i體組（genome)中邱1損傷（ie-) 7存在接者為藉由在無色胺酸下之生長而檢測轉形 (tranSf0rmati0n)提供了一有效環境；同理，可利用帶有^基 53 200938630 因之已知質體，補充缺乏Leu2(Leu2-deficeient)之酵母菌株(ATCC 20,622 或 38,626)。 [00233] 此外，可利用衍生自1.6μιη圓形質體pKDi之載體， 進行克魯維酵母菌之轉形；或者VandenBerg， 幻;，8:135 (1990)中有描述大規模製造重組小牛凝乳酶 之表現系統。吾人已揭露用於以克魯維酵母菌屬之工業菌株來分 泌成熟重組人類血清蛋白之穩定多複製數（multi_c〇py)表現載 體，見 Fleer 以 α/.，及9: 968-975 (1991)。 (iv)啟動子組成 [00234] 表現及選殖載體通常包含可由宿主生物加以辨識之啟 Ό 動子，且可***作以連結至vWF抗體編碼核酸。原核生物宿主適 用之啟動子包含ph〇A啟動子、β_内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼 性構酸酶、色胺酸（trp)啟動子系統、及例如tac啟動子之嵌合 (hybrid)啟動子；然而，其他已知的細菌啟動子亦為合適。用於 細菌系統之啟動子亦可包含可***作連結至編碼擬人化vWF抗體 DNA 之 Shine-Dalgamo ( S.D.)序列。 [00235] 已知真核生物之啟動子序列。真核生物基因具有位於 轉錄起始之部位上游約25至30個鹼基（bases)之富AT( AT-rich) 區，在許多基因之轉錄起始點上游7〇至8〇個鹼基所發現之另一 ❹ 序列為cncAAT (SEQIDNO: 31)區，其中N可為任何核苷酸。 在大多數真核生物的3,端為AATAAA (SEQIDNO: 32)序列，此 序列可能為附加多A尾部（p〇ly A tail)至編碼序列之3’端的信號。 可將這些序列適當地***真核生物之表現載體内，用於酵母菌之 適當啟動序列（promotingsequences)包含：用於3_構酸甘油酸激 酶（3-phosphoglyceratekinase)或其他醣解酵素（例如烯醇酶 (enolase )、甘油輕__3 -鱗酸去氫酶（giyCeraidehyde-3 -phosphate dehydrogenase)、己醋激酶（hexokinase)、丙綱酸去叛酶（pyruvate decarb〇xylase)、磷酸果糖激酶（ph〇sph〇fruct〇kinase)、葡萄糖_6· 磷酸異構酶（glucose—fphosphateisomerase)、3-填酸甘油酸變位 酶（3-phosphoglycerate mutase)、丙嗣酸激酶（pyruvatekinase)、 54 200938630 三碳糖磷酸異構酶（tri〇sq)h〇sphateisomerase)、磷酸葡萄糖異構 酶（ph〇sph〇glucoseisomerase)、及葡萄糖激酶（gluc〇kinase)^ 啟動子。 [00236]其他為具有由生長條件加以控制之額外轉錄優勢之可 =啟動子的酵賴啟動子可為下列蛋白f之啟動子區：乙醇去 氫酶2、異細胞色素c、酸性磷酸酶、與氮代謝相關聯之降解酵素、 Ϊ金if白質、'甘祕·3崎酸去氫酶、及負責麥芽糖及半乳糖利 之酵素。更進-步說制於酵母n表現中之適當載體及啟動 如歐洲專利第73,657號。酵母菌增強子（enh麵〇與 酵母函啟動子一同使用亦相當有利。 ㈣乳類宿主細胞中之載體轉錄擬人化vwp抗體 廇!⑽rma)病毒、禽峰，x)病毒、腺病毒 )、牛乳大狀瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、 骑έ ^ ^肝炎病毒且最佳為猿狼病毒40 (SV40)之染色 之啟動子、異源视飯動子（例如_蛋白啟動子 i可才Γ容於統熱休克啟動子加以控制，條件是此類啟動 =亦勺ϊί!便利地取得SV40病毒之早期及晚期啟動子，
SV4G病毒域的SV4G _片段；吾人可便 ΐ 二病毒之立即早期（―y)啟動 載體而表段。已揭示利科乳餘瘤病毒作為 4 4^446|哺之職的系統，見例如美國專利第 號中。Reya / 舰係說明於例如美國專利第4,601，978 皰i病297:598顧（1982)贿在_來自單純 干擾===;—)啟動子之下，將人酃- (v)增強子元素組成 由較高等真核生物而轉錄編碼本發日月之擬人化VWF 來自哺乳騎基因（血球蛋自、雅蛋_、^ 55 200938630 島素）之有用增強子序列；然而，—般來說，吾人可使 用來自真核生物細胞病毒之增強子，彳杆包括：在 期側上之SV40職子（bp _Q)、細魅 之增強子、在複製原點之晚期侧上之多瘤增強子、及腺 ί ί核生物增強子之增私素呵她人化二 位置㈣強子切絲趙，但較佳為在由 (ν〇轉錄終止組成
❹ [00240] 用於真核生物宿主細胞（例如酵母菌、真菌、昆蟲、 植物、動物、人類、或來自其他多細胞生物體之有核細胞）中之 表現載體可包含終止轉錄或穩定禮^所必須之序列，此類序列 一般可得自於真核生物或病毒DNAs或cDNAs之未轉譯區之5， 端（有時為3’端）’這些未轉譯區包含在編碼擬人化乂胃抗體之 mRNA之β未轉，部分中經轉錄成為多聚腺苷酸化（p〇㈣邮耐) 片段之核苷酸節段。一有用之轉錄終止組成為牛生長荷爾蒙多聚 腺普酸化（polyadenylation)區（見例如wo 1994/ΐι026及直中所 揭露之表現載體）。 (vii)宿主細胞之篩選及轉形 [00241] 用於選殖或表現載體中之DNA之適當宿主細胞包含 各種不同^原核生物、酵母菌、或較高等之原核生物細胞，用於 此目的^當適原核生物包含真細菌類（eubacteriaK例如革蘭氏陰 j·生或革蘭氏1%性生物體’像是腸桿菌科（Enter〇bacter|aceae )如大 腸菌屦（Escherichia)(例如 E、co⑼、腸桿菌屬（Enier〇bacter)、 伊文氏桿菌屬（加_)、克留氏菌屬（腿_//α)、變形桿菌數 (Proiews)、沙門杯菌屬(例如^^ typ^muriunO、鋸稈菌饜{Sermtia) {例如 Sermiia marcescans)、
忘t释亀屬（Shigella)、认及稈蛰 QBacilli)如 B subtilis li^heniformis、假隼孢亀屣、Pseud〇m〇nas)如 p aemgin〇sa 反缝氤 菌（及re声五.co/i_選殖宿主包含五c〇//294(ATCC 31，446)、五.co/f B、五· cwx1776 (ATCC 31 537)及五ϋ W3110 56 200938630 (ATCC 27,325)。 [00242] 除了原核生物以外，真核微生物（例如絲狀真菌或酵 -母菌）為適合之擬人化vWF抗體編碼载體之選殖或表現宿主，可 將απνζϋβ或常見之麵包酵母菌用於表現。此外， 其他若干屬、種、及菌株亦為一般可得到且可使用者，例如； Schizosaccharomycespombe·，先魯維鳟母蛰屨（Kluyver〇myces)宿 主’例如 K.〖actis，K.fragilisi (ATCC12,424)，K. bu〖garicus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC %,9Q6), K. thermotolerans,反 K. marxianus; (EP 402,226); 列加呛(EP 183,070);念珠菌屬 ❹ （Cimi/沾z) ; (EP 244,234);粗厚神經孢子菌 QNeuwspora crassa) ’ Schwanniontyces 例如 Schwanniomyces occfcfewtofe ’及絲狀真囷’例如紅徽菌屬青黴菌 屬（Penicillium)、Tolypocladium、反觀豫慝（Aspergillus)宿支 如 A. nidulans 反 A. niger。 [00243] 用於表現醋化（glycosylated )之擬人化vWF抗體之適 當宿主細胞可得自於多細胞生物體，真核生物細胞之例子包含植 物、昆蟲及脊椎動物細胞。吾人已辨識出許多昆轰病毒 (baculoviral)株及變異株、以及來自例如处而 ❹ (毛备）、Aedes aegypti(故子）、Aedes albopictusi 故子）、Drosophila ⑽ga你r (果繩）、及•等宿主之對應可容許之昆蟲 宿主細胞。有許多種轉染（transfection )用之病毒株可資公眾利用， 例如 Autographa califomica NPV 及 mon· NPV 之 Bm-5 株， 且可利用此類病毒作為此處根據本發明之病毒，尤其用於 細胞之轉染上。 [00244] 亦可利用棉花、玉米、馬鈴薯、黃豆、牵牛花、蕃茄、 及於草之植物細胞培養作為宿主。 [00245] 然而，最大的興趣已經在脊椎動物細胞’且在培養（組 織培養）中之脊椎細胞之繁殖已成為例行程序。可使用之哺乳類 宿主細胞株之範例包含：ChK2細胞（Chromos Molecular Systems 57 200938630
Inc.);由SV40 (COS-7，ATCCCRL1651)加以轉形之猴子腎臟 CV1細胞株；人類胚胎腎臟細胞株（293或用以在懸浮培養基中 生長而加以次選殖（subcloned )之293細胞，Graham ei a/.，J_ Gew %〇/.，36:59 (1977));幼倉鼠腎臟細胞（BHK, ATCC CCL 10);人 類胚胎腎臟（HEK ) 293 細胞（Simmons，1990 Ex/? 75:309 ); SP2 脾臟-骨髓瘤融合細胞（Haas and Wabl，1984,/W乂581:7185); 中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR( CHO, Urlaub ei 〇/.，Proc.他汉 iScz·· t/Λί, 77:4216 (1980)，包含 DG44 (Urlaub ei β/.，Ce" am/Mo/. Gen., 12: 555-566(1986))及 DP12 細胞株）；老鼠赛特利（sertoli) 細胞（TM4,Mather,及23:243-251 (1980));猴子腎臟細 〇 胞（CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎臟細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587);人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCCCCL2);犬腎臟 細胞（MDCK,ATCCCCL70);水牛鼠肝臟細胞（BRL3A,ATCC CRL1442);人類肺臟細胞（W138，ATCCCCL75);人類肝臟細 胞（Hep G2, HB 8065 );老鼠***瘤細胞（MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI 細胞（Mather ei a/., JΑΓ·Παί/. *Sa_·, 383:44-68 (1982)); MRC 5細胞；ES4細胞；及人類肝腫瘤細胞株（Hep G2)。 利用上述用於製造擬人化vWF抗體之表現或選殖載體而將宿主細 胞轉形，並於視需要而調整之習知培養基中培養，以誘發啟動子、 ❹ 篩選轉形體（transformant)、或放大編碼期望序列之基因。 [00246] 亦可使用表現高水平抗體之穩定細胞株，以製造本發 明之擬人化抗體。例如，可利用突變的λ-整合酶（integrase)(例 如ACE整合酶）結合穿梭載體（shuttle vector)，以異源基因序列 載入基於鼠類人工染色體表現（ACE)平台之高產量哺乳類蛋白 質表現系統中，該ACE平台已被設計成含有多個具部位特異性之 重組受體部位（recombination acceptor sites )( Lindenbaum β α/， (M/c/32 (21):el72 (2004);美國專利申請案第 2003/0119104 A1號及第2006/0246586 A1號）。可利用此系統產生 用於表現所筛選之擬人化變異株及NMC-4嵌合體之穩定細胞株。 (viii)培養宿主細胞 58 200938630 [00247] 可將可用於生產擬人化vWF抗體之宿主細胞培養於 多種培養基中。商品化培養基例如HamSFlO(Sigma)、最低必需 培養基（Minimal Essential Medium，MEM (Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)、及 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ((DMEM)，Sigma) 均適合用來培養宿主細胞；此外，在例如：Ham Me仇 58:44 (1979) ; Bames β α/.，历102:255 (1980);美國專 利第 4,767,7〇4 號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號、或第 5，122,469 號；WO 1990/03430 ; WO 1987/00195 ;或美 國專利第Re. 30,985號中所述之任何培養基，皆可用作宿主細胞 之培養基。可視需要以荷爾蒙及/或其他生長因子（例如姨島素、 運鐵蛋白（transferrin)或表皮生長因子）、鹽類（例如氣化鈉、鈣、 鎂、及磷酸鹽）、缓衝液（例如HEPES )、核芽酸（例如腺核芽酸、 胸腺嘧啶核苷酸）、抗生素（例如GENTAMYCIN™藥劑）、微量 元素$定義成通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物）、 及葡萄糖或等量能源補充至任何這些培養基；亦可包含熟悉此項 技藝者已知之適當濃度的任何其他必需補充料。可對所篩選之表 現用宿主細胞使用各種培養條件’例如溫度、。 (ix)擬人化vWF抗體之純化 [00248] 當使用重組技術時，抗體可產生於胞内或間膜區域 〇 (periplasmic sPace)中、或者直接分泌至培養基内。若抗體產生 於胞内，第一步可藉由例如離心或超過濾而移除宿主細胞或細胞 /谷解片段之微粒碎片。Carter ei fl/·,所o/Tec/mo/ogy, 1 〇: 163 -167 (1992)描述分泌至五·⑺"間膜區域之抗體的分離程序；要言之，於 醋酸納（pH 3.5)、EDTA、及苯甲磺醯基氟 (phenylmethylsuifonylflu〇ride(pMSF))存在下將細胞糊（cdl paste)解凍約30分鐘，可藉由離心而移除細胞碎片。在抗體分泌 ^培養基=之情況下’通常首先濃縮來自此類系統之上澄液，包 3利用商品化蛋白質濃縮過濾器，例如amic〇nt PELLIC〇N1"超過渡單元。可將如苯甲姐絲 Cphetiylmethylsulfbnyifl—de (pMSF))之蛋白酶抑_ 包含於前 59 200938630 制蛋白質分解（prcteQiysis)，且可包含抗生 素以防止偶發性》亏染擴大。 7〇249] 刊_如氫氧做抑躲（hydrcxylapatite 、f料秘、透概、城抑概而純化出 I 體成分，其中親和層析法為較佳之層析技 質f作為親和力配位體(ligand)之適合性係取決於存在 中之任何免疫雜自&倾之_及到（⑹―）。可 1 ，質A來純化基於人類w、％、或y重鍵之抗體丽k /麵麵/.施九62:M3 (1983));可利用蛋白質g作為老 ❹ ❹ (Guss etal.,EMBOJ., 5:15671575 (1986)) 〇 親和力配健_之基f (matrix)可為洋雜（agafGse)，但亦 可使用其他基質。機械上穩定之基質，例如可控孔徑玻璃 (controlled-poreglass)或聚(苯乙烯·二乙烯基苯）（p〇iy(styrene dmnyl-benzene))，容許比使用洋菜糖所能達到者更快之流速及更 短之處理時間。在抗體包含CH3領域之情形中，可將 BAKEMONDABX™樹脂（j.T Baker，腿ipsburg NJ )用於純 化，亦可根據待回收之抗體而使用其他的蛋白質純化技術，例如 離子交換管柱分餾、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽土層析 (chromatography on silica)' 肝素（heparin) SEPHAROSE™層析、 陽離子或陰離子交換樹脂層析（例如聚天門冬胺酸（p〇lyaspartic acid)管柱）、色層焦集（chromatofocusing)、SDS-PAGE、及硫酸 銨沉澱法。 藥物配方 [00250]*茲提供包含具有vWF特異性之擬人化抗體之藥物配 方。可藉由混合具有期望純度之抗體與非必須之藥物上可接受的 載體、賦形劑、或安定劑（及簡P/iarmace如·ca/ &如⑽16th edition, Osol，A. Ed. (1980)) ’而製備具有冷;東乾燥配方或水溶液形 式之擬人化vWF抗體之儲存用配方。可接受的載體、賦形劑、或 安定劑為在所使用之劑量及濃度下對接受者不具毒性者，且其含 200938630 有：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑， 包含抗壞血酸、曱硫胺酸（methionine);防腐劑，例如十八烧基 .二曱基节基氯化銨（octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)、氯化六經季銨（hexamethoniumchloride)、經基氯苯胺 (benzalkonium chloride )、氯化苯胺松寧（benzethonium
