TW200932907A - SM-protein based secretion engineering - Google Patents

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TW200932907A
TW200932907A TW097149850A TW97149850A TW200932907A TW 200932907 A TW200932907 A TW 200932907A TW 097149850 A TW097149850 A TW 097149850A TW 97149850 A TW97149850 A TW 97149850A TW 200932907 A TW200932907 A TW 200932907A
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Hitto Kaufmann
Eric Becker
Lore Florin
Martin Fussenegger
Ren-Wang Peng
Joey M Studts
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Boehringer Ingelheim Pharma
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Description

200932907 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於細胞培養技術之領域。其係關於一種製造 蛋白質之方法以及一種產生新表現載體及宿主細胞以供生 物醫藥製造之方法。本發明另外係關於醫藥組合物及治療 方法。 . 【先前技術】 用於人類療法之生物醫藥品的市場繼續高速增長，有 Φ 270種新穎生物醫藥品在臨床研究中正得到評估且估計在 2003年出售了 300億。生物醫藥品可自各種宿主細胞系統 製造，該等宿主細胞系統包括細菌細胞、酵母細胞、昆蟲 細胞、植物細胞及哺乳動物細胞，包括衍生自人類之細胞 株。目β ’由於真核生物細胞之正確加工及修飾人類蛋白 質之能力，因此自真核生物細胞製造愈來愈多數目之生物 醫藥品。因此，自此等細胞成功且高產率地製造生物醫藥 品係關鍵的且高度視用於方法中之重組單株細胞株之特徵 ® 而定。因此，急需產生具有改良特性之新穎宿主細胞系統 且建立以高的比生產率培養生產細胞株之的方法作為高產 率方法之基礎。 任何生物醫藥品製造方法之產率均很大程度上視當在方 法條件下生長時生產細胞（producing ceU)每次分泌之蛋白 質產物之量而定。許多複雜之生物化學細胞内過程對於自 真核生物細胞合成及分泌治療用蛋白質為必要的。所有此 等步驟，諸如轉錄、RNA運輸、轉譯、轉譯後修飾及蛋白 136226.doc 200932907 質運輸在野生型宿主細胞株中均經嚴格調控且將影響衍生 自此宿主之任何生產細胞株的比生產率。 在以往，大多數工程化方法係集中於推動諸如轉錄及轉 譯之過程的分子網路以提高蛋白質製造中此等步驟之產 率。然而，就任何多步驟製造過程而言，在過程鏈之早期 步驟期間拓寬瓶頸均可能在遠處下游（尤其分泌途徑中之 轉譯後）產生瓶頸。上至卜臨限，已報導生產細胞之比 生產率係與產物基因轉錄量線性相關。 然而，進一步增強產物在mRNA水準之表現可引起蛋白 質合成、摺疊或運輸機構之超負荷，導致蛋白質產物在細 胞内累積。實務上，此現象可在目前製造過程令頻繁地觀 察到。因此，製造細胞株之分泌運輸機構為用於新穎宿主 細胞工程化策略之引人關注之目標。 對工程化所分泌之治療用蛋白質之細胞内運輸的首次研 究係圍繞如結合蛋白BiP/GRP78及蛋白質二硫化異構酶 (PDI)之分子伴隨蛋白的過度表現。伴隨蛋白為宿於内質 網（ER)中且有助於新合成蛋白質之摺疊及組裝的細胞蛋白 質。然而’與可預期之情況相反，已展示哺乳動物細胞中 之BiP過度表現降低而非增大其所締合之蛋白質的分泌， 而CHO細胞中之PDI過度表現產生與不同蛋白質產物抵觸 之結果。描述在CHO細胞株中對於IFN_y製造之ER至順式 高爾基體運輸問題之報告（H〇〇ker等人，1999)支持此等驚 人發現（增大細胞之蛋白質摺疊能力產生遠處下游製造瓶 頸）之可能解釋。 136226.doc 200932907 總之，需要改良宿主細胞之分泌能力以便重組蛋白紙製 造。此與新穎轉錄增強技術及高力價方法組合可甚至變得 更重要以防止轉譯後瓶頸及蛋白質產物之細胞内累積。然 而，目前在通向分泌運輸機構之目標操作的道路上存在兩 個主要障礙：關於基本調控機制之仍受限之瞭解及防止在 • 分泌過程中瓶頸移至遠處下游之挑戰。 【發明内容】 本發明描述Secl/Muncl8(SM)蛋白質家族之成員，尤其 β 兩個成員，亦即Munc-1 8c及Sly 1，藉由聯合促進將所分泌 蛋白質運輸至細胞表面及調節分泌小泡與細胞膜之融合中 的若干後續步驟而在刺激總體胞吐作用中的新穎及驚人作 用。本發明亦提供有效改良自真核生物細胞經由分泌途徑 運輸<蛋白質之產量的方法。另外，其描述分泌途徑之目 標操作用於治療疾病及發炎病況之用途。 蛋白質分泌為複雜之多步驟機制：蛋白質預定運輸至細 ❿ 胞外空間或將外部細胞膜首先以共轉譯方式運輸至内質網 中。自此’將其封裝於脂質小泡中且運輸至高爾基體 (Golgi apparatus)且最終自反式高爾基網路至細胞膜中， 其中將其釋放至培養基中。 在各運輸步驟中’自小泡及目標膜之SNARE[可溶性 NSF(N-乙基馬來醯亞胺敏感因子）附接受體]蛋白質均形成 反式SNARE複合物’其構成發生融合所需之核心機構。為 滿足在各種情況下之生理需求，snare介導融合機構必須 空間地且暫時地可調以自待適當整合之細胞内及細胞外來 136226.doc 200932907 源均獲得刺激。
Secl/Muncl8(SM)蛋白質似乎為調節SNARE蛋白質之關 鍵。兩種SM蛋白質，Slyl及Muncl8(包括a、b及c三種同 功異型物）係與沿分泌途徑（ER-高爾基體-細胞膜）之小泡融 合有關。Slyl為融合至内質網（ER)衍生COPII小泡之高爾 基體所需且Munc 1 8為融合至分泌小泡之細胞膜（pm)所 需。 在本發明中，吾人分析Sly 1及Muncl 8c對分泌途徑之生 理影響且首次發現兩種SM蛋白質一致地刺激總體胞吐作 用。Muncl 8c及Slyl之活化作用的分子機制可能亦保守。 基於本文之發現，吾人開創了在哺乳動物細胞中產生增強 之分泌的基於SM蛋白質之分泌工程設計。基於sm蛋白質 之分泌工程設計表示代謝工程設計之新穎策略且為在工業 中製造蛋白質醫藥品提供新穎平台。 在本發明中所述之方法在若干方面有利： 首先’吾人論證Munc-18c或Sly-1，或兩種蛋白質一起 之異源表現為藉由提高宿主細胞之分泌能力來增強重組蛋 白產量之策略。 關於工業應用，該研究藉由經由引入在分泌途徑中轉譯 後發揮其作用之轉基因的基因工程設計來開拓避過此瓶頸 之激勵人心的前景。此作為最新代高效表現載體之用途的 特定相關性之出現可能引起生產細胞株内蛋白質摺疊、修 飾及運輸機構之超負荷，因此降低其理論最大生產率。異 源性引入SM家族之分泌增強蛋白質（諸如Munei8&/或 136226.doc 200932907
Slyl)可克服此限制。 第二，SM蛋白質係自酵母至人類保守進化：在酵母 中，存在四種SM蛋白質（Seclp ' Siylp、Vps33p及 VPs45P)，在果蠅中有三種（R〇p、Siyl及Vps33/康乃馨 (carnation))，在蠕蟲中有六種（Unc·丨8以及5種根據基因組 — 序列資料庫之其他基因）以及在脊椎動物中有七種蛋白質 (Muncl8-1、Muncl8-2 及 Muncl8-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B及Slyl)。鑒於跨物種之高保守程度，似乎極有可 0 能將SM蛋白質用以調節在所有真核宿主細胞物種（自酵母 歷經蠕蟲及昆蟲細胞至哺乳動物系統）中蛋白質之分泌及 細胞表面表現。 第三，SM蛋白質家族之所有成員均展示在整個序列十 之高序列相似性程度，表明其應顯示類似整體結構。另 外，已為四個物種中九種SM基因描述了功能損失突變， 其所有均引起小泡運輸及融合之嚴重損傷，表明sm蛋白 φ 質在小泡運輸及分泌過程中應起到類似及重要之作用。因 此，吾人主張Mimcl8及/或Slyl對在本發明中所述之目的之 適用性可同等地轉移至SM蛋白質家族之任何其他成員。 第四，藉由調節SNARE介導之小泡融合機構，sm蛋白 質家族之成員係與自ER至高爾基體、自高爾基體至細胞膜 之小泡運輸及最終胞吐融合（ex〇eyt〇tic fusi〇n)之所有不同 步驟均有關。因此，參與分泌運輸鏈之後續步驟的多種 SM蛋白質之異源表現具有對跨膜蛋白之總體胞吐作用或 細胞表面表現產生附加或甚至協同效應的潛力。另外，作 136226.doc -10· 200932907 為藉由轉錄因子XBM異源性共表現之蛋白質運輸的起點 之ER之同時工程設計進一步提高此分泌增強作用。 作為第五優勢，SM蛋白質亦影響分泌途徑之最後一個 步驟，亦即小泡運輸至細胞膜，且藉此在不產生遠處下游 瓶頸之風險的情況下促進蛋白質分泌。 •總之，SM蛋白質在小泡介導蛋白質運輸（自现至高爾基 •體及自高爾基體至細胞膜）之所有步驟中的參與使得 Muncl8c、Slyl及所有其他SM家族蛋白質均為用於目的在 ^ 於增強真核生物細胞分泌能力之(多)基因工程化方法的極 誘人及有希望之目標。 在本發明中所述之小泡介導蛋白質運輸之目標工程設計 可具有廣泛應用。詳言之，兩種基本方法可為突出的： ⑴過度表現SM蛋白質及/或增強8河蛋白質之活性以提高細 胞之分泌運輸能力，或 (ii)降低SM蛋白質活性及/或表現以作為降低癌細胞增殖及/ 或侵入之基因療法的手段。 ® SM蛋白質過度表現之適用性： 所述之本發明描述一種藉由81^家族蛋白質之過度表現 改良細胞之總體蛋白質分泌能力來產生用於製造異源蛋白 質之改良真核宿主細胞之方法。 此使得在基於真核生物細胞之製造過程中提高蛋白質產 率。其藉牝降低此等過程之物品的成本且同時降低需經製 造以產生物質之批料之數目’該物質為治療用蛋白質之調 查研究、診斷學、臨床研究或市場供應所需。本發明另外 136226.doc 200932907 加速藥物開發’因為產生足量的用於臨床前研究之物質常 為關於時間表之關鍵工作包。 本發明可用以提高用於產生一或若干種用於診斷目的、 研究目的（目標識別、先導識別（leadidentificati〇n)、先導 最佳化（lead 〇ptimizati〇n))或在市場或在臨床開發中製造 治療用蛋白質的特異性蛋白質之所有真核生物細胞的蛋白 - 質製造能力》 如在本申請案中所示’ SM蛋白質之異源表現引起所有 ❿ 類別蛋白質（包括經分泌之酵素、生長因子及抗體）之產量 增加。因為跨媒蛋白共用同一小泡介導運輸途徑（其係由 SM蛋白質與SNARE之相互作用來調節），所以此工程化方 法同等地適用於改良跨膜蛋白之運輸及增強其在細胞表面 上之豐度。 因此，本文所述之方法亦可用於學術及工業研究目的’ 其旨在表徵細胞表面受體之功能。舉例而言，其可用於表 • ®蛋白之製造及後續純化、結晶及/或分析。另外，藉由 所述方法產生之跨臈蛋白或表現此等蛋白質之細胞可用於 篩選檢定，例如物質之篩選、孤兒受體之配位體的識別或 在先導最佳化期間對改良效用之搜尋。因為細胞表面受體 為藥物目標之主要類別，所以此對於新穎人類藥物療法之 開發至關重要。 另外，本文所述之方法對於研究與細胞表面受體締合之 細胞内信號複合物或分析細胞-細胞通訊（部分係由可溶性 生長因子與在同一或另一細胞上之其相應受體的相互作用 136226.doc 12 200932907 所介導）而言可為有利的。 降低/抑制SM蛋白質表現及/或活性之適用性： 在本發明中，吾人提供SM表現降低引起可溶性細胞外 蛋白質分泌降低之證據，如為]^[1111(；18(：及8171所示。此使 得SM蛋白質為治療性操作之誘人目標。 自正常健康細胞轉化為癌細胞的特點之一為自外源生長 因子之存在獲得獨立。與正常細胞相反’腫瘤細胞能夠產 生所有為其存活及自身增殖所必需之生長因子。除此自分 泌機制之外，癌細胞常展示在其表面上生長因子受體之上 調表現，其導致對自周圍組織中之細胞所分泌之旁分泌作 用生長及存活因子的反應性增強。例如藉由使用shRNA_ 方法siRNA-方法或反義rnA-方法，藉由粗向sm-蛋白 質，如腫瘤細胞中之Sly_1&Muncl8，可能以兩種方式破 壞自分泌以及旁分泌生長-刺激及/或存活機制：⑴藉由降 低生長因子運輸及分泌及（ii)藉由減少腫瘤細胞上相應生 長因子-受體之量。藉此，生長刺激信號之量及癌細胞感 知及響應此等信號之能力均將降低。抑制在癌細胞中之 SM蛋白質表現或活性因此應代表防止癌細胞增殖及存活 之強大手段。 SM蛋白質另外似乎為抑制腫瘤侵入及轉移之有效治療 目標》在大多數類型之人類癌症的晚期，原發腫瘤產生先 驅細胞（pioneer ceU)，該等先驅細胞移出、侵入相鄰組織 且行進至遠端位點，其中其可成功建立新群落（稱為轉 移）。 136226.doc •13· 200932907 作為組織侵入之先決條件，癌細胞表現整套蛋白酶，該 等蛋白酶使其能夠經由周圍健康組織而遷移，穿過基膜， 進入血流且最終侵入目標組織。將此等蛋白酶中之一些表 不為膜結合蛋白質，例如MT_MMP及ADAM❶由於其在基 質重塑、生長因子排出（shedding)及腫瘤侵入中之關鍵作 用，因此將蛋白酶本身討論作為癌症療法之藥物目標。吾 人主張抑制腫瘤細胞中SM蛋白質表現及/或活性減少在目 標細胞表面上之膜結合蛋白酶之量。此應降低或甚至損傷 腫瘤細胞之侵入能力以及其對生長因子排出之能力，從而 使得腫瘤侵入性及轉移潛力降低。因此，靶向SM家族之 蛋白質提供防止晚期腫瘤發生，尤其自良性/實體節結轉 化為侵襲性轉移腫瘤之新穎方式。 因此，對於治療應用而言，目標在於降低及/或抑制SM 蛋白質之活性及/或表現。此可藉由核苷酸組合物來達 成’將該核苷酸組合物用作藉由抑制SM蛋白質功能來治 療疾病之人類治療劑，藉以該藥物包含經由結合其rna之 序列移動子（sequence motive)來特異性抑制8河蛋白質的 shRNA、RNAi、siRNA或反義RNA。降低/抑制SM蛋白質 活性/表現亦可藉由含有結合及沈默各別SM蛋白質基因之 啟動子的核苷酸之藥物物質來達成。 另外，藥物物質或產物可包含抑制8仏(蛋白質之表現或 活性的新穎化學實體或肽或蛋白質。在蛋白質為活性醫藥 化合物之情況下，其可為⑴與SM蛋白質之啟動子結合藉 此抑制其表現之蛋白質，（ii)與SM蛋白質或其相互作用搭 136226.doc 200932907 配物（例如，SNARE複合物内之突觸蛋白或蛋白質）結合藉 此阻礙SM蛋白質與其結合搭配物之功能相互作用的蛋白 質，（iii)類似於SM蛋白質但並不履行其功能之蛋白質，意 謂"顯性負"SM蛋白質變異體，或（iv)充當SM蛋白質及其結 合搭配物兩者之骨架從而使得蛋白質不可逆結合且形成穩 定及非功能性蛋白複合物的蛋白質。 根據本發明，提供使用本發明之化合物的新穎方法。因 此，本發明之化合物可用以治療癌症或其他異常增殖性疾 病。癌症係以兩種方式分類：癌症起源之組織的類型（組 織類型）及原發部位’或在體内癌症首先發生之位置。癌 症發生之最常見部位包括皮膚、肺、女性***、***、 結腸及直腸、淋巴系統、子宮頸及子宮。 