TW200932912A - Biocarburant preparation using pencillium funiculosum enzymes - Google Patents
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Description
200932912 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 5 Ο -10 15 ❹ 本發月/歩及藉由獲得自布達佩斯條約(Bu(Japest的咐) 下被保存於國際真菌研究所IMI號碼378536的繩狀青黴菌 (Pemc山mm 酵素混合物於製造生質酒精之生 物質的酶解糖化作用。 本發明特別指利用纖維素酶、万葡聚糖酶、纖維二糖 水解酶、万-葡萄糖苷酶和選擇性木聚糖酶處理用於製造生 質酒精之生物質的方法。 近十年内已廣泛研究可再生木質纖維素生物質至乙醇 之作為另類液體燃料的生物轉化。 生物乙醇具有尚製造成本和低產能量,以及仍持續在 研究更經濟的製程。酶水解被視為可將纖維素生物質轉化 成可發酵糖最具潛力的技術。酵解步驟的成本為該製程中 最主要的經濟因素。已曾努力改善纖維素材料之酶水解的 效率。
Vidmantiene等人(2006)述及一種從穀類衍生廢物產生 適合被發酵成乙醇之糖飼料以利用第一種水解搬粉和包含 來自枯草芽孢桿菌(及似份沿㈨之α -澱粉酶和沒葡聚糖酶 二隨後酵素製品的糖化而水解該多糖的方法。此步驟為在 65°C進行90分鐘。第:種酵素製品包含來自泡盛麵菌(Α iiwamori·)的葡糖激粉酶、殿粉酶和葡聚糖酶乂及谷 木聚糖酶、來自里氏木黴菌(Γ· read)的纖維素酶和召葡聚 20 200932912 糖酶以及被用於55〜6(TC的溫度下進行i2〇分鐘。 啤⑶等人(細6)提及-種對整體乙醇產量無負面影 響的預水解處理法’該預處理利用補充卜葡萄糖普酶的市 售纖維素酶混合物或由來自嗜熱子囊菌σ· _她㈣之 5改良纖維二糖水解酶、來自嗜熱枝頂抱菌(Α. ___ 之内切葡聚糖酶、來自嗜熱子囊菌之/3-葡萄糖苦酶和木聚 糖酶蛋白所組成熱活化酵素的研製混合物在贼進行16、8 或4小時。
Tabka等人(2_描述利用真菌木質纖維素酶於轉化木 1〇質纖維生物質至可發酵糖以製造生物乙醇的改良條件。以 稀硫酸預處理麥梗接著蒸煮爆碎。源自不同真菌的酵素之 間可觀察到協同效應:在臨界酵素濃度(1〇單位/克的纖維素 酶、3單位/克的木聚糖酶和10單位/克的阿魏酸醋酶)的纖維 素酶、來自里氏木黴菌的木聚糖酶和來自黑麵菌(a則·㈣ 15的阿魏酸酯酶(ferul〇ylesterases)。藉由溫度從37°C升高至50 °c以提昇酶水解的產量。 對降解特別指木質纖維受質之纖維素受質的新賴方 法’以及能增強降解效率的新賴酵素和酵素混合物仍有持 續性的需求。亦需要能在低溫下操作、能—致性利用高生 2〇物質及產生高糖和乙醇濃度的方法和酵素。此方法亦可節 省能源及投資成本。本發明的目的為符合至少一部分這些 需求。 4 200932912 【發明内容;3 發明概要 5 ❹ -10 15 本發明涉及藉由獲得自布達佩斯條約下被保存於國際 真菌研究所mm碼378536之崎青黴_至少—酵㈣ 合物於處理生物㈣方法,其步驟包含提供生物質以及i 上迷可糖化生物質的條件下使其接觸酵素混合物。 —根據本Μ,職得自布舰斯條钉被保存於國際 真菌研究所ΙΜΙ號碼378536之繩狀青黴菌單一真菌的酵素 混合物已描述於歐洲專利申請案Ερ丨〇〇7 743,將其内容併 入於此以供參考。 根據ΕΡ 1 007 743的描述藉由寄存菌株在27至36它培 養溫度於種子培養基(較佳組成為(重量比):玉米漿1至 4%、除泡的消泡劑、加水至100%,蒸餾培養液前可將ρΗ 調整至約3.0至6.0的NaOH)之發酵製造上述的繩狀青黴菌。 生產培養基較佳為具有下列的組成(重量比):在27至36 C培養溫度下使用玉米漿〇至4.〇%、分批式和流加式纖維素 0.8至14%、約鹽:〇至〇·8%、硫酸錄〇至丨〇%、除泡的消泡 劑、加入足量水至100%,蒸餾培養液前可將pH調整至約3.〇 至6.0的NaOH ;以及足夠將pH維持在約3.0至6.0的H2S04、 足以維持pH在約3.0至6.0的氨氣或氨液。 在發酵過程中被加入碳的主要來源為纖維素;在不同 的纖維素碳源中較佳為使用不同等級的ARBOCEL、 SOLKAFLOC、CLAROCEL ' ALPHACEL,或 FIBRACEL。 較佳為藉由加入硫酸或另一種酸及氣或液態氨或另一 20 200932912 種驗控制該發酵過程。 