chloride)、酚（phenol)、丁醇（butyl alcohol)或苄醇（benzyl alcohol)、如對經基苯甲酸曱酯（methyiparaben)或對經基苯曱酸 丙酯（propylparaben)之烷基對羥基苯甲酸酯（aikyiparabens)、 兒命紛（catechol)、間 ^—紛（resorcinol )、環己醇（cyclohexaiiol)、 3-戊醇（3-pentanol)、及間甲苯酚（m_cres〇i);低分量（小於約 10個殘基）多胜肽；蛋白質，例如血清蛋白、白明膠或免疫球蛋 白；親水性聚合物’例如聚乙稀四氫比略嗣 (polyvinylpyrrolidone);胺基酸，例如甘胺酸（glycine)、麩醯胺 (glutamine)、天門冬醯胺酸（aSparagine)、組胺酸（histidine)、 精胺酸（arginine)或離胺酸（iysine);單醣、雙醣及其他包含葡 萄糖、甘露糖（mannose)、或糊精（dextrins)之碳水化合物；螯 合劑，例如EDTA ;糖類，例如蔗糖、甘露醇（mannit〇1)、海藻 糖（trehalose)或山梨醇（sorbit〇l);鹽類形成相對離子 (cmmter-ion) ’例如鈉；金屬錯合物（例如鋅-蛋白質錯合物）； 及/或非離子性界面活性劑’例如TWEENTM、plur〇nicstm、或 聚乙二醇(>如％1咖glycol，PEG)。較佳之冷凍乾燥擬人化vWF 配方說明於WO 1997/04801中，其以參考資料併入於此。 人ί處之配方亦可包含―種以上特定之治療症狀所必須 =活性化合物，較佳為具林會彼此產生不卿響之互補活性 ^ ’或者’，此外，組成可更包含化療劑、細胞毒性劑、細胞介 生長抑制劑、抗激素劑、擬人化清藥物、抗血 Ϊ laranglGgenic agent)、及/或保心藥（論幽^ ^ 此類分子適合崎夠針對需要目的發揮 技術或；f面聚合（例如分別為羥甲基纖維素 61 200938630 (hydroxymethylcellulose)或明膠_微膠囊（gelatin_micr〇capsule) 及聚曱基丙烯酸曱醋（poly-(methylmethacylate))微膠囊）而在膠 -體藥物傳遞系統（例如脂質體、卵蛋白微球體、微乳液、奈米粒 子及奈米膠囊）或***液中加以製備之微膠囊内。此類技術揭露 於 Remingtor^s Pharmaceutica! Science式第 16 版，由 Oslo, A.所編 著（1980))之專書中。 [00253] 可製備持續釋放（sustained-release)製劑。持續釋放 製劑之例子包括含有抗體之固態疏水性聚合物之半透性基質，其 中基質係以成型物品之形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續釋放 基質之例子包含聚酯、水凝膠（例如聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚 ❹乙稀醇）、聚乳酸交醋（p〇lylactide)(美國專利第3,773,919號）、 L-麩胺酸及γ-乙基-L-麩胺酸之共聚物、非可降解之乙烯_乙酸乙烯 酯共聚物、可降解之乳酸-甘醇酸（lacticacid_glyc〇licacid)共聚 物（例如LUPR〇NDEP〇tm (由乳酸_甘醇酸共聚物及柳菩林 (leuprolideacetate)所組成之可注射微球體）及聚·D_㈠_3•羥丁 酸）。 [00254] 待用於活體内（zVzWvo)服用之配方必須為無菌，此 係透過經由無菌過濾膜之過濾加以完成。 ❿ 利用擬人化vWF抗體之治療 [00255] 可利用擬人化vWF抗體或其結合片段來治療各種不 同之vWF相關疾病或異常，例示之狀況或異常包含血栓性疾病或 異常。血栓性疾病或異常可包含心血管疾病或例如局部缺企性中 風之腦血管疾病。在某些實施例中，心血管疾病可為動脈粥狀硬 化症（atherosclerosis )、血管再阻塞（restenosis )、心絞痛（angina )、 急性心肌梗塞（acute myocardial infarction)、急性冠狀動脈症（a_ eoronary syndrome)、或與糖尿病（diabetes )相關聯之心企管異常； 在某些實施例中，血拴性疾病或異常為血管發炎、靜脈血栓'、鐮 刀形血球疾病、異體移植排斥（狀⑽识紐㈣邮丨⑽）、末梢血管疾 病（peripheral vascular disease)、栓塞性血小板減少性紫癜症、 62 200938630 (thrombotic thromb〇Cytopenic purpura ) ' 囊腫纖維化（c fibrosis> (vascular dementia)^ (Raynaud^s f員風屋性關節炎（rheumatoid arthritis)、或糖尿病；在某 些實轭例中，腦血管疾病包含由大腦動脈梗塞（cerebrai姐 infarcts)及小竇隙梗塞（smalllacunarinfarcts)兩者所引起之局 缺血性中風以及血管性失智症（vasculardementia)。亦可利用 化vWF抗體來預防再發性（recuiTent)中風或由腦血管發炎所引 f之中風起始。在急性冠狀動脈症之情況中，擬人化vWF抗體或 八結合片段尤其適合用來治療8丁段（ST_segmem)診斷受試者一； © 擬人化VWF&體或其結合片段用於術後治療，以預防血塊 [00256]再者，可利用活體内診斷測定法來評估vWF之過产表 給予結合至—待測分子且以可檢測之標籤广加 以“記的刀子（例如抗體）’並在外部掃描病患以定位該標鐵。 些實施例中，可將包含與細胞毒素嵌合之擬人化 ν抗體之免疫接合體（lmmun〇c〇njugate)提供予病患；較佳狀 Ϊ為合體及/或其所結合之擬人化VWF抗體被細胞藏在内 ^此提升了免疫接合體在殺死其所結合之癌細胞上的治療效 用。在一較佳實施例中，細胞毒素（包含例如美登醇 ’、 ❹ （m^nsinoici)、卡奇黴素（calicheamidn)、核糖核酸酶 (nb^mclease)及DNA内切酶）鎖定或干擾癌細胞内的核酸 ^-實施例巾’峨毒素（例如紫槪（taxane)或埃坡 jotlnlone))可鎖定或干擾癌細胞内的微管及依憑微管之有絲 裂 C microtubule-dependent mitosis )。 、 咖可根據已知之方法，例如以大量（b〇ius)方式或藉由 一奴時間内的連續式輸注（continuousinfUsion)之靜脈内點 射（intmVenous administration)、肌肉内、腹膜内、腦脊趙内滴虔 ^關節内、滑膜内、脊_内、口服n ___皮 2 1匕1嘗，或免疫接合體提供予病患。抗體之靜脈内二、腹 膜内、或皮下給藥較佳；腹膠内或皮下途徑尤佳。較佳之給藥計 63 200938630 二y為針對急性異常單—缝，崎對慢性異常則 知:其接=療2定哺乳動物、抗體類型、及;醫者熟 ί。結合之給ίίίίίί針結ί擬人化vWF抗體之給予方 gP \ ^ 二二 J 已 3 σ 併用樂（c〇-administration)、利用獨立 ^方、及以任―次序連續給藥，其愤佳者為有 兩（或王部）活性劑同時展現其生物活性之時段。 治療方式可包括擬人化抗爾抗體與 ❹
Ξΐί i 劑（卿agent)及/或抗血小板劑之結合給予， ，維蛋白浴解_例子如栓體舒（alteplase)、蝙福唾液酶 desmoteplase)或微纖微蛋白溶酶（micr〇piasm^n)，抗血小板劑 的例子如聽練由峨梗絲腦聽或其侧血轉常所誘發 之局部缺血的阿斯匹靈、雙β密大莫（dipyridam〇1)或保检通 (clopidogrel) 〇 [00261] 亦值得結合擬人化vWF抗體之給予及導向另一腫瘤 關聯抗原之抗體之給予。 [00262] 在一實施例中，本發明之治療方式涉及擬人化vwf抗 體、哺乳動物中之免疫功能之一個以上調節劑（例如細胞激酶）、 以及化療劑或生長抑制劑的結合給藥，包括不同化療劑之雞尾酒 療法之合併用藥；較佳之化療劑包含紫杉烷（例如太平洋紫杉醇 (paclitaxel)及歐洲紫杉醇（docetaxel))及/或小紅莓 (anthracycline)抗生素。可根據製造廠之用法說明或由熟悉之行 醫者依經驗判定，而使用此類化療劑之製劑及調劑計晝；此類化 療劑之製劑及調劑計晝亦說明於Chemotherapy Service, Ed.，M. C. Perry, WQliams & Wilkins, Baltimore，Md. (1992)。 [00263] 可以已知劑量之抗荷爾蒙化合物，將擬人化vWF抗體 與此類分子相結合。抗荷爾蒙化合物之例子包含：例如黛莫芬 (tamoxifen )之抗***化合物或例如安美達疑（anastrozole )之 芳香族酶抑制劑；例如奥那司酮（onapristone )之抗黃體素 (anti-progesterone)(見 EP 616 812);或例如氟他胺（flutamide) 200938630 之抗雄巧素（anti-androgen)。若欲治療之癌症為荷爾蒙無關者， 病患先前可能已接受過抗荷爾蒙療法，且在癌症變成荷爾蒙無關 '之後，可給予病患擬人化vWF抗體（及如此處所述之其他非必須 劑方）。 ' ❹ [00264] 就疾病之預防或治療而言，抗體之適當劑量將取決於 如上，義之待治療疾病之類型、疾病之嚴重性及進程（不論給予 抗體係為預防或治療之目的）、先前之治療、病患之臨床病史盥對 抗體之反應、及主治醫師之判斷。可將抗體一次或在一連串治療 期間適當地給予病患。根據疾病之類型與嚴重性以及抗體之淨化 速率，給予病患之起始候選劑量為約lMg/kg〜15mg/kg (例如 〇.l-20mg/kg)之抗體，不論例如藉由一次以上 連續灌注皆然。-般之日劑量範圍可自約1μ_〜觸 亡，依據上述之因子而定。根據狀況，為了若干天以上之重複給 樂，可持續治療至產生疾病症狀之期望抑制效果為止。 [00265] 擬人化vWF抗體之較佳劑量可在自約〇.〇5 mg/kg〜約 10 tng/kg之範_ ’因此，可給轉患約G 3 mg/kg、Q 5 mg/kg、 ❹
2j)mg/kg、4.〇mg/kg、或lOmg/kg (或其組合）等一個以上之 量。可間歇性地給予此劑量，例如每週、每兩週、每三週或每四 週（例如俾使病患接受自約2至約2〇(如6)種劑量之擬人化ψρ 抗體）；可在開始時給予較高初劑量（1〇adingd=)^=W ^上較侧1。例示性之定量法包含給予擬人化抗體或其 …了片段約4 mg/kg之初劑量，接著維持約2 mg/kg之劑量達一、 2及用其他定量法。此種療法之進行可藉由習知技 m ί評估如此處所述之擬人化vw抗體或其結合片段 體可以搞全性的研究中’已出人意表地發現此種抗 ΐηϋ在低_之範圍内）有效地預防（例如 體内（ζ•㈣·w)之血小板凝集，此為治療 或卩f之綠纖且騎未有之結果。在這些濃度 下’白未觀察到出血之臨床症狀，除了小傷口的出血增加以外（例 65 200938630 如在切口出血測試中所量測到的模板出血時間 量甚至更令人驚觸是，在自ED⑽之约〗至25〇倍^^下， .亦未觀察到明顯之出血臨床症狀，儘管有觀察到小傷口的出血增 加。因此，如此處所述之擬人化vWF抗體或其結合片段似乎可有 效地治療人類之vWF媒介疾病或異常。 ❹ [00267]因此，可以範圍自約αοοι至約100mg/kg之有效治療 量，將如此處所述之擬人化vWF抗體或其結合片段投予至一受試 者（較佳為人類）；較佳之有效治療量範圍為自約〇 〇〇2至約2〇 mg/kg ’自約_2至約10 mg/kg尤佳，特別是自約〇施至約〇 4 mg/kg、自約0.005至約〇.2 mg/kg ’最好是給予受試者自約〇 〇1 至約0.1 mg/kg之有效治療量，較佳之受試者為人類。可以一種以 上之有效治療劑量，將擬人化vWF抗體或其結合片段投予至一受 ，者，所好之有效治療雜通常不足則丨發·之出血邮症 足時制血小板凝集；換言之，可給予有效治療劑量而 =會引發之出血臨床症狀（例如不會產生出血之臨床症狀， 除了小傷口的出金增加以外）。 =268]可以範圍自約_2至約〇 4 mg/kg或特別為自約 0=5至約〇.2 mg/kg、更特別為自約〇 〇1至約〇」以跑之有效治 ❹ 療罝’將如此處所述之擬人化vWF抗體或其結合片段投予至一受 =(較佳為人類）’以在受試者上產生治療效果（例如減少 开>成）。 [0(^69]可以範圍自ED⑽之約i至⑽倍、較佳為自eDi〇〇 ΐϋ 200倍、自EDi00之約1至100倍尤佳的有效治療量，給 予t此處所述之擬人化VWF抗體或其結合片段，而不致引發明顯 ifi臨床症狀（例如不會產生出血之臨床症狀，除了小傷口的 加以外）。可以單—或多個次劑量（秦dGse)，將如此處所 人ΐ VWF抗體或其結合片段給予至受試者。較佳狀況為使 =靜，注射方式給予上述有效治療劑量。在透過皮下途徑之給藥 分阁較佳之給藥總量可在經由靜脈注射之給藥量的約1至3倍之 乾圍内，較佳為約2倍。 66 200938630 [00270] 出企之臨床症狀可參考由Serebmany及Atar所述 (American Journal of Cardiology, 2007, Volume 99, Issue 2, 15 -January 2007, Pages 288-290)並加以應用至動物模型之 Bieedscore 分類，已將BleedScore具體地開發成可就出血的類型計分，出血 的類型係抗血小板療法之特徵。BleedScore係基於根據出血的嚴 重性來分派點數至臨床發現（finding)上，藉由加總所有發現之 ，數，便可獲得所產生之分數。出血症狀依漸増之嚴重性被分成 三類：1)表淺（supreficial)出血（每事件丨得分點數）；2)内部 (internal)出企（每事件3得分點數）；3)警示性（alanning)出 〇 ^以上之組合（每事件6得分點數），此方法在判定並記述與現 代抗血小板及抗血栓療法相關聯之緩和至中等之出血事 有用’同時亦說明了最嚴重之出血併發症。表淺出血包含下列g ^容如之出A(例如職之模板出血時 j )出點（Petechn )、瘀斑（πΛγιηο^);内部出血包含下 (epistaxis)'來自口腔或***之 5黑糞症（melena)、目艮睛出血、血尿症（hematuria)、吐血 (hematemesis) ’警不性出血包含下列準則··雪
(trans^sion)(mM =71]在猎由制錢流經動脈所制之祕鑛之動y 法為透過在動脈創傷模型中之循環流m抑制的方 reducti⑽，CFRs)之制，如此 予之有效治療量足以減少動物中之抑制可表不所給 ^項=之能力範圍内’特別是根據此㈡Ϊ 媒介疾病辆^撕絲量；爾之含^ 67 200938630 或抑制血小板凝集（例如在主動脈、末梢動脈、小動脈、 血栓形成過程中）所需要之用量。 静脈之 .[00273]有效治療劑量或有效劑量可指可有效地改善或預防症 •狀、或延長所治療钱者之存活時間之劑量。如此處所述 = 治療劑量包含可有效地治療受試者之vWF媒介疾病或異常之 Z抗體量；VWF抗體之有效治療劑量包含治療或抑制灰小板凝 集（例如在主動脈、末梢動脈、小動脈、靜脈之血栓形成過程 所需要之劑量。有效治療劑量包含EDi〇〇，其為足以在3〇分鐘之 時間内將如同由血液容器中之血流減少量所量測之血栓形成 ❹約100%之有效劑量；如此處所述之ED包含足以在3〇分鐘之時 間内將由血液容器中之血流減少量所量測之血栓形成降至零之 jVF抗體里。有效治療劑量包含能夠減少如同由血液容器中之血 ，減少，、或由量測血小板凝集減少量之適當活體外（以你測 忒加以置測之血栓形成的劑量，例如至少足以減少約15%之劑 量，較佳為減少至少30%，更佳為減少至少50%，最佳為減少至 少80% ’特別是減少至少1〇〇%的血栓形成。 [00274] 或者’可將擬人化vWF抗體連續地或結合放射性治療 (例如照射或引進放射性物質，像是參照中所述者）而適當地給、 予。 、° ❿[00275]如此’本發明更提供具有馮威里氏因子（VWF)特異 性之人類抗體或其結合片段，其可以範圍自ED⑽之約丨至約25〇 倍之有效治療量來給予，而不致引發明顯之出血臨床症狀。較佳 狀況為人類抗體或其結合片段具有人類vWp之A1領域之特異 性，具有vWF特異性之人類抗體或其結合片段更佳地為具有vW 特異性之擬人化抗體或其結合片段。 製造物品（Article of Manufacture ) [00276] 在本發明之另一實施例中，提供了包含可用於治療上 述異常之材料的製造物品（例如擬人化vWF抗體）^製造物品可 包含容器及在容器上或與容器相關聯之標籤（label)或仿單 68 200938630 (package insert);適當之容器包含例如瓶子、小 可由多種材料形成’例如玻璃或塑膠;容:ί裝 了可有政地治療疾病之組成物，且可具有無菌之接取口（枣， 器可為點滴液袋（intravenous solution bag )或者且右可洫例如谷 針刺穿之瓶塞之小玻璃觀）。在該組成物中之至少^ 處所述之擬人化vWF抗體，標籤或仿單可指出;^為此 治療特別的疾病，例如癌症。在-實施例中，標籤來 可使用包含擬人化抗體之触成物來治 乂 = ❹ [r7i—再者，製造物品可包含：（撕含有組成^之第容 器/、中w亥組成物包含此處之擬人化抗體；及(b)其中含右如士札 =第二容|| ’其巾該組成物包含除了擬人化抗體以外之治療 在本發明之此實施例中之製造物品可更包含指出可址用]一 及第二組成物以治療VWF相關疾病或異常，此治 乐 #落中所述往何灘絲（修錢轉劑、抗 ，、抗血讀生劑、抗激素化合物、保㈣、及/或哺乳動物中之 免疫功能調節劑，包含細胞介素）。或者，或 =第二（或第三）容ϋ，其具有醫紅可接受之緩^^^更 注射用之抑菌水（BWFI)、魏鹽緩衝之生理食鹽水 ^ ❹ 溶液（Ringer，s solution)及葡萄糖液；其可更包含其他由^爾 使用者立場看來為合宜之材料，包含其他緩衝液、娜液商^ 器、注射針'及注射器。 、氣 擬人化vWF抗體之非治療性用途 [00278]擬人化vWF抗體及其結合片段具有更進一步 療性應用。舉例而言，可將抗體作為親合力 ^ 可利用此技藝中已知之方法，將抗體固定化在固相上，中 ，EPHADEXtm樹脂或遽紙。可使固定化抗體與含有待純化之擬人 蛋自冑（或其#段）她觸，之後，可以實冑上將移除樣 擬人化VW蛋白f (其可結合至化抗體）以 有物貝的射洛劑來洗掉支撐體（suppGrt)<}最後，可以另—適當 69 200938630 溶劑（例如pH 5.0之甘胺酸緩衝液）來洗掉支撐體，此溶劑將由 抗體中釋放出擬人化vWF蛋白質。 .[^0279] 擬人化vWF抗體亦可用於人類vWp蛋白質之診斷測 疋上，例如檢測特殊細胞、組織、或血清内之表現。就診斷應用 而言，可以可檢測部分來標記抗體。有一般可歸類成下列種類之 標籤可資使用： [00280] ⑻放射性同位素，例如35s、14c、125i、3h、及131工。 舉例而言，可利用Cwrre加V()lumes i & a Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)' 〇 中所述之技術來標記抗體，且可利用閃爍計數法（’scintillation counting)來量測放射性。 [00281] 05)可使用螢光標籤例如稀土螯合劑（销螯合劑）或螢 光素（fluorescein)及其衍生物、玫瑰紅（rhodamine)及其衍生物、 丹石κ醯基（dansyl)、（Lissamine)、藤紅素（phycoerthrin)及德州 '.·工了利用例如 ⑼iPwioco/s/w/wiTwwwo/og)；, supra 中所揭露之 技術，將螢光標記接合至抗體；可利用螢光計來定量螢光標記。 [00282] (c)可使用各種不同之酵素-基質標記（例如見美國專 利第4,275，149號）’這些酵素通常催化可利用各種技術加以量測 之顯色基質之化學變化作用。例如，酵素可催化基質中之顏色變 © 化，其可以分光光度測定方式加以量測；或者，酵素可以改變螢 光性或化學發光（chemiluminescence)，定量螢光性變化之技術如 上所述。化學發光基質可藉由化學反應而以電子方式激發，且其 接著可放出可被量測的光或供給能量至螢光受體。酵素標記之例 子包含螢光素酶（luciferases，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素 酶；美國專利第4,737,456號）、螢光素（hidferin)、2,3_二氫呔口 井二酮（2,3-dihydrophthalazinediones)、蘋果酸去氫酶（maiate de^drogenase)、尿素酶（urease)、過氧化酶（peroxidase，例如 山葵過氧化酶（horseradishperoxidase) (HRPO))、鹼性磷酸酯酶 (alkalinephosphatase)、β-半乳糖酶（β-galactosidase)、糖化酵素 (glucoamylase)、溶菌酶（lysozyme)、醣類氧化酶（saccharide 200938630 oxidases)(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖_6_鱗酸 鹽去氫酶）、雜環氧化酶（例如尿酸酶（uricase)及黃嗓呤氧化酶 (xanthine oxidase))、乳過氧化酶（lactoperoxidase)、及微過氧化 酶（microperoxidase)。將酵素接合至抗體之技術說明於O’Sullivan et al, ''Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,5, Methods in Enzym. (Ed., J.
Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)。 酵素-基質組合之例子包含：
❹ [00283] (0以過氧化氬酶作為基質之山葵過氧化酶（HRPO)， 其中過氧化氫酶氧化染料前驅物（例如鄰苯二胺（〇rthophenylene diamine)或 3,3’,5,5’-四曱基聯苯胺氯化氫（3,3'，5,5'_tetramethyl benzidine hydrochloride (TMB)))； [00284] ⑼以對硝苯磷酸鹽（para-nitrophenylphosphate)為 顯色基質之驗性鱗酸鹽（AP);及 [00285](诅)具有顯色基質（例如對硝苯-β-D-半乳糖酶）或螢 光基質4-曱基繳形基半乳糖酶 及蛍 (4-methylumbelliferyl_/5-D-galactosidase )之β-D-半乳糖酶 (β-D-Gal) ° [00286]熟悉此項技藝者可使用多種其他酵素-基質組合（見例 如美國專利第4,275,149號及第4,318,980號）。 ^)0=87]有時可使標記間接地接合至抗體，熟悉此項技藝者應 ^成此目的之各種麟。糊而言’可使抗體魅物素（b論） t ΐ可將上述三大麵之任—標記與抗生物素蛋自（avidin) +二位亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結合，故可以 接抗體相接合；或者’為達到標記與抗體之間 接a 口二监抗體”小型半抗原（hapten)(例如地谷新（digoxin)) 同種麵記其中一者與抗半抗原抗體（例如 [002881新Hi合。如此，可完成標記與抗體的間接接合。 在本發明之另一實施例_，擬人化vWp抗體不需要被 71 200938630 加上標記，且其存在可利用結合至擬人化VWF抗體之標記抗體加 以檢測。 [00289] 可將本發明之抗體使用於任何已知之測定方法中，例 如贶爭性結合測疋、直接及間接夾心式測定（sandwich assays )、 及免疫沉澱（immunoprecipitation)測定，見 似/
Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。 [00290] 就免疫組織化學而言，腫瘤樣本可為新鮮或冷凍或經 埋置於石躐中並以例如福馬林之防腐劑加以固定。 ❹ ❹ [00291] 亦可將抗體用於活體内之診斷測定上。一般而言，可
以放射性核種（radionuclide)(例如 ulln，99Tc 14C 131I 125I 3H 32P 或S)將抗體加上標記，俾使例如可利用免疫顯像 (immunoscintigraphy)而將腫瘤定位。 [00292] 為方便故，本發明之抗體可以套件（kit)之形式來提 供（例如預定量之試劑與用以施行診斷測定之使用說明書之套裝 式組合）。若為抗體係以酵素來標記之情況，套件可包含^素所需 要之基^及輔因子（cofactor) ’例如提供可檢測之發色團或勞光團 之基質靡物；此外’可包含其他添加劑，例如穩定劑、缓衝液 j例如阻斷緩衝液(bbckbuffer)或細胞溶解緩衝液〇ysisbuffer)) 等。可廣泛地地改變各觀劑之相對量，以提供溶 最佳^試劑濃度；尤其，試劑可以乾粉末（通^ ^冷/東乾_)之喊加以提供’包括在轉時將提 度之試劑溶液之賦形劑。 週虽/辰 [00^93]擬人化vWF抗體亦可用於活體内成像，其中可 抗體給予宿主（較佳為血流），並測定宿主中产 置；此祕肋可_壯塞之砂 威及治療上。抗體可以在宿主中可檢__^ =之由rr振或其他此技藝中 記’包括糊如…)，、雙 72 200938630 CU)、錯（例如99Tc)、及銖（例如186Re及1%)等。可藉由任 何f法Ϊ放射性同位素接合至蛋白質，包括例如金屬螯合化合物 ’或乳過氧化酶、或硬化（iodination)用之四氯二苯基甘脲（iodogen) 技術。 [00294] 材料之寄存： 下列材料已經寄存於德國布藍茲維（Braunschweig)之國家菌種保 存中心（Deutsche Sammlimg vcm MikroOTgMdsmeii und Zellkulturen
GmbH (DSMZ)): (1) 2008年1月23日寄存於DSMZ、存取編號為DSM 21059之微 生物（瓦⑺/ζ·) ’其包含載體GS264，而GS264包含具有編碼擬人 化NMC-4變異株H9L9IgG4之核酸序列之輕鏈的分離核酸；⑺ 2008年1月23日寄存於DSMZ、存取編號為DSM 21060之微生 物U ‘），其包含載體GS265，而GS265包含具有編碼擬人化 NMC-4變異株H9L9IgG4之核酸序列之重鏈的分離核酸。此等寄 存皆基於微生物有機體保存專利程序之國際認可布達佩斯協定 (International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure )及其（布達佩斯協定）下之規定而為。 [00295] 在無進一步說明之下，吾人相信：在此領域中具有通 常知識者使用前述說明及下列例示性實施例，可製造並利用本發 © 明之試劑且實施所請求之方法。茲提供下列工作實施例以輔助本 發明之實施’且其不應被解釋為限制性。 實施例 實施例1 :嵌合抗體之建構 [00296] 產生NMC-4-人類Fc之嵌合體：包含來自鼠類抗體 NMC-4之變異區及人類Fc區的嵌合抗體係以下述方式加以建 構。在一例示方法中’係利用抗vWF抗體NMC-4 (例如具有已 被公開之變異區胺基酸序列之IgGl/c )作為模板（template)來產 生NMC-4之VH及VL區所用之合成基因序列（Celikel以β/，1997,
Blood Cells，Molecules and Diseases 23:123-134)。舉例而言，nmc-4 73 200938630 [00297] &-例示方法中，係利用 AccuprimePFXDNA POLYMERASE KIT (Invitrogen)來進行PCR反應；例如，組合包 ^含下列之50 μ1反應混合料（_) : IxPFX緩衝液、〇.2μΜ dNTP 混合料、1單位的PFX聚合酶、1μΜ前置引子、1μΜ反置引子及 • 働叩之DNA模板。標準之PCR程序包含：在峨下開始進行 變性（denaturation)持續1分鐘，接著以每一循環為94χ：持續3〇 秒、55°C持續30秒、68。(：持續1分鐘進行3〇個循環，以及在68。〇 下持、，ω分鐘之最後延長（^顺如心步驟。以在〇跟TAE膠 上之洋菜膠電泳純化PCR產物，切除一條（band)以上之期望大 小，並以Qiagen GEL EXTRACTION KIT純化。室溫下，在包含 > lx T4 DNA 連接酶（ligase)緩衝液、〇 5μ1 T4 DNA 連接酶 (NEB)及各DNA 100ng之10 μΐ體積中，連接（ligate) DNA片段 持續30分鐘;接著，利用1 μΐ之連接液來轉形说1〇9五w細胞， 且藉由利用貝克曼（Beckman) CEQ 8000 DNA分析儀加以定序， 以驗證PCR所產生之嵌入段（inserts )。 [00298] 此等包含來自鼠類抗體NMC-4之VH及/或VL以及人 類Fc之嵌合抗體’係根據此技藝中已知之標準規則（pr〇t〇c〇1)利 用PCR加以合成。在一例示方法中，係藉由以Njyfcw專用之引 子及人類Fc專用之引子，將來自NMC_4之VH及/或VL融合至 人類Fc。 [00299] 任意地，將胺基酸取代基導入IgGl Fc區，以破壞Fc 及補體結合部位（complement binding sites )而消除假設由野生型γΐ Fc恆定區居間促成之細胞毒性（見例如SEQ ID NO: 143 )。例如， 衍生自 I.M.A.G.E. cDNA clone #4764579 (ATCC) (SEQ ID NO: 33) 人類IgGl恆定區（如FC)係利用引子hlgG-F (SEQ ID NO: 36)及 hlgG-R (SEQ ID NO: 37)(表1)加以放大。藉由進行例如定點突 變（site directed mutagenesis )( Duncan & Winter; Nature. 332(6166):738-40(1988))，將胺基酸取代基（例如 L235E (FcR 結 合區）及E318A，K320A，K332A(在Clq補體結合部位））導入IgGl Fc區。舉例而言，利用引子對hpc_L235E-F ( SEQ ID NO: 39 )及 75 200938630 hFc-L235E-R (SEQIDNO: 40)將L235E突變導入恆定區；利用 引子對 CH2-Clq(-)-F (SEQ ID NO: 41)及 CH2-Clq(-)-R) (SEQ ID r NO: 42)(表 1)導入補體點突變（complement site mutations)。利 用兩外部引子 hlgG-F (SEQ ID NO: 36)及 IgGl-BamHI-R (SEQ ID ’ NO: 38)來連結包含四種突變之合成之PCR產物，以產生編碼修飾
IgGl Fc 區（稱為 IgGl(dm))之 PCR 產物。 [00300] 在一例示方法中，係藉由此技藝中已知之重組技術而 將NMC-4之重鏈變異區融合至修飾IgGl Fc區（例如IgGl(dm))。 例如，利用在NMC-VH之N端上游導入五coRI選殖部位之引子 NMC-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO: 34)及 NMC-VH-IgGl-R (SEQ ID 〇 NO: 35)，放大編碼NMC-4之重鏈變異區（SEQ ID NO: 1)之核苷 酸序列；要言之，藉由兩步驟之重組PCR，可使PCR產物與重鏈 恆定區（例如IgGl(dm))連結，首先利用引子對NMC-VH~EcoRI-F (SEQ ID NO: 34)及 MgG-R (SEQ ID NO: 37)，接著利用引子對 NMC-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO: 34)及 IgGl-BamHI-R (SEQ ID NO: 38)進行PCR反應。以及oRI及5amHI來分解（digest)最終之 PCR產物，並將PCR產物選殖至pIRES2-EGFP-IgK載體(Clontech， PaloAlto，CA)之五coRI及5izmHI部位中，該載體經過修飾成包 含被選殖至瓜〇1及五coRI部位之IgK先導序列（leader sequence ) (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD) (SEQ ID NO: 107))(由 SEQ ID NO: 140之多核苷酸加以編碼）。 [00301] 在一例示方法中，係藉由如下所述之重組技術而將 NMC-4之輕鏈變異區融合至修飾IgGl Fc區（例如IgGl(dm))。 例如，利用在IgK輕鏈恆定區之3’端更進一步導入5amHI限制部 位之引子 Kappa-F (SEQ ID NO: 47)及 Kappa-BamHI-R (SEQ ID NO: 48)，放大來自由 I.M.A.G.E done #4704496 (ATCC) (SEQ ID NO: 108)所製成之DNA中之IgK輕鏈恆定區（例如kCI (SEQID NO: 141));同理，利用在5,端導入五coRI部位之引子 NMC-VL-EcoRI-F (SEQ ID NO: 45)及 NMC-VL-Kappa-R (SEQ ID NO: 46)(表1)，放大來自合成VL基因之輕鏈變異區；接著，利 76 200938630 用引子 NMC_VL_EcoRI-F (SEQ ID NO: 45)及 Kappa-BamHI-R (SEQ ID NO: 48)，以重組PCR來連結NMC-4變異區及KC1片段。 以五c<?RI及jBawHI來分解最終之PCR產物，並將其選殖至相同部 位上之pIRES2-DsRed2-IgK載體中。 [00302] 相較於表現輕鍵老鼠-人類嵌合體之pIRES-DsRed質 體，在pIRES2-EGFP載體中之重鏈的表現水平可能不足，僅管對 於輕鏈及重鏈兩者皆使用相同之IgK先導序列。因此，為改善重鏈 的表現水平，利用引子對 4-59 leader-HindIII-NMC-4 (SEQ ID NO: 43) and IgGl-BamHI-R (SEQ ID NO: 38)並以 pIRES2-EGFP-NMC4-IgG(mut)載體作為模板（表1)，以來自人類 生殖細胞株 4-59 VH (MKHLWFFLLLVAAPRWVLS) (SEQ ID NO: 109)之先導序列取代IgK先導序列；片段則以及/>„^1加以 分解，並次選殖至 pcDNA6-cMyc-A 載體（Invitrogen，Carlsbad，CA) 之部位。 [00303] AJW2〇0參考抗體之建構：AJW200為針對VWF之 A1領域之另一抗體，其具有阻斷vWF A1領域與GPIb-α之間的交 互作用之能力。AJW200參考抗體係藉由設計美國專利第6,228,360 中所述之VH及VL序列，以包含例如改善表現用之額外功能性 Kozak序列而產生。舉例而言，合成之AJW200VH基因係利用引 子 Hind III-Ko-AJW-F (SEQ ID NO: 49)及 HuFab-H-R (SEQ ID NO: 50)(表2)加以放大’並將其選殖至包含人類igGl(dm)重鏈恆定 區之以分解的pCDNA6_cMyc-A載體之历m/ΙΠ及 却αΐ部位中（藉以取代NMC-4之VH);而AJW200 VL係利用引 子對 XhoI-Ko-AJW-F (SEQ ID NO: 51)及 Kappa-BamHI-R (SEQ ID NO: 48)加以放大’並將其次選殖至帶有NMC-4輕鏈嵌合體之瓜01 及5amHI部位中（藉以取代NMC-4之VL )。 77 200938630 積（例如0.2-0.3 ml)。在此濃縮步驟期間，利用PBS進行中間稀 釋’以將緩衝液由Tris-甘胺酸換成PBS。利用透過例如〇 2卿針 • 頭過濾器之過濾而使最終濃縮液無菌化，並利用勞立（Lowry)蛋 . 白質測定法（BioRadDC蛋白質測定法）來決定含抗體樣太 白質濃度。 [00306] 就大規模純化而言’以超過滤在中空纖維匣（例如
Amersham Biosciences 30,000 NMWC/290 cm2 之中空纖維管柱 UFP-30-C-3X2MA)上濃縮來自短暫轉染附生細胞（例如 HEK-293T)之2L條件培養基，直至體積降至〜2〇〇 ml為止。將此 濃縮物質或用於較小型轉染之純CM抽取至已利用〇. 1 m，pH 8 0 ❹ 的Tris'HC1加以平衡之12 ml蛋白質A之SEPHAROSE管柱上， 再以0.1 M，PH 8.0的Tris-HCl清洗管柱，直至之讀數已建 立基線為止。以0.1 M，pH 2.7之甘胺酸洗出抗體並收集3 mi之分 餾液’藉由加入0.1 M，pH 8.0的Tris-HCl至0.1 Μ的最終濃度來 調整含尖峰蛋白質（peakprotein)之分餾液的ρΗ值；集合尖^分 顧液’藉由超過濾（例如在離心裝置上）將其濃縮至小於71 體積，接著利用在ΡΓΜ0管柱上（Amersham 如之
Biosciences/GE-Healthcare)之兩獨立回合進行去鹽化。 [00307] 藉由此技藝中已知之方法（例如勞立（Lowry)蛋白質 ❿ 測定法（Bi〇RadDC蛋白質測定法）），定量並分析得自於培養上 澄液之蛋白質。在一例示方法中，係以SDS_PAGE分析培養上澄 液’要s之’將蛋白質轉換至硝化纖維膜，在室溫下以5%牛奶^pBS 阻斷持續1小時，並與接合有HRP之老鼠抗人類IgG (例知鏈 特異性（γ-chainspecific) ’ 1:10,000)及老鼠抗人類卡帕（例如κ_ 鏈特異性）一起培養，以ECL套件檢測訊號。 · [00308] 在瑞斯特黴素（ristocetin)誘導血小板凝集測定中之 活體内抑制活性：在一例示方法中，測試嵌合胃心斗人類&抗 體之活性，包括例如對於vWF之結合特異性。舉例而言，血小板 凝集測定係以標準血小板凝集測定儀（aggreg〇meter) (Bi〇/Data, model PAP-4)、利用冷凍乾燥之人類血小板（Bi〇/〇ata，H〇rsham 79 200938630 st〇ck) 體積t含有 L之入至試管以啟動凝集反應前10秒，記錄基線讀 ，估^測试抗體之EQ。值，作為抑制5〇%血小板凝集之 ”=單株抗體她’絲體表現出等同於親代鼠類^c_4抗體 之效力。 ❹ ❹ =309]再者，為更精確地判定心值，利用例如改編自微孔 盤（m〇cr〇plate)法之反應盤判讀器（platereade〇法來測 抗體。在一例示方法中，利用96-wel1COSTAR36〇3plate添加 池（perwell) 15〇1111丁38_7.5)中包含4.5><1〇7個經三聚曱醛 (pamofrmaldehyde)固定之血小板，並添加純化人類vWp (Calbiochem，SanDiego, CA)至每池 1.5 pg/mL 之最終濃度。在 加入瑞斯特黴素至每池1.5 mg/mL之最終濃度後，添加一連串濃 度之測試抗體，以啟動凝集反應，並利用設定於37它下持續6分 鐘、而讀取循環之間有20秒機載振盪（on_b〇ard shaking)之 SPECT狀隱X PLUS PLATE 腿DER (Molecular Devices)監測 濁度（例如在405nm下之吸收度）。加入（例如20p1/well)抑制 劑化合物或參考MAb (例如AVW-3)，培養且監測該混合物達2 分鐘。最後’加入瑞斯特黴素或美洲予頭蝮毒蛋白（b〇tr〇cetin)(例 如20 μΙ/well)培養且監測該混合物達40分鐘。監測以吸收度減 少之程度（例如-△吸收度）之凝集訊號。 [00310] 比較NMC-4-人類Fc嵌合體與原始NMC-4單株抗 體、以及所選殖之AJW200抗體。如圖1所示，在瑞斯特黴素誘 導血小板凝集測定中，NMC-4嵌合抗體在活性方面類似於原始 NMC-4MAb，且略優於AJW200，其EC50值分別為〇.1，〇.17,及 0.27 nM。 ’ 實施例2 :擬人化抗體之建構 [00311] 人類受體架構之篩選：可利用資料庫（例如人類生殖 200938630 細胞株資料庫、人類V區資料庫（Vbase)、或卡巴（Kabat)資料 庫）或公開發表刊物（例如 Kabat et al.，Sequences of Proteins of' • Immunological Interest，1992 )來識別鼠類重鏈及輕鏈v區所屬之 • 亞科（subfamily)，並判定最適之人類生殖細胞株架構，以利用之 作為受體分子。其中可利用此等亞科内之VH及VL序列作為受體 序列之篩選，可基於序列同源性及/或CDR1及CDR2區之典型結 構之匹配性，以幫助保存六個CDRs在移植後之適當相對表現厂 [00312] 舉例而言，假定識別出NMC-4 VL架構與忙亞科i (νκι)之成員之間具有良好同源性’則使用人類v區資料庫指 出NMC-4之K輕鏈屬於卡帕1亞科。吾人觀察到：生殖細胞株序 €> 列〇18(SEQIDNO:5)具有CDR環路之典型結構之最高同源性 及最佳保存性，就上至CDR3全部序列而言，其具有78%之序列 相同性（sequenceidenty);就架構區而言’其具有84%之序列相 同性。NMC-4 輕鏈、人類重鏈 〇18 (SEQ ID NO: 5)、及 AAK94808 (得自於018之成熟抗體，用來提供LCDR3及架構4序列，以 與此區中之NMC-4相比較）（SEQ ID NO: 6)之比對（alignment) 顯示於表3中，NMC-4與人類抗體之間的差異係以粗體字表示（編 號係基於卡巴記數制（Kabat, 1978))。 [00313] 同樣地，使用人類V區資料庫指出直至架構3之VH ❹ 序列落在VH亞科IV中。在人類VH亞科IV内，NMC-4 VH顯 示4-59生殖細胞株序列（SEQ ID NO: 3)具有最高序列同源性， 就直至CDR3的整個VH而言，展現對鼠類VH 56%之序列相同 性；單就架構區而言，則展現67%之相同性（表4)。在不受限於 本發明之理論下，選擇AAC18165.1 (SEQ ID NO·· 4)以提供HCDR3 及架構4比較序列（comparator sequence )’因為其在架構1至3 與HCDR1及HCDR2中具有與人類生殖細胞株4-59VH相同之胺 基酸序列。吾人已知HCDR3為高度分歧者，且FW4為取自於獨 立基因產物(J)之不同領域，故HCDR3及架構4並未被包含在人類 V區資料庫之VH生殖細胞株序列中。在表4中，將NMC-4VH 與AAC18165.1 (SEQIDNO:4)序列之間的胺基酸差異以粗體字、 200938630 其位置以星號加以強調 表3 NMC-4 VL與人類抗體AAK94808之比對，後者具有與人 類生殖細胞株VL，018相同之胺基酸架構、CDR1及CDR2序列 〇