化合物因此適用於治療多種癌症，包括（但不限於）以 下： AIDS相關之癌症’諸如卡波氏肉瘤（Kap0siis sarc〇ma); 骨相關癌症，諸如尤因（Ewing)家族腫瘤及骨肉瘤；腦相 關癌症諸如成人腦瘤、兒童腦幹神經膠質瘤、兒童小腦星 形細胞瘤、兒童大腦星形細胞瘤/惡性神經膠質瘤、兒童 室管膜瘤、兒童神經管胚細胞瘤、兒童小腦幕上原始神經 外胚層瘤、兒童視覺途徑及下丘腦神經膠質瘤及其他兒童 腦瘤；乳癌；消化/胃腸相關癌症，諸如肛門癌、肝外膽 管癌、胃腸類癌、結腸癌、食道癌、膽囊癌、成人原發性 肝癌、兒童肝癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌及胃癌；内分 泌相關癌症’諸如腎上腺皮質癌、胃腸類癌、胰島細胞癌 136226.doc 15 200932907 (内分泌胰腺）、副曱狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤及甲狀 腺癌；眼相關癌症，諸如眼内黑色素瘤及視網膜胚細胞 瘤，泌尿生殖器相關癌症，諸如膀胱癌、腎臟（腎細胞） 癌陰^癌、鈿列腺癌、移行細胞（transitional cell)腎盂 及輸尿管癌、睾丸癌、尿道癌、韋爾姆斯氏瘤（WUms, tumor)及其他兒童腎臟腫瘤；生殖細胞相關癌症，諸如兒 童顱外生殖細胞腫瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細 胞腫瘤及睾丸癌；婦科相關癌症，諸如子宮頸癌、子宮内 膜癌姓娠期滋養細胞Μ瘤（gestational trophoblastic tumor)、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低惡性潛 力腫瘤、子宮肉瘤、***癌及外陰癌；頭及頸部相關癌 症，諸如下儀癌（hyp0pharyngeai eancer)、喉癌、唇及口 腔癌、原發灶隱匿之轉移性鱗狀頸癌、鼻咽癌、口咽癌、 鼻竇及鼻腔癌、副甲狀腺癌及唾液腺癌；血液學/血液相 關癌症’諸如白血病，諸如成人急性淋巴母細胞白血病' 兒童急性淋巴母細胞白血病、成人急性骨髓白血病、兒童 急性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓白血病 及毛細胞白血病；及淋巴瘤，諸如AIDS相關之淋巴瘤、 皮膚T_細胞淋巴瘤' 成人霍奇金氏淋巴瘤（adult Hodgkin's lymphoma) '兒童霍奇金氏淋巴瘤、懷孕期間霍奇金氏淋 巴瘤、蕈樣真菌病、成人非霍奇金氏淋巴瘤、兒童非霍奇 金氏淋巴瘤、懷孕期間非霍奇金氏淋巴瘤、原發性中樞神 經系統淋巴瘤 '赛謝症候群（Sezary syn(Jr〇me)、皮膚I細 胞淋巴瘤及華氏巨球蛋白血症 136226.doc •16- 200932907 macrogl〇bUlinemia)及其他血液學/血液相關癌諸如慢性 脊髓增生病症、多發性骨髓瘤/漿細胞瘤、骨趙發育不^ 症候群及骨髓發育不良/骨髓增生病；肺相關癌症月諸^ 非小細胞肺癌及小細胞肺癌；肌肉骨骼相關癌症，諸如尤 因氏家族腫瘤、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、兒童橫 紋肌肉瘤、成人軟組織肉瘤、兒童軟組織肉瘤及子宮肉 瘤；神經相關癌症，諸如成人腦瘤、兒童腦瘤、腦幹神經 膠質瘤、小腦星形細胞瘤、大腦星形細胞瘤/惡性神經膠 質瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、小腦幕上原始神經外 胚層瘤、視覺途徑及下丘腦神經膠質瘤及其他腦瘤，諸如 神經母細胞瘤、垂體瘤及原發性中樞神經系統淋巴瘤；呼 吸道/胸相關癌症，諸如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡 性間皮瘤、胸腺瘤及胸腺癌；皮膚相關癌症，諸如皮膚τ_ 細胞淋巴瘤、卡波氏肉瘤、黑色素瘤、梅克爾細胞癌 (Merkel cell carcinoma)及皮膚癌0 此等病症已在人類中充分表徵，但於其他哺乳動物中亦 以類似之病源學存在，且可藉由本發明之醫藥組合物來治 療。 對於治療用途而言，可以治療有效量、以任何習知劑 型、以任何習知方式來投與化合物。投與途徑包括（但不 限於）靜脈内、肌肉内、皮下、滑液内、藉由輸注、舌 下、經皮、經口、局部或藉由吸入、錠劑、膠囊、囊片、 液體、溶液、懸浮液、乳液、***劑、糖漿、可復水散 劑、顆粒、栓劑及經皮貼片劑。製備此等劑型之方法為已 136226.doc -17- 200932907 知的（例如，參見，H.C. Ansel 及 N.G. P〇p〇vish Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems > 第5版，Lea及Febiger (1990))。治療有效量可由熟習此項 技術者基於諸如體重、代謝及疾患嚴重性等因素來確定。 活性化合物較佳以每公斤體重每日約1 mg至約5〇〇 mg來給 藥。活性化合物更佳以每公斤體重每日約1 mg至約丨 來給藥。 化合物可單獨或與佐劑組合投與，該等佐劑增強抑制劑 之穩定性，促進在某些實施例中含有其之醫藥組合物的投 與，提供增強之溶解或分散’提高抑制活性，提供輔助療 法，及其類似情況。有利地，此等組合可利用較低劑量之 活性成份，由此降低可能之毒性及不利副作用。 與根據本發明之化合物一起使用的醫藥學上可接受之載 劑及佐劑包括（例如）離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵 磷月曰企巧蛋白、緩衝物質、水、鹽或電解質及基於纖維 素之物f。此並非可能<醫藥學上可接受之載劑及佐劑的 完整清單，且一般技術者知道其他可能性，其在此項技術 中為充分的。 總之本發明描述藉由異源表現Muncl8c、Slyl或SM蛋 白質家族之其他成員及其組合來增強在真核生物細胞中蛋 白質之分泌運輸的新穎方法。此方法尤其適用於以增強之 製过旎力產生最優化宿主細胞系統以便表現及製造重組蛋 白產物。
Secl/Muncl8(SM)蛋白質為在細胞内蛋白質運輸中膜融 136226.doc -18- 200932907 合所需的，但已長期提出其作用之性質為不同而非統一 的，其部分係因為在SM蛋白質與SNARE之間相互作用之 非均質性。在本發明中，吾人評估兩種SM蛋白質對分泌 途徑之生理影響。基本發現在於在小泡融合至細胞膜及高 爾基體中涉及之Muncl 8c及Sly 1 —致地刺激總體胞吐作 . 用。 - 與此模型一致，吾人展示當敲除Slyl及Muncl8c時，總 體胞吐作用降低（圖3)。相反地，藉由過度表現造成的增加 ❿ 水準之Slyl提高分泌能力（圖4)。重要及令人驚訝地，
Munc 1 8c亦顯著刺激宿主細胞之分泌能力。為支持此，吾 人論證Muncl8c係與為融合至PM(細胞膜）而特異性化之 SNARE複合物直接結合（圖5)。 先前研究指定Munc 1 8c在胞吐作用中之抑制作用（Riento 等人，2000; Kanda 等人，2005; Tellam 等人，1997; Thurmond等人，1998)，其與本發明之結果相抵觸。為提 供Muncl8c在運輸機構中之作用，詳言之其與由突觸蛋白 ^ 4、SNAP-23及VAMP2組成之胞吐SNARE蛋白質之相互作 • 用的分子理解，吾人報導免疫沈澱實驗。如圖5中所示， • Munc 18c-特異性抗體定量地使Munc 18c連同顯著量之突觸 ，蛋白4、SNAP-23及VAMP 2—起沈澱，表明Muncl8c與此
等SNARE之活體内締合，其促進在分泌途徑中的小泡-細 胞器融合（Peng及Gallwitz，2002; Shen等人，2007; Scott等 人，2004)。此發現強調類似於與完全組裝之SNARE複合 物結合且促進融合高爾基體之Slyl，Munc 18c亦與SNARE 136226.doc -19- 200932907 複合物直接相互作用’提示藉由促進SNARE介導之運輸機 構之保守作用機制。 因此，Slyl及Muncl8e功能之生理學作用及機制在 SNARE介導分泌途徑中均為保守的。 當Slyl、Muncl8c及通用細胞器擴增因子又“丨過度表現 時，基於SM蛋白質之分泌工程增強多種蛋白質之胞吐作 用’該等蛋白質包括酵素、生長激素及免疫治療單株抗 體。 本申請案之資料論證一旦在相同細胞内兩種SM蛋白質 同時過度表現即對蛋白質分泌有附加或甚至協同之效應， 如為Muncl8c及Slyl所示。吾等資料因此支持8?^蛋白質在 刺激SNARE介導運輸機構中之統一功能的模型且表示用於 增強分泌之轉譯後工程設計的新穎策略。 總之，在本申請案中，吾人提供SM蛋白質在胞吐/分泌 途徑中之統一活化作用的第一個驚人證據。基於此發現， 吾人開創了基於SM蛋白質之轉譯後工程設計，藉由其成 功達成増強之胞吐作用。 有效製造蛋白質治療劑對生物技術工業仍為大挑戰。迄 今為止’已開發多種不同代謝工程設計策略。舉例而言， 藉由增大轉錄（轉錄工程設計）；藉由調節哺乳動物細胞之 轉譯效能（轉譯工程設計）；藉由提高特異性糖型 (glycoform)之產量（糖基化工程設計）；藉由僅將代謝能重 疋向至產物形成（受控增殖技術）及藉由改良生產細胞株之 生存力（抗細胞凋亡工程設計）。然而，基於和諧配合之 136226.doc 20- 200932907 (orchestrated)分泌機構的代謝工程仍為難懂的。基於Slyl 及Munc 18c—致地刺激總體胞吐作用之發現，在本文中吾 人首次報導引起哺乳動物細胞之分泌能力增強的基於SM 蛋白質之轉譯後工程設計。該系統係與所用啟動子之表現 組態、類型及啟動子介導轉錄量無關，使得其尤其適於工 ’ 業製造重組蛋白及醫藥》 • 本發明另外提供藉由干擾SM蛋白質表現來抑制或降低 蛋白質胞吐作用之手段。此將為治療癌症或發炎病況提供 〇 適用手段。 先前已描述，在真核生物細胞中，膜結合運輸小泡使蛋 白質及脂質在亞細胞區室/細胞器之間穿梭。在各運輸步 驟，自小泡及目標膜之SNARE[可溶性NSF(N-乙基馬來醯 亞胺敏感因子）附接受體]蛋白質均形成反式SNARE複合 物，其構成發生融合所需之核心機構。為滿足在各種情況 下之生理需求，SNARE介導融合機構必須在空間上暫時地 可調以自待適當整合之細胞内及細胞外來源均獲得刺激。 w 因此，關鍵在於活體内調節或微調SNARE功能以使膜融合 之特異性及速度均不受損。Secl/Muncl8(SM)蛋白質可為 - 調節SNARE蛋白質之關鍵。首先在酵母及線蟲中識別之 . SM蛋白質為融合所必需。除SNARE外幾乎不存在相互作 用搭配物之事實已得出SM蛋白質係與SNARE蛋白質功能 偶合之普遍觀點（Gallwitz及Jahn，2003; Jahn等人，2003; Toonen及Verhage，2003)。然而，推廣SM蛋白質之功能模 型的嘗試已顯著地受阻於其與SNARE相互作用之異質性 136226.doc 21 200932907 質。在獨特運輸步驟且在不同生物體中，單體突觸蛋白 (Dulubova等人，1999; Yang等人，2000; Peng及 Gallwitz， 2002)、小泡相關 SNARE(Li等人，2005; Carpp等人，2006; Peng 及 Gallwitz; 2004; Shen 等人，2007)、異二聚體 t-SNARE複合物（Scott等人，2004; Zilly等人，2006)以及三 • 元完全組裝之SNARE複合物（Carpp等人，2006; Peng及
• Gallwitz; 2004; Shen等人，2007; Togneri等人，2006; Carr 等人，1999; Dulubova等人，2007)已展示易於與個別SM e 蛋白質結合。因此，已為膜融合中之SM蛋白質功能以正 面及負面觀點解釋了此等相互作用之生理學意義。 因此，分子機制，尤其SM蛋白質在分泌途徑中之生理 作用仍為未知的。舉例而言，Sly 1係與單體突觸蛋白5、 單體小泡結合SNARE及完全組裝之SNARE複合物相互作 用（Li等人，2005; Peng及Gallwitz; 2004)，且已展示正面 影響形成SNARE複合物及融合特異性（Peng及Gallwitz， 2002; Kosodo等人，2002) ° W 另一方面，先前研究指定Muncl8蛋白質在膜融合及胞 吐作用中之抑制作用：突觸小泡之經調節胞吐作用尤其需 要之神經元特異性Munc 18a呈現兩種與SNARE相互作用之 功能對立：藉由與突觸蛋白1之封閉構形結合，由此抑制 SNARE複合物組裝（Dulubova等人，1999; Yang等人， 2000)，且與完全組裝之SNARE複合物結合，因此促進膜 融合（Shen等人，2007; Dulubova等人，2007)。一 致地， 報導了 Muncl 8a對胞吐作用之抑制及促進作用（Wu等人， 136226.doc -22- 200932907 1998; Verhage等人，2000;.Voets等人，2001)。Muncl8b及 Muncl8c在序列上與Muncl8a同源但無所不在地表現。活 體外資料表明Muncl8c在SNARE結合方面類似於Muncl8a (Latham等人，2006; D’Andrea-Merrins等人，2007)，且兩 種蛋白質之結構為保守的（Misura等人，2000; Hu等人， * 2007)。然而，遺傳學及生理學研究迄今為止已提供 - Munc 1 8b及Munc 18c在胞吐作用中之抑制作用的專有證據 (Riento等人，2000; Kanda等人，2005; Tellam等人，1997; © Thurmond等人’ 1998)。舉例而言，1)蠅類中Muncl8a之過 度表現抑制神經元傳輸（Wu等人，1998)，2)在Caco-2細胞 中Munc 18b之過度表現抑制流感病毒血球凝集素之頂端傳 遞（apical delivery)(Riento等人 ’ 2000)’ 3)Muncl8c對犬觸 蛋白4與對VAMP2競爭結合（Thurmond等人，1998) ; 4)在 脂肪細胞中經胰島素刺激GLUT小泡之易位係受Munc 18c 過度表現抑制但在無Muncl 8c小鼠中增強（Tellam等人’ 1997; Thurmond等人，1998)。 與此等報導相反且與主導預想不同，在本申請案中，吾 人藉由證明兩種蛋白質通常同等刺激胞吐作用來論證兩種 SM蛋白質sly 1及Munc 18c之新穎及驚人之作用。藉由 Munc 18c及Slyl之活化作用的分子機制可能亦為保守的。 基於此等驚人發現，吾人開創了在哺乳動物細胞中產生增 強之分泌的基於SM蛋白質之分泌工程設計°基於SM蛋白 質之分泌工程設計表示代謝工程之新穎策略且為在工業中 製造蛋白質醫藥提供新穎平台。 136226.doc •23- 200932907 詳言之，Slyl及Muncl8c表現對哺乳動物細胞分泌能力 之正面作用指出一種將增大分泌之哺乳動物生產細胞株工 程化之新穎轉譯後方法。 在實例5中說明slyl與muncl8c同時過度表現引起SEAP 產量增大8倍，相比之下’藉由單獨之sly 1或munc 1 8c增大 • 5倍。SAMY及VEGF12i之分泌亦增大（圖4b、4c)。slyl、 muncl8c及xbp-1全部之過度表現將SEAP、SAMY及VEGF 之分泌分別增大倍、12倍及8倍（圖4a、4b、4c)，明顯地 © 說明在Slyl與Munc 18c之間及在兩種SM蛋白質與通用細胞 器擴增因子Xbp-Ι之間對分泌存在協同效應。 在實例6中進一步說明，藉由產生為slyl(CHO-Slyl16& CHO-Slyl23)或 munc18e(CHO-Muncl8c8 及 CHO-Muncl8c9) 之構成性表現而工程化的穩定CHO-K1衍生細胞株，CHO-Slyl]6及CHO-Slyl23刺激SE AP分泌增加4倍及8倍（圖6a)及 SAMY產量提高4倍及5倍（圖6b)。有趣地，產生較多SEAP 之CHO-Slyl23亦展示較高Slyl水準，表明SM與產物蛋白質 ❹ 之正相關性（圖6c)。類似地，為構成性muncl8c表現轉瘦 • 基因之細胞（CHO-Muncl8c9)產生多9倍及6.5倍之SEAP及 SAMY(圖6e及6f)且產生更多SEAP之CHO-Muncl89亦展示 較高Muncl8e水準（圖6d)。與親本CHO-K1相比，穩定細胞 株0110-81丫1-1^11111(；18〇丨（為構成性81>^1及141111〇18(；表現之兩 重轉殖基因）及CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7(為構成性Slyl、 Muncl 8c及Xbp-1表現之三重轉殖基因）展示高13倍及16倍 之SEAP產量（圖6g)。 136226.doc •24- 200932907 特定言之’基於SM蛋白質之分泌工程設計提高生產細 胞株之抗體的比生產率。實例7藉由在原型生物醫藥製造 方案中使用基於SM蛋白質之分泌工程設計以在cho- 81丫116及 CHO-Slyl23 中（增大至多 1〇倍）、在 cH〇_siyl-Muncl8c丨中（增大至多15倍）及在cH〇_siyl-Xbp-l4中（增大 至多13倍）及在CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7中（增大至多19 倍）表現稱為利妥昔單抗（Rituximab)之單株抗人類CD20 IgGl 來說明此（圖 7a)。當在 CH〇_slyl Muncl8c_Xbp l^ 產生利妥昔單抗時’可達到至多pg/細胞/天之特別製造 水準’與同基因對照細胞株相比，其對應於增大接近2〇倍 (圖 7a)。SDS-PAGE分析表明藉由 CHO_slyl_Muncl8c_xbp_ 17及野生型CHO-K1細胞產生之抗體為結構完整的且彼此 不可區分（圖 7b、7c)。自在 CHO-Slyl-Muncl8c_Xbp-l7 中 產生之利妥昔單抗的N_鍵聯Fc寡醣之基於Maidi_T〇F之糖 基化概況分析（Glycoprofiling)揭示與原生生產細胞株相比 無差異，表明基於SM/Xbp-1之分泌工程設計並不損害產物 品質（圖7d及7e)。 【實施方式】 一般實施例"包含"涵蓋更特定之實施例"由…組成另 外’單數及複數形式並非以限制方式使用。 在本發明期間所用之術語具有以下含義。 術語"基因"意謂去氧核酸（DNA)序列（例如，cDNA、基 因組DNA或mRNA)。在本發明中，基因較佳係指人類〇να 序列’但包括自其他哺乳動物物種（較佳為小鼠、倉鼠及 136226.doc -25- 200932907 大鼠）之同等同源序列’以及自額外真核物種（包括雞、 鴨、苔蘚、蠕蟲、蠅及酵母）之同源序列。 集合術語"Secl/Munc-18蛋白質”或，，SM蛋白質"或 "SeCl/MUnci8蛋白質群"或"SM-蛋白質"或"編碼SM_蛋白質 之基因"或"SM家族，，包含60-70 kDa之親水性蛋白質之家 ' 族’其具有高的結構相似性程度且自酵母至人類保守進 化。