發酵結束時,藉由固-液分離法例如過渡或離心除去固 體,收集該液相以及濃縮例如藉由有機或礦物膜上的超淚 法。 、 5 根據本發明,該酵素混合物可為一經分離純化酵素製 品或—粗製品例如生長繩狀青黴菌的培養液。純化酵素製 品可購自市面商品Rovabio™ Lc。本發明的酵素混合物可 補充附加的純化粗酵素製品例如木聚糖酶。 根據本發明的生物質指可被用作為燃料或用於工業生 1〇產的活和最近死亡生物植物性物質。該生物質係由碳煙和 非碳烴材料所構成。該碳烴化物可被細分成纖維素、沒 鍵結葡萄糖基團的直鏈聚合物,以及半纖維素、由点_14 鍵結木糖主鏈與***糖、半乳糖、甘露糖和搭糖酸分枝 所構成的複合支化聚合物。有時該木糖可能被乙酿化以及 ^***糖可能含有連接至其他半纖維素鍵或至木質素的阿 魏酸伽_)或桂皮咖。生物f的最後主要成分為高度交 聯類苯基丙酸構造的木質素。 執行本發明的方法時可利用含木質纖維為主要成分的 生物質’或含纖維素的任何組成物(木質纖維生物質亦包含 2〇木質素)例如種子、榖類、塊莖;食品加工或工業生產的植 物廢料或副產品(例如莖);玉米(包括芯、稽样等);禾草; 木材(包^木屑,、加工廢料);紙;襞;再生紙⑽如報紙)。 在特疋態樣中,被用於水解纖維素的本發明酵素包含直 鏈的石-1,4-鍵結葡萄糖基圏。但是在較佳的具體實施例中 200932912 係使用麥梗、麥麩、***纖維或剝皮麻桿作為生物質。 5 ❹ 10 15 ❹ 20 根據本發明的生物質加工包含獲得自布達佩斯條約下 被保存於國際真菌研究所IMI號碼378536之繩狀青黴菌的 酵素混合物,其中該酵素混合物至少含有根據上述方法獲 得的木聚糖酶、々-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、石葡萄糖 苦酶、纖維素酶、果膝酶和阿魏酸醋酶。 在進一步態樣中’根據本發明的方法包含在至少一酵 素混合物接觸該生物質之前的預處理步驟。此預處理步驟 的目的為増加該生物質與酵素的接觸表面積及可加工性。 該預處理步驟可為化學方法例如將該生物質置入98。^ 的3克/升濃度硫酸内或機械方法例如礙碎該生物質。 在又進一步態樣中本發明涉及一種用於製造生物乙醇 的方法’其步驟包含提供獲得自布達佩斯條約下被保存於 國際真菌研究所IMI號碼378536之繩狀青黴菌的至少—酵 素混合物、提供生物質、在可糖化生物質的條件下使酵素 混合物接觸該生物質’以及發酵該糖化產物。在本發明的 一特定具體實施例中’藉由含該生物質和酵素混合物之# 養液的離心分離糖化水解液。 〇 下被保存 的酵素旄 該生物質的糖化可使用獲得自布達佩斯條約 於國際真菌研究所IMI號碼378536之繩狀青微菌 合物。 圖式簡單說明 第1圖:含R〇vabioTMLC纖維素的消化率 A.在37。(:以1〇〇微升R〇vabio™LC/克的受質進行24、 7 200932912 72和96小時的水解。藉由稱取乾物質重量測定被水解纖 維素的百分率。 Β·藉由水解上清液的HPLC分析測定其含糖量。此圖代表 纖維素水解過程中各種糖的釋出量。 5第2圓:在溫和條件下各種木質纖維受質的水解 Α.在37。(:以1〇〇微升R〇vabi〇TMLC/克的受質進行麥梗、麥 麵的水解。其為在28t下培養72小時。 B.此圖顯示全部受質可釋出葡萄糖以及其主要來自麥麩 (0.094克/克的初受質)。 10第3圖:酵素濃度對水解麥梗和麥麩的影響 在28°C下進行72小時的水解。 A. 以酵素濃度為函數的水解麥梗和麥趄之變化。 Β·以酵素濃度為函數的葡萄糖釋出量。 第4圖:以R〇vabi〇TMLC濃度和水解時間為函數從麥麩的葡 15萄糖釋出量 葡萄糖的最高釋出量為0.094克/克的Si,此係在28。(:溫度下 經由100微升的R〇vabioTMLC/克受質作用72小時。 第5圖:溫度對麥麩水解的影響 以100微升Rovabio™LC/克受質進行麥麩的水解。 2〇 A.以溫度和時間為函數的生物質水解變化。 B. 以溫度和水解時間為函數的勤萄糖釋出變化。 第6圖:以稀釋酸預處理對麥梗和麥越水解的影攀 8 200932912 在98°C之下將受質於50毫升的3%硫酸内培養20分鐘,然後 以100毫升的超純水清洗。以100微升RovabioTMLC/克受質 在37 C之下水解該兩種受質。該預處理可促進受質的水 解,但對葡萄糖的釋出(B)具有負面的效應。 5 〇 10 ❿ 15 第7囷:含木聚醣酶之麥越的水解 將繩狀青黴菌的木聚糖酶B表現於畢赤酵母菌(p 及木聚糖酶c表現於耶氏酵母菌·⑼。使 木聚糖酶的濃度相當含於2〇〇微升R〇vabi〇TMLC的木聚糖酶 活性。Rov-Xyn B為50%木聚糖酶活性來自R〇vabi〇TMLc及 另一半活性來自木聚糖酶B的混合物(R〇vXyn c混合物亦 如此,其Xyn C為木聚糖酶C)。麥麵的水解係在37它進行 小時。 A. 以各種酵素比較麥楚的水解。 B. 各種酵素從麥麵釋出的木糖和葡萄糖。 【實施方式;J 較佳實施例之詳細說明 實例1 :材料和方法 1·酵素和受質 3下被保存於國際 的酵去、冷液,其主 R〇vabi〇™LC係獲得自布達佩斯條約 真菌研究所IMI號碼378536之繩狀青黴菌<