Kabat No: 78901234567890123456789012345678 901234567 NMC-4 VL GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPED工ATYYC QQYEKLPWT 018 (AAK94808) GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQYDNLPLT CDR3 *8 -9·
Name FW1 ---------1----*----2-*-
Kabat No: 12345678901234567890123
NMC-4 VL (SEQIDNO： 2) DIQMTQSPSSLSASLGDRVTISC 018(AAK94808) (SEQ ID NO: 6) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC Name FW3 • 6, CDR1 FW2 CDR2 ★ — 一 么喻^ 4r —. 41 45678901234 567890123456789 0123456
SASQD 工 NKYLN WYQQKPDGAVKLLIF YTSSLHS QASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIY DASNLET FW4 8901234567
FGGGTKLEVK
FGGGTKVEIK 表4 NMC-4VH與人類抗體AAC18165.1之比對，後者具有與 人類生殖細胞株4-59相同之架構、CDR1及CDR2胺基酸序列
Name FW1 CDR1 FW2 CDR2 ----*----!--*--**-_*------*_*3*-*** - *- -4-------* - 5 - * * * -
Kabat No： 12345678901234567 89012345 6789012345 678 901234 56789 01234567 89012345
NMC-4 VH
(SEQ Π> NO： 1) QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVS GFSLTDYGVD WVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYNSALKS 4-59(ACC18165.1) (SEQ ID NO: 4) QVQLQESGPGLVKPSBTLSLTCTVS GGSXSSYYWSWXRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKS Name FW3 CDR3 FW4 _**-7*-* — - ****8~** — **** — — — *9 — *- *****iq****★_ _ _____
567890abcdef12 34567890123 DPADYGNYDYALDY WGQGTSVTVSS GYRF6VAAHSFFDY WGQGTLVTVSS
Kabat No： 67890123456789012abc345678901234
NMC - 4 VH RLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCVR
4-59 (AAC18165.1) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
[00314] 由於吾人假設來自老鼠抗體之CDRs直接移植至人類 抗體架構造成了抗原結合親和力之損失（Foote and Winter /. Mo/. Biol. 224: 487-499 (1992); Xiang et al JMol Biol 253:385-90 (1995); Homes et al，·/· //wmwwo/. 167:296-301 (2001))，故可能期望使架構中 82 200938630
表7 用來建構擬人化重鏈變異株之模板及引子總結 VH變異株 棋板 片段-1 PCR引 子 片段-2 PCR 引子 最終VHPCR 引子 載體 選殖部位 H2 來自 Retrogen 之合成DNA 4-59-huNMC-F 及 hu-VH-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H4 H2 in pcDNA6-lgG1( dm) PCDNA6-F 及 VH-V93A-Rev VH-V93A-For 及 hFc-L235E-R pcDNA6-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H5 H2 in pcDNA6-lgG1( dm) pcDNA6-F 及 HC-L67V-R HC-L67V-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H6 H2 in pcDNA6-!gG1( dm) pcDNA6-F 及 HC-K71V-R HC-K71V-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H7 H2 in pcDNA6-lgG1( dm) pcDNA6-F 及 HC-N73T-R HC-N73T-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H8 H2 in pcDNA6-lgG1( dm) pcDNA6-F 及 HC-V78F-R HC.V78F-F 及 hFc-L235E-R pcDNA6-F 及 hFc-L235E-R PCDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H9 來自 Retrogen 之合成DNA 4-59-huNMC-F 及 hu-VH-R pcDNA6- lgG1(dm) Hindlll Apal H6 V67L, T73N, F78V, A93V L7 P44V. Y49F F73L, G100O H7 V67L, V71K, F78V, A93V L8 無回復突變 F73L. G1000 H8 V67L, V71K, T73N, A93V L9 無回復突變 F73L, I83F, G100Q H9 無回復突變 [00317] 比較假設可影響標準結構及介面堆積之殘基可知：在 NMC-4VL與018人類VL受體架構（例如殘基44,49，及71)之 間有三處差異，因此，可設計出帶有三個至鼠類殘基之回復突變 (例如P44V，Y49F，及F71Y)之原型擬人化變異株L5 ;此外，此 變異株被設計成具有由***酸改變成白胺酸（leucine)之殘基 73，因為在人類抗體清單中，白胺酸為在此位置上更常見之殘基。 85 200938630 LC-P44V-F 5，-AAGCCCGGCAAGGCCGTC AAGCTGCTGATC _3， (SEQ ID NO: 78) LC-P44v.R 5 ^-GATCAGC AGCTTGACGGCCTTGC CGGGCTT -3f (SEQ ID NO: 79) LC-F49Y-F 5^-GCCGTCAAGCTGCTGATCTA CTACACCAG-3* (SEQ ID NO: 80) —----- LC-F49Y-R 5，CTGGTGTAGTAGATCAGCAGCT TGACGGC -3， (SEQ ID NO: 81) LC-Y71F-F 5，-GGC AGCGGCACCGACTTC A CCCTGACCATC ·3， (SEQ ID NO: 82) LC-V71F.R 5^GATGGTCAGGGTGAAGTCGGTG CCGCTGCC -3* (SEQ ID NO: 83) HuLC-V44P， F49Y-F 5’-GGC AAGGCCCCC AAGCTGCT GATCTACTACACCAG _3， (SEQ ID NO: 84) HuLC-V44Pj F49Y-R ~~— . 5’-CTGGTGTAGTAGATCAGCAGC TTGGGGGCCTTGCC -3’ (SEQ ID NO: 85) ❹[〇〇318]平行於選殖此等第-紅變異株，利用在BLAST搜尋中 經識別為具有向上直到HCDR3之所有序列之最高序列相同性 (88%)及架構區之89%序列相同性的1DNQ pdb結構（例如2 3 埃解析度）’建立電腦產生之4-59受體生殖細胞株序列之三維模 型選擇結構lAOK.pdb作為具有8i〇/〇序列相同性之擬人化 序列之模板。可利用鼠類NMCM Fv之兩結晶結構：丨Α〇κ_(例 如2.2人解析度）’其已結合抗原（Celikeleia/，舰s加ct腿 5··189·194 (1998))且亦被選為在原型擬人化變異株之VH領域中 之最佳配適，及IFNS.pdb (2.0人解析度），已結合至突變抗原。 _ lA0K.pdb及IFNS.pdb兩者具有實質上相同之介面角、 (interface angle) ’故將lAOK，pdb用於重疊人類受體之模型及擬 人化VH及VL序列之模型。 、 [00319]當重疊NMC-4 VH及4-59之骨幹結構時，可觀察到三 區差異。第一’差異存在於殘基H27至犯3，其包含11(：1)111之 一部分。不受限於本發明之理論，這些殘基接觸共同形成抗原結 合部位之一部分的HCDR2及HCDR3。吾人預測殘基34 (在鼠^ NMC-4 VH中為Val，在4-59序列中為Trp)極可能為H27-33環 路之構形改變的原因，且因此為回復突變之候選者。第二，差異 存在於殘基H52至H55 ’其形成CDR2環路之一部分。吾人認為 架構殘基71(老鼠中之Lys，4-59中之Val)極可能與此差異有關， 88 200938630 ΐΞϊίΓ復突變之候選者。在4·59結構中之三額外殘基被識別 出極可旎阻礙抗原結合：Η37，相較於老鼠中之Val，豆為ne之
❹ 保守性變化；H73，相較於老鼠中之Asp，其代表砂、中之恤 的和緩變化；及H78，相較於老鼠中之Val，其代表4_59中之phe 的巨大變化。帛三’差異存在；^CDR3 +，可麵其+之歧異性。 [00320]關於將生殖細胞株018及原型擬人化抗體VL領域模 型化，結構1101^^(11)(例如2.3入解析度）與〇18具有優異之序 列相同性（例如95%)，有四處差異在殘基L34, Μ5, L47，及L92。 選擇OlBJi.pdb作為原型擬人化VL之模板，因為其可匹配97/1〇7 殘基（例如91%序列相同性）。 [00321] NMC_4之VL骨幹及〇18 VL結構之良好配適性符合 序列相同性，唯一明顯之結構差異在由殘基U9_L45所組成之環 路中，其接觸VH且因此影響堆積接著影響結合囊袋（binding pocket)之形狀。不受限於本發明之理論，殘基44 (例如老鼠中 之Val、4_59中之Pro)可能為此差異之原因，因此基於電腦模型 化而可能為回復突變之候選者。 、 [00232] 在瑞斯特黴素誘導血小板凝集測定中之艘外（加νι·ί#Ό ) 抑制活性·為測試電腦模型化預測是否可準碟地預測在活性上之 效應，將VH2原型變異株與VL變異株（例如L4, 5, 6及7)配對， 且將原型L5與VH變異株（例如H2, H4, H5, H6, H7及H8 )相結 合。藉由HEK293T細胞之暫時轉染來產生抗體變異株，並如同針 對實施例中之NMC-4嵌合抗體所述’將其由經過濾之培養上澄液 中純化出來。 [00323] 瑞斯特黴素誘導jk小板凝集測定係利用如實施例1中 所述之冷來乾燥血小板加以施行。針對複製抗體之一連串稀釋 液’利用Spectromax反應盤判讀器（MolecularDevices)量測吸 收度之變化、並利用Prism軟體來分析資料，以判定各種不同之純 化抗體變異株之EC50值（見例如表9)。 [00324] 擬人化抗體之第一型（由H2及L5所組成）展現與親 代般合體（例如EQo為〇·18ηΜ)相同之活性（例如EC50為0.13) 89 200938630 如表14所示，可容忍導入三處變異以將LCDR1轉換成完全為〇18 之LCDR1 ’且不致引發效力上之明顯損失。當H12，13,及14變 異株與L9結合時，H12-L9變異株抗體在效力上顯示出略有損失； . 但額外V34W突變保留了完整之效力，且加入S61P及A62S'突變 在效力上幾無影響，此表示這些殘基可在不影響活性之情況下被 轉換成4-59序列。其次，LCDR2在維持vWF阻斷活性上之重要 性，係藉由建構L10鏈之變異株加以評價，在該L10鏈之變異株 中，整個LCDR2 (YTSSLHS) (SEQID NO: 11)皆利用編碼VL變異 株L10之質體及表11及12中所列之引子對，而由人類生殖細胞 株 018 LCDR2 (DASNLET) (SEQ ID NO: 118)加以取代。接著將 © 此新建構之變異株L11與H14配對，以產生抗體變異株L11-H14。 * 雖然此變異株仍展現nM級效力，但相較於血小板凝集測試中之 嵌合體（ECso為1.63nM)，其活性卻降低1〇倍，此暗指LCDR2 可能為擬人化抗體達到最適活性所不可或缺者。
92 200938630 新0又°十輕鍵及重鍵開放閱讀框架（open reading frames)，以包含5, 端（例如Mol及Hindlll部位）及3,端（例如Bamm及Notl部位) 上之限制核酸内切酶部位，以輔助將其次選殖成表現載體 ' pST0518之多重選殖部位，而用於下游細胞株發展及大規模抗體 生產（表15 )。 [00330] 舉例而言’藉由以IgG4恆定區取代igGl恆定區，並 在重鏈表現卡匣（cassette)之5’端上導入瓜〇[及价部位、 而在3’端上導入所則皿及他红部位，將兩擬人化VH變異株H9 及H14轉換成lg〇4形式。IgGl及IgG4兩者在靠近變異區及恆定 區之接合處皆包含自然生成之却部位，此部位被用來在IgG4 ❹ (取代在1gGl)中選殖。將五flw/Π及限制部位置放於序列 之3’端上，以輔助稍後至pST〇518載體内之次選殖。利用Blue Heron Biotechnology (Bothell，WA)，客製化合成具有加入万⑽M 及AM部位、由却αΐ部位至終止密碼子（terminati〇nc〇d〇n)之 ***子刪除（intron-deleted)之IgG4恆定區序列。再者，藉由以 被設計成在重鏈變異區之5’端包含历Win及瓜〇1且***IgK訊號 序列之引子進行重疊PCR (overlappingPCR)，將pSTO518載體 中之訊號序列改變成Igic前導子（leader)序列。 [00331] H9及H14重鏈序列有相同之引子區，因此兩者均使 ❹ 用相同之引子及選殖策略。產生兩獨立之PCR產物，每一者皆包 含在huNMC4-H9 (及huNMC4-H14)重鏈變異區中所必須之變化 其中一者。利用pIRESdsRed-HULlO作為模板以及引子igKLF _(3©>^0:100)及18纽11111成师(3〇3肋：101)(見表15&及 15b)’進行在前置引子上包含及历限制部位且放大IgK 訊號胜肽之PCR反應，接著進行利用pCDNA6-H9 (or pCDNA6-H14)作為模板以及引子 14VHF(SEQIDNO: 102)及 14VHR(SEQ IDNO: 103)、並與第一 PCR反應重疊30個核皆酸之 第二反應步驟，PCR產物包含H9 (或H14)變異區以及IgGl恆 定區經過ΧραΙ部位之前五個胺基酸；恆定區之前五個胺基酸在 IgGl與IgG4之間並無不同。該反應在^(pal部位之後加入部 96 200938630 位’以輔助在***IgG4恆定區之前的變異區之選殖。藉由第三 PCR步驟（利用前兩步驟之反應產物作為模板、第一反應之前置 ' 引子（IgKLF)、及第二反應之反置引子（14VHR))，在上游加入 卡帕前導子；以分解來自此反應之產物，並將其***以 相同方式分解之質體骨幹pCIneo中，此連接（ligation)產生了選 殖中間體 pCI-NMC4-VH9var (或 pCI-NMC4-VH14var)，其含有 Ig前導子及NMC4-H9 (或H14)之變異區。以Apal及Notl分 解來自於Blue Heron Biotechnology且含有重新（de novo)合成之 IgG4恒定區之質體，以凝膠純化（gel-purified) 1 kb之IgG4怪定 區片段並連接成為却al/iVoil分解之pCI-NMC4-VH9var (或 ❹ pCI-NMC4-VH14var))，如此便產生了 pCI-NMC4-VH9 及 PCI-NMC4-VH14。在轉形成DH5a細胞後，對來自個別選殖株之 質體嵌入段進行定序以確認其為正確者。 表15a 用於重鏈PCR反應中之引子 名稱 序列 IgKLF 5’CCTATCTCGAGAAGCTTCCACCATGGAGACAGACACACTCCT (SEQ ID NO: 100) IgKHnmcR 5,ACCCGGACCGGATTCCTGCAGCTGCACCTGTCCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGC (SEQ ID NO: 101) 14VHF 5'CAGGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTCCG (SEQ ID NO: 102) 14VHR 5，CCTATGCGGCCGCGGGCCCTTGGTGGAAGCGGAGGAAACGGT (SEQ ID NO: 103) 表15b 用於重鏈建構之PCR反應 PCR 前置引子 反置引子 模板 產物 1st IgKLF IgKHnmcR pIRESdsRed-huL 10 Xhol，Hindlll，IgK 訊號胜肽 2nd 14VHF 14VHR pCDNA6-huH9, (orpCDNA6-huH14) hu-H9 變異區,Apal, Notl (或 hu-H14 變異區,Apal, Notl) 3rd IgKLF 14VHR 以上兩PCR反應之產物 Hu-VH9 (或VH14)變異區 [00332] L9及L10輕鏈中之變化係藉由PCR來完成。由於L9 及L10輕鏈有相同之引子區，因此兩者均使用相同之引子及選殖 97 200938630 (5 ’-AGCGAATTCCCCCGAACCCCCCCTGCAC AACTTC-3，）
(SEQ ID NO: 114)及 Rat-vWF-Al_R (5 ’-AGTGCGGCCGCTTATCACCTTTTGGGTCCTGGTGATGAAA CC-3’）（SEQ ID NO·· 115)，將染色體 DNA 用於 PCR 反應。將 PCR 產物以EcoRI及Notl加以分解，並選殖入pETDuct-l載體之相同 部位中；將所連接成之產物轉形成DH5a勝任細胞。 [00336] 以25 ml之過夜細菌培養液（例如帶有質體P35 [pET-Duet-Rat-A1 ] 或 ρ3ό [pET-Duet-human-Al] 之
OrigamiB菌株）’培養含有抗生素卡本西林（Carbencillin)、康黴 素、四環黴素之1公升細菌培養基（LB或2χΥΤ)，使培養液在