Muncl8及Slyl兩者均屬於Secl/Muncl8蛋白質家族。此 © 家族迄今進一步包括： 在酵母中：Seclp、Slylp、Vps33p 及 Vps45p 在果蠅中：ROP、Slyl及Vps33/康乃馨 在線蟲中：Unc-18以及5種其他根據基因組序列資料庫 之基因 在脊椎動物中：Muncl8-1、Muncl8-2 及 Muncl8-3、 VPS45、VPS33-A及 VPS33-B及 Slyl。 參術語SM-蛋白質亦涵蓋此等蛋白質之衍生物、突變體及 片段，例如帶flag-標蕺、帶HIS_標籤或帶另外標籤之SM_ 蛋白質。頻繁地將此等衍生物例如用於蛋白質之簡易純化 或分離或觀測。 SM蛋白質展示在整個序列上之高同源性，表明其可能 具有類似整體結構。另外’已為四個物種中九種SM基因 描述了功能喪失突變，其均引起小泡運輸及融合之嚴重損 傷表明蛋白質在小泡運輸及分泌之過程中起到類似 及重要之作用。 136226.doc -26 - 200932907 本發明之實例使用Muncl8及Slyl作為模型蛋白質，然 而’本發明可同樣轉移至SM蛋白質家族之其他成員。 另外’蓉於跨物種之高保守程度，SM蛋白質可用以調 節在所有真核宿主細胞物種（自酵母歷經蠕蟲及昆蟲細胞 至哺乳動物系統）中蛋白質之分泌及細胞表面表現。 在真核生物細胞中，膜結合運輸小泡使蛋白質及脂質在 亞細胞區室/細胞器之間穿梭。細胞運輸小泡與細胞膜或 與目標區室（諸如溶酶體、高爾基複合體或細胞膜）之融合 係由SNARE[可溶性NSF(N-乙基馬來醯亞胺敏感因子）附接 夂體]蛋白質介導。為滿足細胞之生理需求且保持區室特 異性膜組成，藉由Secl/Muncl8(SM)家族之小蛋白質來在 空間上暫時地控制SNARE介導之融合機構。藉由與 SNARE及突觸蛋白直接結合，SM蛋白f調節在細胞内區 室/細胞器與細胞膜之間小泡介導運輸之所有步驟。 術語"Munc-18"或"Munc-18蛋白質"或白質家 族”包括存在於真核生物體中之所有Munc l8基因及基因產 物/蛋白質。此清楚地包括三種Munc_18旁系同^源物 (paralog),亦即 MUnc-18a(其亦稱為"Munc_18 l")、Munc_ 18b及MUnC-18c，其已在脊椎動物中進化。更特定言之， 術語"MUnC-18c"係指人類基因及亦稱為"突觸蛋白結合蛋 白 3"(STXBP3)或"血小板 Seel蛋白質"(psp)(SEQ_ID n〇 39) 之蛋白質Mun·’包括在其他哺乳動物物種（包括小鼠、 倉鼠、大鼠、狗及兔）中之其同源物。 術語"Siy-i"或"Siy-i蛋白質"係指所有自脊椎動物（較佳 136226.doc -27· 200932907 2哺乳動物)中此等基因表現之siyi基因及蛋白 曰之，"Sly-l”係指人類幻 ，疋 族址椹敁夕質亦稱為"含有Seel家 構域之蛋白fl"(咖】）或"突觸蛋白結合蛋白】狀蛋 白質 2”(STXBP1L2)，SEQ_mN〇 41。 狀蛋 表樣係指XBIMDNA序列及所有自此基因 2之蛋白質，包括XBIM拼接變異體。較佳地，XBP1 係私人類XBP-1序列且較佳係 ,+ β : 之拼接及活性形 ❹
:，亦稱為"狐卜已知轉錄因子χΒρι為分泌細胞分 化以及維持ER穩態及擴增之關鍵調節子之—（&，娜；
Iwakoshi，2〇〇3)。此等功能使得χΒρι為用於分泌’工程方 法之候選物。 更特定言之，"ΧΒΪΜ"係指人類咖^蛋白# seqid NO. 43。 術語"生產帛"或·，比生產率"描述藉由限定數目之細胞在 限定時間内產生之特異性蛋白質之量。比生產率因此為細 胞表現/合成/產生所關注之蛋白質的能力之定量量度。在 工業製造中，通常將比生產率表示為每細胞及每天所產生 之以皮克（’pg/細胞*天'或'ped')計的蛋白質之量。 測定所分泌蛋白質之"比生產率"的一種方法為藉由酶聯 免疫吸附檢定（ELISA)來定量量測分泌至培養基中的所關 注之蛋白質之量。出於此目的，將細胞以限定密度接種至 新鮮培養基中。在限定時間之後，例如在24小時、48小時 或72小時之後，對細胞培養液取樣且使其經受EUSA量測 以測定所關注之蛋白質的力價。可藉由將力價除以平均細 136226.doc -28 - 200932907 胞數目及時間來測定比生產率。 藉由均勻時間解析螢光（HTRF®)檢定來提供如何量測細 胞·'比生產率”之另一實例。 對於細胞内、膜相關或跨膜蛋白而言之細胞的”生產率" 亦可藉由西方墨點法來债測且定量。將細胞首先洗務且隨 後溶解於含有諸如Triton-X、NP-40或SDS之清潔劑或高鹽 濃度之緩衝液中。接著將細胞溶胞物中之蛋白質藉由在 SDS-PAGE上以尺寸分離，轉移至耐綸膜，其中所關注之 蛋白質隨後藉由使用特異性抗體來偵測及觀測。 測定細胞之"比生產率"之另一方法為藉由針對所關注之 蛋白質而提出之螢光標記抗體來免疫偵測所關注之蛋白質 且在流式細胞儀中定量螢光信號。在細胞内蛋白質之情況 下，百先將細胞固定於中例如三聚甲醛（paraf〇rmaldehyde) 緩衝液中，且接著滲透以允許偵測抗體穿透至細胞中。可 在無需事先固定或溱透的情況下對活細胞定量細胞表面 白。 細胞之"生產率”可另外藉由量測諸如綠螢光蛋白（GFp) 之報導蛋㈣表現來間制定，該㈣光蛋白係表現為具 有所關主蛋白質之融合蛋白或來自與所關注蛋白質相同之 爪觀作為：表現單元、三表現單元或彡表現單元之部 分。 紆、。提网/增加生產率"包含増加/提高細胞之比生產率 二法右生產率在所研究之細胞中較之各別對照細胞更 局且若此差異為統計上顯著的，則比生產率増加或提高。 136226.doc •29· 200932907 所研究之細胞可為經處理、轉染或 轉染或基因修飾之細胞的非均
高/增加/改良之生產率"及"增強/提高/改良之 胞吐作用，，及，，提高/增加/改良之分泌"具有相同含 換使用。 術語"衍生物”通常包括適於實現本發明之預定用途的序 列’其意謂該等序列介導細胞中分泌運輸之提高。 術語”衍生物"當用於本發明中時意謂在序列中與原始序 列或其互補序列至少70%一致之多肽分子或核酸分子。多 肽分子或核酸分子較佳在序列中與原始序列或其互補序列 至少80%—致。多肽分子或核酸分子更佳在序列中與原始 序列或其互補序列至少90%一致。最佳為在序列中與原始 序列或其互補序列至少9 5 % 一致且顯示與原始序列相同或 類似之對分泌之影響的多肽分子或核酸分子。 序列差異可基於自不同生物體之同源序列的差異。其亦 可能基於藉由取代、***或缺失一或多個核苷酸或胺基酸 (較佳1、2、 、4、5、7、8、9或10個）之序列的目標修 飾 了使用位點特異性突變及/或基於PCR之突變技術來製 造缺失、***或取代突變體❶可藉由使用（例如）標準"對準 ’’演算法’例如"BLAST"來測定參考序列之序列一致性。 當其在其序列中配合在一起時，序列對準，且可借助於標 準"對準"演算法來識別。 另外’在本發明中，術語"衍生物"意謂與其他核酸序列 136226.doc 200932907 雜交之核酸分子（單股或雙股）。雜交較佳在嚴格雜交及洗 滌條件下進行（例如在65°C下在含有5x SSC之緩衝液中雜 交；在42°C 下使用 0,2xSSC/0，l% SDS洗滌）。 術語"衍生物"另外意謂尤其在絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸 位置處蛋白質缺失及/或***突變體、磷酸化突變體，及 : 帶有蛋白激酶C(PKC)或酪蛋白激酶II(CKII)之結合位點缺 ; 失的突變體。 術語"活性"描述且定量在細胞内或在活體外檢定中蛋白 © 質之生物學功能。 量測SM蛋白質"活性"之一種檢定為例如用於模型蛋白、 抗體或所關注之蛋白質的分泌檢定。將細胞以ss-HRP-Flag 質體連同空載體或所研究之基因（諸如Munc-18c或Sly-1) — 起共轉染。轉染後24 h以無血清培養基洗滌細胞且在0、 1、3及6 h之後藉由一起培育澄清細胞上清液與ECL試劑對 HRP分泌定量。以光度計（Lucy2，Anthos)在450 nm下進行 量測。 _ 偵測就SM蛋白質之功能結合而言之"活性”的另一方法將 展示SM蛋白質與其已知相互作用搭配物之結合，例如 Munc-18c與突觸蛋白-4之結合或Sly 1與突觸蛋白-5之物理 .相互作用。SM蛋白質與其他蛋白質之結合可藉由免疫共 沈澱來證明，例如使用與珠粒偶合之特異性抗體使SM蛋 白質下沈（pull-down)，珠粒變性及之後藉由SDS-PAGE及 西方墨點之免疫共沈澱蛋白質之分離及偵測。 SM蛋白質與另一蛋白質（例如，突觸蛋白）之直接結合可 136226.doc -31 - 200932907 進一步在酵母-二-雜交（yeast-two-hybrid)檢定中4貞測。在 此檢定中，兩種蛋白質在酵母細胞中以分別與轉錄因子之 DNA結合域及轉錄活化域之融合蛋白的形式表現。兩種蛋 白質之直接相互作用均引起轉錄因子重構，該轉錄因子之 活性係以比色方式或藉由酵母細胞在選擇性條件下生長之 '· 能力來偵測。 -* 藉由SM蛋白質與其結合搭配物之共免疫螢光法（co- immunofluorescence)及债測其在細胞内之共定位來提供另 ® —間接方法。 量測XBP-1之”活性"的一種方法為進行帶移實驗以偵測 XBP-1轉錄因子與其DNA結合位點之結合。另一方法為偵 測活性XBP- 1拼接變異體自細胞溶質至核之易位。或者， XBP-1"活性”可藉由量測真正（bona fide)XBP-l目標基因 (諸如結合蛋白（BiP))之一旦XBP-1異源表現後的誘導表現 來間接證實。 在本發明之含義中"宿主細胞"為諸如倉鼠細胞之細胞， — 較佳為 BHK21、ΒΗΚ ΤΚ·、CHO、CHO Pro-5、CHO衍生 - 之突變細胞株 Lecl 至 Lec35、CHO-K1、CHO-DUKX、 ； CHO-DUKX B1及CHO-DG44細胞或此等細胞株中任一者之 衍生物/後代。尤其較佳為CHO-DG44、CHO-DUKX、 CHO-K1及BHK21，且甚至更佳為CHO-DG44及CHO-DUKX細胞。在本發明之另一實施例中，宿主細胞亦意謂 鼠類骨髓瘤細胞，較佳為NS0及Sp2/0細胞或此等細胞株中 任一者之衍生物/後代。亦將可用於本發明含義中之鼠類 136226.doc -32- 200932907 及倉鼠細胞之實例概括於表1中。然而，彼等細胞、其他 哺乳動物細胞（包括（但不限於）人類、小鼠、大鼠、猴及齧 齒動物細胞株，或真核生物細胞，包括（但不限於）酵母、 昆蟲、植物及禽類細胞）之衍生物/後代亦可以本發明之含 義使用，尤其對於製造生物醫藥蛋白質而言。 表1 :真核生物生產細胞株 細胞株 順序編號 NSO ECACCNo. 85110503 Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL-10 BHKTK· ECACCNo· 85011423 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2(BHK-21 衍生物） ATCC CRL-8544 CHO ECACCNo. 8505302 野生型CHO ECACC 00102307 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX ATCC CRL-9096 (=CHO duk', CHO/dhfr) CHO-DUKX Bll ATCC CRL-9010 CHO-DG44 (Urlaub等人，1983) CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 Lee 13 (Stanley P.等人，1984) V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 HEK 293 ATCC CRL-1573 COS-7 ATCC CRL-1651 U266 ATCC TIB-196 HuNSl ATCC CRL-8644 Per.C6 (Fallaux，F.J.等人，1998) CHL ECACCNo. 87111906 宿主細胞當在無血清條件下建立、改適且完全培養，且 136226.doc -33- 200932907 視情況在不含動物來源之任何蛋白質/肽之培養基中時為 最佳。市售培養基，諸如 Ham's F12(Sigma，Deisenhofen， Germany)、RPMI-1640(Sigma)、杜貝可改質之伊格爾培養 基（Dulbecco’s Modified Eagle's Medium ， DMEM; Sigma)、最低必需培養基（Minimal Essential Medium， • MEM; Sigma)、伊斯科夫改質之杜貝可培養基（Iscove's
·* Modified Dulbecco's Medium » IMDM; Sigma)、CD-CHO (Invitrogen，Carlsbad, CA)、CHO-S-Invtirogen、無血清 © CHO培養基（Sigma)及無蛋白質CHO培養基（Sigma)為例示 性適當營養溶液。必要時任何培養基均可補充有多種化合 物，其實例為激素及/或其他生長因子（諸如，胰島素、運 鐵蛋白、表皮生長因子、胰島素樣生長因子）、鹽（諸如， 氣化鈉、磷酸鈣、磷酸鎂）、緩衝液（諸如HEPES)、核苷 (諸如，腺苷、胸苷）、麩胺醯胺、葡萄糖或其他等效能 源、抗生素、微量元素。亦可包括熟習此項技術者將已知 之適當濃度的任何其他必要補充劑。在本發明中，使用無 血清培養基較佳，但補充有合適量血清之培養基亦可用於 培養宿主細胞。對於表現可選基因之經基因修飾之細胞的 ； 生長及選擇而言，將合適選擇劑添加至培養基中。 .術語"蛋白質"可與胺基酸殘基序列或多肽互換使用且係 指任何長度之胺基酸的聚合物。此等術語亦包括經由包括 (但不限於）糖基化、乙醯化、磷酸化之反應或蛋白質處理 而經轉譯後修飾之蛋白質。在分子保持其生物學功能活性 之同時，可在多肽結構中產生修飾及改變（例如與其他蛋 136226.doc -34- 200932907 白質融合）、胺基酸序列取代、缺失或***。舉例而言， 可在多肽或其基本核酸編碼序列中產生某些胺基酸序列取 代且可獲得具有類似特性之蛋白質。 術語"多肽"意謂具有10個以上胺基酸之序列且術語"肽" 意謂至多1 0個胺基酸長度之序列。 本發明適於產生用於製造生物醫藥多肽/蛋白質之宿主 細胞。本發明尤其適於藉由展示增強之細胞生產率的細胞 使大量不同之所關注基因高產率表現。 "所關注之基因"（GOI)、"所選序列"或"產物基因"在本文 中具有相同含義且係指編碼所關注之產物或"所關注之蛋 白質"（亦稱為’'所需產物"）的任何長度之聚核苷酸序列。所 選序列可為全長或截短基因、融合或帶標籤基因，且可為 cDNA、基因組DNA或DNA片段，較佳為CDNA。其可為原 生序列，亦即天然存在之形式，或必要時可經突變或另外 經修飾。此等修飾包括密碼子最佳化以最優化密碼子在所 選宿主細胞、人類化或帶標籤中之用途。所選序列可編碼 所分泌之細胞質、核、膜結合或細胞表面多肽。 所關注之蛋白質"包括蛋白質、多肽、其片段、肽其 所有均可在所選宿主細胞中表現。所需蛋白質可為（例如） 抗體、酵素、細胞激素、淋巴介質、黏著分子、受體及其 衍生物或片段，及可充當促效劑或拮抗劑及/或具有治療 或診斷用途之任何其他多肽。下文亦給出所需蛋白質/多 肽之實例。 夕 在諸如單株抗體之較複雜分子之情況下，G⑴編碼兩個 136226.doc 35· 200932907 抗體鍵中之一或兩者。 ”所關注之產物"亦可為反義RNA、siRNA ' RNAi或 shRNA。 "所關注之蛋白質”或"所需蛋白質"為上述彼等者。特定 s之，所需蛋白質/多肽或所關注之蛋白質例如為（但不限 於）騰島素、騰島素樣生長因子、hGH、tPA、細胞激素（諸 如介白素（IL) ’ 例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-