要已知活性為纖雄素酶 9 200932912 亦測疋繩狀青黴菌的木聚糖酶。這些為畢赤酵母菌内 的繩狀青黴菌木聚糖酶B選殖株和耶氏酵母菌内的繩狀青 黴菌木聚糖酶C選殖株。 亦使用繩狀青黴®發酵衆。此係由於RQvabiGTMLC為一 5種配方產品’因而欲測定_素混合㈣水解能力。 被選取的觉質為:頂級麥梗⑽Agr〇,批號MO·5 113)、麥甦(不明來源)、麥梗(不明來源)以及纖維素(JRS, 八1*1)(«^1批號16〇〇6 8〇121)。 2.製備受質 10 就該兩種研究的受質而言,為使酵素與受質獲得最大 的接觸面必需進行混合步驟。使用頂級麥梗和普通麥梗。 利用混合機縮小體積,其最終將為公分級粒徑。 就其後步驟而言,以相同方法處理全部的受質。稱取 δ亥焚質置入錐形燒瓶内’然後加入pH 5.4的50毫升0.1克分 I5子醋酸鹽緩衝液。接著將該錐形瓶在下高壓滅菌π分 3.化學預處理 為在溫和條件下進行平行試驗,化學預處理該麥梗和 麥麵。預處理的目的為改變生物質的物理結構及分離各部 2〇分以便使纖維素更易接觸酵素因而將其轉化成可發酵糖。 使這些受質以3克/升接觸20毫升的硫酸然後在98°C的水浴 内培養20分鐘。接著以1〇〇毫升的超純水清洗。移除該洗滌 水接著以相同處理方法預處理該預處理受質,即加入醋酸 200932912 鹽然後高壓滅菌。 4·酵素水解 在錐形瓶被冷卻至室溫之後’在滅菌條件下加入該酵 素溶液。重複測定各條件及將對照融入各項測試中。該對 5照包含未加入酵素的錐形瓶。測試各種濃度的酵素以評估 何種酵素/受質的含量比最為有效,即可能的最高比例。就 除Rovabi〇TMLC之外的酵素而言,測定使該纖維素酶及/或 木聚糖酶相當於Rovabi〇TMLC之活性的含量。 接著在150 rpm攪拌下的一已知溫度將錐形瓶培養 10 24、48或72小時。在各種測試期間其測定溫度為28、扣和 37〇C 0 5·可溶物和不可溶物的分離 培養之後,藉由在4t下於10000克離心15分鐘收集各 種樣本的不可溶物。等分上清液及儲存於-2(TC以便其後進 15行HPLC的分析。至於顆粒部分,先以50毫升水清洗然後以 4〇毫升水再清洗-次。每次清洗之後,藉由離心收集該顆 粒(如前述相同條件)’及同樣將清洗上清液分成等分以便進 行其後的HPLC分析。 此外’為了測定受質被轉化成可溶性糖的百分比,在 20 120C將賴粒乾燥24小時然後稱重。水解後剩餘不可溶生 物質的百分比等於(剩餘乾物質/最初乾物質)x 100。為測定 最初的乾物質,在水解試驗之前錢出各受質的重量然後 在me乾燥24小時。因此’可利用新鮮受質與乾燥後之間 11 200932912 的質量差異測定生物質内的含水比例。隨後將該含水比例 運用於各稱取的新鮮受質以測定其乾物質重量。 6·上清液的HPLC分析 為測定該可溶物的糖組成,藉由HPLC(Agilent 1100) 5分析離心的上清液以及清洗上清液。該層析系統包含一等 強度泵送系統、一樣本轉換器、一前置柱(Bi〇_Rad,Micr〇_
Guard® Carbo P)、一Aminex® HPX-87P管柱(Bio-Rad)、一 折射率檢測(RID)偵測器或折射計及一資料擷取器和處理 系統。在被注入層析管柱内之前,為粒化任何的雜質將上 10 π液在4 C及在16 100克離心30分鐘。隨後其被過濾通過一 〇·45微米纖維素膜。其分析條件如下:在肋^溫度進行層 析》IL動相為超純水,流率為0.6毫升/分鐘,以及注入2〇 微升樣本,接著以100微升水清洗。藉由預建立校正範圍利 用滞留時間鐘定該樣本的組成分。此範圍係由4種糖所構 15成,其'辰度範圍為從0.5至25克7升。校正範圍所使用的糖為 纖維二糖、D-葡萄糖、D-木糖和L-***糖。其為木質纖 維素生物質水解過程中主要釋出的糖類。 7·纖維素酶和木聚糖酶活性的檢測