❹ 37°C下的搖瓶中生長至OD600為0.6-0.8。藉由加入IPTG至ImM 之最終濃度來誘導重組蛋白質的表現；接著，在37°C下繼續培養 培養液持續另外4-5小時；之後在JA-10轉子（貝克曼）中以6000 rpm離心’收集細菌。將細胞沉澱物（ceu peilet)於_8〇。〇下冷凍， 或立即藉由使沉澱物在含有兩錠溶解之完全蛋白酶抑制劑 (Roche)之20 ml PBS中重新懸浮加以處理，對所得之細胞懸浮 液在冰塊上施行兩次2分鐘之細胞破裂循環(例如使用在1-2之固 定負載循環設定及輸出控制設定下、配備著微量滴管尖頭 (micro-tip )之 Branson Sonifier 250 )。在 4。〇 下，以 16000 rpm 於 ❹ JA-20轉子（貝克曼）中離心這些細胞溶解產物（cell lySate)持續 30分鐘；以0.45 μηι之針頭過濾器過濾上澄液，之後利用已在結 合緩衝液（5mM 之咪唑，〇.3MNaC卜 50mMTris-HCl，pH8.0) 中平衡過且填充著His-SelectHF鎳親和性凝膠（Sigma)之管柱， 以將流速調整於1 ml/min之注射泵浦來施行層析法。在以2〇ml 之結合緩衝液沖洗管柱後，以250 mM之咪唑，0.3 M NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 8.0洗出蛋白質，並收集1 ml之分餾液；大多數蛋白 質在刖4個洗出分德内便被洗出。在經考馬斯（Coomassie)藍染 色之SDS-聚丙烯醯胺凝膠（p〇iyacryiami(ie gel)上監測蛋白質之 大小（〜28kD)及完整性。集合尖峰分顧液，若有必要則將其濃 縮至 2.5 ml，接著利用 PD-10 管柱（Amersham/GE-Healthcare)去 100 200938630 鹽化成PBS。利用勞立（Lowry)蛋白質測定法（BioRadDC蛋白 質測定法）來決定蛋白質濃度。 [00337] 結合動力學··施行敏感性測定以評估、尤。#及& 數值’藉此分析並純化銪（N1螯合劑）抗體接合體。利用分解增 強型鑭系氟免疫測定法（DELFIA)，量測此等以銪標定之NMC-4 嵌合體及亞型控制抗體至固定化A1抗原之結合。 [00338] 舉例而言，以銪標定之控制抗體（例如亞型控制組 MOPC-21，來自人類骨髓漿之IgGi/K;Sigma_Aldrich，stL〇uis MO) 及NMC-4嵌合體；要言之，將抗體加入經無菌過濾處理之磷酸鈉 缓衝液（96 mM，pH 7.4)，並廣泛地透析成磷酸鹽緩衝液（PBS，
❹ Phosphate Buffered Saline ; 1.47 mM KH2P〇4, 8.1 mM Na2HP04, pH 7.4, 138mMNaCl及2.67mMKCl)，以移除低分子量一級胺。在 4°C下，以 9500rpm (7000xg)之 JA-20 轉子在沖洗式 MicroSep 濃縮器中濃縮經透析之抗體持續20分鐘，以含有最終濃度為1〇〇 mM NaHC〇3, pH 9.3之PBS調整抗體至4.0 mg/m卜藉由以吸管 (pipet)溫和地上下吸移，將mAb/二碳酸鹽（bicarbonate)混合 物（0.250 ml)混合至含有以 Eu3 ( Eu-Nl-ITC; Perkin Elmer Life Sciences，WalthamMA)螯合之V-(對異硫氰苄基)_二伸乙三胺 -Α^Λ^7ν3,7ν3-四乙酸 • ( 7/1-(p-isothiocyanatobe 的 yl)-diethylenetriamine-A^ 尤 ,A^3-tetmac etic acid) 0.2 mg中’使抗體及胺反應性螯合劑之混合物在4〇c、 不攪拌之情況下反應隔夜。 [00339] 將經標定之抗體混合物施加至以PBS預平衡之獨立 NAP-10 管柱（AmershamBiosciences，Piscataway,NJ)，利用作為 管柱緩衝液之PBS收集分餾液;在藉由利用Vict〇r2多標定反應盤 判讀器（Perkin-Elmer)之時間解析螢光法（time_res〇lved fluorescence, TRF )、於 DELFIA 增強溶液（Perkin—Elmer )中以 1:10,000稀釋之後，利用SpectraMax384吸收度反應盤判讀器測 疋樣本之總蛋白質（例如布萊德福試劑（Bradford reagent); Bio~Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)及銪。集合對蛋白質及銪兩者皆 101 200938630 為％性反應之分顧液，並將其施加至以電泳緩衝液（如皿hg puffer)； 50 mM Tris，pH 7,4 and 138 mMNaCl)預平衡之新 NAP-10 1柱，由這些管柱集合對蛋白質及以銪標定兩者皆為陽性反應之 ' 分餾液，並將其施加至以電泳緩衝液預平衡之PD-10管柱，集合 對蛋白質及以銪標定兩者皆為陽性反應之分餾液，並藉由對照銪 標準液（Peridn-Elmer)加以校正之TRF來測定總蛋白質及銪含 量。接著計算F··蛋白質比例。 [00340]以來自人類(例如在 100 μΐ/well 中，30 mM Tris, pH 7.4 f 300mMNaCl或不含二價陽離子之PBS中之25ng)或下隔 夜培養之小鼠（例如50 ng/well)之VWF的His-Al領域塗佈 Immulon-4反應盤池。在室溫下，利用以300 μΐ/well阻斷緩衝液 (例如含有3.0 mg/ml的無lgG之BSA及01%疊氮化鈉之清洗緩 衝液）加以阻斷之清洗緩衝液（Wash Buffer，例如50 mM HEPES， pH7.4, 150mMNaCl，〇.5%Tween_2〇)清洗反應盤三次持續1小 時，且在使用前以清洗緩衝液清洗5次^ [〇〇341]如下施行平衡結合測定。將銪-抗體預先稀釋入結合緩 衝液，（例如含有3.0 mg/ml的無lgG之BSA及0.1%疊氮化鈉之清 洗緩衝液）中並施加至96池之各池，以SEALPLATE膜密封住反 應盤。振盪反應盤（例如若15秒以上或者在室溫下6〇秒，將Titer ❹ PlateShak=速率設定在4)，將其置入含有溼紙巾之他⑼狀盒 内，於37°C下在封閉盒中培養2小時。就無標定者之量測而言， 將上澄液樣本（4.0 μΐ)由含有結合混合物之各池轉移至含有 DELFIA增強溶液（ι〇〇μι/λν6ΐ1)之一平行池組中。為評估被結合 之抗體，以清洗緩衝液清洗具有剩餘結合混合物之Ai塗佈池五 次，在紙=上輕拍乾，且將DELFIA增強溶液（1〇〇 _weU)加入 =空池以量測被結合之抗體。就測定校正而言，將DELFIA增強 溶液（100 μΐ/well)加入未用池並加入銪標準液（丨〇 w/weli)。振 盪反應盤（例如在室溫下將Titer piate shaker速率設定在5持續 10分鐘），利用Victor2多標定反應盤判讀器（Perkin-Elmer Wallac， Boston，ΜΑ)讀取時間解析螢光（TRF)強度，藉由個別抗體之氟:’ 102 200938630 蛋白質比例（F:P)而將結合情形就銪螯合物含量加以正規化。藉 由將總結合(例如Eu-NMC-4之結合)扣除非特定結合(n〇n_spedfic binding ’例如以Eu標定之亞型控制組之平均結合）計算特定結 合，以Scatchard(1949)法計算結合部位之數目及iQ值，藉由將 l〇g(7/〇-；7))對自由Eu-NMC-4濃度之對數作圖以繪製出希爾圖來 估算結合狀況，其中η為每池之高親和性結合部位之數目，^為每 池之特定結合Eu-NMC-4 mAb之平均數，且自由Eu-NMC-4後合 體則由溶液相中所量測之TRF讀數加以計算。 入口 [00342] 此分析透露出兩類結合部位：及/為〇·37 nm之高親和 性部位及為5 nM之低親和性部位；同理，結合至來自由抗His mAb所捕獲之小鼠vWF之His_rA1亦展現出具有〇 19及3 Am 之^值（表17)之兩類結合部位。 fit5二3rc下培養持續—段指定時間；以清洗緩 衝液 > 月洗含有結合混合物之反應盤五次，在紙巾心遍，墟
[⑻343]利用相同規則決定結合動力學，除了在不同時點以指 示濃度（100 μΐ/wdl)之以銪標定之抗體代替清洗緩衝液以外。立 即封住反應盤、振| (例如在室溫下將版恤—速率設定 特定結合對時間，量測每一 on-rate ) kon> app 〇
[00344] 擬合至線性狂本、.
Kn,app = ^〇„[mAb] + k〇ff
[00345] 其中結/ Eu-NMC-4之濃度， [00346] 所計算】 103 200938630 [00351] 以競爭結合測定法來測試AJW200抗體。相較於與 Eu-NMC-4結合至His-Al競爭之擬人化NMC_4變異抶 • 結合至His-Al被AJW200強化，其EQo為21〇 pM (圖2 )。 ·
Eu-NMC-4結合至His-Al之希爾圖顯示出接近i之希爾斜 = 0.984及0.957) ’與在無協同性下結合至單一類衾士 合部位一致。相較之下，在1.8nM或20nMAJW2〇Z存在時 別見圖2C及2D)之Eu-NMC-4結合至His-Al的希爾圖顯現大二 1之希爾斜率（吻=1.548及1.201)，此表示正向（p〇sitive)協同 性（coopemtivity)。由AJW200作為媒介之正向協同性在兩不同曰 所進行之兩獨立實驗中被觀察到，這些結果不僅證實了 NMC—4結 φ 合至AJW200在vWF之A1領域上之獨立結合部位，亦指出至^ 就分離之A1片段而言’ AJW200使NMC-4能夠結合至GPIb_a結 合部位。 實施例5 ··抗體阻斷血小板附著之能力 [00352] 抗體阻斷在vWF上之GPIb-a受體結合部位之證實為 其在原始流動條件下對抗vWF-GPIb交互作用力之能力。已由 Moake 及其同僚（1986, JC/z>i /«vest. 78:1456-61)發展出之一方法 發現以下事實：當以組織胺活化内皮細胞時，其分泌出超大型vWf (ULvWF) ’其中A1領域係處於開放（例如活性）構形中。因 P ULvWF之ADAMS-13媒介***之故，内皮細胞在導入漿液之下 迅速瓦解（Dong et al.，2002 100:4033-9 )。 [00353] 在一例示方法中，分出第一轉徙接種（passage) (pi) HUVECs，並以lxl〇5細胞/培養皿之密度接種至35 mm之培養皿 上’培養7天，且在第7天（在其1〇〇〇/0簇集後2-3天）時使用。 在1.2mL/min之流速下，以CFSE標定之人類血小板輕易地附著 至HUVECs (圖3A);當在室溫下以25 μΜ之組織胺預處理細胞 達10分鐘時’更多血小板附著至HUVECs (圖3B);當血小板在 含有濃度為10 pg/ml之NMC-4之緩衝液中被灌注成單層時，完全 抑制住此種血小板之附著（圖3C);而當血小板在濃度為18 pg/ml 106 200938630 體/例如編）存在下被灌注時，則血小板之附著 fM刀阻斷。相較之下，濃度為18 Mg/ml之鼠類栌制 未阻止血小板附著至vWF聚合物上（ $、· j 為媒介。當吾人自每回合所擷取之2°個影像量測被 ί;=ίίί面?並利用—軟體加以定量日寺，相較於控制 =體所&成之可忽略效應，NMC_4將血小板附著性減少了 95% 以上。 實施例6 :抗體預防血管阻塞之能力 © [00354]利用動脈血栓之氣化鐵模型，以評估^^_4嵌合體及 擬人化衍生株（例如H14，L10)相較於AJW2〇〇之抗血栓活性。 對側頸動脈係透過唾腺及附隨脂肪組織重新定位至切口之頭顱 侧，使?動脈外露，並將其置於折疊成可作為毅驗脈之支架 且提供氯化鐵（7.5% )溶液之表面的一片據紙（例如4 咖） 上。在施加FeCl3溶液4分鐘後，置放流動探針於頸動脈附近，並 利用Transonic Systems Inc·流動系統（池咖，!^)量測流量，直 至阻塞之時間（在控制組小鼠中一般為1〇分鐘）或45分鐘為止。 在1 μΐ/g小鼠體重之體積下以隻小鼠之各組彳生理食鹽水之炉^) ❹皆投以範圍例如由5至〇.〇1 mg/kg之NMC-4嵌合體、V14,L10、 AJW200或控制組IgG的4種劑量。無菌過濾抗體製備液，且在 遵照製造商之規則下利用LIMULUS AMOEBOCYTE ASSAY KIT (BioWhittaker)加以測試，以確保低内毒素含量；並在使用作動物 研九之刖’以HPLC分析估計單分散性（m〇n〇_diSpersity)0 [00355] 如圖4所示，NMC-4及AJW200兩者大幅地抑制了血 管阻塞。NMC-4在劑量為〇.〇3及oj mg/kg下顯現出類似於 AJW200之EDso，擬人化衍生株m4，L10在劑量介於〇.〇3及〇.1 mg/kg之間亦顯現出類似之ED5〇 〇 實施例7 :抗艘在出血時間及失血董上之效應 107 200938630 AJW200 0.01 mg/kg 0.03 π^/kg 0.10 mg/kg 0.30 mg/kg 3.00 mg/kg
ED 0.05 mg/kg 2.8 ±0.2$ (2) 8.2+1.56(7) 25.1 ±〇.4(5) 29.2 ± 0.72 (5) 30.9 ± 0.62 (3) 50 : 0.177 ±0.059 (2) 0.250 ± 0.059 (4) 1.943 ±0.420 (2) 2.074 ±0.521 (3) 2.912 ± 0.243 (4) ❹
HEMATOLOGY ANALYZER™ (Drew Scientific)，利用一出血尾部 量測基線血球數量。在藉由利用毛細吸管之眼後抽取而自未麻醉 小鼠注射入抗體或生理食鹽水後，在上至48小時（例如3〇分鐘、 2,4, 24,及48小時）之預定時間點時收集血液樣本，接著將約4〇 μι之血液轉換至含有5叫酸化檸檬酸葡萄糖抗凝血液（addifled citrate dextrose anti-coagulant solution, ACD)之試管中，並立即在 HEMAVET細胞計數器中取樣，以決定血小板及白血球之數量。 就各次抽血而言，兩眼交替使用以進行取樣。 [00358]這些抗體之有害副作用在止赢上之另一參數血 係在決定出血時間時針對所收集之也液加以測定:又，在 ft時’這些抗體誘發出卿的失血量；然而，在 ΐϋ.ΐΐ 3吨知時，相同劑量下AJW200引發比NMC-4欲 a—體南出更夕之失A量’儘管這些差異僅處理3 Q mg/kg組（其中 n=4而非n=3)在統計上之意義（表2〇)c>H丨 株 親代NMC-4嵌合體並未表現出明顯的差異。 體變/、株對 實施例8 :抗體在血小板及白血球循環數量上之效應 ^00359]吾人假設某些抗金小板劑可抑制血栓形成，而同時可 能引發血小板減少症（thrombocytopenia) (Hansenetal.，·/ Τ.· 298:165-71 (2001))。為決定 NMC_4 在被治療 動物中之白血球(WBC )及血小板猶環數目上之效應，便以 1 mg/ml
之NMC-4注射（例如以靜脈方式）至重量23〇_26〇呂之5隻小鼠 的一組’而以藥物控制（vehicie contr〇i)(例如外科手術級pBS ) 注射至3隻小鼠的控制組。在注射之前，以例如HEMAVET 109 200938630 [rmr分析之任何時間點’麵「4對血小板數量之影響 甚极，在注射後30分鐘時，觀察到白血球短暫減少了 37 5% (p=0.016)’但在注射入PBS藥物時，亦觀察到類似的減少現象。 在NMC-4及控制藥物處理組兩者中，白血球水平皆 小時之間回到基線。 你对俊2-4 實施例9 ··抗艘表現用之細胞株之建立 [00361] 可開發出基於鼠類人工染色體表現（ACE)平台之高 產量哺乳類蛋白質表現系統，該ACE平台已被設計成含有1個可 利用突變的λ-整合酶（integrase)(例如ACE整合酶）結合目標穿 梭載體（targetingshuttlevector)而以異源基因序列載入之具部位 特異性之重組受體部位（recombinati〇n acceptor sites)(Lindenbaum βα/，(M/c/. Jdc?32 (21):el72 (2004);美國專利申請案第 2003/0119104 A1號及第2006/0246586 A1號）。可利用此系統產生 用於表現所篩選之擬人化變異株及NMC-4嵌合體之穩定細胞株。 [00362] 以·^W加上招Wi/ΙΠ (輕鍵載體）或刀1〇[及及抓hi (重 鏈載體）來分解質體pCI-NMC4-VL10及pCI-NMC4-VH14之嵌入 段，隨後將其選殖入pST0518載體之MCS 1 (輕鏈）及MCS2 (重鏈）中。帶有前後串列之重鏈及輕鏈之pST0518載體作為用 以運送至具有不同抗性基因（resistancegenes)之ACE目標載體 (ATVs )内之穿梭載體，此係得自於由Lindenbaum等人所說明 之目標載體（池32 (21):el72 (2004); U.S. Patent Application Nos: 2003/0119104A1 & 2006/0246586 A1)。為 了將含 有重鏈及輕鏈抗體兩者之卡匣（cassette)運送至ATVs内，以I-Ceul 及 ΡΙ-Scel 導歸内切酶(homing endonuclease XNew England Biolabs， MA)來分解pST0518-VH14, VL10載體；凝膠純化VH14加VL10 片段，並將其選殖入以相同之I-Ceul及ΡΙ-Scel内切酶預先分解之 pZeo及pHygro-ATV之相同部位中。此即產生質體 pNHT605_H14U0-IgG4 (hygR 基因）及pNHT607-H14L10-IgG4 (p zeoR 基因）。 110 200938630 [00363] 同理，建構帶有NMC-4 IgG4嵌合體之pST0518目標 載體’並將則後串列嵌入段次選殖入pZeo及pHygro-ATV載體 内’如此產生質體PNHT623 (人類IgG4嵌合體加hygR基因）及 PNHT624 (人類igG4嵌合體加zeoR基因）。 [00364] 為目標整合至平台ACE，以6池培養皿之每池〇.4χ1〇5 個細胞之密度接種宿主ChK2 ACE平台細胞並隔夜培養。在轉染 前3小時，以無血清培養基更換培養基；3小時後，以1 之載 體及1 pg之根據製造商之使用說明利用試劑（Invi比〇gen )加以複 合之整合酶表現載體進行轉染24小時之後，將細胞擴充至15 cm 之培養皿上；隔天’將3.0 pg/mj之zeomycin或潮黴素（hygr〇mydn) > 加入培養基中；在14天的篩選後，利用選殖環分離出抗藥性菌落， 放大個別選殖株以用於抗體生產之分析。 實施例10 : NMC-4抗體之活艘内效力及安全性 [00365] 以一活體内動物（例如狒狒）模型來測試擬人化 NMC-4抗體之活體内效力及安全性。 [00366] 在一例示方法中，以鹽酸氣胺酮（ketamine ❹ hydrochloride)(購自Premier·製藥公司之麻醉狒狒 (10mg/kgIM/30分鐘或有必要時，以維持全身麻醉），並以加熱 桌將其體溫維持於37°C。其次，緩慢地解剖開一節4_5 cm、周圍' 無組織之股血管，連接所有在股動脈及股靜脈中之附近分支。接 著，在股動脈及股靜脈中切出一小切口，***血管尖端並以外 手術線固定’接將賴管崎至血管魏，以使動脈血液轉向分 流入股靜脈；繞過毛細管而由舰直接至靜脈彳魏之分流增加企 液流量至約150-300 mL/分鐘，管型超因波流㈣針巾義咖 Systems Inc，Maastricht，the Netherlands))貼附至矽 g同管，容許 穩定約20分鐘；整個實驗中連續地量測平均及位向 ^ 液流量，將分流用於給藥以及金液取樣。 111 200938630 靠ΐ血·?尖端處損傷股動脈之内皮層。製造出兩重 =少窄器五，_上方，以_ 、泉ΐ /〇。吾人觀察到因血栓形成而使錢 ^出二备血液流量減少至$5111[711±1時，打開縮窄器以 於开板之錢；其次，再度使外部變狹窄並重新開始血 次基線循環流減縮量；注射生理食鹽水後並監測 NMC 個二十分鐘。使用如實施例3中所述之擬人化 NMC-4 變異株 H9L9 IgG4。 y利用兩方法來評估給藥時之出血狀況。在第-方法 I姻2 ί之處蚊表皮模板出血_。在臂_近施加壓 摑擊並在40mmHg下使之膨脹，接著以裝置㈣， 譽1誘發出傷口。將表皮出血時間定義為傷口之誘發與視 _皮中止之間的時間。每15秒鐘以I紙小心地輕擦血液，而勿 石’昜口。當表皮出血時間超過900秒（例如15分鐘）時停止量 測，並將出血時間視為9〇〇秒。 ⑩ ί第二方法中，係藉由重組annexin V而以兔頸動脈創 .來估鼻切口之失血量（見例如P. Thiagarajan et al. (1997) 9φ):2339_47 )。在腹股溝上切出2贿〇 8咖切口並 先秤重之紗布祕棉塊，在每三十分鐘劑量注人週期結束 J其充f血液時更換紗布消毒棉塊；在研究結束時將所有紗布秤 f 得到失血量。以生理食鹽水控制階段紗布之比例來表示每 一劑1之數值。在整個研究期間，以1〇分鐘為間隔連續地監測心 跳速率及血壓。 [00370]在每一劑量週期結束時，抽取1 mi之EDTA血液及1〇 ml之含檸檬酸血液，並判定FBC血小板數量、凝血酶原 (Pr〇thr〇mbin)時間、活化之副凝血質時間（activatedpartial thnm^boplastintime)、第八因素及vWf。