6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL_12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干擾素（IFN)a、㈣ β、IFN γ、IFN ω或IFN τ、腫瘤壞死因子（TNF)，諸如tnF a^TNF β > TNF γ > TRAIL ； G-CSF ^ GM-CSF > M-CSF > MCP-1及VEGF。亦包括製造紅血球生成素或任何其他激 素生長因子。根據本發明之方法亦可有利地用於製造抗體 或其片段。此等片段包括(例如)Fab片段(片段抗原結合 =Fab)。Fab片段係由藉由相鄰怪^呆持在—起之兩個鍵 的可變區組成。此等者可藉由自f知㈣例如以木瓜酵素 進行蛋白酶消化來形成，但在同時藉由基因工程亦可產生 類似㈣片段。其他抗體片段包括F(ab，)2片段，其可藉由 用胃蛋白酶之蛋白水解***來製備。 所關注之蛋白f較佳係自培養基中以分泌之多肽的形式 ::中或若在無分泌信號情況下表現則其可自宿主細胞溶 胞物中回收。有必要以獲得所關注之蛋白質的大 製劑之方式自其他重組蛋白 一二 之蛋白質“… 胞蛋白質純化所關注 、” 一步，自培養基或溶解物移除細胞及/ 136226.doc -36 - 200932907 或微粒細料。此㈣如藉由免疫親和或離子交換管柱 分館、乙醇沈殿、逆相HPLC、葡聚糖凝膠層析（㈣如 chr〇mat〇graphy)、矽石層析或諸如DEAE之陽離子交換樹 脂層析將所關注之產物自污染的可溶性蛋白質、多肽及核 酸純化。一般而言，在此項技術中熟知教示熟習此項技術 者如何純化由宿主細胞異源表現之蛋白質的方法。 使用基因工程方法，可能產生僅由重鏈之可變區（VH)及 輕鏈之可變區（VL)組成的縮短抗體片段。將此等者稱為Fv 片段（可變片段（Fragment variable)=可變部分之片段）。因 為此等Fv片段缺乏兩個鏈藉由恆定鏈之半胱胺酸的共價鍵 結，所以Fv片段經常為穩定的。有利的在於藉由短肽片段 (例如，具有1〇至3〇個胺基酸，較佳15個胺基酸）鍵聯重鏈 之可變區與輕鏈之可變區。以此方式，獲得由藉由肽連接 子鍵聯之VH及VL組成的單一肽鏈。將此類抗體蛋白質稱 為單鏈—Fv(scFv)。自先前技術已知此類scFv-抗體蛋白質 之實例。 近年來，已開發各種策略用以製備呈多聚體衍生物之 scFv。此尤其意欲產生具有改良之藥物動力學及生物分布 特性以及具有提高之結合親和力的重組抗體。為達成scFv 之多聚化，將scFv製備為具有多聚化結構域之融合蛋白。 多聚化結構域可為（例如）IgG或捲曲螺旋結構（螺線結 構）（諸如白胺酸-拉鏈域domain))之CH3區 域。然而，亦存在將scFv之VH/VL區域之間的相互作用用 於多聚化（例如，雙功能抗體（diabodies)、三功能抗體 136226.doc •37· 200932907 (tribodies)及五功能抗體（pentab〇(jies))之策略。對於熟習 此項技術者而言雙功能抗體意謂二價均二聚scFv衍生物。 將scFv分子中之連接子縮短至5_1〇個胺基酸使得形成内部 產生鏈間VH/VL疊加之均二聚體。雙功能抗體可另外藉由 併入二硫橋（disulphide bridge)而穩定。自先前技術已知雙 功能抗體-抗體蛋白質之實例。 對於熟習此項技術者而言微型抗體意謂二價均二聚scFv 衍生物。其係由融合蛋白組成，該融合蛋白含有免疫球蛋 白較佳I g G最佳呈一聚化區域形式（其經由欽鍵區（例 如’亦自IgGl)及連接區域來連接至scfv)之igGi的CH3區 域。自先前技術已知微型抗體_抗體蛋白質之實例。 對於熟習此項技術者而言三功能抗體意謂：三價均三聚 scFv衍生物。VH-VL在無連接子序列之情況下直接融合之 scFv衍生物使得形成三聚物。 對於熟習此項技術者而言，"骨架蛋白"意謂藉由基因選 殖或藉由共轉譯過程與另一蛋白質或具有另一功能之蛋白 質之部分偶合的蛋白質之任何功能域。 熟習此項技術者亦應熟悉具有二價、三價或四價結構且 衍生自SCFV之所謂微型抗體。藉由二聚、三聚或四聚捲曲 螺旋結構進行多聚化。 據定義，即使所引入序列或基因與宿主細胞中之内源序 列或基因-致’仍將任何引入宿主細胞中之序列或基因相 對於宿主細胞稱作”異源序列”或，，異源基因"或"轉殖基因，, 或"重組基因·’。 136226.doc -38- 200932907 甚至當所關注之序列為内源序列，但序列已（人工地/有 意地/實驗地）被帶進細胞中且因此自不同於内源基因座之 宿主基因組中之基因座表現時，將序列稱作"異源序列，，。 甚至當所關注之序列（例如cDNA)為（人工地/有意地/實 驗地）再引入（=重組）之内源序列且此序列之表現係受調節 序列之改變/修飾（例如，啟動子改變或藉由任何其他手段） 之影響時，將序列稱作"異源序列"。 "異源"蛋白質因此為自異源序列表現之蛋白質。
可藉由使用"表現載體"，較佳真核生物’且甚至更佳哺 乳動物表現載體將異源基因序列引入目標細胞中。用以構 築載體之方法為熟習此項技術者所熟知且描述於各種公開 案中。詳言之，在先前技術中已知用於構築合適載體之技 術’包括描述功能組件，諸如啟動子、強化子、終止子 (termination)及聚腺苷酸化信號、選擇標記、複製起點及 拼接信號。載體可包括（但不限於）質體載體、噬菌粒 (phagemid)、黏質體、人工/微型染色體（例如ACE)或病毒 載體’諸如桿狀病毒（baculovirus)、反轉錄病毒、腺病 毒、腺聯病毒（adeno-associated virus)、范瘡單純型病毒、 反轉錄病毒、嗤菌體。真核生物表現載體通常亦將含有促 進載體在細菌中繁殖（諸如複製起始）之原核序列及用於在 細菌中選擇之抗生素抗性基因。在此項技術中熟知多種含 有選殖位點（聚核苷酸可有效鍵聯至其中）之真核生物表現 載體，且一些可購自諸如Stratagene，La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega，Madison, WI 或 BD 136226.doc -39- 200932907
Biosciences Clontech, Palo Alto, CA之公司。 在一較佳實施例中，表現載體包含至少一種核酸序列， 該核酸序列為編碼所關注之肽/多肽/蛋白質之核苷酸序列 的轉錄及轉譯所必需之調節序列。 如本文中所用之術語”表現"係指異源核酸序列在宿主細 胞中之轉錄及/或轉譯。所需產物/所關注之蛋白質在宿主 細胞中之表現程度可取決於存在於細胞中之相應mRNA之 量，或藉由如在本發明實例中之所選序列編碼的所需多肽/ 所關/主之蛋白質之量。舉例而言，自所選序列所轉錄之 mRNA可藉由北方墨點雜交、核糖核酸酶RNA保護 '與細 胞RNA之原位雜交或藉由PCR來定量。由所選序列編碼之 蛋白質可藉由以下各種方法來定量：例如藉*EUSA '藉 由西方墨點法、藉由放射免疫檢定、藉由免疫沈澱、藉由 檢定蛋白質之生物活性、藉由將蛋白f免疫染色接著 FACS分析或藉由均勻時間解析螢光（HTRF)檢定。 在本發明中，術語，，表現"同樣係用於基因（意謂DNA序 列)之情形中，以及DNA序列所轉譯之蛋白質產物之情形 中。術語”基因"及"蛋白質"因此在表現之情形中可互換使 用，例如"所關注之蛋白質之表現"及"所關注之基因之表 現"可互換使用且兩個用語係指同—事實問題。在本發明 中’此等術語較佳係指人類基因及蛋白f，但包括來 他哺乳動物物種(較佳為小鼠、倉鼠及大鼠)之同等同源序 列’以及來自額外真核物種(包括雞、鴨 蠅及酵母）之同源序列。 喝錄 136226.doc -40· 200932907 如本文中所用之術語"實現"所關注之蛋白質mm "實現”所關注之蛋白質的分泌係指正面影響該事件或引起 該事件。如本文中所用之此等術語較佳係指"增加表現"或 "提高分泌"。 , 可藉由在此項技術中熟知之任何方法對真核宿主細胞進 •’ #以聚核㈣或表現載體"轉染”’從而產生經基因修飾之 ί 細胞或轉殖基因細胞。轉染方法包括（但不限於）脂質體介 導轉染、填酸辦共沈殺、電穿孔、聚陽離子（諸如deae_ © 葡聚糖)介導轉染、原生質體融合、病毒感染及顯微注 射。轉染較佳為穩定轉染。在特定宿主細胞株及細胞類型 中提供異源基因之最佳轉染頻率及表現的轉染方法為有利 的。可藉由常規程序確定合適方法。為了穩定轉染，將構 築體整合至宿主細胞之基因組或人工染色體/微型染色體 中或以游離基因方式（episomally)定位以便穩定地保持在宿 主細胞内。 B 除非另作說明，否則本發明之實踐將採用細胞生物學、 刀子生物學、細胞培養、免疫學及在熟習此項技術者之技 術中的類似學科之習知技術。在目前文獻中充分揭示此等 技術。 本發明係關於在細胞中產生所關注之異源蛋白質的方 法，其包含a)增加至少一種編碼SM蛋白質之基因的表現 或各別蛋白質或其至少一種衍生物、突變體或片段之活 性，及b)實現該所關注之異源蛋白質的表現。 本發明特定言之係關於在細胞中產生所關注之異源蛋白 136226.doc 200932907 質的方法，其包含叻增加至少一種編碼來自SEC：1/Munci8 蛋白質群（SM-蛋白質）之蛋白質的基因之表現，及b)實現 該所關注之異源蛋白質的表現。在方法步驟b)中所關注之 蛋白質的分泌較佳得以提高。本發明因此較佳係關於在細 胞中產生所關注之異源蛋白質的方法，其包含句增加至少 一種編碼來自SEC1/Muncl8蛋白質群（SM-蛋白質）之蛋白 質的基因之表現’及b)提高該所關注之異源蛋白質的分 泌。 本發明較佳係關於在細胞中產生所關注之異源蛋白質的 方法’其包含a)增加至少一種編碼選自SEC1/Muncl8蛋白 質群（SM·蛋白質）之蛋白質的基因之表現，該SEC1/ ]^1111(：18蛋白質群係由以下各物組成：
Seclp、Slylp、Vps33p及 Vps45p、ROP、Slyl 及 Vps33/ 康乃馨、Unc-18、Muncl8-1、Muncl8-2 及 Muncl8-3、 VPS45、VPS33-A、VPS33-B及 Slyl， 及b)實現該所關注之異源蛋白質的表現，較佳增加該所 關注之異源蛋白質的表現或尤其較佳其之分泌。 步驟a)中之蛋白質較佳係選自SEC：1/Muncl8蛋白質群 (SM·蛋白質），該群係由以下各物組成：Seclp、Slylp、
Vps33p、Vps45p、Muncl8-1、Muncl8-2 及 Muncl8-3、 VPS45、VPS33-A及 VPS33-B及 Slyl。 步驟a)中之蛋白質更佳係選自SECi/Muncl8蛋白質群 (SM-蛋白質），該群係由！^1^18-1、河1111(；18-2、^4111^18-3、VPS45、VPS33-A 及 VPS33-B 及 Slyl 組成。步驟 a)中之 136226.doc •42_ 200932907 蛋白質最佳係選自SEC1/Muncl8蛋白質群（sm-蛋白質）， 該群係由 Muncl8-3/Muncl8c及Sly-Ι組成。 在本發明之一特定實施例中’方法之特徵在於步驟a)中 之一基因編碼Munc-1 8蛋白質或Munc-1 8蛋白質家族成 員。在本發明之一特定實施例中’方法之特徵在於步驟a) 中之—基因編碼三種Muncl8同功異型物，Muncl8a、b或c 中之一者’較佳Muncl8co Ο
在本發明之另一特定實施例中，方法之特徵在於步驟a) 中之一基因編碼 Muncl8c(SEQ ID NO: 39) 〇 在本發明之一特定實施例中，方法之特徵在於步驟a)中 之基因編碼Sly-Ι蛋白質或Sly-Ι蛋白質家族成員，較佳 Sly-Ι 〇 在本發明之另一特定實施例 中之一基因編碼 Sly-1(SEQ ID NO: 41)。 在本發明之一較佳實施例中，方法之特徵在於步驟a)包 含增加至少兩種編碼SM_蛋白質之基因的表現或活性藉 此該等SM蛋白質係與小泡運輸之兩個不同步驟有關。 在本發明之—特定實施例中，方法之特徵在於a)-基因 編碼調節小泡與細胞膜之融合的⑽蛋白質，b)第二基因編 碼調節小泡與高爾基複合體之融合的SM蛋白質。 在本發明之—尤其較佳實施例令，方法之特於 -表現
在本發明之另一眘尬M A 1中，方法之特徵在於步驟a)包含 136226.doc •43- 200932907 a)增加編碼SM蛋白質家族之一成員的第一基因之表現或活 性’ b)第二基因編瑪SM蛋白質家族之另一成員，及c)第三 基因編碼XBP-1。 在本發明之一尤其較佳實施例中，方法之特徵在於
Muncl8c(SEQ ID NO: 39)、Sly-1(SEQ ID NO: 41)&ΧΒΡ- 1(SEQ ID NO: 43)之表現或活性增加。 本發明另外係關於將細胞工程化之方法，其包含a)將一 或多種包含為至少兩種多肽編碼之核酸序列的載體系統引 入細胞中，藉以i)至少一種第一核酸序列編碼SM_蛋白質 或其衍生物、突變體或片段’及ii)第二核酸序列編碼所關 注之蛋白質’ b)在該細胞中表現該所關注之蛋白質及該至 少一種SM-蛋白質或其衍生物、突變體或片段。 在本發明之一特定實施例中，方法之特徵在於將核酸序 列依次引入該細胞中。 在本發明之另一特定實施例中’方法之特徵在於引入至 少一種編碼SM蛋白質之核酸序列，隨後引入編碼該所關 >主之蛋白質的核酸序列。 在本發明之另一實施例中，方法之特徵在於引入至少一 種編碼所關注之蛋白質的核酸序列，隨後弓丨入編碼該 蛋白質的核酸序列。 在本發明之一較佳實施例中，方法之特徵在於將核酸序 列同時引入該細胞中。 在本發明之一特定實施例中，方法之特徵在於SM_蛋白 質為^如卜以同功異型物中之任一者，較佳 136226.doc -44 - 200932907 (SEQ ID NO: 39)或 Sly_l(SEQ ID NO: 41)。 在本發明之-較佳實施例中，方法之特徵在於在步驟 训中组合使用兩種SM蛋白#，藉以該等⑽蛋白質係與 小泡運輸之兩個不同步驟有關。 在本發明之另一實施例中，方法之特徵在於a) 一基因編 碼調節小泡與細胞膜之融合的SM蛋白質，b)第二基因編碼 1 調節小泡與高爾基複合體之融合的81^蛋白質。 在本發明之-特定實施例中，方法之特徵在於組合使用 霽 之兩種 SM-蛋白質為 Munc-18C(SEQ ID Ν〇· 39)及 Sly-1 (SEQ ID NO: 41)。 在本發明之一較佳實施例中，方法之特徵在於在步驟 a)0中，將兩種SM-蛋白質與XBP-1組合使用。 在本發明之一尤其較佳實施例中，方法之特徵在於SM 蛋白質為與XBP-1(SEq ID N0: 43)組合之Μ_指(剛 ID NO: 39)及 Sly-1(SEQ ID NO: 41)。 在本發明之另一實施例中，方法之特徵在於該細胞為真 核生物細胞，諸如酵母、植物、蠕蟲、昆蟲、禽類、魚、 爬行動物或哺乳動物細胞。 在本發明之一特定實施例中，方法之特徵在於該細胞為 真核生物細胞，較佳為脊椎動物細胞，最佳為哺乳動物細 胞。 該脊椎動物細胞較佳為禽類細胞，諸如雞或鴨細胞。 在本發明之另一特定實施例中，方法之特徵在於該哺乳 動物細胞為中國倉鼠卵巢（Chinese Hamster 〇vary， 136226.doc • 45· 200932907 CHO)猴腎CV1、猴腎COS、人類晶狀體上皮pER C6TM、 人類胚腎HEK293、人類骨髓瘤、人類羊水細胞（hu_ amniocyte)、嬰兒倉鼠腎臟、非洲綠猴腎臟、人類宮頸 癌犬腎、水牛大鼠肝臟、人類肺臟、人類肝臟、小鼠乳 腺腫瘤或骨髓瘤細胞、刪、狗、緒或怪河狼細胞、大 鼠、兔、貓、山羊細胞，較佳為CH〇細胞。 在本發明之-較佳實施例中，方法之特徵在於該細 胞為野生型 CHO、CHO K1、CH〇 DG44、cH〇 DUKX_ CHO Pro-5或由其衍生之突變體’包括c肋突變體
Lecl 至 Lec35 ’ 較佳為 CHO DG44。 在本發明之另一實施射，方法之特徵在於所關注之蛋 白質為治療用蛋白質。 在本發明之—特定實施例中，方法之特徵在於所關注之 蛋白質為膜或分泌蛋白，較佳為抗體或抗體片段。 /本發明之另一特定實施例中’方法之特徵在於抗體為 早株、多株、哺乳動物、鼠類、嵌合、人類化、靈長化、 :長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體、免疫球 :白輕鏈、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鏈及重鏈、 域abF'F(aW2'Fe、Fe•㈣合蛋白、‘單鏈F”單結構 :雔四價單鍵FV、二硫鍵聯FV、結構域缺失、微型抗 功能抗體，或以上片段中—者與另—肽或^之融 。多肽、Fc肽融合蛋白、Fe毒素融合蛋白、骨架蛋白。 蛋之另一實施例中，方法之特徵在於該異源SM 蛋白質存在於包含至少一種SNARE蛋白質之小泡融合複合 136226.doc -46· 200932907 物中。 在本發明之一特定實施例中，方法之特徵在於該異源 SM蛋白質存在於包含至少一種SnAre蛋白質及突觸蛋白4 或大觸蛋白5之小泡融合複合物中。 在本發明之另一實施例中，方法之特徵在於在該細胞中 該所關注之異源蛋白質的比生產率為每細胞每天至少5 Pg，每細胞每天15 pg，每細胞每天20 pg，每細胞每天25 Pg ° Ϊ 在本發明之另一實施例中，方法之特徵在於該方法引起 該所關注之蛋白質在該細胞中與表現該所關注蛋白質之對 照細胞相比提高之比細胞生產率，但藉以該對照細胞並不 具有任何SM-蛋白質之增加之表現或活性。 在本發明之一較佳實施例中，方法之特徵在於生產率之 k咼為約5%至約10%、約11%至約2〇%、約21%至約3〇%、 約31%至約40%、約41%至約50%、約51%至約60。/。、約 • 61°/。至約 70%、約 71%至約 80。/。、約 81❶/〇至約 90°/。、約 91% 至約100%、約101%至約149%、約150%至約199%、約 200%至約299%、約300%至約499%，或約500。/。至約 1000% 〇 本發明另外係關於一種提高所關注之膜或分泌蛋白在細 胞中之比細胞生產率或力價的方法，其包含a)將一或多種 包含為至少兩種多肽編碼之核酸序列的載體系統引入細胞 中，藉以i)至少一種第一聚核苷酸編碼SM_蛋白質或其衍 生物、突變體或片段，及ii)第二聚核苷酸編碼所關注之蛋 136226.doc .47· 200932907 白質，及b)在該細胞中表現⑽ 白質或其衍生物、突變體或片段。 i 本發明另外係關於包含編竭至 表現載體，藉以a)至少一種多二種：肽之表現單元的 多狀為SM-蛋白質或苴名干冰 物、突變體或片段，及b)第二多肽 ^ 夕狀為所關、/主之蛋白質。 在：發明之一特定實施例中，表現載體之特徵在於所關 注之蛋白質為治療用蛋白質’較佳為抗體或抗體片段。 ❹