藉由3,5-二硝基水楊酸(DNS)檢測法(G L 測定酵素的活性。纖維素酶或木聚糖酶的活性單位定義為 在定義的酶解條件,即纖維素酶活性為PH 5和木聚糖酶為 PH 4 ’及在5(rc溫度下,每分鐘和每克產物分別釋出一微 莫耳葡萄糖當量或木糖當量所需的酵素量。 12 200932912 就纖維素酶的活性而言,該試驗係根據藉由点_ i,4鍵結 連接之葡萄糖聚合物羧曱基纖維素(CMC)的酵解。該酵素 水解釋出葡萄糖單體,其在反應結束藉纽色測定法和利 用葡萄糖標準曲線在54〇奈米吸光度測定其濃度。在超純水 5 ❹ • 10 15 ❹ 20 中進行酵素的稀釋。為獲得一平均活性值重複各樣本的檢 測及亦同時製備其對照。將175毫升的受質(1 5%重量/體積 CMC)置入試管内然後在5(rc的水浴中培養5分鐘。除了對 照試管之外藉由加入25〇微升的酵素稀釋液啟動該反應。在 10分鐘之後同樣於5(rc之下藉由加入2毫升的1%(重量/體 積)DNS中止該反應。在此階段,從水浴中取出試管,將250 微升的酵素稀釋液加人對照試管内,然後中止全部試管的 反應及轉而在95°C的第二水浴槽内放置5分鐘。此步驟可使 DNS(橘色)藉由釋出葡萄糖而被還原成3_胺基_5_硝基水揚 酸(橘紅色)。為使其恢復至室溫,將試管置入冷水槽内。最 後,藉由加入10毫升水進行附加稀釋,及在54〇奈米讀取吸 光度。 就木聚糖酶的活性而言,利用相同的檢測原理。由於 使用1.5%(重量/體積)的樺木木聚糖作為受質,該酵素水解 釋出的木糖單體具有如用於纖維素酶活性之葡萄糖相同扮 演還原的角色。另一方面以木糖製備其標準範圍。 實色L2」藉由R0vabi0TMrr;:嫿錐素測定單純的夸 事實上所使用市售纖維素為真纖維素和半纖維素的混 合物。纖維素係一種召」,^鍵結D_葡萄糖的聚合物。在生 物乙醇合成基礎上,Rovabi〇TMLC借助於其纖維素酶的活性 13 200932912 (内切-l,4-yS-葡聚糖酶、纖維二醣水解酶和点-葡萄糖普酶) - 可將其水解而釋出葡萄糖單體。半纖維素係一種亦以^ -1,4-鍵結的D-木糖聚合物’以及具有各種糖的分支例如甘 露糖、半乳糖、***糖等。其借助於後者(其中一些為内 5 切-1,4-石-木聚糖酶、谷-木糖苷酶、α -呋喃***糖苦酶) 之木聚糖酶的活性亦被Rovabio™LC所水解。 由於纖維素具有99.5%的純度(根據供應商的資料),因 此在實驗條件下我們可估計R〇vabio™LC(主要為其纖維素 酶活性及亦包括木聚糖酶的活性)的最大水解能力,其接近 〇 1〇 生物質的轉化試驗而非酵素活性檢測。為了測定將纖維素 轉化成可溶性糖的產量,我們使用兩種方法作為基礎。首 先由稱取乾質量所組成;第二為藉由水解和清洗上清液的 - HPLC分析測定釋出糖的數量和性質。 . 就此受質而言,在1〇〇微升/克受質的R〇vabi〇TMLC濃度 15和37°C的溫度下進行酵素水解。在24和96小時之間進行培 養的監控。 1·乾質量 〇 藉由反應後剩餘生物質的百分比測定水解產量。 由於纖維素係一種簡單聚合物,不似其他生物質試驗 20其水解如同在酵素複合物Accelerase™ 1000(第1號技術公 報Genencor)必然快速即必然接近9〇〜99%範圍以及必然在 丰又相對短的期間内。然而,如第lA圖所示,在96小時之 後纖維素水解僅達到27 3%。事實上,在水解之後,可收獲 約70%的不溶物。從水解條件和受質的性質而言此結果令 14 200932912 5 Ο 10 15 Ο 20 人極為評異。此結果的-種解釋為水解條件過為溫和(溫 度、pH等),或相對受質量過低的酵素濃度,或者,相反地, 藉由纖維二糖水解酶釋出纖維二糖而抑制某些纖維素酶 (VaUjamaeP·等人,2_。為證明此假說,必需檢測該上清 液的HPLC分析結果。 2·釋出糖分析 由於纖維素具有99.5%的純度,我們可預期⑽被水解 至對應的葡萄糖、較少量的纖維二糖以及源自半纖維部分 的木糖。第1B圖顯示纖維素水解過程中所釋出的各種糖。 木糖的釋出量達物8克/初@體克數⑸),即克纖維素 可釋出8克。 至於葡萄糖的釋出,在96小時之後可獲得〇225克⑻ 克的釋出量。此結果與上述乾f量的差異具有—致性。事 實上,已發現28%被水解溶化的纖維素為葡萄糖(22•㈣和 ^糖__式。邏輯上’從纖維素釋出的«糖量應代 表以R〇Vabi〇™LC水解木質纖維生物質期間的最大可被釋 出量。 H維二糖的存在。從纖維 糖借助於酵素混合液的纖維二糖水解酶活 克)Π 在24和96小時之間極低(約嶋克⑻ 克)。因此未被受質所抑制, 轉時㈣增加纖維 水二?2 濃度將維持恒定。因此低度的纖維素 2可油因於料的濃衫足或該水解條件過於溫和。 …、而’與目t料所制者她較_ 15 200932912 和的條件下進行試驗。此選擇係為了顯示R〇vabi〇TMLC在較 便且條件下的有效性。因此隨後將在初始設定條件下進行 更複雜生物質的試驗。