若有必要，於_8〇〇c下冷 凍兩管300 μΐ之小劑量，以運送至審查者處供額外活體外實驗室 112 200938630 ，究之用。同理’在流量研究結束後〇 5, i，2,8,24及 抽血’而在最終劑量結束時， 時進饤 集測試。 —以糾及控舰樣本施行血小板凝 ^〇371]在累積劑量（例如當觀察到CFRs之完全抑制時）之 ί廿=1μ_/ιηίη之劑量注入腎上腺素（intr_d) 分 2並再度，CFRs。僅有腎上腺料會在狒狒中引發血n ^但可藉由強化其他血愤縣因子碰復已遭破壞之 里變化（見例如 G· Anfossi ei β/. (1996) Eur J Clin Invest ^ " 26:353-370)。 _ ❹ ❹ :0037:] GBR_之效力及安全性研究： 4以判定GBR 600之效力及安全性。 4付T九丄至 =73]魅I :以㈣動物進行先導研究，建立含量遞增之 ⑽Hff量古應答（d〇SereSP〇nSe)曲線’並識別出觀察到最大 口出3 it之嘴對所有之測試劑量欺模板*錢切 體=;達小時内取出血液樣本’以建立最高劑量下之抗 [〇〇=] _ 30分鐘注射下_增缝之GBR _，並在 J 内記錄流量··劑量i，〇·〇3 mg/kg ;劑量2，〇]她； 0.3mg/kg，劑量 4 ’ 1 mg/kg ;及劑量 5，〇 〇 者在每-之注射之後10分鐘時施行出血測試。 丧 [00375]圖5及表21說明遞增劑量之GBR600在CFRs上之效 若CFRS縣敎’在接近三十分絲騎段絲時再 =脈。相較於生理食鹽水階段之咖分鐘，㈣mg/kg之qbr _ 冬CFRs的數目降低至5/30分鐘；注人額外的Q1 mg/kg可完全地 抑制CFRs，此現象係由動脈再度受損傷並未使利卿回復之 ^加以破認。就下列遞劑量而言，有觀察到抑制現象。在注入最 两劑量之GBR600 (lOmg/kg)後，在之速率下注 入^上腺素，以建立究竟達到血小板凝集之強力或微弱抑制。由 於腎上腺素狂壓上之效應，注人腎上腺素導致血織量之短 增加，但並未逆轉CFRs之抑制。 113 200938630 表21 劑量（mg/kg) 累積劑量（mg/kg) CFRs之數目 基線 0 8 生理食鹽水 0 8 0.03 0.03 5 0.1 0.13 0 0.3 0.43 0 1 1.43 0 10 11.43 0 [00376] 进究2 :研究2係以類似於研究1之方式進行，除了 在開始逐步升高劑量時（〇.〇3mg/kg劑量之前）使用0.01mg/1ig 的劑量以外，因為在研究1中已觀察到在劑量〇 〇3 mg/kg下存在 CFRs之部分抑制。 [00377] 在研究2中（見例如圖6及表22)，觀察到〇.〇1 mg/kg 之GBR 600在CFRs上之效應（7 CFRs/30分鐘，相較於生理食鹽 水的9 CFRs/30分鐘），然而’注入額外的〇 〇3 mg/kg (累積劑量 = 0.04 mg/kg)造成CFRs之完全抑制，GBR 600之ED100因此為 0.04 mg/kg。動脈之再度損傷並未逆轉CFRs之抑制，表示此為真 實抑制。抑制效應維持於較高劑量下，上至最大劑量1〇mg/kg。 由於腎上腺素在血壓上之效應，注入腎上腺素導致血液流量之短 暫增加，但並未逆轉CFRs之抑制。 表22 遞: 劑量（mg/kg) 累積劑量（mg/kg) CFRs之數目 基線 0 9 生理食鹽水 0 9 0.01 0.01 7 0.03 0.04 0 0.1 0.14 0 0.3 0.44 0 114 200938630
[00378] 幽··研究3係以類似於研 量 起f Γ、接著給予另—次〇·二二了量 mg/k8)' °·01 ^ [00379] 在研究3中（見例如圖7)，觀察 ⑻ 之 GBR 600 在 CFRs 上之效應（8 CFRs/3〇 分 ·005
❿ 鐘）。CFRS隨著舰_之劑量增加而里線性 期之CFR數目顯示於表23與圖8中；圖8說明與咸遞^齊·^量 GBR 600相關聯之CFRs數目之線性減少。CFRs數目盘gbr 彻⑽下列綠式絲之，雜擬合此輕式時的
Kz^Hj.yyui 〇 CFRs之數目/劑量週期=_1〇9 χ GBR_之劑量+ 74517 =0380]嫌於研究2中因累積劑量〇4 mg/kg所引起之完全抑 制’研究3中之ED100為〇.07 mg/kg。在研究3中，遞增劑量之間 的日，間為30分鐘’而所觀察到之此EDi。。上的差異可能由血液中 因藥物之起始清除結果導致之GBR 600濃度下降所引發。注入腎 上腺素逆轉了 CFRs之抑制’此可能與在〇 〇7 mg/kg累積劑量時之 CFR曲線之形狀有關。在〇 〇7mg/kg累積劑量下，抑制情形被緩 慢地逆轉，其顯示血栓正在發展中。在這些特殊條件下，腎上腺 素似乎能夠逆轉CFR。 表23累積劑量之GBR 600在CFRs上之效應（〇.005_0.07 mg/kg) 劑量（mg/kg) 累積劑量（mg/kg) CFRs之數目 基線 0 8 生理食鹽水 0 8 0.005 0.005 7 0.005 0.01 6 115 200938630
[00381] :研究4係以類似於研究1 在三隻狒狒中以保栓通（cl〇pid〇grel)作A 式進仃，除了 ❹ ^ i GBR 600^ 1 ! 5 5^ 抗保栓通之效力及出血傾向。.，·5,5及1()吨細劑量下對 [00382] 在研究4中，保栓通於狒狒〗由 下、於驰驰« w 在 1〇 mg/kg累積齊J量 := 狒狒2 & 3中在5 mg/kg累積劑量下完全地抑制了 _，
如表24及圖9 (顯示表24巾之狒狒3之結果） I 素逆轉了 CFRs之抑制。 〜所不庄入腎上腺 表24 伯 ^栓通在狒狒1 遞增O-lOme/ka^) 劑量 (mg/kg) 累積劑量 (mg/kg) CFRs之數目 狒狒1 CFRs之數目 狒狒2 CFRs之數目 佛拂3 基線 0 13 8 6 生理食鹽水 0 13 7 8 1 1 8 7 1.5 2.5 5 2 2 2.5 5 2 0 0 5 10 0 0 0 10 20 0 0 0 隣83]模板出血時間：在研究i及2中，所有高於〇 〇4吨細 劑量下之模板出血時間皆長於15分鐘；在包含保栓通 (Bristol-Myers Squibb/Sanofi Pharmaceuticals)之陽性（positive) 控制組研究中，模板出血時間延長至與大於2 5mg/kg累積劑量時 116 200938630 相同之程度；在研究3中，模板出血時間從未 -細雜（見例 不被視ίϋϋ非極精準之出血傾向度量，模板出血時間本身 • 確地預測臨床上相關出血，例如在手術前調整中 (見例如Lmd心胸他，sec〇nd ed— ^ iDtei=emie/·)。切^轉嫌示較讀倾，因其7 ^^由切二之失灰量且具有較大動態範圍。因此，除了 裊t 執打切口出血測試。此等數據整理於表25及26中。
表6保、栓通之模板失血時間[分鐘] ❹ ❹ 117 200938630
[00384]表27及28顯示以保栓通及GBR 6〇〇 ' ❹ ==之結果。由紗布所吸收之血液量起初隨缝^口出血 = 式 現自限性。在所有研究中’所觀察到之最妓二= 其後由紗布所吸收之錢量便減少，且似乎ϊίί =合;在研究!及2中，最大出血量類似 發^ "GBR 600 250 f ’在研九3中’觀察到全部之注射劑量下的出血情況微不足 表^~測試[生理食鹽水值之倍數單位1 劑量（mg/kg) 基線 -5*3 劑量（mg/k£f) 研究1 研究2 Γ^究3 0 n.a. n.a. n.a. 生理食鹽水 0 ' ----- 1 1 1 0.005 1〇.〇〇5 n.a. n.a. 0.13 0.005 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 ------- n.a. n.a. 0.08 0.02 — n.a. n.a. 0.05 0.03 ^ n.a. n.a. 0.05 0.04 ----- n.a. n.a. 0.02 0.05 --- n.a. n.a. 0.03 〇.〇6 ~·*-*--- n.a. n.a. n.d. 0.07 n.a. n.a. n.d. 118
❹ [00385] GBR600^^#fp (therapeutic window ) ❹ ^ (bleedsc^e):在圖10中，將來自研究1及〗及三項保 口測越果對GBR _及保栓通之侧（將劑量表示 成其ED100s之倍數並在對數刻度上作圖）。 ’、 [00386] 即使在大於其ED1()〇的1〇〇倍之劑量下， 導致保謝在僅高至㈣⑽的4倍下血 夕口卜地’ GBR_ _出血風險係具有前所未見之安全性之治療^ [=8p ^項研究中所觀察到之唯—臨床上相關之増加為 表皮傷π之自限性出血的增加’如同由模板出血及切口出血 判定者。在外科手術後密切峨察動物達48小時，並未檢 ^ 夕|之表皮出血訊號，例如容歸血、出血點、雜等；更 = 是’未檢測到内部出血之訊號，例如血腫（hemat〇ma)、流鼻灰 119 200938630 (epistaxis)、來自口腔或***之失血、黑糞症（melena)、眼睛出 血血尿症（hematuria)、或吐血（hematemesis)等，此等手術傷 口不會出血且可正常地癒合。 ρ〇388] 如表29所示，保栓通及GBR 60〇兩者在Bleedsc〇re β十分方ί中之得分皆為1。除了表皮傷口上之出血增加外，在實驗 期間或得出諸研究之結論後48小時之觀察期期間，並未在動物上 檢測到其他症狀。 容易瘀血 由小傷口出血 出血點 瘀斑 需要輸血 顱内出血 生命危險
效力及安全性研究之發現：表3q_32顯示在研究^ 表g1 呆栓通及GBR 600》jieedScore判定 BleedScore 判定 症狀 表皮出jk 内部出jk ❹ 血腫 流鼻血 來自口腔或***之 失血 黑糞症 眼睛出血 血尿症 吐血 警示性出血
BleedScore [00389] 120 200938630 中之GBR 600在下列方面之效應：vWF水平、第八因素水平、白 量、血紅素濃度⑽）、血小板數量（Plt)、凝血酶原時間 • (PT)、活化之副凝血質時間（aPTT)。 ’90] _於在研究丨_3中所獲得之;馬威里氏水平，於研究！ 察到任何模式；但於研究2&3 ’清楚地觀察到碼威里氏 7平^低。在使，更高劑量之研究2中，效應比使用相對低劑量 ^研九3更加顯著；在使用未與vWF結合之控制組擬人化單株 體之研冑中，未觀察到對於瑪威里氏水平之效應，在未來 ❹ 2二應仔^監測其此類效應及涵義。在所有研究中，GBR600 對於第八因素水平均無顯著效應。 ❹ [=0391]雖然觀察到WBC增加’但此為侵入性程序之已知效 二，且至，前為止，此結果與針對未結合vWF之控制組擬人化單 ^ Ig=體、及在賴财所職之—切其他難所觀察到之結 2有良好關聯性；未能觀察到因注入GBR6〇〇所引發之對於血 =素濃度之麟效應；然注人(3服_對於到、板數量有一效 J二t於血小板沉積為CFRS期間動脈阻塞之原目，故血小板在此 二序期間被>肖耗掉’因此，CFRS2有效抑制將減少血小板之消 解釋了在未結合爾之控做擬人化單株1gG4抗體中 到之較大血小板消耗量，其中並未觀察到CFRs2抑制。 GBR 600對於指示凝血蛋白之完整性之PT及aPTT似 vWF ig〇4 ^ 121 200938630 表30研究1
基線 生理食嫌水 0.03mg/kg 0.1mg/kg 0.3mg/kg 1.0m g/kg 10mg/kg WBCx 109/1 7,48 6,92 7,89 9,32 11,57 12,29 11,52 RBCx 1012/1 5,7 5,88 5,75 5,86 5,83 5,79 5,8 航素a/di 13,4 14,3 14,1 14,1 14,4 14 14 血容比1/1 40,5 43,5 42,5 43,5 43,4 〇,4 41,4 MCVfl 71,1 74,0 73,9 74,2 74,4 74,6 71,4 MCHpg 23,5 24,3 24,5 24,1 24,7 24,2 24,1 MCMCg/dl 33,1 32,9 33,2 32,4 33,2 32,4 33,8 pit x 109/1 306 249 234 236 245 257 262 ne ut x 109/I 3,46 3,32 4,35 5,92 8,16 8,89 8,44 lymph x 109/1 3,62 3,21 3,04 2,80 2,75 2,88 2,32 單核白血球x i〇e/i 0,36 0,36 0,46 0,58 0,61 0,50 0,73 嘻酸性球X 109/1 0,03 0,02 0,04 0,03 0,03 0,01 0,02 嗜鎗性球x 109/1 0,01 0,01 ο,σι 0,00 0,01 0,01 0,01 PT 9 10 10 10,00 10 10 10 aPTT 屯 42 44 43 42 42 45 FVIII 107 89 83 88 80 78 78 vWF濃度 25 46 3Θ 15 2B 48 17 mm% Λητ. m JrrT. m JrrT m Jnr m Jrrt 熟 Jrrr m ^Ttf. m 表31 研究2
纖 牛·理食鹽水 0.01mg/kg 0.03mg/kg 0.1mg/kg 0.3mg/kg 1.0mg/kg 10mg/kg WBCx 109/1 11,98 12,42 12,49 11,89 11,14 10,91 11,01 13,92 RBC x 1012/1 5,24 5,36 5,34 5,34 5,42 5,57 5,57 5,54 JME3lg/di 12,2 1^7 1^8 1^8 1^9 13,2 13,4 13,2 血容比l/l 34,1 34,9 34,8 34,7 35,1 36,1 36,1 36,1 MCVfl 65,1 65.1 66,2 65,0 64,8 64,8 64,8 65,2 MCHpg 23,3 23,7 24,0 24,0 23,8 23.7 24,1 23,8 MCMC g/dl 35,8 高4 36^8 36i9 36^8 36,6 37,1 36,6 pit x 109/1 313 2B1 276 2B1 257 283 283 268 neut x 109/1 9,37 9,44 9,12 8,60 8,03 7,98 8,15 11,33 lymph x 109/1 2,20 2,55 2,84 2,82 2,68 2,51 2,46 2,10 雜白血球x 109/1 Q38 0,40 0,47 Ο,β 0,37 0,36 0,32 0,38 嗜馳球X 109/1 0,01 0,02 0,05 0,04 0,04 0.C5 0_06 0,10 嚐IS性球X 1_ 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 PT 9 9 9 9 9 9 9 9 aPTT 55 ?>120 53 60 61 56 55 53 FVIII 56 圯 W 54 95 53 68 vWF澹度 34 31 23 21 16 14 14 10 mm% Αη*. 眺 Jnr. 撕 Arrf: 撕 無 無 Λητ. 撕 無 200938630 表32 研究3
血栓過程巾之強力血小板沉_ 600時Ϊ抑制反應，如同保栓通雜。使用GBR H 嚴重之有㉞血’牧當雜以目前縣像是高遠有 時亦然。在此等劑量下藉由切口 、°GBR600對於壯蛋白不具影響力，此係由ί 、，，°果加以顯不，然而，存在馮威里氏因子水平降低的情 :’但在第八因素水平上卻未觀察到;青楚的效應。由於殺鼠靈 (warfarin)係藉由降低機能性維他命κ相依凝血蛋白之循 來抑制凝血系統，故此方面並非令人困擾之處。在此研究中，= 於全血計量參數並未觀察到意料之外的效應。 實施例11 :擬人化NMCM變異株之熱穩定性 [00394] 利用熱量量測法比較鼠類NMC-4之Fab片段之擬人化 fMC-4變異株及NMC_4_IgG1嵌合體之熱穩定性。單株抗體之熔 融輪廓為其亞型之特徵（Garber and Demarest (2007), BBRC 355:751-7);然而，即使在全長IgG之上下文中，仍可輕易地識別 出Fab片段之中點熔融溫度。吾人利用此種Fab片段之中點溶融 溫度來監測擬人化候選者之單株抗體穩定性。 [00395] 在 VP_DSC 微差掃描微熱量計（differential scanning 123 200938630
micrccalorimeter，MicroCal，Northampton，UK )上進行熱量量測 法。槽池（cell)體積為〇.l28ml;加熱速率為l°c/min ;且將超壓 ' (excess pressure )維持於64 psi ;所有蛋白質片段皆於PBS (pH 7.4)中1-0.5 mg/mL (74 μΜ)濃度下使用。藉由與含有相同緩衝 液之複製樣本（蛋白質以從中去除）相比較，估計每一蛋白質之 部分莫耳熱容量；利用標準程序分析部分莫耳熱容量及熔融曲 線。在進一步於軟體Origin ν7.0中利用非兩狀態模型（N〇n-Two State model)分析溫度記錄圖之前，以基線校正之並將濃度正規 化。針對如實施例3中提及之H14L10-IgG4所獲得之數據之例子 顯示於圖11。鼠類NMC-4之Fab片段在74.7°C時顯現單一轉換， © 而H14L10-IgG4之Fab片段轉換則在81.1。(：時顯現，其對應至穩 定性上之明顯差異（6.4°C )。為了探知人類Fab穩定領域之影響， 製備由經移植至人類IgGl (最穩定之人類亞型；Garber and
Demarest (2007)，BBRC 355:751-7)上之鼠類 NMC-4 變異領域所 組成之散合體。就 H14-L10 Fab 而言 ’H14L10-IgG4 及 NMC-4-IgGl 嵌合體之表觀（apparent) Fab Tm值仍顯示出穩定性上之明顯增加 (△Tm>rc) θ 實施例12 :編碼GBR600重鏈（VH9)及輕鏈（VL9)之基因之 φ 選殖 [00396] 用於選痩編碼GBR 600之基因之材料及方法列出如 下：
PfuUltxa (Stratagene, Cat-No.: 600380)
Spel (NEB, Cat.-No.: R0133)
Hindlll (NEB, Cat.-No.: R0104) CIP (NEB, Cat.-N〇.:M0290) pCR-鈍端（Invitrogen，Cat.-No.: 44-0302) 弓 1 子：Operon, Cologne，Germany
GLNPR107: TAACTAGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC GLNPR108: 124 200938630
AAGCTTACGGCTAGCTCACGACACCTGAAATGGAAG
GLNPR139: CCTCAGACAGTGGTTCAAAG
GLNPR176: GCTAGCGCC ACC ATGGAGAC AGAC AC AC
GLNPR177:TAAGCTTCTATCATTTACCCAGAGACAGGG
GLNPR178:TAAGCTTCTATCAACACTCTCCCCTGTTG BGHREV:由 Fasteris 所提供 TMC 載體 pCI-NMC4-VL9 (pl56)及 pCI-NMC4-VH9 (pl58)(由 Chromos所提供）
Qiaquick Gel extraction kit (Qiagen, Cat.-No.: 28706) lkb+ ladder (Fermentas, Cat.-N〇.:R0491) © pcDNA3.1 ㈠(Invitrogen, Cat-No.: V795-20) pEF-Dest51[CD19] (RZPD, Cat.-No.: RZPD〇839GO 167-pEF-DEST51) 定序：Fasteris SA (Geneva, Switzerland)
Gigaprep kit (Macherey-Nagel, Cat.-No.: Nucleobond PC10000) [00397] 表現載體pEFcDNA3.1之選殖 表現載體pEFcDNA係藉由以來自pEF-DEST51之EFl-α啟動 子取代來自pcDNA3.1(-)(Invitrogen)之CMV啟動子而加以建構。 為此目的，故利用引子GLNPR107, 108及PfUUltra (Stratagene，退 ❹ 火溫度55°C，30個循環）來放大EFl-α啟動子；引子放大全部之 EFl-a啟動子，並在所放大片段之5’端貼附侧而在3’端貼附 i/MIII側。將PCR增幅子（amplicon)選殖入pCR-純端 (Invitrogen)，並藉由处el/历分解來分析選殖株。切下來自 選殖株#4之*招m/III片段’並將其選瘦入利用相同酵素組合及 CIPed加以分解之pcDNA3.1(-)骨架中。利用5^1及所《ί/πι分析 選殖株，選殖株#2似乎呈陽性反應；以骨架及嵌入段進行第二次 分解更證實了啟動子片段之正確大小。