^本發明之-較佳實施例中，表現載體之特徵在於抗體 為早株、多株、哺乳動物、鼠類、嵌合、人類化靈長 化、靈長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體免 疫球蛋白輕鍵、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白輕鍵及重 鏈、Fab、F(ab，）2、Fc、以如融合蛋白、Fv、單鏈Fv、單 、-·〇構域Fv、四彳貝單鍵Fv、二硫鍵聯Fv、結構域缺失、微型 抗^、雙功能抗體，或以上片段中之一者與另一肽或多肽 之融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋 白0 在本發明之另一實施例中’表現載體之特徵在於表現單 元為多順反子，較佳為雙順反子。 在本發明之一特定實施例中，表現載體之特徵在於載體 包含在圖8中所述之表現構築體的任一者。 在本發明之一較佳實施例中，表現載體之特徵在於載體 包含至少一個配置如下之雙順反子表現單元：a)編碼SM蛋 白質之基因，b)IRES元件及c)編碼SM蛋白質之第二基因。 參見圖8d)。 136226.doc -48- 200932907 在本發明之另一較佳實施例中，表現載體之特徵在於自 分離之表現單元（圖8a)或自一種雙順反子單元（圖8b)編碼 至少一種所關注之蛋白質（G0I)及一種SM蛋白質。在本發 明之另一較佳實施例中，表現載體之特徵在於其包含自分 離之表現卡匣（圖8匀編碼或以雙順反子而其中兩個基因經 由一個IRES元件鍵聯（圖8d)編碼兩種SM蛋白質的基因。在 本發明之另一實施例中，表現載體之特徵在於其編碼至少 兩種SM蛋白質及-個所關注之基因（圖8e)或自—種多順反 子表現單元編碼幾種SM蛋白質。 在本發明之一個較佳實施例中，表現載體之特徵在於 SM蛋白質為Munc_i8同功異型物Munc a、b、c之一，較 佳為 Munc-1 8c(SEQ ID NO: 39) » 在本發明之另一較佳實施例中，表現載體之特徵在於 SM_蛋白質為 Sly-1(SEQ ID NO: 41)。 在本發明之另一實施例中，表現載體之特徵在於組合使 用至少兩種SM-蛋白質。 在本發明之一個特定實施例中，表現載體之特徵在於該 至少兩種SM蛋白質涉及小泡運輸之兩個不同步驟。 在本發明之另一實施例中，表現載體之特徵在於a)—種 SM蛋白質調節小泡與細胞膜之融合，b)第二SM蛋白質調 節小泡與高爾基複合體之融合。 在本發明之一個較佳實施例中，表現載體之特徵在於 8河蛋白質為 MUnc-18c(SEQ ID N〇: 39)&sly l(SEQ m NO: 41) 〇 136226.doc -49· 200932907 在本發明之另一較佳實施例中，表現載體之特徵在於至 少兩種SM-蛋白質與XBP-1組合使用，較佳Munc-18c(SEQ ID NO: 39)及 Sly-1(SEQ ID NO: 41)與 XBP-1(SEQ ID NO: 43)組合。 本發明另外係關於表現至少兩種異源基因之細胞：a)至 ' 少一種編碼SM-蛋白質或其衍生物、突變體或片段之基 , 因，及b)編碼所關注之蛋白質的基因。 在本發明之一特定實施例中，細胞之特徵在於所關注之 φ 蛋白質為治療用蛋白質，較佳為抗體或抗體片段。 在本發明之一較佳實施例中，細胞之特徵在於抗體為單 株、多株、哺乳動物、鼠類、嵌合、人類化、靈長化、靈 長類、人類或其抗體片段或衍生物，諸如抗體、免疫球蛋 白輕鍵、免疫球蛋白重鍵、免疫球蛋白輕鏈及重鏈、 Fab、F(ab')2、Fc、Fc-Fc融合蛋白、Fv、單鏈Fv、單結構 域Fv、四價單鏈Fv、二硫鍵聯Fv、結構域缺失、微型抗 體、雙功能抗體，或以上片段中之一者與另一肽或多肽之 融合多肽、Fc肽融合蛋白、Fc毒素融合蛋白、骨架蛋白。 在本發明之一特定實施例中，細胞之特徵在於SM蛋白 ； 質之表現量顯著在内源量以上，較佳10%。在本發明之另 . 一實施例中，細胞之特徵在於該蛋白質之表現量係在内源 量以上5%，較佳在内源量以上10%、15%、20%、25%、 30% ' 35% > 40% ' 45% > 50% ' 55% ' 60% ' 65% > 70% > 75% ' 80% ' 85%、90%、95%、100%、120% ' 150%、 175% ' 200% ' 300% > 400% ' 500% ' 1000〇/〇 ° 136226.doc -50- ❹ 鲁 200932907 之任::明之另-實施例中，細胞包含本發明之表現載體 真=ΓΠ定實施例中，細胞之特徵在於該細胞為 物細胞，較佳為脊椎動物細 胞。尤其較佳為齧齒動物細胞。 為南礼動物細 在本發明之-較佳實施财， 物細胞為禽類細胞。 符徵在於該真核生 動一特定實施例_，細胞之特徵在於該哺乳 發明為蓄齒動物細胞’較佳為倉鼠或鼠類細胞。在本 發明之一較佳實施例中，細 ..m ^ 、胞之特徵在於該哺乳動物細胞 為中國倉鼠_巢（咖）1腎CV1、歸 體上皮PER.C6W、人類骨髄癍,, 狀 人類月髓瘤、人類羊水細胞、人類胚腎 HEK293、嬰兒倉窗替魅 .. 鼠腎臟、非洲綠猴腎臟、人類宮頸癌、 犬腎、水牛大鼠肝臟、人類肺臟、人類肝臟、小鼠乳腺腫 瘤或骨錄瘤細胞、咖、狗、豬或怪河猴細胞、大鼠、 兔、貓、山羊細胞，較佳為CHO細胞。 在本發m較佳實施例中’細胞之特徵在於該⑽ 細胞為野生型 CHO、CH0 K1、CH〇 郎44、cH〇 DUKX· BU、CH0 Pro-5或由其衍生之突變體，包括ch〇突變體
Lecl至 Lec35，較佳為 CHO DG44。 在本發明之-尤其較佳實施例中，細胞之特徵在於該細 胞為CHO細胞，較佳為CHO DG44細胞。 本發明另外係關於所關注之蛋白質，較佳藉由任何本發 明之方法產生的抗體。 136226.doc •51 · 200932907 本發明另外係關於一種醫藥組合物，其包含適用於阻斷 或降低一或若干種SM-蛋白質之活性或表現（較佳為表現） 之化合物及醫藥學上可接受之載劑。 在本發明之一特定實施例中，醫藥組合物之特徵在於化 合物為聚核苷酸序列。聚核苷酸序列較佳為shRNA、 . RNAi、siRNA 或反義-RNA，最佳為 shRNA。 ' 在本發明之另一特定實施例中，醫藥組合物之特徵在於
SM-蛋白質為 Munc-18c(SEQ ID NO: 39)或 Sly-1(SEQ ID © N〇: 41)或兩者之組合。 本發明另外係關於一種識別SM·蛋白質功能之調節劑的 方法’其包含a)提供至少一種SM-蛋白質或其衍生物、突 變體或片段’較佳為Munc-18c，b)使步驟a)之該SM-蛋白 質與測試劑接觸’ c)測定與細胞表面蛋白之增加或減少之 蛋白質分泌或表現相關的效應。 本發明另外係關於一種治療癌症、自體免疫疾病及炎症 之方法，其包含向有此需要之患者投與治療有效量之根據 本發明之醫藥組合物。 本發明亦係關於一種包含應用根據本發明之醫藥組合物 ： 以治療癌症、自體免疫疾病及炎症之方法。 .本發明亦係關於一種抑制或降低細胞增殖或遷移之方 法’其包含使該細胞與根據本發明之醫藥組合物接觸。 本發明之可能治療應用包括防止諸如自細胞或組織之發 炎性介體、生長因子、血管生成因子之蛋白質的分泌以在 癌症療法、自體免疫疾病及炎症中控制細胞-細胞通訊， 136226.doc -52- 200932907 或為了促進在懸浮液中生長及防止細胞聚集之目的藉由減 少錫定跨膜蛋白之細胞表面存在來減少細胞附接。 本發明另外係關於SM-蛋白質或編碼SM-蛋白質之聚核 普酸在活體外細胞或組織培養系統中增加所關注之蛋白質 的分泌及/或產量之用途。SM蛋白質較佳為Munc 18蛋白 質’諸如MimC18c(SEQ ID NO: 39)。亦較佳的為蛋白 ; 質，諸如 Sly-1(SEQ ID NO: 41)。 本發明另外係關於本發明之任何方法、表現載體、細胞 © 或醫藥組合物的診斷用途。 本發明另外係關於一種提高細胞之蛋白質分泌/將細胞 工程化/在細胞中產生所關注之異源蛋白質的方法，其包 含： a)將人類Secl/MunC18及Slyl/SCFDl選殖至表現載體（例 如’哺乳動物ΒΙ-HEX®表現平台）中’藉以該等蛋白質可 藉由一種或不同雙順反子/多順反子表現單元來編碼且藉 ©以可在同一或不同質體上含有該等蛋白質， b)以單獨或組合方式，同時或依次將該等構築體轉染至真 核生物宿主細胞中，該等真核生物宿主細胞較佳為哺乳動 : 物細胞，諸如 CHO、BHK、NS0、HEK293、PerC.0， . c)視情況：核對轉殖基因表現， d)引入編碼所關注基因（g〇I)之構築體，較佳為分泌蛋白 或跨膜蛋白， e)例如藉由ELISA、西方墨點法或流式細胞儀進行〇〇1之 表現分析。 136226.doc -53- 200932907 或者’步驟（b+e)及（d+e)之順序可變化，藉此首先引入 GOI，或步驟（b)及（d)可同時進行。 參考僅出於說明本發明之某些實施例之目的而包括於本 文中之以下實例’將較易於理解上文一般描述之本發明。 以下實例並非限制性的。其僅展示本發明之可能實施例。 " 熟習此項技術者可易於調節條件以將其應用於其他實施 < 例。 實驗 0 材料及方法 質體設計。 將寡核苷酸ORP70 (5，-CGCGGATCCACCATGGCGGCGG CGGCGGCAGCG-3，，SEQ ID NO 1)及 ORP71 (5'-CCGCTCG AGTTACTTTTGTCCAAGTTGTGACAACTG-3', SEQ ID NO 2)及經選殖 BamHI/XhoI用至 pcDNA3,1 (Invitrogen)中以產 生 pRP24 (PhCMV_slyl-pASV40)，從而將人類 slyl 自 HEK-293 總RNA進行RT-PCR擴增。同樣地，將munc 1 8c選瘦 (ORP69, 5'-CGCGGATCCACCATGGCGCCGCCGGTGGCAG AGAGG-3', SEQ ID NO 3; ORP66, 5'-CCCTCGAGCTATTCA • TCTTTAATTAAGGAGAC-3'，SEQ ID NO 4)，其產生pRP17 ， （PhCMv-muncl 8c-pASV4〇)。藉由將 sly 1(使用 ORP29 (5’- CTCAGATCTGCGGCGGCGG CGGCAGCG-3，，SEQ ID NO 5)及 ORP30 (5'-ACCGTCGACCTTTTGTCCAAGTTGTGAC AACTG-3，，SEQ ID NO 6)自 pRP24經PCR擴增）、Bglll/Sall ***至pEYFP-Cl (Clontech)中來構築 pRP32 (PhCMV-EYFP- 136226.doc -54- 200932907 slyl-pASV4〇)。藉由自 pRP17切除muncl8c BamHI/XhoI且將 其 Bglll/Sall 選殖至 pEYFP-Cl 中來設計 pRP23 (PhCMV-EYFP-muncl8c-pASV40)。藉由將 slyl(使用01^9 (5，- CGCGCGGCCGCACCATGGCGGCGGCGGCGGCAGCG-3', SEQ ID NO 7)及 ORPIO (5'-CCGGGATCCTTACTTTTGT CCAAGTTGTGACAACTG-3'，SEQ ID NO 8)經PCR擴增）、 , Notl/BamHI***至pRPl中來產生pRP3，該pRPl係藉由以
Smal/Xbal GFP置換賦予新黴素（neomycin)抗性之基因而自 〇 pIRESneo(Clontech)衍生，使用 ORP5 (5'-CCCCCGGGAT GGTGAGCAAGGGCGAGG-3', SEQ ID NO 9)a〇RP6 (5'-TTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCC-3', SEQ ID NO 10) 自pLEGFP-Nl (Clontech)經PCR擴增。同樣地，藉由將 muncl8c(自 pRP17 (ORP15，5’-CGCGCGGCCGCACCATGG CGCCGCCGGTGGCAGAGAGG-3', SEQ ID NO 11; ORP16, 5'-CCGGATCCCTATTCATCTTTAATTAAGGAGAC-3', SEQ ID NO 12)經PCR擴增）、Notl/BamHI***至pRPl中來構築 ® pRP4。藉由突觸蛋白4之PCR介導擴增（ORP127，5’·
* CCCAAGCTTTGCGCGACAGGACCCACGAG-3'， SEQ ID NO 13; ORP128, 5'-CGCGTCGACTTATCCAACGGTTATGG TGATGCC-3’，SEQ ID NO 14)，接著將Hindlll/Sall選殖至 pECFP-Cl (Clontech)中來構築 pRP29 (PhCMV-ECFP-突觸蛋 白4-pASV40)。同樣地，將突觸蛋白5選殖（ORP136，5’-GGAAGATCTATCCCGCGGAAACGCTAC-3'，SEQ ID NO 15; ORP137, 5'-CCCAAGCTTTCAAGCAAGGAAGACCAC- 136226.doc -55- 200932907
3'，SEQ ID NO 16)，其產生pRP40 (PhCMV-ECFP-突觸蛋白 5-pASV40)。藉由將雙股DNA片段Bbsl/Xbal***pmU6中來 選殖具有sly 1特異性shRNA或muncl 8c特異性shRNA之表現 載體：（i) slyl(shRNAslyl_1; pRP5，5'_TTTGGAAGTAAACT GGAAGATATTTTCAAGAGAAATATCTTCCAGTTTACTTCT '· TTTT-3'，SEQ ID NO 23，及 5'-CTAGAAAAAGAAGTAAA
v CTGGAAGATATTTCTCTTGAAAATATCTTCCAGTTTACTT
C-3，； SEQ ID NO 24, shRNAslyl 2; pRP6, 5，-TTTGGCAGTG © AAACTAGACAAGAAATTCAAGAGATTTCTTGTCTAGTTT CACTGCTTTTT-3'，SEQ ID NO 25及 5'-CTAGAAAAAGCA GTGAAACTAGACAAGAAATCTCTTGAATTTCTTGTCTAG TTTCACTGC-3'; SEQ IDN0 26 shRNAslyl 3;pRP7，5，-TTTGGGAGGCAACTACATTGAATATTTCAAGAGAATATTC AATGTAGTTGCCTCCTTTTT-3', SEQ ID NO 27，及 5'- CTAGAAAAAGGAGGCAACTACATTGAATATTCTCTTGAA ATATTCAATGTAGTTGCCTCC-3', SEQ ID NO 28) ； (ii)
® muncl8c (shRNAmunci8c 1； pRP12, 5'-TTTGCACATGAATCTC
• AGGTGTATATTCAAGAGATATACACCTGAGATTCATGTGT
; TTTT-3', SEQ ID NO 29，及 5'-CTAGAAAAACACATGA
ATCTCAGGTGTATATCTCTTGAATATACACCTGAGATTCA TGTG-3'，SEQ ID NO 30; shRNAmuncl8c2； pRP14, 5'-TTTGGCTTGAAGACTACTACAAGATTTCAAGAGAATCTT GTAGTAGTCTTCAAGCTTTTT-3，，SEQ ID NO 31，及5，-CTAGAAAAAGCTTGAAGACTACTACAAGATTCTCTTGAA 136226.doc •56- 200932907
ATCTTGTAGTAGTCTTCAAGC-3'， SEQ ID NO 32; shRNAmuncl8c 3； pRP38, 5'-TTTGCGCCAGAAAC CCAGAG CTAATTTCAAGAGAATTAGCTCTGGGTTTCTGGCGTTTTT -3'，SEQ ID NO 33，及 5，_CTAGAAAAACGCCAGAAA CCCAGAGCTAATTCTCTTGAAATTAGCTCTGGGTTTCTGG CG-3', SEQ ID NO 34; shRNAmuncl8c 4; pRP39, 5'-TTTGGC t TGAATAAACCCAAGGATAATTCAAGAGATTATCCTTGGG
TTTATTCAGCTTTTT-3', SEQ ID NO 35，及 5，-CTAGAA ❹ AAAGCTGAATAAACCCAAGGATAATCTCTTGAATTATCCT
TGGGTTTATTCAGC-3'，SEQ ID NO 360; (iii)對照 shRNA