16 200932912 主要歸因於R〇Vabio™LC的半纖維素酶活性(特別指内切 木聚糖酶、α-呋喃***糖苷酶和万木糖苷酶)。 水解過程中葡萄糖的釋出量為〇 〇34克/ 5 e 10 15 ❹ 20 水解條件下被釋出的主要糖類,其濃度仍過低而;= 用麥梗作為生物乙醇合成的受質。 麥梗在經過混合後仍然極為粗糙。然而,祇有利用小 表面積受f和低比财質素錢⑽維素結日日日度才有助於 酵素的水解。麥麵為具有這些特性的受質。 1·2麥麩 由於來源小麥的組成差異和小麥研磨法以及所使用的 分析方法極*㈣確地狀各種錢的組成關。然而, 其3有平均3至7%的木質素(Schwartz等人,1988)以及其似 乎含有下列組成的不溶性糖類:2 1%的半乳糖、23·7%的阿 拉伯糖、29.1%的葡萄糖和43 7%的木糖(Benamr〇uche等 人,2002)。 在試驗過程中,麥麩顯示為最適合用於酵素水解的受 質。明確而言’已發現在水解後可減少32.5%的生物質。此 外’上清液的HPLC分析顯示其不溶物係由0.048克纖維二 糖/Si克、0.034克***糖/Si克、〇 ο%克木糖/&克和〇 〇94 克葡萄糖/Si克所組成。因此,在溫和水解條件下,約1〇% 的水解受質量以葡萄糖的形式被釋出。由於可能未完全被 酶解及或者與原始和研磨後比較麥麩的糖組成有極大的差 異’因此獲得的可溶性糖比例未如Benamrouche等人中所預 測。 17 200932912 麥麵似乎為用於釋出葡萄糖的理想受質。 · 在相對溫和的水解條件下(28t進行72小時及酵素濃 度為100微克/受質克數)進行這些初步的試驗。 實例4:水解铬件螃爭作仆 5 此最佳化涉及三種重要因素:酵素濃度、水解溫度以 及為改善受質與該酵素接觸性的化學預處理。 h酵素濃度的效應 為增加受質的葡萄糖釋出量,可合理地增加酵素的濃 ❹ 度。然而,目前發展生物燃料的主要障礙為用於木質纖維 10生物質之糖化步驟中的酵素成本。基於此理由,必需定義 該最適的酵素濃度。 因此我們測試在先前條件下可獲得最佳結果之酵素濃 度對兩種受質:麥梗和麥麩的效應。 除酵素用量之外,該分析條件不變,即在28乞培養72 15小時及在150 rPm下進行攪拌。我們主要興趣於生物質水解 的百分比及葡萄糖的釋出量。 ❹ 甚麥梗而言’測定三種濃度:40、100和200微升的 Rovabio™LC/受質克數。鑑於100微升R〇vabi〇TMLC/麥梗克 數之濃度所獲得的結果’決定不管處理成本以較高的濃度 20 進行試驗。 根據對乾生物質的水解效應,4〇、1〇〇和200微升濃度 的Rovabio™LC/受質克數分別減少! 2%、n 2%和15%(第 7Α圖)。必需指出在相同比例之下倍增R〇vabi〇TMLC的濃度 18 200932912 無法提高麥梗的水解。 5 Ο 10 15 ❿ 20 如預期,已發現在200微升/受質克數的酵素濃度具有 最大葡萄糖釋出量。明確而言,增加RovabioTM濃度可分別 獲得0.025、0.034和0.067克的葡萄糖/Si克(第7B圖)。在此 範例中,增加酵素濃度之後可增加葡萄糖的釋出量。較佳 為必需指出’就40微升Rovabio™LC/受質克數的濃度而 言,其相當於每100微升R〇vabio™LC/受質克數釋出73%的 葡萄糖。此結果證明在保持有效纖維素酶的同時可使用較 少的酵素。該水解在40和100微升/受質克數(分別為0.007和 0.009克/Si克)的濃度下亦能釋出事實上相同量的木糖以及 在200微升RovabioTM/受質克數時為0.018克木糖/si克。 就麥麵而言,我們測定四種不同的濃度:20、40、50 和100微升Rovabio™LC/受質克數。 增加Rovabio™LC濃度具有增加麥麩水解的效應,但如 同對麥梗並非成比例。事實上,增加濃度等級可獲得下列 減少的乾生物質:23、25、32和32.5%的水解麥麩。因此50 微升RovabioTMLC/受質克數足以達到最大的水解作用。因 此如此看來’就其所使用的水解條件即pH 5 4和28l溫度而 言,Rovabio™LC的最高水解受質不超過約3〇%。 至於上清液的HPLC分析’其亦顯示利用較高酵素濃度 的優點。事實上’使用RovabioTMLC進行水解可增加葡萄糖 的釋出量。下列為其釋出量:20、40、50和100微升/受質 克數的RovabioTMLC濃度分別為〇 〇4、〇 〇58、〇 _和〇 〇94 克葡萄糖/Si克(第3圖)。更重要必需注意的是當使用最高 19 200932912
Rovabio™LC濃度而獲得最高量葡萄糖時,5〇%的酵素濃度 . 僅增加28%的葡萄糖釋出量。因此可在不過度降低葡萄糖 釋出量之下減少酵素的使用量。 另外’我們亦分析以各種Rovabi〇TMLC濃度水解24、48 5和72小時的上清液(第4圖)。此將浮現出許多的結論。首先, 相同的水解時間(24、48或72小時)最高酵素濃度通常將釋出 最大量的葡萄糖。此外,就相同的R〇vabi〇TMLC濃度而言, 在72小時之後可獲得最大量的釋出葡萄糖。然而,從第48 小時開始出現相當於80%最大量可釋出葡萄糖的高峰。木 n 1〇糖亦可觀察到相同的釋出曲線,其在1〇〇微升/受質克數的