[00398] 將 GBR 600 選殖至 pEFcDNA 利用PfuUltra (標準條件，退火溫度55°C，30個循環）及引子 GLNPR176 及 177 來放大 GBR 600 VH9，模板為 TMC 載體 P156 ; 125 200938630 以如同對於重鏈所述者，姻肝GLNpRl76及i78來放大 = 5，=. ^1莫板為™C _ Pl58。引子將編1限制部 ^限制部位3,附加至個別增幅子’將所獲得之PCR 殖入PCR_剌’並_ MeI及施·勤關分解加以 之選細1及重鏈之選絲#3，並將顧殖入利 :酵素及仿爾及CIPed打開之ρ_ΝΑ中。該限制分解 顯不.輕鏈之選殖株#6及重鏈之選殖株#1含有正確大小之
If &序縱簡齊參考祠。由於少量製備 ❹ DNAH不佳’故重鏈序列GS257無法確認至獅％程度 用編碼 GBR 600 重鏈 VH9( GS257 )及 GBR 600 輕鏈 VL9( GS256 ) 以J備多量製備（Gigaprcps )。將質體製備再度送至Fasteris以進 行序列確認，此次之樣本名為GS265 (GBR 6〇〇重鏈^9)及 GSS264 (GBR600重鏈VL9)。由於其DNA品質較佳， 重鏈及輕鏈對於參考序列之序列相同性。 敌了確邮 [00399]雖然本發明於此已藉由參照各種特定材料、程序、及 實施例加以說明，但應瞭解熟悉此項技藝者在閱讀以上說明書及 研究圖式時將可實現各種不同之修改、增加、變更及其均等^。 因此’本發明實施例應被視為例示性而非限制性，其真實範圍及 ❹ 精神係由下列申請專利範圍所表示。本案中所來昭'之右失老資 料、專利、專利申請案係藉由參考文獻方式將^整體糾t 【圖式簡單說明】 [0036] 圖1顯示NMC-4嵌合抗體在瑞斯特黴素（rist〇cetin) 誘導 vWF 媒介血小板凝集測定（restocetin_induced vWp_mediated platelet agglutination assay)下之抑制活性，其係相較於原始丽&斗 單株抗體及不同抗vWF抗體AJW200。 [0037] 圖2A-B顯示以單獨及組合無標定nmc-4德:合抗體（同 源競爭）及AJW200對以Eu標定之NMC-4喪合抗體結合之競爭 (圖2A)。圖2A為以無標定之NMC-4散合抗體、亞型控制、 126
❹ 200938630 妷ΐ為H9,L9之變異區的刪〇4抗體之擬人化衍生 Δ TW· ^ ^之細^ *合抗體結合之競爭；圖2B為在20 _ 存 存在時之聰c·4競爭之希關⑽#)。 []圖3A-E顯示NMC-4在剪流情形下阻斷血小板附著至 ，皮、vWF之能力’包括附著至細胞之血小板之顯微照 ^。以PBS (圖A)或25 μΜ組織胺（圖B_E)、加上1〇 μ§/ιη1 抗 vWF 抗體、NMC-4 (圖 C )、18 pg/ml 抗 GPIb-α抗體、ΑΚ2 (圖 D)]或18 pg/ml鼠類ig〇 (圖e)處理HUVEC細胞單層。在灌 注單層各處之前，亦立即將不同抗體包含於對應之血小板懸浮液 中。 [0039] 圖4A-C顯示相較於AJW200 (圖4C)，在動脈血栓的 小鼠氣化鐵模型中之NMC-4嵌合體（圖4A)及具有表為H14, L10 之變異區之擬人化抗體（圖4B)的活性。將此三抗體於劑量應答 研究中比較之。 ° [0040] 圖5顯示遞增劑量（0.03-10 mg/kg)之GBR 600在狒 狒中之循環流縮減（CFRs)上之效應。 [0041] 圖6顯示遞增劑量（0.01-10 mg/kg)之GBR 600在狒 狒中之CFRs上之效應。 [0042] 圖 7 顯示遞增劑量（0.005-0.07 mg/kg)之 GBR 600 在 狒狒中之CFRs上之效應。 [0043] 圖8顯示累積劑量之GBR600在狒狒中之CFRs上之劑 量應答曲線。 [0044] 圖9顯示遞增劑量（MO mg/kg)之保栓通在狒狒中之 效應。 [0045] 圖10顯示遞增劑量之GBR 600及保栓通在切口出血測 試上之輸注效應比較。已將劑量表成有效劑量之倍數（例如CFRs 降至零時之累積劑量）。 [0046] 圖11顯示由微差掃描熱量測定法所測量之擬人化 NMC-4變異體之熱穩定性。 127 200938630 【主要元件符號說明】 無。

Claims (1)

  1. 200938630 七、申請專利範圍： 結合^種ίί祕里朗子（VWF)特紐之擬人化抗體或其 ⑻如SEQIDNO:19中所述之重鏈變異區序列；及 (b)如SEQ ID NO: 28中所述之輕鏈變異區序列。 化抗2體if具有VWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人 ⑻如SEQ ID NO: 237中所述之重鏈變異區序列；及 (b)如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈變異區序列。
    3. -種具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人 化抗體包含： (a)重鏈及輕鏈互補決定區（CDRs)，其對應至存在於鼠類抗 體NMC-4之重鏈及輕鏈變異區（分別為SEQ仍Ν〇·〗及2 )中之 CDRs ;以及 (b)重鏈架構區及/或輕鏈架構區，前者對應至存在於人類抗體 AAC18165.1 (SEQIDNO:4)之變異區中之架構區，後者對應至 存在於人類抗體AAK94808(SEQ ID NO: 6)之變異區中之架構區。 4. 一種具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人 化抗體包含： 選自於由以下所組成之群組之重鏈CDRs其中一者以上： HCDR1: GFSLTDYGVD ( SEQ ID NO: 7 ) , HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQIDNO:8),及 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQIDNO:9);以及/或 選自於由以下所組成之群組之輕鏈CDRs其中一者以上： LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ Π) NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)，及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 5. —種具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，該擬人 化抗體包含： 重鏈 CDRs: HCDR1: GFSLTDYGVD( SEQ ID NO: 7 )，HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS ( SEQ ID NO·· 8 )，及 HCDR3: 129 200938630 DPADYGNYDYALDY ( SEQ ID NO: 9 );以及/或 輕鏈 CDRs : LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11),及 LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)。 6. 如申請專利範圍第4或5項之具有VWF特異性之擬人化抗 體或其結合片段’更包含：來自人類抗體AAC18165.1(SEQIDNO: 4 )之重鏈架構區；及/或來自人類抗體AAK94808 ( SEQ ID NO: 6) 之輕鏈架構區。 7. 如申請專利範圍第6項之具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段，其中該重鏈架構區更包含一個以上之鼠類殘基。 8. 如申請專利範圍第6項之具有^特異性之擬人化抗體或 其結合片段’其中該重鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 9. 如申請專利範圍第6項之具有vWF特異性之擬人化抗體或 其結合片段’其中該輕鏈架構區更包含一個以上之鼠類殘基。 10. 如申請專利範圍第6項之具有vWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該輕鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 11. 如申請專利範圍第4或5項之具有vWF特異性之擬人化 抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體包含選自於由下列所組成 之群組之重鏈變異區：H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), 〇 H5 (SEQ Π) NO: 15)，H6 (SEQ ID NO: 16)，H7 (SEQ ID NO: 17)，’ H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: ? 145)，或 H16 (SEQ ID NO: 146)。 12. 如申請專利範圍第4或5項之具有vWp特異性之擬人化 抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體包含選自於由下列所組成 之群組之輕鏈變異區：L5 (SEQ ID NO: 23)，L40EQ ID Μλ. 24)， L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28)，Ll〇 (SEQ ID NO: 29)，或 LI 1 (SEQ NO: 30)。 13. 如申請專利範圍第4或5項之具有vWF特異性之擬人化 抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體包含： 130 200938630 選自於由下列所紐成之群組之重鏈變異區： 13)，H4 (SEQ ID NO: 14)，H5 (SEQ ID NO: 15)，H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22) ，H15 (SEQ ID NO: 145)，或 H16 (SEQ ID NO: 146);以及 選自於由下列所組成之群組之輕鏈變異區：L5 (SEQ ID NO: 23) , L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29), 或 Lll (SEQIDNO.30)。 φ 14.如申請專利範圍第5項之具有vWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該擬人化抗體包含··重鏈變異區序列，其含 有至少80%與SEQ ID NO: 19之架構區相同之架構區；及/或輕鏈 變異區序列’其含有至少80%與SEQ ID NO: 28之架構區相同之 架構區。 15. 如申請專利範圍第5項之具有vWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，更包含： 對應於人類抗體家族VH4中之架構區之重鏈架構區；以及 對應於人類抗體家族VK1中之架構區之輕鏈架構區。 16. 如申請專利範圍第5項之具有VWF特異性之擬人化抗體 G 或其結合片段，更包含： 對應至人類抗體生殖細胞株序列（germline sequence) 4-59中 之架構區之重鏈架構區1，2,及3，其中重鏈架構區1為 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 171)，重鏈架構 區 2 為 WIRQPPGKGLEWIG(SEQIDNO: 172)，且重鏈架構區 3 為 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 173);以及 對應至存在於人類抗體輕鏈生殖細胞株序列018中之架構區 之輕鏈架構區1,2,及3，其中輕鏈架構區1為 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNa 186)，輕鏈架構區 2 為 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187)，且輕鏈架構區 3 131 200938630 為 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188)。 • 17.如申請專利範圍第5項之具有VWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，更包含： 對應至人類抗體生殖細胞株序列4-34中之架構區之重鏈架構 區1，2,及3，其中重鏈架構區1為 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY(SEQIDNO: 165)，重鏈架 構區 2 為 WIRQPPGKGLEWIG(SEQIDNO: 166)，且重鏈架構區 3 為 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 167);以及 ® 對應至存在於人類抗體輕鏈生殖細胞株序列018中之架構區 之輕鏈架構區1,2,及3，其中輕鏈架構區1為 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQIDNO: 186),輕鏈架構區 2 為 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQIDNO: 187)，且輕鏈架構區 3 為 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188)。 18·如申請專利範圍第1-5, 7-10, 14-17項中任一項之具有 vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體係以 10 nM以下之親和力（Kd)結合至vWF。 ❹ 以如申請專利範圍第1-5,7-10, 14-17項中任一項之具有 vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體係以 ΙΟΟηΜ以下之親和力（Ki)競爭結合至VWF。 20.如申請專利範圍第1-5, 7-10, 14-17項中任一項之具有 vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體係以 10nM以下之親和力（Kd)結合至VWF之A1領域（domain)。 21·如申請專利範圍第1-5, 7-10,14-17項中任一項之具有 vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體係以 ΙΟΟηΜ以下之親和力（Ki)結合至vWFiA1領域（d〇main)。 22.如申請專利範圍第1-5, 7-10,14-17項中任一項之具有 vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體具有 132 200938630 大於65°C之FAB片段熱穩定性溫度。 23. 如申請專利範圍第1-5, 7-10, 14-17項中任一項之具有 ' vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體具有 .高於親代非擬人化抗體之FAB片段熱穩定性溫度。 24. —種具有VWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，包含： 重鏈 CDR1 ’ 為 GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7);重鏈 CDR2， 為 MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8);重鏈 CDR3，為 DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9);輕鏈 CDR1 ;輕鏈 CDR2 ; 及輕鏈CDR3 ’為QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)，附帶條件為輕 鏈 CDR1 非 SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10)且/或輕鏈 CDR2 非 ❹ YTSSLHS (SEQ ID NO: 11)。 25. 如申請專利範圍第24項之具有VWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段’更包含人類抗體重鏈架構區及/或人類抗體輕鏈架 構區。 26.如申請專利範圍第25項之具有¥醫特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該重鏈架構區對應至存在於4_59衍生人類抗 體中之重鏈架構區。 、27.如申請專利範圍第26項之具有VWF特異性之擬人化抗體
    或其結合片段，其中存在於4-59衍生人類抗體中之該重鏈架構區 更包含一個以上之鼠類殘基。 28.如申請專利範圍第26項之具有vWp特異性之擬人化抗體 或^結合)ί段’其巾存在於4_59魅人類紐+之該魏架構區 不包含一個以上之鼠類殘基。 式甘ί!.入如申請專利範圍第25項之具有vWF特異性之擬人化抗體 =、、，十片段’其中該輕鏈架構區對應至存在於⑽ 體中之輕鏈架構區。 或苴ϊ人t mi圍第29項之具有特異性之擬人化抗體 h 15 i 存在於018衍生人類抗體中之該輕鏈架構區 更包含一個以上之鼠類殘基。 31.如申請專利範圍第烈項之具有vwp特異性之擬人化抗體 133 200938630 iff合歧’其巾存在於⑽触人類抗體t之雜鏈架構區 不包含一個以上之鼠類殘基。 +甘ϋ如申清專利範圍第26項之具有vWF特異性之擬人化抗體 或…、〇口片段，其中該4-59衍生人類抗體為AAC181651。 33. 如申請專利範圍第29項之具有vWp特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該〇18衍生人類抗體為AAK94808。 34. 如申請專利範圍第24項之具有vWp特異性之擬人化抗)體 或其結合片段，其中LCDR1及/或LCDR2係來自於人類抗體。 、35.如申請專利範圍第34項之具有vWF特異性之擬人化抗體