(pRP9，5，-TTTGCACAAGCTGGAGTACAACTACTTCAAGA GAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGTTTTT-3·，SEQ ID NO 37，及 5'-CTAGAAAAACACAAGCTGGAGTACAACTACTC
TCTTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTG-3·，SEQ ID NO 38)。 編碼人類胎盤鹼性磷酸酶（SEAP)之SEAP2對照物係購自 W Clontech且之前49已描述具有嗜熱脂肪芽孢桿菌衍生之分 • 泌α-澱粉酶（SAMY)的pSS158。含有人類血管内皮生長因 子121(¥0尽卩121)之？賈界276以及分別編碼人類4〇1利妥昔 單抗之重鏈及輕鏈的PWW943及pWW946係由Wilfried Weber友情提供。之前已描述（Tigges及Fussenegger，2006) xbp·l表現載體pcDNA3，l-Xbp-l(PhCMV-xbp-l-pASV40)。 細胞培養及轉染 a)黏附細胞之培養： 136226.doc •57· 200932907 在37°C下在含有5% C02之濕潤氣氛中，在補充有5% FCS(PAN Biotech, Aidenbach，Germany ;目錄號3302，批 號 P231902)之 ChoMaster HTS 培養基（Cell Culture Technology, Gravesano，Switzerland)或杜貝可改質之伊格 爾培養基（DMEM; Invitrogen，Carlsbad, CA，USA)中培養中 v 國倉鼠卵巢（CHO-K1 ; ATCC CCL-61)及人類胚腎細胞 ^ (HEK-293 ; ATCC CRL-1573)。為了瞬間轉染，將 ΙχΙΟ5個 細胞接種於12孔組織培養板之一個孔中且在24 h之後使用 Φ 基於改質磷酸鈣之方案47或FuGENE6轉染試劑（Roche，
Basel, Switzerland)進行轉染。使用表現及選擇載體以及抗 生素之以下組合來產生為構成性轉殖基因表現而工程化之 單轉殖基因穩定CHO-K1衍生物：（i) CHO-Slyl〗6及（：110-Slyl23 ; pRP24 ; 400 pg/ml G418 (Merck) ; (ii) CHO-Muncl8c8及 CHO-Muncl8c9、pRP17 ; 400 pg/ml G418。兩 重轉殖基因細胞株(1：11〇-8171-]^1111〇18〇丨及0：11〇-8171-又5?14 係藉由將 pRP17 與 Ppur (Clontech)、pcDNA3.1-Xbp-l35 與 ® pPUR分別共轉染至CHO-Slyl23中，接著以G418及嘌呤黴 素（4 pg/ml)進行純系選擇來構築。藉由將pcDNA3.1-Xbp-l 與 pZeoSV2(Invitrogen)共轉染至 CHO-Slyl-MunclSc!中， , 接著以G418 (400 pg/ml)、嘌呤黴素（4 pg/ml)及博來黴素 (zeocin)(150 pg/ml)進行選擇來產生使能夠構成性表現 slyl、muncl8c及xbp-Ι之三重轉殖基因細胞株CHO-Slyl· Muncl8c-Xbp-l7。 b)懸浮液培養物 136226.doc -58 - 200932907 將產生CHO-DG44細胞之單株抗體（mAB)的懸浮液培養 物（Urlaub等人’ 1986)及其穩定轉染物培育於BI專屬化學 定義之無血清培養基中。每2-3天轉種（sub-cultivated)晶種 儲備培養物，接種密度分別為3xl〇5-2xl05個細胞/毫升。 使細胞生長於T-燒瓶或搖瓶（Nunc)中。在5% C02、3 7。(：及 120 rpm下’在濕满培育箱（Thermo)中培育T-燒瓶且在 1 Multitron HT培育箱（Infors)中培育搖瓶。 藉由錐蟲藍排除（trypan blue exclusion)，使用血球計來 β 測定細胞濃度及生存力。 進料分批培養 將細胞以3χ105個細胞/毫升接種於1〇〇〇 ml搖瓶中，於 250 ml無抗生素或MTX(Sigma-Aldrich，Germany)之 BI-專 屬製造培養基中。在120 rpm下，在37°C及5% C02(稍後當 細胞數目增加時將其降至2°/。）中攪拌培養物。每日測定包 括pH值、葡萄糖及乳酸鹽濃度之培養參數且需要時使用 NaC03將pH值調節至pH 7.0。每24 hr添加BI-專屬進料溶 液。藉由錐蟲藍排除，使用自動化CEDEX細胞定量系統 • (Innovatis)來測定細胞密度及生存力。收集來自細胞培養 液之試樣且藉由ELISA使其經受力價量測。 - 為進行ELISA，使用抗人類-Fc片段之抗體（Jackson
Immuno Research Laboratories)及共輛人類 κ 輕鍵 HRP (Sigma) 〇 將加重比生產率計算為在某天之產物濃度除以直至該時 點之"活細胞之積分"（IVC)。 136226.doc •59- 200932907
RNA分離、RT-PCR及定量即時PCR 使用 NucleoSpin RNA II 套組（Macherey-Nagel， Oensingen，Switzerland)自哺乳動物細胞製備總RNA且以 TITANIUM™ One-Step RT-PCR套組（Clontech)根據製造商 方案進行RT-PCR。seap、samy及vegfm mRNA之相對定量 '· 係以 Applied Biosystems 7500即時PCR裝置，使用 25 μΐ含 ·- 有 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，
Warrington，UK)、100 ng cDNA、900 nM正向及反向引子 〇 (itseap (5'-AGGCCCGGGACAGGAA-3', SEQ ID NO 17; 5'- GCCGTCCTTGAGCACATAGC-3', SEQ ID NO 18)、samy (5'-AAA GCTCAATATCTTCAAGCCATTC-3', SEQ ID NO 19; 5'-AACACGACATCGGCGTACACT-3', SEQ ID NO 20) 及 vegfm (5'-CTTGCTGCTCTACCTCCACCAT-3'，SEQ ID NO 21; 5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3', SEQ ID NO 22)具有特異性）之反應液來進行。使用核糖體18s-RNA特 異性轉錄物檢定（Applied Biosystems)將所有試樣均標準化 且對所有擴增子（amplicons)均進行熔融曲線分析以證實不 . 存在非特異性擴增。 共焦顯微法 .在48 h之後將接種且轉染於塗佈聚灕胺酸之玻璃載片上 的HEK-293以磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)洗滌，以三聚曱醛（3% w/v)固定，以PBS再次洗滌，且藉由共焦顯微法分析。以 Leica TCS SP1 (Leica，Heerbrugg，Switzerland)記錄影像且 藉由Adobe Photoshop 10加以分析。 136226.doc •60- 200932907 抗艎、免疫沈溉及西方墨點法 在冰上將哺乳動物細胞溶解於溶胞緩衝液（5〇111]^1'1^-HCL，pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM DTT、1 mM EDTA、 l°/〇 Triton X-100)中。藉由在4°C 下在 14,000xg下離心 10 min接著在4°C下與蛋白質A-瑷脂糖珠粒（Amersham • Biosicences，Uppsla，Sweden)— 起培育 30 min來獲得總蛋 ‘ 白質溶胞物。藉由在4°C下藉由旋轉隔夜使2 mg總蛋白質 與親和性純化之Munc 18c抗體（與蛋白質A-瓊脂糖偶合）混 © 合於最終體積為500 μΐ之溶胞緩衝液中來進行免疫沈澱。 接著以500 μΐ溶胞緩衝液將珠粒洗滌四次且藉由SDS-PAGE 將蛋白質溶離且分離，接著進行西方墨點分析。對Sly 1具 有特異性之抗體係由 Jesse Hay(University of Montana, Missoula，MO，USA)友情提供。對Muncl8a、突觸蛋白4及 Vamp2具有特異性之抗體係講自Synaptic Systems (Goettingen，Germany)且抗 Muncl8b、Muncl8c 及 ρ27Κιρ1 之 抗體係來自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA， ® USA)。使用ECL-Plus偵測試劑及HRP-共軛第二抗體 • (Amersham，Piscataway，NJ，USA)來觀測經塗墨之蛋白 ; 質。 蛋白質製造 在培養物中48 h之後，使用標準化檢定來評估蛋白質製 造：SEAP，基於對硝基苯磷酸鹽之吸光時間過程； SAMY，藍澱粉Phadebas®檢定（Pharmacia Upjohn，Peapack, NJ，目錄號 10-5380-32) ; VEGF121，藉由人類 VEGF丨21特 136226.doc -61 - 200932907 異性 ELISA(R&D System, Minneapolis, MN，目錄號 DY293)及利妥昔單抗，藉由ELISA(Sigma，目錄號12136 及 A0170)。 如下測定生長於懸浮液培養物中之細胞的抗體力價及比 生產率：
以雙順反子載體轉染產生CHO-DG44之抗體以分析異源 蛋白質表現對mAb生產率之影響。為評定晶粒儲備培養物 之生產率，自三個連續繼代收集來自細胞培養物上清液之 試樣。接著藉由酶聯免疫吸附檢定（ELISA)來分析產物濃 度。為進行ELISA，使用抗人類-Fc片段抗體（Jackson Immuno Research Laboratories)及共扼人類 κ 輕鏈 HRP(Sigma)。可如下來計算比生產率，連同細胞密度及生 存力： (mAbp+] +mAbp) qp 2
^P+,+ccF
136226.doc -62- 200932907 和。藉由SDS-PAGE證實純度/完整性。接著藉由在37°C下 以2 mM Tris(pH7)中之〇.〇5 mU/mg蛋白質進行N-糖苷酶消 化（PNGaseF，EC 3.5.1,52，QA-Bio，San Mateo，CA)歷時 3 h，從而使募醣自抗體中酶促釋放。在150 mM乙酸中培育 所釋放之寡醣，隨後以DHB作為基質（Papac等人，1998)， 使用 Autoflex MALDI/TOF (Bruker Daltonics，Faellanden， , Switzerland)，以陽離子模式操作來進行MALDI分析。 HRP運輸檢定 Ο 以編碼所分泌辣根過氧化酶（SSHRP)之構築體與空載 體、Muncl8c、Slyl之表現構築體或編碼Muncl8c及Slyl之 雙順反子表現單元中之任一者來共轉染人類HT1080纖維 肉瘤細胞。在轉染後24 h及48 h後，自細胞培養液取樣且 藉由一起培育澄清細胞上清液與TMB試劑（BD Biosciences， Pharmingen)來偵測報導蛋白質ssHRP之分泌。在3 min之 後，停止反應且以ELISA讀取器（Spectra Rainbow Thermo) 在450 nm下量測吸收度以測定ssHRP力價。為進一步分析 _ 比生產率，在最後一次量測之後將細胞胰蛋白酶化，使用 CASY®細胞計數器（Schaerfe System)來計數且藉由將 ； ssHRP力價除以總細胞數目來計算比生產率。 實例 實例1 :將Slyl及Muncl8c沿分泌途徑在HEK-293中定位。 吾人使用基於RT-PCR之分析以描繪SM蛋白質Slyl及 Muncl8之同功異型物（a、b、c)在HEK-293中之表現。如在 圖 la 及 lb 中所示，slyl(NM_016160)及 muncl8c (NM_ 136226.doc -63- 200932907 007269)表現較高且mucl8b(NM_006949)以微量表現同時 未能偵測到神經元特異性rmmcl8a(NM_003165)之轉錄 物。藉由西方墨點法（圖lc)來證實SM蛋白質概況。藉由在 HEK-293中共表現YFP-Slyl(pRP32)與CFP-突觸蛋白 5(pRP40)或 YFP-Muncl8c(pRP23)與 CFP-突觸蛋白 4(pRP29) •’ 來分析Slyl及主要Muncl8同功異型物Muncl8c之細胞内定 ‘ 位。突觸蛋白5為定位於高爾基體之Slyl結合SNARE且突 觸蛋白4為與細胞膜結合之與Muncl8c相互作用的 © SNARE。共焦顯微法展示Slyl顯示與突觸蛋白5在高爾基 體處極敏密之核周共定位及Munc 1 8c與突觸蛋白4之細胞膜 共染色（co-stain)(圖Id)。此等結果證明Slyl及Muncl8c在 HEK-293中表現且定位於高爾基體與細胞膜，此係與其在 各別細胞器處之兩個獨特融合步驟中之作用一致（Jahn等 人，2003)。 實例2 : Slyl及Muncl8調節蛋白質分泌》 已知SM蛋白質控制對細胞内蛋白質運輸必需之小泡融 W 合，但其對於蛋白質分泌之作用仍未知。為表徵Slyl及
Muncl8對總體胞吐作用之影響，吾人設計對此等SM蛋白 ； 質有特異性之shRNA。藉由以雙順反子Slyl-(pRP3; PhCMv- . slyl-IRES-eGFP-pA)及 Muncl8c-(pRP4; PhCMV-muncl 8c- IRES-eGFP-pA)(編碼報導構築體）與特異性以及非特異性 對照物shRNA共轉染之細胞的螢光顯微法來證明Sly 1及 Munc 18c之敲除（圖2)。在HEK-293中證實個別shRNA敲除 内源Slyl及Munc 18c表現以達到至多70%之能力（圖3a及 136226.doc •64· 200932907 3c)。為分析Sly 1及Mime 18c敲除對哺乳動物細胞之總體蛋 白質分泌能力的影響，吾人將PSEAP2對照物及pRP5 (shRNAslyl l)、pRP6(shRNAslyl 2)、pRP7(shRNAslyl 3)或 pRP12(shRNAmuncl8c_i) 、 pRP 14(shRNAmuncl8c2) 、 pRP38(shRNAmunci8c 3)、pRP39(shRNAmunel8c 4)共轉染至 ' HEK-293中且描繪培養物上清液中之SEAP水準。Slyl及
>· Muncl8c敲除與SEAP製造減少之直接相關性表明此等SM 蛋白質在哺乳動物分泌途徑中之重要作用（圖3b及3d)。 Ο 實例3 : Slyl及Muncl8c之異位表現提高哺乳動物細胞之分 泌能力。 在Slyl或Muncl8c於CHO-K1中異位表現（圖4a 4b、4c)之 後，與用以推動產物基因轉錄之啟動子（P SV40 ' PhCMV、 Pefi«)無關地，SEAP、SAMY或VEGF121之異源製造提高至 多5倍。當使用HEK-293細胞時，亦觀察到類似結果（資料 未展示）。因為SEAP、SAMY及VEGF之mRNA水準在存在 或不存在提高之Slyl、Munc 18c或兩者之情況下粗略地·|•亙 ® 定（圖4d)，所以異源蛋白質產量之提高係由轉譯後機制介 導。吾等結果與主張在一系列細胞類型（包括脂肪細胞及 ; 肌細胞）中Munc 1 8蛋白質對胞吐作用之抑制作用的先前研 , 究（Riento 等人，2000; Kanda 等人，2005; Tellam 等人， 1997; Thurmond等人，1998)形成鮮明對比，且提供 Munc 18c及Slyl均促進總體胞吐作用之第一證據。 實例4 : SM蛋白質及Xbp-Ι對分泌途徑之協同效應》 因為Slyl及Muncl8以及Xbp-1(最近已被識別為藉由增大 136226.doc -65- 200932907 分泌細胞器之尺寸來提高蛋白質分泌（Tigges及 Fussenegger，2006))在分泌途徑中具有不同目標，所以其 可能能夠協同地提高蛋白質產量。因此吾人將Sly 1編碼、 Muncl8c編碼及Xbp-Ι編碼及含SEAP、SAMY及VEGF⑴之 表現載體的不同組合共轉染至CHO-K1中且描繪培養物上 · 清液中之報導蛋白質水準。如圖4a中所示，slyl與 muncl8c之同時過度表現引起SEAP產量提高8倍，相比之 下，藉由單獨之slyl或muncl8c提高5倍。SAMY及VEGF121 ® 之分泌亦增多（圖4b、4c)。slyl、muncl 8c及xbp-1全部之 過度表現將SEAP、SAMY及VEGF之分泌分別增多10倍、 12倍及8倍（圖4a、4b、4c)，明顯地說明在Slyl與Munc 18c 之間及在兩種SM蛋白質與通用細胞器擴增因子Xbp-1之間 對分泌存在協同效應。 實例5 : SM蛋白質藉由刺激SNARE介導之運輸機構來提高 分泌能力。 先前研究指定Munc 18c在胞吐作用中之抑制作用，其與 m 在本文中報導之結果形成對比（Riento等人，2000; Kanda , 等人，2005; Tellam等人，1997; Thurmond等人，1998)。 • 為提供Muncl8c在運輸機構中之作用，詳言之其與由突觸 . 蛋白4、SNAP-23及VAMP2組成之胞吐SNARE蛋白質之相 互作用的分子理解，吾人進行免疫沈澱實驗。如圖5中所 示，Munel8c-特異性抗體定量地使MunclSc連同大量突觸 蛋白4、SNAP-23及VAMP 2—起沈澱，表明Munc 18c與此 等SNARE之活體内締合，其促進小泡-細胞器在分泌途徑 136226.doc -66- 200932907 中融合（Peng and Gallwitz，2002; Shen等人，2007; Scott等 人，2004)。此發現強調，類似於與完全組裝之SNARE複 合物結合且促進融合高爾基體之Slyl，Muncl8c亦與 SNARJE複合物直接相互作用，表明藉由促進SNARL·介導 之運輸機構的保守作用機制。 實例6:用於在哺乳動物細胞中提高分泌能力的哺乳動物 , 細胞之基於SM蛋白質之工程設計。