Ro vab1〇™LC濃度水解72小時之後可獲得讀6克⑸克的最 高濃度。 ' 全部這些結果清礎地證明可在較低R〇vabi〇TMLC濃度 和較長水解時間’或在高酵素濃度但較短水解時間之下進 15 行水解的事實。 2·溫度的效應 先前係在28°C的溫度進行試驗,但此非為κ〇ν^〇τΜΐ^ •生的最適μ度。事實上’此酵核合液通常係由檢測於 阶溫度下的各種活性酵素所組成。此外, 2〇百先並且主要被用作為動物飼料中的營養添加劑 。因此其 必需為能在動物消化道内發揮活性的溫度,其視品種介於 一和41 C之間因此木f纖維素生物質的水解試驗必需進 仃於28°C以上的溫度。 為測定溫度對Rovabi〇TMi r 水解木質纖維生物質的效 20 200932912 應我1們在二種不同溫度:28、30或37°C下於1〇〇微升/受 質克數之R〇vabi〇™LC濃度内水解24、48和72小時以麥麩作 為梵質進行一系列的試驗(第5A圖)。根據先前試驗獲得的 最佳結果測定該受質和酵素濃度。 5 10 15 ❹ 20 當觀察此試驗甲水解生物質的百分比時,可發現許多 令人驚訝之處(第5B圖)。首先,不論水解的時間在3〇和37 〇之下進行水解僅存在些微的差異。另一方面,若與28°C 之下進行的水解相比較可發現稍微增加水解生物質的百分 比(在28、30和37 C溫度的水解麥麵平均分別為%%、39% 和39%)。因此可證明在28t以上可增加水解速率。 現在將觀察溫度對特別指纖維素酶活性之各種酵素活 性的效應。 不似藉由處理該乾生物質獲得的結果’該來自分析上 清液的結果更具有相關性。事實上,葡萄糖的釋出量隨著 時間而增加及在37°C的試驗中達到最大量。明確而言,在 37 C水解72小時所獲得的最高濃度為〇上克葡萄糖/Si克。 此試驗中,溫度增加約urc因而使其葡萄糖的釋出量增加 14.5% 〇 至於木糖,其釋出曲線類似葡萄糖及最高木糖釋出量 為0.096克/Si克。由於在生物乙醇製程中亦可收獲木糖而具 有其價值。 儘管測試溫度極為類似’在增加水解溫度的平行試驗 中亦發現可增加可溶性糖的釋出量。由於用於R〇vabi〇TMLC 活性檢測的溫度為5〇°C,因此可再一次於37。(:以上溫度最 21 200932912 佳化木質纖維生物質的水解作用。 儘管低成本水解條件的需要,在某些情況下,該糖化 過程的加入步驟仍然不可避免,特別當受質内含有過高的 半纖維素或木質素組成時。 5 3.化學預處理的效應 用於製造生物乙醇的受質為極粗糙的材料因而在酵素 水解之前需要進行預處理。有各種的預處理方法,所有這 些方法的目的為藉由縮小顆粒的尺寸或藉由減小半纖維素 及/或木質素的比例以改善受冑鱗素的可接觸性。已發展 © 10出許多預處理方法:機械預處理法(受質加壓法)、熱預處理 法(蒸煮法)(M〇SlerN.等人’ 2005)或其他化學(酸或驗)預處 里法後者不僅在實驗至規模亦在產業發展階段中為最廣 泛被使用者(Schell D,J.等人,2003)。 我們選擇的預處理方法為在98〇c溫度下使用3%的硫 15酸。這些預處理條件不同於一般常用者。事實上,此預處 理法係在較馬溫度(從1〇〇至2〇〇。〇但在低酸濃度(約六倍的 低漠度)下進行(Lloyd T.A.等人,2005 ; Wyman C.E.等人, ❹ 2005)。先前已知麥梗具有高比例作為纖維素之保護層的半 纖維素和木質素。酸預處理具有移除該半纖維素部分及改 2〇變木質素構造的性質,因而使纖維素易於接觸酵素。我們 比較酸預處理對上述在溫和條件下不易被水解之麥梗和麥 麩的兩種受質之有效性。 預處理生物質然後以Rovabio™水解的百分比如下. 17.5%的麥梗被水解對1〇%無預處理者,及39 6%的預處理 22 200932912 麥麵被水解同時’未預處理者的水解可達到20%(第6八圖)。 因此該預處理對以R〇vabi〇TM水解的受質具有正面的效應。 另一方面,當針對葡萄糖的釋出量時,其預處理的有 效性較不明顯(第6B圖)。就麥梗而言,可獲得〇〇63克濃度 5的釋出葡萄糖/Sl克,即與未經預處理的水解比較減少 30%。最後,就麥麩而言,葡萄糖的釋出量為〇 〇62克/Si克, 即與未經預處理的水解比較減少34%。根據這些結果,明 顯地預處理對從這些生物質釋出葡萄糖並不具有預期的效 應。