    ❹ 或其結合片段，其中LCDR2為DASNLET (SEQ ID NO: 118)。 36.如申請專利範圍第^^说沐^及以項中任一項之具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中hcdri包含一 個以上選自於由F27Q L29I，T30S及V34W所組成之群組之胺基 酸取代基。 37. 如申請專利範圍第1-5, 7-10, 14-17及24項中任一項之具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中HCDR2包含二 個以上選自於由S61P及A62S所組成之群組之胺基酸取代基。 38. 如申請專利範圍第1_5, 7-10, 14-17及24項中任一項之具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中LCDRi包含二 個以上選自於由S24Q，N30S及K31N所組成之群組之胺基酸取代 基。 39. 如申請專利範圍第1-5,7-10, 14-17及24項中任一項之具 有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中HCDIU包含二 個以上選自於由F27Q L29I，T30S及V34W所組成之群組之胺基 酸取代基’ HCDR2包含一個以上選自於由S61P及A62S所組成 之群組之胺基酸取代基，且LCDR1包含一個以上選自於由S24Q， N30S及K31N所組成之群組之胺基酸取代基。 40. 如申請專利範圍第4或5項之具有VWF特異性之擬人化 抗體或其結合片段，更包含來自人類抗體之重鏈架構區，其中該 人類重鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 134 200938630 41.如申請專利範圍第4或5項之具有vWF特異性之擬人化 抗體或其結合片段，更包含來自人類抗體之輕鏈架構區，其中該 人類輕鏈架構區不包含一個以上之鼠類殘基。 42·如申請專利範圍第15-17項中任一項之具有VWF特異性 之擬人化抗體或其結合片段，其中該重鏈架構區不包含一個以上 之鼠類殘基。 43. 如申請專利範圍第15-17項中任一項之具有VWF特異性 之擬人化抗體或其結合片段’其中該輕鏈架構區不包含一個以上 之鼠類殘基。 44. 如申請專利範圍第1-5,7-10, 14-17及24-35項中任一項之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體 保留與親代非擬人化抗體、或包含來自親代非擬人化抗體之變異 區及人類Fc區之嵌合體相同之活性。 45. 如申請專利範圍第44項之具有VWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該活性係以瑞斯特黴素誘導血小板凝集活性 (ristocetin-induced platelet agglutination activity )加以量測。 46. 如申清專利範圍第1-5, 7-10，14-17及24-35項中任一項之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體 缺乏效應子（effector)功能。 ❹ 47.如申請專利範圍第1-5,7-10, 14-17及24-35項中任一項之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體 包含源自於IgG4之Fc區。 48. 如申請專利範圍第1-5, 7-10, 14-17及24-35項中任一項之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體 具有對人類VWF之A1領域之特異性。 49. 如申請專利範圍第1-5, 7-10,14-17及24_35項中任一項之 •具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該擬人化抗體 為全長（fhll length)抗體。 50·如申請專利範圍第1-5, 7-1〇, 14-17及24-35項中任一項之 具有vWF特異性之擬人化抗體或其結合片段，其中該結合片段為 135 200938630 選自於由 Fab，Fab’，Fab’-SH，Fv，scFv，F(ab’)2 及雙鍵抗體 (diabody)所組成之群組之抗體片段。 51. 如申請專利範圍第50項之具有VWF特異性之擬人化抗體 或其結合片段，其中該抗體片段不為Fab。 52. —種分離核酸，編碼申請專利範圍第ι_43項中任一項之 抗體或其結合片段。 ' ' 53. —種分離核酸’其包含編碼載體（vect〇r) GS264之核酸 序列之輕鍵’該載體GS264向DSMZ申請寄存於微生物中，其寄 存號碼（accession No.)為 DSM 21059 〇 54. 一種分離核酸’其包含編碼載體（vector) GS265之核酸 W 序列之輕鏈’該載體GS265向DSMZ申請寄存於微生物中，其寄 存號碼（accessionNo·)為 DSM21060。 55. —種分離核酸，編碼具有VWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段，該擬人化抗體或其結合片段包含如SEq IDN〇: 中 所述之重鏈變異區序列及如SEQ ID NO: 28中所述之輕鏈變異區 序列。 56. —種分離核酸，編碼具有VWF特異性之擬人化抗體或其 結合片段’該擬人化抗體或其結合片段包含如SEQ ID NO: 237中 所述之重鏈序列及如SEQ ID NO: 238中所述之輕鏈序列。 ❹ 57. 一種載體（vector)’其包含申請專利範圍第52_56項中任 一項之分離核酸。 58· —種寄主（host)細胞’其包含申請專利範圍第52_56項 中任一項之分離核酸或申請專利範圍第57項之載體。 59. —種擬人化抗體或其結合片段之製造方法，包含：培養申 請專利範圍第58項之寄主細胞，使得核酸被表現並產生抗體。 60. 如申請專利範圍第59項之擬人化抗體或其結合片段之製 造方法’更包含自寄主細胞培養液（culture)回收該抗體。 61. 如申請專利範圍第59項之擬人化抗體或其結合片段之製 造方法’其中該抗體係回收自寄主細胞培養基（meduim)。 62. 如申請專利範圍第59項之擬人化抗體或其結合片段之製 136 200938630 其中，於該培養步驟之前’該寄主細胞係以包含編瑪重 之核酸之載體及包含編碼輕鏈變異區之核酸體而典 同感染（co-transfected )。 聚1 體 63· —種組成物，包含：申請專利範圍第卜43項 擬人化抗體或其結合片段、及醫藥上可接受之載劑 、 (pharmaceutically acceptable carrier )。 64· —種組成物，包含：申請專利範圍第〗_43 ίί擬人化抗體或其結合片段、及結合至爾之A1領域之第二 ❹ AJwfoo如申請專利範圍第64項之組成物，其中該第二抗體為 66. -種受試者中之vWF媒介疾病或異常的治療方法，該方 法^ 3給予該受試者有效治療量之申請專利範圍第丨-犯項 一 項之擬人化抗體或其片段。 67. 如申請專利範圍第66項之受試者中之vWp媒介 異 吊的治療方法，其中該受試者為人類。 、〆 68·如申請專利範圍第66項之受試者中之vWp媒介或旦 常的治療方法，其巾該vWF齡疾病或異常為錄性疾病或異^ 常的1請tl範圍第6 8項之受試种之vw媒介疾病或異 療方法，其巾該錄性疾減財為心血管疾 疾病。 常的^範圍第69項之找者中之VW媒介疾病或異 吊的化療方法，其中該心血管疾病為動脈粥狀硬化症 2herosclerosis)、血管再阻塞（rest_is)、心絞痛（如細心、 ⑵、性心肌梗塞（acute my〇cardial infarcti〇n)、急性冠狀動脈症（咖e coKmary syndrome)、或與糖尿病（diabetes)相關聯之心血管異常。 71.如申請專利範圍第68項之受試者中之vWp媒介疾病或異 常的治療方法，其巾該血栓性疾減異“血管發炎、靜脈血检、、 鐮刀形血球疾病、異體移植排斥（xenograftrejection)、末梢血管 疾病（peripheral vascular disease)、栓塞性血小板減少性紫療症& 137 200938630 (thrombotic thrombocytopenic purpura)、囊腫纖維化（记 (vascular dementia), f (Raynaud^ disease)、類風溼性關節炎（rheumat〇idarthritis)、或糖尿病。 當=·容圍第69項之受試者中之VW媒介疾病或異 ，的4方法’其中該腦血管疾病為血管性失智症（職心 dementia)、局部缺血性中風、或再發性（recu_t)十風。 73.如申請專利範圍f 66_72項中任一項之受試者中之餅 =疾，或異常的治療方法，其中該有效治療量係自約。。 100mg/kg。 Ο ❹ 當的範圍第73項之受試者中之vwp媒介疾病或異 吊的/α療方法，其中該有效治療量係自約_2至約 當的範圍第73項之受試者中之vWF媒介疾病或異 吊的>口療方法，其中該有效治療量係自約0002至約10m m如申請專利範圍帛66_75項中任一項之受試者中之麟 媒;I疾病或異常的治療方法’其中係將單一或多次小劑量 之該有效治療量之該擬人化抗體或其結合片段投予該 77. 如申請專利範圍第66_乃項中任一項之受試者中之濟 =疾:減異常的治療方法’其中該有效治療量足以抑制血小板 滅木，但不足以引發明顯之出血臨床症狀。 78. 如申請專利範圍第66_72項中任—項之受試者中之撕 ίίΐίi異常的治療方法’其中該有效治療量係自之約1 至約250倍，而不致引發明顯之出血臨床症狀。 处人種申明專利乾圍帛M3項中任一項之擬人化抗體或盆 :片,的用途’，係作為藥劑(medicamen〇，包含以一有t台 療罝投予該擬人化抗體或其結合片段。 8〇.種申明專利範圍帛項中任一項之擬人化抗體戍其 二U的用其係，於製備VWF媒介疾病或異常之治療藥、 知，匕3以二有效治3量投予該擬人化抗體或其結合片段。…、 81.如申請專利範圍第79項之申請專利範圍第⑷項中任一 138 200938630 療 82·如申請專利範圍第80或81項之申請專利範圍第]__43項 中任一項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該vWp媒介疾 病或異常為血栓性疾病或異常。 83.如申請專利範圍第82項之申請專利範圍第丨—犯項中任一 項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該血栓性異常為心血 管疾病或腦血管疾病。
    84.如申請專利範圍第83項之申請專利範圍第丨—^項中任一 項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該心血管疾病為動脈 粥狀硬化症（atherosclerosis)、血管再阻塞（resten〇sis)、心絞痛 (angina)、急性心肌梗塞（acutemy〇cardiaiinfarcti〇n)、急性冠狀 動脈症（acute coronary syndrome)、或與糖尿病（diabetes)相關 聯之心血管異常。 85.如申請專利範圍第82項之申請專利範圍第μ43項中任一 項之擬人化抗體或其結合片段的用途’其中該血栓性疾病包含： 血管發炎、靜脈血气、鐮刀形血球疾病、異體移植排斥（xen〇gmft rejection)、末梢血管疾病（peripheral vascular disease)、栓塞性血 小板減少性紫巍症（thrombotic thrombocytopenic purpura)、囊腫纖 ❹ 維化（cysticfibrosis)、血管性失智症（vasculardementia)、^諾氏 症（Raynaud’s disease)、類風溼性關節炎（rheumat〇id 咖也）、 或糖尿病。 86. 如申請專利範圍第83項之申請專利範圍第丨_43項中任一 項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該腦血管疾病為血管 性失智症（vasculardementia)、局部缺血性中風、或再發性 (recurrent)中風。 87. 如申請專利範圍第79-81，83-86項中任一項之申請專利範 圍第1-43項中任一項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該 有效治療重係自約0.001至約1 〇〇 mg/kg。 88. 如申請專利範圍第87項之申請專利範圍第ι_43項中任一 139 200938630 項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中 0.002 至約 20mg/kg。 尔目、'Ί 89. 如申請專利範圍第87項之申請專利範圍第Μ3. 項之擬人化抗贱其結糾段的_，其巾 俾 0.002至約10 mg/kg。 深里1示目约 90. 如申請專利範圍帛79_8!，83_86項中任一項之 Si U中任—項之擬人化抗體或其結合片段的用途上5 之該有效治療量之該擬人餘體 ❹ ❹ 91. 如申請專利範圍f 79_81,83_86項中任一項之 項中任—項之擬人化抗體或其結合片段的用途，Li 了療m抑制血小板凝集，但不^以引發明顯之出血臨床义 圍笛利範圍第㈣，83_86項中任—項之帽專利範 ^第1-43項中任-項之擬人化抗體或其結合片段_途，^ ED1°。之約1至約250倍，而不致引發明顯:出: 93.如二申請專利範圍第以㈣，⑷7，及2435項中任一項 抗體或其結合片段，當其被用作藥劑時，包含以 > 口療篁投予該擬人化抗體或其結合片段。 有 之擬9人4化圍/1-5,7-10,14·17,及24-35項中任一項 常時，勺片當其被用於治療vWF媒介疾病或異 \匕3丄有效療量投予該擬人化抗體或其結合片段。 中兮藥二2專= 範圍第93項之擬人化抗體或其結合片段，其 中该樂劑被用來治療vWF媒介疾病或異常。 段，申圍第94或％項之擬人化抗體或其結合片 & 媒介疾病或異常為血栓性疾病或異常。 中該血於利範5第％項之擬人化抗體或其結合片段，其 μ血技性異㊉為心血官疾病或腦血管疾病。 98.如申請專職_97項之擬人化抗體或其結合諸，其 140 200938630 中該心血管疾病為動脈粥狀硬化症（atherosclerosis)、血管再阻塞 (restenosis)、心絞痛（angina)、急性心肌梗塞（acutemyocardial infarction)、急性冠狀動脈症（acute coronary syndrome)、或與糖 尿病（diabetes)相關聯之心血管異常。 99. 如申請專利範圍第96項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該血栓性疾病包含：血管發炎、靜脈血栓、鐮刀形血球疾病、 異體移植排斥（xenograft rejection )、末梢血管疾病（peripheral vascular disease)、栓塞性血小板減少性紫癜症（thrombotic thrombocytopenic purpura)、囊腫纖維化（cystic fibrosis)、血管性 ❹ 失智症（vascul31 dementia)、雷諾氏症（Raynaud’s disease)、類風 、屋性關節炎（rheumatoidarthritis)、或糖尿病。 100. 如申請專利範圍第97項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該知血官疾病為血管性失智症（vasculardementia)、局部缺灰性 中風、或再發性（recurrent)中風。 101. 如申請專利範圍第95-100項中任一項之擬人化抗體或其 結合片择’其中該有效治療量係自約〇〇〇1至約l〇〇mg/kg。 102. 如申請專利範圍第101項之擬人化抗體或其結合片段， 其中該有效治療量係自約0.002至約20mg/kg。 103·如申請專利範圍第101項之擬人化抗體或其結合片段， ❿ 其中該有效治療量係自約0.002至約1〇 mg/kg。 104. 如申請專利範圍第95, 97-100, 102-103項中任一項之擬 人化抗體或其結合片段，其中係將單一或多次小劑量（sub_d〇se) 之該有效治療量之該擬人化抗體或其結合片段投予該受試者。 105. 如申請專利範圍第95, 97-100, 102-103項中任一項之擬 人化抗體或其結合片段’其中該有效治療量足以抑制企小板凝 集，但不足以引發明顯之出血臨床症狀。 106. 如申請專利範圍第95, 97-100項中任一項之擬人化抗體 或其結合片段’其中該有效治療量係自ED10〇之約1至約250倍， 而不致引發明顯之出血臨床症狀。 107· —種具有馮威里氏因子（vWF)特異性之人類抗體或其 141 200938630 結合片段’其係以範圍自ED⑽之約i至約25〇倍之有效治 以投藥’而不致引發明顯之出血臨床症狀。 ’、 108. 如申請專利範圍第1〇7項之人類抗體或其結合片段，苴 中δ亥人類抗體或其結合片段具有人類vwp之Ai領域之特異性。 109. -種將申請專利範圍第M3項中任一項之擬人化抗體或 八結合片段投予有此需要之受試者的方法，包含：給予一有效^ 療量的該擬人化抗體或其結合服，其足财卩制血小板凝集而= 致引發明顯之出血臨床症狀。 110. 如申請專利範圍第66項之受試者中之vWF媒介疾病戋 ❹ Ο f常的治療方法，其巾該擬人化抗體或其結合版 下方 式加以投予。 111. 如申請專利範圍第66項之受試者中之vWF媒介疾病或 ，常的治療方法’其巾該擬人化抗體或其結糾段係經脈 式加以投予。 112. 如申請專利範圍第66項之受試者中之vWp媒介疾病或 二吊的治療方法’其巾該擬人化抗體或其結合片段係經由靜脈方 式結合放射性治療法加以投予。 里申請專職圍第66項之受試者中之vWF媒介疾病或 :常，>。療方法’其巾雜人化抗體或其結糾段之該有效治療 I係自roioo之約1至約250倍。 114,如申請專利範圍第79項之申請專利範圍第1-43項中任 擬人化抗體或其結合片段的用途’其中該擬人化抗體或其 m 口片段係以自ED1(K)之約1至約25〇倍的劑量加以投予。 ^了種製品’其係用以治療vWF媒介疾病或異常，該製品 =含如料糊範_ μ#項巾任—項之擬人化抗體或其結合片 Ί又0 二種套件（kit) ’其係用以治療¥胃媒介疾病或異常， ^人片^3如巾請專利範圍第1-43項中任一項之擬人化抗體或其 117. —種申請專利範圍第μ43項中任一項之擬人化抗體或其 142 200938630 結合片段的用途，其係用於非治療性應用上。 118.如申請專利範圍第117項之申請專利範圍第ι_43項中任 一項之擬人化抗體或其結合片段的用途，其中該非治療性應用為 診斷性測定（diagnostic assay )。 119. 如申請專利範圍第93項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該有效治療量係自約0.001至約1〇〇mg/kg。 120. 如申請專利範圍第94項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該有效治療量係自約0.001至約lOOmg/j^g。
    121. 如申請專利範圍第93項之擬人化抗體或其結合片段，其 中係將單一或多次小劑量（sub-dose)之該有效治療量之該擬人化 抗體或其結合片段投予該受試者。 122。·如申請專利範圍第94項之擬人化抗體或其結合片段，其 中係將單一或多次小劑量（sub_d〇se)之該有效治療量之該擬人化 抗體或其結合片段投予該受試者。 12t如申請專利範圍第96項之擬人化抗體或其結合片段，其 中係將單一或多次小劑量（sub-dose)之該有效治療量之該擬人化 抗體或其結合片段投予該受試者。 . 124· ^申請專利範圍第1〇1項之擬人化抗體或其結合片段， 其中係將單一或多次小劑量（sub-dose)之該有效治療量之該擬人 化抗體或其結合片段投予該受試者。 V _ 125.如申請專利範圍第93項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該有效治療量足以抑制到、板凝集，但不足則發之金、 臨床症狀。 ^ 12f如申請專利範圍第94項之擬人化抗體或其結合片段，其 中該有效治療量足以抑制血小板凝集，但不足以引發明顯之出血、 臨床症狀。 ’ 12【如申請專利範圍第％項之擬人化抗體或其結合片段，其 療量足以抑制血小板凝集，但不足以引發明顯之出血' 臨床症狀。 128·如申請專利範圍第101項之擬人化抗體或其結合片段， 143 200938630 顯之出 療量足以抑制到、板凝集’但不足以引發明 如申請專利範圍帛1〇9項之將申請 任-項之擬人化抗體或其'结合片段投予有此需要之項中 法，其中該擬人化抗體或其結合片段係經由皮下 =方 130·如申請專利範圍第1〇9項之將申請專利範^第 任一項之擬人化抗體或其結合片段投予有此需要之項中 法，其中該擬人化抗體或其結合片段係經由靜脈方式加：： 131. 如申請專利範圍第109項之將申請專利範 ^予。 任一項之擬人化抗體或其結合片段投予有此需要之受-3項中 法，其中織人化抗體·結合片段餘由靜脈 治療法加以投予。 、、σ 口放射性 132. 如申請專利範圍第1〇9項之將申請專利範圍 任一項之擬人化抗體或其結合片段投予有此需要之受項中 法，其中該擬人化抗體或其結合片段之該有效治療量係 之約1至約250倍。 τ'日h!3100 八、圖式· ❹ 144
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