Sly 1及Munc 18c表現對哺乳動物細胞分泌能力之正面效 〇 應指出一種將提高分泌之哺乳動物生產細胞株工程化之新 穎轉譯後方法。因此吾人製造為31丫1((：^10-81丫116及(：110-Slyl23)或muncl8c(CHOMuncl8c8及CHO-Muncl8c9)之構成 性表現而工程化的穩定CH0-K1衍生之細胞株。CHO-Slyl16&CHO-Slyl23刺激SEAP分泌提高4倍及8倍（圖6a)及 SAMY產量增加4倍及5倍（圖6b)。有趣地，產生較多SEAP 之CHO-Slyl23亦展示較高Slyl水準，表明SM與產物蛋白質 之正相關性（圖6c)。類似地，為構成性munc 18c表現轉殖 ❹ 基因之細胞（CHO-Muncl8c9)產生多9倍及6_5倍之SEAP及 . SAMY(圖6e及6f)且產生更多SEAP之CHO-Muncl89亦展示 • 較高1^\111(；18(：水準（圖6(1)。與親本（：110-1(：1相比，穩定細胞 株（：110-81丫1-]\4111^18〇1(為構成性8171及\1111^18(1表現之兩 重轉殖基因）及（：110-81丫1-]^111^18〇又1卩-17(為構成性81丫1、 Munc 18c及Xbp-Ι表現之三重轉殖基因）展示高13倍及16倍 之SEAP產量（圖6g) » 實例7:基於SM蛋白質之分泌工程設計提高生產細胞株之 136226.doc -67- 200932907 抗體的比生產率。 為在原型生物醫藥製造方案中驗證基於SM蛋白質之分 泌工程設計，吾人使稱為利妥昔單抗之單株抗人類CD20 IgGl 在（：110-817116及 CHO-Slyl23 中（增加至多 10倍）、在 CHO-Slyl-MunclSq 中（增加至多 15 倍）及在 CHO-Slyl-Xbp-'· 14 中（增加至多 13 倍）及在 CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7 中（增 , 加至多 19倍）表現（圖 7a)。當在CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7 中產生利妥昔單抗時，可達到至多40 pg/細胞/天之特別製 © 造水準，與同基因對照細胞株相比，其對應於增加接近20 倍（圖 7a)。SDS-PAGE 分析表明藉由 CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-17&野生型CHO-K1細胞產生之抗體為結構完整的且 彼此不可區分（圖71>、7(；)。自在（1^0-81)^1-141111〇18〇-\5卩-17中產生之利妥昔單抗的N-鍵聯Fc募醣之基於Maldi-TOF 之糖基化概況分析揭示與原生生產細胞株相比無差異，表 明基於SM/Xbp-Ι之分泌工程設計並不損害產物品質（圖7d 及 7e)。 ® 實例8 :基於SM蛋白質之分泌工程設計在製造過程中提高 總抗體產率。 • a)為測試SM蛋白質之異源表現是否亦可用以在工業製造 . 之相關條件下提高治療用蛋白質分泌，以空載體（MOCK對 照物）或編碼Slyl(SEQ ID NO. 41)或Munc-18(序列標識NO. 39)或兩種蛋白質之表現構築體作為雙順反子表現單元來 穩定轉染產生分泌人類化抗CD44v6 IgG抗體BIWA 4之 CHO細胞株（CHO DG44)的抗體。接著使細胞經受選擇以 136226.doc -68 - 200932907 獲得穩定細胞池（cell pool)。在六個後續繼代期間，自所 有穩定細胞池之晶粒儲備培養物取得上清液，藉由EUSA 測定MCP-1力價且將其除以細胞之平均數目以計算比生產 率。在所有表現任一 SM蛋白質之細胞中，與]^〇(：1^或未經 轉染之細胞相比，IgG表現均顯著提高，藉以最高值係見 於同時表現兩種SM蛋白質之細胞池中。 若使穩定轉染物經受分批醱酵或進料分批醱酵，則可獲 得類似結果。每日量測總細胞數目及細胞生存力，且在第 3天、第5天、第7天、第9天及第11天，自細胞培養液取樣 以測定IgG力價及比生產率（圖1〇A、1〇B)。在此等條件 下，與MOCK對照物及未經轉染之親本細胞株相比 ，SM蛋 白質轉殖基因細胞展示類似生長特性。然而與M〇CK對照 物相比，在表現Slyl或Munc-18或同時表現兩種81^蛋白質 之細胞中IgG比生產率顯著提高（高至多5〇%)(圖1〇A)，造 成在製造過程中單株抗體力價明顯增大（圖1〇B)。 總而言之’此資料證明基於Sly[蛋白質之細胞工程方法 對於以多種培養形式（包括串聯培養、生物反應器分批培 養及進料分批培養）提高治療用蛋白質產量之適用性。 b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc-18(SEQ ID NO· 39)或兩種蛋白質一起之載體轉染ch〇宿主細胞（CHO DG44)。使細胞經受選擇壓力且挑選演示SM蛋白質之異源 表現的細胞株。隨後，此等細胞株及平行CHO DG 44野生 型細胞係以編碼人類單株IgG型抗體作為所關注之基因的 表現構築體轉染。在第二輪選擇之後，自所有歷經六個後 136226.doc •69· 200932907 續繼代之期間的穩定細胞池之晶粒儲備培養物取得上清 液，藉由ELISA測定IgG力價且將其除以細胞之平均數目 以計算比生產率。 最高值係見於具有兩種SM蛋白質之細胞池，接著見於 表現單獨之Slyl或Munc-18的彼等者，其仍產生與不表現 任一 SM蛋白質之CHO DG-44細胞相比顯著更高之抗體力 價。若使穩定轉染物經受分批醱酵或進料分批醱酵，則可 獲得類似結果。在此等情況之每一者中，兩種SM蛋白質 © —起之過度表現引起抗體力價及比生產率均顯著提高。此 表明單獨之Slyl或Munc-18之異源表現足以增強治療用抗 體分泌。另外，兩種蛋白質之異源表現以組合形式聯合地 以協同方式在瞬間以及穩定轉染之細胞株中增強總體胞吐 作用。 實例9 : SM蛋白質之過度表現提高纖維母細胞活化蛋白質 a(Fibroblast Activation Protein alpha，FAP)之生物醫藥 蛋白質產量。 (a)以空載體（MOCK對照物）或編碼Slyl(SEQ ID NO. 41) 或Munc-18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白質作為雙順反子表 ; 現單元之表現構築體來轉染表現跨膜明膠酶纖維母細胞活 __ 化蛋白tx(FAP)之人類纖維肉瘤細胞株（HT1080, ATCC CCL- 121)。接著使細胞經受選擇以獲得穩定細胞池。自此等池 之晶粒儲備培養物收集細胞且將其固定以便藉由FACS測 定FAP表面表現或製備細胞溶胞物以便使用抗FAP抗體進 行西方墨點法。與MOCK細胞相比，細胞表面上FAP之量 136226.doc -70- 200932907 在所有表現SM蛋白質之細胞中均顯著增大，且在表現Sly 1 及Munc-1 8兩者之細胞中表現為最高。此等結果表明兩種 SM蛋白質協同作用以為細胞-表面跨膜蛋白增強細胞之製 造及運輸能力。 b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)或 Munc-18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白質一起之載體轉染人類HT1080或 , HEK293細胞。使細胞經受選擇壓力且挑選演示SM蛋白質 之異源表現的細胞株。隨後，此等細胞株及平行HT1080 ❹ 或HEK293野生型細胞係以編碼FAP α作為所關注之基因的 載體轉染。在第二輪選擇之後，自所有穩定細胞池之培養 物取得細胞且藉由FACS或西方墨點法來測定FAP之表現 量。最高值係見於具有兩種SM蛋白質之細胞池，接著見 於表現單獨之Slyl或Munc-18的彼等者，其仍表現與不表 現任一 SM蛋白質之親本細胞相比顯著更高之FAP水準。若 使穩定轉染物適應於在懸浮液中生長且經受分批醱酵或進 料分批醱酵，則可獲得類似結果。在此等情況之每一者 W 中，兩種SM蛋白質一起之過度表現引起FAP表現顯著增 多。此表明Slyl及Munc-18之異源表現引起跨膜蛋白之產 • 量及細胞表面定位改良，藉以一旦異源引入組合之兩種蛋 . 白質後，效應即為最高。 實例10 : SM蛋白質之過度表現增大跨膜蛋白上皮生長因 子受體（EGFR)之生物醫藥蛋白質產量》 (a)以空載體（MOCK對照物）或編碼Slyl(SEQ ID NO· 41) 或Munc-18(SEQ ID NO. 3 9)或兩種蛋白質作為雙順反子表 136226.doc -71 - 200932907 現單元之表現構築體來轉染表現跨膜蛋白上皮生長因子受 體（EGFR)之CHO細胞株（例如CHO-DG44)。接著使細胞經 受選擇以獲得穩定細胞池。在四個後續繼代期間，自此等 池之晶粒儲備培養物取得細胞，且藉由FACS或西方墨點 法測定EGFR之表現量。與MOCK細胞相比，細胞表面上 *· EGFR之量在所有表現SM蛋白質之細胞中均顯著增大，且 , 在表現Slyl及Munc-18兩者之細胞中表現為最高。若使穩 定轉染物經受分批醱酵或進料分批醱酵，則可獲得極類似 φ 結果。在此等情況之每一者中，Slyl或Munc-18之過度表 現引起EGFR表現與對照物相比中等增加，而一旦Sly 1與 Munc-18同時過度表現後EGFR水準即顯著提高，表明兩種 SM蛋白質協同作用以為細胞-表面跨膜蛋白以多種培養形 式（包括串聯培養、生物反應器分批培養及進料分批培養） 增強細胞之製造及運輸能力。 b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO· 41)或 Munc-18(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白質一起之載體轉染CHO宿主細胞（CHO ® DG44)。使細胞經受選擇壓力且挑選演示SM蛋白質之異源 . 表現的細胞株。隨後，此等細胞株及平行CHO DG 44野生 - 型細胞係以編碼EGFR作為所關注之基因的載體轉染。在 第二輪選擇之後，自六個連續繼代之所有穩定細胞池之晶 粒儲備培養物取得細胞且藉由FACS或西方墨點法來測定 EGFR之表現量。最高值係見於具有兩種SM蛋白質之細胞 池，接著見於表現單獨之Slyl或Munc-18的彼等者，其仍 表現與不表現任一 SM蛋白質之CHO DG-44細胞相比顯著 136226.doc -72- 200932907 更高之EGFR水準。若使穩定轉染物經受分批醱酵或進料 分批醱酵，則可獲得類似結果。在此等情況之每一者中， 兩種SM蛋白質一起之過度表現引起EGFR表現顯著增加。 此表明Sly 1及Munc-1 8之異源表現引起跨膜蛋白之產量及 細胞表面定位改良，藉以一旦異源引入組合之兩種蛋白質 '—後，效應即為最高的。 , 實例11 : SM蛋白質之過度表現增大單核細胞化學引誘剤 蛋白質l(MCP-l)之生物醫藥蛋白質產量。 〇 (a)以空載體（MOCK對照物）或編碼Slyl(SEQ ID NO· 41) 或Munc-1 8(SEQ ID NO. 39)或兩種蛋白質.作為雙順反子表 現單元之表現構築體來轉染分泌單核細胞化學引誘劑蛋白 質l(MCP-l)之CHO細胞株（CHO DG44)。接著使細胞經受 選擇以獲得穩定細胞池。在六個後續繼代期間，自所有穩 定細胞池之晶粒儲備培養物取得上清液，藉由ELISA測定 MCP-1力價且將其除以細胞之平均數目以計算比生產率。 在所有表現任一 SM蛋白質之細胞中，與MOCK或未經轉染 ® 之細胞相比，IgG表現均顯著增加，藉以最高值係見於同 時表現兩種SM蛋白質之細胞池中。若使穩定轉染物經受 ； 分批醱酵或進料分批醱酵，則可獲得類似結果。在此等情 . 況之每一者中，兩種SM蛋白質之過度表現引起MCP-1分泌 增強，表明兩種SM蛋白質協同作用以多種培養形式（包括 串聯培養、生物反應器分批培養及進料分批培養）改良細 胞之蛋白質製造能力。
b)首先以編碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)或Munc-18(SEQ ID 136226.doc -73- 200932907 NO· 39)或兩種蛋白質—起之載雜轉染c肋宿主細胞 DG44)。使細胞經受選擇壓力且挑選演示sm蛋白質之異源 表現的細胞株。隨後，此等細胞株及平行C肋％ 44野生 型細胞係以編碼單核細胞化學引誘劑蛋白質Η·」）作為 所關注之基因的載體轉染。在第二輪選擇之後，自所有歷 Μ六個後續繼代之期間的穩定細胞池之晶粒儲備培養物取 得上清液，藉由ELISA測定MCIM力價且將其除以細胞之 平均數目以計算比生產率。 & 值係見於具有兩種SM蛋白f之細胞池，接著見於 表現單獨之SlyeMunc_18的彼等者，其仍產生與不表現 任一 SM蛋白質之CH〇 DG_44細胞相比顯著更高之Mcp·!力 價。若使穩定轉染物經受分批撥酵或進料分批酸酵則可 獲得類似結果。在此等情況之每一者中，兩種sm蛋白質 -起之過度表現引起MCIM力價及比生產率均顯著提高。 此表明單獨之Slyl或Munc-18之異源表現足以增強Mcp i ，刀泌二而，兩種蛋白質之異源表現以組合形式聯合地以 協同方式在瞬間以及穩定轉染之細胞株中增強總體胞吐作 用0 實例U : SM蛋白質增強自人類細胞之HRp分泌。 為解決SM蛋白質之過度表現是否亦可用以在非蓄齒動 物細胞、尤其人類細胞中增強分泌運輸之問題，吾人利用 編碼所分泌辣根過氧化酶（ssHRP)之質體，其可用作構成 性蛋白質分泌之報導物。 以編碼SSHRP之表現質趙，與空載體（MOCK對照物）或編 136226.doc 200932907 碼 Slyl(SEQ ID NO. 41)、Muncl8(SEQ ID NO. 39)或兩種 蛋白質作為雙順反子表現單元之表現構築體來共轉染人類 纖維肉瘤細胞株（HT1080, ATCC CCL-121)。轉染後24小時 及48小時，自細胞培養物上清液取樣且分析過氧化酶活 性。在量測之後，將細胞胰蛋白酶化且計數以測定細胞之 比生產率。 v 在24小時之後，可在表現Muncl8或Muncl8與Slyl之細 胞中偵測到與對照細胞相比ssHRP分泌之略微增強（圖9)。 〇 在轉染後48小時，與mock對照物相比，所有表現SM蛋白 質之細胞均展示提高之ssHRP力價（圖9)。在自以Muncl8轉 染之細胞的試樣中量測到最高值，與對照試樣相比，其顯 示HRP活性提高約1.4倍。與對照細胞相比，以Munc 18或 Slyl，或兩種SM蛋白質轉染之細胞的比生產率亦顯著提高 (圖 9)。 此證實兩種SM蛋白質均功能表現且增強自人類細胞之 蛋白質分泌。 W 參考文獻清單