一般認為有兩種解釋:一為酸預處理可裂解該纖維素, 10 此時葡萄糖將在加熱後出現於酸溶液内,或另一為預處理 後使受質的pH過低而不活化ROVabi〇TMLC的纖維素酶活 性。 為了證實此兩種假設,我們先藉由HPLC分析預處理後 的清洗上清液。該分析並未顯示任何可溶性糖的存在;因 15 此纖維素並未被預處理所溶解。第二,我們確認pH 5 4之50 毫升0.1毫克分子醋酸鹽緩衝液(水解前的混合物)内經預處 理觉質的pH以及在相同緩衝液内未經預處理的pH。經預處 理混合物的pH為5.1,而未經處理受質的pH為5 6。我們因 此藉由DNS測定法檢測在pH 5.1和在pH 5.6的R〇vabi〇TMLC 2〇 之纖維素酶活性以確認該活性是否受pH降低所影響(通常 在PH 5進行DNS測定)。該兩種檢測條件之間發現有7%的差 異’然而其無法解釋預處理對受質的效應,其原因為第一 該活性的差異過小,以及第二為較低PH的該纖維素酶活性 較大於本試驗的活性。 23 200932912 然而,另一種可能的解釋為:以稀酸的預處理可能由 於過酸的pH而導致糖的裂解(Ogier等人,1999)。這些裂解 將改變該受質而因此無法被酶所確認。 迄今為止,我們把注意力集中在木質纖維生物質之摊 5 化過程中的RovabioTMLC性質,其主要目的為從這些生物質 產生葡萄糖。此係由於葡萄糖為目前微生物用於製造生物 乙醇的較佳受質。然而,目前已開始利用能同化葡萄糠和 木質作為碳源的基因改性生物。因此較佳為研究純木聚雜 φ 酶對木質纖維受質的效應。此外,必需在低成本之下製造 10 生物乙醇。目前所使用的Rovabio™LC係一種配方產品;我 們因此亦研究繩狀青黴菌對水解木質纖維受質的發酵能 ". 力。 實例5 :木聚糖醯的水解及發珐泯合物 僅利用麥麩進行下列的試驗。其分析條件如下:在37 15 °C (最有效的溫度)下水解72小時。酵素濃度的定義為使木聚 糖酶的活性等於200微升的Rovabi〇TMLC以及,發酵混合物 Ο 的纖維素酶活性相當於維持200微升的Rovabio™。其結果 示於第7圖。
1·木聚糖酶B 20 具有等於R〇vabi〇TMLC活性的木聚糖酶B濃度為150微 升/受質克數。以木聚糖酶B水解之後,可收獲79%的麥麩, 其意指可達到21%的水解。 另外,上清液的HPLC分析顯示存在一種單糖:0.021 24 200932912 克木糖/5丨克,即在相同水解條件下低於1^(^讣1〇1^1(:的46 倍。此結果可被解釋為R〇vabi〇TMLC係一種由具有相互加乘 作用之各種活性所組成的酵素混合液,因此可將該複雜的 受質裂解成可溶性糖。 另外一種繩狀青黴菌木聚糖酶的基因被過度表現:其 為木聚糖酶C。
2·木聚糖酶C
Ο 這些試驗所使用木聚糖酶C的濃度為850微升/受質克 數。在反應72小時之後木聚糖酶c僅水解18%的麥麩。可看 10出木聚糖酶C對水解此類型受質的效率較木聚糖酶b為低。 另一方面,有令人訝異的HPLC分析結果。明確而言, 在水解上清液内發現微量的木糖(0·04克/Si克)以及葡萄糖 的濃度為0.057克/Si克。儘管在努力維持等於R〇vabi〇TMLC 的木聚糖酶活性之下仍僅釋出低量的木糖。此外,在測定 15 木聚糖酶的過程中未預期地出現葡萄糖。因此可推斷繩狀 青黴菌木聚糖酶C亦具有纖維素酶活性。 單獨使用木聚糖酶無法如同R〇vabi〇TMLC從麥麵釋出 木糖,其可能原因為純木^^糖轉無法受益於R〇vabioTMLC 各種活性之間的互補作用。 20 3. Rovabio™和木聚糖酶的協同作用 下列試驗係利用50%來自Rovabi〇TMLc^〇5〇%來自木聚 糖酶B或木聚糖酶C的木聚糖酶活性進行酵素水解。今反應 在37°C下進行72小時。 25 200932912
Rovabio™LC-木聚糖酶b混合物可水解41%的麥麵,同 時Rovabi〇™LC-木聚糖酶C混合物水解38%。R_bi〇TMLC 則可水解37%的麥麩。因此可維持整體的水解效率;此處 該木聚糖酶可補助Rovabi〇TMLC的作用0 5 另外,借助於Rovabi〇TMLC和木聚糖酶B的複合作用可 釋出0.12克的葡萄糖和0.095克的木糖/別克。R〇vabi〇TMLC_ 木聚糖酶C混合物可釋出H36克的葡萄糖和〇 〇7克的木糖 /si克。這些結果稍優於獲得自麥麵或單獨以R〇vabi〇TMLc 的水解者,因而可證實Rovabio™LC各種複合酵素之間相互 ◎ 10 作用的重要性。 在研究以木聚糖酶水解麥麵之後,為完成木質纖維受 質之酵素水解的研究必需另外進行-項試驗:含發酵齡 - 物之麥麵的水解作用。 4.發酵混合物 15 因此我們以587微升繩狀青黴菌發酵混合物分析麥麩 在37°C下進行72小時的水解作用。此試驗所使用的發酵混 〇 合物相當於在代於麵克下離領獲得的發酵上清液。 可獲得44%的水解麥麩,表示其可獲得較其他試驗過 程中實質上更多的水解。該水解上清液產纽129克的葡萄 20糖和請6克的木糖/si克。再一次,該葡萄糖和木糖的釋出 豆稍高於藉由R〇vabi〇TMLC水解麥麩所獲得者。 26 200932912 5 ' 10 參考文獻 Benamrouche S,Cronier D, Debeire P,Chabbert B.(2002)。 (1—4)/3-内切木聚糖酶處理對麥麩之效應的化學和組織學 研究。Journal of cereal Science,36(2) : 253~260。 Lloyd TA,Wyman CE.(2005)。藉由剩餘固體之半纖維素水 解配合酵素水解之預處理的總糖產量。B/orejowrce rec/mo/og);,96(18) : 1967~ 1977,2005。 Miller GL.( 1959)。利用二硝基水楊酸試劑於還原糖的測 定。Aaa/yi/ca/ C/iembir};,第 31卷,第 426~428 頁。 Mosier N, Wyman C, Dale B, Elander R, Lee YY, Holtzapple M,Ladisch M.(2005 a)。木質纖維生物質預處理之前瞻性技 術的特性。7^c/mo/i7^y,96(6) : 673〜86。 Mosier N, Hendrickson R, Ho N, Sedlak M, Ladisch MR.(2005 b)。控制液熱水預處理玉米桿的最佳化pH。 15 fi/oresoMrce rec/mo/<?g;y,96(18) : 1986~93。 Ohgren K, Vehmaanrera J, Siika-Aho M, Galbe M, Viikari L, Zacchi G(2007)。用於乙醇生產之同步糖化和發酵蒸汽預熱 玉米稈前的高溫酵素預水解法。Enzyme and MicraWa/ ,40 : 607~13。 20 Ogier JC, Leygue JP, Ballerini D, Pourquie J和 Rigal L. (1999)。木質纖維素生物質的乙醇生產。ά Gw Sconce !Tec/mo/og;y-/?ev· /i7/*,54(1) : 67〜94。 Schell DJ,Farmer J,Newman M,McMillan JD.(2003)。試驗 級反應器内玉米稈的稀硫酸預處理法:固體之產量、動力 27 200932912 學和無可消化性的研究。所价%;^ «o/i?g;y,105〜108 : 69〜85。
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Claims (1)
- 200932912 七、申請專利範圍: 1. 一種用於處理生物質的方法其步驟包含: (a) 提供獲得自布達佩斯條約下被保存於國際真菌研究 所IMI號碼378536之繩狀青黴菌的至少一酵素混合 物; (b) 提供植物生物質; (c) 在可糖化該生物質的條件下使步驟(a)的酵素混合物 φ 接觸步驟(b)的生物質。 • 2.如申請專利範圍第1項中任一項之生物質處理方法,其 . 中該生物質在接觸步驟(a)的酵素混合物之前進行至少一項 ' 預處理步驟。 • 3.如申請專利範圍第2項之方法,其中該預處理步驟為在 98°C之下將該生物質置入3克/升硫酸濃度之硫酸槽内的一 種化學預處理法。 4. 如申請專利範圍第2項之方法,其中該預處理步驟為碾 碎該生物質的一種機械預處理法。 5. —種用於製造生物乙醇的方法其步驟包含: (a) 提供獲得自布達佩斯條約下被保存於國際真菌研究 所IMI號碼378536之繩狀青黴菌的至少一酵素混合 物; (b) 提供生物質; (c) 在可糖化該生物質的條件下使步驟(a)的酵素混合物 接觸步驟(b)的生物質; 31 200932912 . (d)發酵該獲得自步驟(c)的產物。 6. 如申請專職衫料’其巾辑素混合物被 &供作為一經分離純酵素製劑。 7. 如申請專㈣圍第⑴項之方法,其中該酵素混合物被 提供作為一粗酵素製劑。 8. 如申請專利範圍第1至7項之方法,其中該生物質係選自 麥梗、麥麩、***纖維或剝皮麻稈。 9. 一種包含獲得自布達佩斯條約下被保存於國際真菌研究 所題號碼378536之,繩狀青黴菌的酵素混合物於糖化生物 質的用途。 10· -種包含酵素混合物的經處埋生物質該混合物獲得 自布達佩斯條約下被保存於國瞭真菌研究所匪號碼 378536的繩狀青黴菌。 〇 32
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