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Zilly, F,E.，Sorensen，J.B.，Jahn, R.及 Lang, T. Muncl8-bound syntaxin readily forms SNARE complexes with synaptobrevin in native plasma membranes. PLoS Biol. 4, e330 (2006). 【圖式簡單說明】 圖1 © Slyl及Muncl8在HEK-293中之表現及定位。（a)及（b)將 肌動蛋白用作内源對照物對sly 1(a)及munc 18(b)轉錄物進 行基於RT-PCR之偵測。將Ι-Kb梯用作尺寸標準。 (c)Muncl8a/b/c之西方墨點（Western blot)。（d)展示Slyl 及 Muncl8c 在以 YFP-Muncl8c(pRP23)及 CFP-突觸蛋白 4 (Stx4，PRP29)或 YFP-Slyl(pRP32)及 CFP-突觸蛋白 5 (Stx5，pRP40)之組轉染的HEK_293中之亞細胞定位的共焦 顯微圖。箭頭表示Slyl與突觸蛋白5(上板）或Muncl8c與突 觸蛋白4(下板）之共定位（colocalization)。 圈2 slyl及Munc 18c之基於shRNA之敲除。（a)用作不同slyl 特異性shRNA之slyl特異性敲除報導構築體之雙順反子 slyl-/GFP-編碼之表現載體pRP3之示意圖。（b)以pRP3及不 同shRNA-編碼之表現載體共轉染且培養48 h之CHO-K1的 螢光顯微圖。（c)用作不同Munc 18c特異性shRNA之 Muncl8c特異性敲除報導構築體之雙順反子Muncl8c-/GFP- 136226.doc -81 - 200932907 編碼之表現載體pRP4之示意圖。（d)以pRP4及不同shRNA-編碼之表現載體共轉染且培養48 h之HEK-293的螢光顯微 圖。 圖3 sly 1及muncl 8c之基於shRNA之敲除降低總體胞吐作 ' 用。（a)以把向slyl之shRNA表現載體（shRNAs ly1_1/2/3; -. pRP5-7)轉染之HEK-293的Slyl特異性西方墨點。將親本載 體pmU6、對照物shRNA及p27Kipl用作對照物。（b)以 〇 PSEAP2-對照物及不同shRNAslyl表現載體共轉染（48 h)之 HEK-293的SEAP表現概況。（c)以把向muncl 8c之shRNA表 現載體（shRNAmuncl8c 1/2/3; pRP12，14，38，39)轉染之 HEK-293的Muncl 8c特異性西方墨點。（d)以pSEAP2-對照物及不 同shRNAmuncl8表現載體共轉染之HEK-293的SEAP表現概 況。 圖4
Sly 1及Munc 18c之異位表現轉錄後提高CHO-K1之蛋白質 ® 產量。（a-c)以 SEAP(pSEAPl-對照物）（a)、SAMY(pSS158) (b)或 VEGF121(pWW276)(c)製造載體及 Slyl-(pRP24)、 Muncl8c-(pRP17)及 Xbp-l(pcDNA3.1-Xbp-l)-編碼表現載 體（之不同組合）共轉染的CHO-K1之製造概況。（d)在存在 或不存在SM蛋白質表現之情況下，產物mRNA水準的基於 定量RT-PCR之概泥分析（profiling)。 圈5
Muncl 8c與胞吐SNARE複合物之相互作用。在使用親和 136226.doc -82- 200932907 性-純化、蛋白質A-瓊脂糖偶合之抗Munc 18c抗體使HEK-293溶胞物免疫沈殿之後，Munc 18c、突觸蛋白4、SNAP-23 及VAMP2/突觸 泡蛋白2(SybII)之西 方墨點 分析。 將未沈 澱之蛋白質（上清液）以及Sly 1用作對照物。 圖6 · 基於SM蛋白質之分泌工程設計提高在CHO-KI衍生之細 胞株中之異源蛋白質的產量。（a)培養48 h之為構成性Sly 1 及SEAP表現基因轉殖之穩定混合及純系CHO-K1衍生群體 〇 (CHO-Slyl16&CHO-Slyl23 及 CHO-Slyl 混合）之 SEAP產量。 (b)以 pSS158 瞬時轉染之 CHO-Slyl16&CHO-Slyl23 及 CHO-Slyl & ^•之SAMY產量。（c)以p27Kipl作為負載對照物 (loading control)之 CHO-KI、CHO-Slyl16&CHO-Slyl23 之 Slyl特異性西方墨點。（d)以p27Kipl作為負載對照物之 CHO-KI、CHO- Muncl8cs及 CHO-Munc 18c9iMuncl8c特 異性西方墨點。（e)培養48 h之為構成性Muncl 8c及SEAP表 現基因轉殖之穩定混合及純系CHO-K1衍生群體（CHO-Muncl8c8、CHO-Muncl8c9 及 CHO-Muncl8c 混合）之 SEAP 產 量。（f)以 pSS158 瞬時轉染之 CHO-Muncl8c8、CHO-- Muncl8c9及 CHO-MunclL 合之 SAMY產量。（g)培養 48 h之 構成性表現8171及1^1111。18〇((：^10-8171-]^111^18〇丨）、8171 及 Xbp-l(CHO-Slyl-Xbpl4)及 Slyl、Muncl8c 以及 Xbp-1 (CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7)之穩定細胞純系的SEAP產量 概況。 圖7 136226.doc -83- 200932907 在分泌工程化CHO-K1衍生物中產生之利妥昔單抗的產 量及糖基化概況分析。（a)不同分泌工程化CHO-K1衍生物 之利妥昔單抗的比生產率。藉由基於SM蛋白質之代謝工 程設計使得人類IgGl之分泌增加。（b、c)藉由非還原（b)及 還原（c)SDS-PAGE來分析自 CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7 及 · CHO-K1細胞純化之利妥昔單抗。展示IgGl之標準蛋白質 , 及重鏈及輕鏈（HC、LC)之分子量（KDa)。（d、e)在CHO-K1 及分泌工程化CHO-Slyl-Muncl8c-Xbp-l7中產生之利妥昔 〇 單抗的基於MALDI-TOF之糖基化概況分析。 圖8 表現構築體之示意圖： 自分離之表現單元（a)或自一個雙順反子單元（b)編碼至 少一種所關注之蛋白質（GOI)及一種SM蛋白質的載體。 包含自分離之表現卡匣（c)編碼，或以雙順反子而其中兩 個基因經由一個IRES元件鍵聯（d)編碼兩種SM蛋白質的基 因之表現載體。 ^ 編碼至少兩種SM蛋白質及一個所關注之基因（e)或自一 個多順反子表現單元（f)編碼幾種SM蛋白質的表現載體。 圈9 SM蛋白質增強人類細胞之HRP分泌： 測量以所分泌之辣根過氧化酶（horseraddish peroxidase， ssHRP)及空載體（Mock，黑條）、Muncl8c(灰條）、Slyl (陰 影條）或編碼Muncl8c及Slyl之雙順反子構築體（Munc-IRES-Sly，條紋條）共轉染的人類ΗΤ108·0細胞之上清液中 136226.doc -84- 200932907 HRP活性。相對於設定為1 .〇之Mock對照物，繪製在轉染 後24 h及48 h測量之相對ssHRP力價以及比生產率之圖 形。該等值對應於三份試樣之平均值，誤差條=SEM。 囷10 SM蛋白質在IgG生產細胞株中之過度表現提高比生產率 · 及最終IgG力價。 （A) 穩定地表現空載體（Mock)或 Sly-l(Slyl)、Munc_ 18c(Munc)或兩種SM蛋白質（Munc/Slyl)之表現構築體之細 © 胞的相對IgG 1比生產率。自進料分批（fed-batch)製造過程 期間之力價及活細胞計數計算生產率。該等條表示 n=2(Mock)至n=6單株轉殖基因igG生產細胞株之平均值， 且相對於設定為1 〇〇%之Mock細胞中之比生產率來描繪。 (B) 歷經9天進料分批醱酵過程穩定地表現所述構築體之 穩定細胞群的IgG力價。 ❹ 136226.doc •85- 200932907 序列表 、11V偽间Θ i佳殷格翰製藥公司 <120>基於SM-蛋白質之分泌工程 <130> P01-2308 <140> 097149850 <141> 2008-12-19 <150> 07150254.6; 08152829.1 <151〉2007-12-20; 2008-03-17 <160> 44 <170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 33 ' <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP70 <400> 1 cgcggaicca ccatggcggc ggcggcggca gcg 33
<210〉 2 <211> 36 <212> DNA <213>人工的 <220> 36 <223> 0RP71 <400> 2 ccgctcgagt tacttttgtc caagttgtga caactg <210〉 3 <211> 36 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> 0RP69 <400> 3 cgcggatcca ccatggcgcc gccggtggca gagagg 36 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213>人工的 <220> 32 <223> 0RP66 <400> 4 ccctcgagct attcatcttt aattaaggag ac <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP29 5 <400> 5 ctcagatctg cggcggcggc ggcagcg 27
<210> 6 <211> 33 <212> DNA 13 6226-序列表.doc 200932907 <213>人工的 <220> <223> 0RP30 <400> 6 accgtcgacc ttttgtccaa gttgtgacaa ctg <210〉 7 <211> 35 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP9 <400> 7 cgcgcggccg caccatggcg gcggcggcgg cagcg <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213>人工的
<220> <223> ORPIO <400> 8 ccgggatcct tacttttgtc caagttgtga caactg <210〉 9 <211> 27 <212> DNA <2Π>人工的 <220> <223> 0RP5 <400> 9 cccccgggat ggtgagcaag ggcgagg <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP6 <400> 10 tttctagatt acttgtacag ctcgtcc <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP15 <400> 11 cgcgcggccg caccatggcg ccgccggtgg cagagagg <210> 12 <211〉 32 <212> DNA <213> 人工的 <220> 136226-序列表.doc 200932907 <223> ORP16 <400> 12 ccggatccct attcatcttt aattaaggag ac <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP127 <400> 13 cccaagcttt gcgcgacagg acccacgag <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213>人工的 <220>
<223> ORP128 <400> 14 cgcgtcgact tatccaacgg ttatggtgat gcc <210〉 15 <211> 27 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP136 <400> 15 ggaagatcta tcccgcggaa acgctac <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> ORP137 <400> 16 cccaagcttt caagcaagga agaccac <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213>人工的 <220> <223〉seap—正向 <400> 17 aggcccggga caggaa <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> 人工的 <220> <223> seap_反向 <400> 18 136226-序列表.doc 25200932907 gccgtccttg agcacatagc <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> samy_ 正向 <400> 19 aaagctcaat atcttcaagc cattc <210〉 20 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> samy_ 反向 <400> 20 aacacgacat cggcgtacac 21 ❹ <210> 21 <211> 22 <212> <213>人工的 <220> <223> vegf〗2匕正向 <400> 21 cttgctgctc tacctccacc at 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> vegf】21_ 反向 <400> 22 tgattctgcc ctcctccttc t 21 <210> 23 <211> 57 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRP5-l_ shRNAslyl. <400> 23 uuuggaagua aacuggaaga uauuuucaag agaaauaucu uccauuuacu ucuuuuu 57 2458RNA- 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220〉 <223> pRP5-2_ shRNAslyl_l <400> 24 cuagaaaaag aaguaaacug gaagauauuu cucuugaaaa uaucuuccag uuuacuuc 58 -4- 136226·序列表.doc 200932907 <2I0> 25 <211> 60 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRP6-l_ shRNAs)yl_2 <400> 25 uuuggcagug aaacuagaca agaaauucaa gagauuucuu gucuaguuuc acugcuuuuu 60 2660RNAJ >>>>> Λυ 1 23 1 n n <2<2<2<2 <220> <223> pRP6-2_ shRNAslyl.2 <400> 26 cuagaaaaag cagugaaacu agacaagaaa ucucuugaau uucuugucua guuucacugc <210> 27 <211> 60 <212> RNA <2丨3>人工的 <220> shRNAslyl_3 <223> pRP7-l. <400> 27 uuugggaggc aacuacauug aauauuucaa gagaauauuc aauguaguug ccuccuuuuu <210> 28 <211> 60 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRP7-2. shRNAslyl_3 <400> 28 cuagaaaaag gaggcaacua cauugaauau ucucuugaaa uauucaaugu aguugccucc <210> 29 <211> 60 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRP12-LshRNAmuncl8c_l <400> 29 uuugcacaug aaucucaggu guauauucaa gagauauaca ccugagauuc auguguuuuu <210> 30 <211> 60 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRPI2-2_shRNAmunc18c_l <400> 30 cuagaaaaac acaugaaucu cagguguaua ucucuugaau auacaccuga gauucaugug
<210> 31 <211> 60 <212> RNA 136226-序列表.doc 200932907 <213>人工的 <220> <223> pRP14-l_shRNAmuncl8c.2 <400> 31 uuuggcuuga agacuacuac aagauuucaa gagaaucuug uaguagucuu caagcuuuuu <210〉 32 <211> 60 <212> RNA <213> 人工的 <220> <223> pRPl4-2_shRNAmunc18c_2 <400> 32 cuagaaaaag cuugaagacu acuacaagau ucucuugaaa ucuuguagua gucuucaagc <210> 33 <211> 60 <2I2> RNA <213> 人工的 <220> <223> pRP38-l_shRNAmunc18c_3 <400> 33 uuugcgccag aaacccagag cuaauuucaa gagaauuagc ucuggguuuc uggcguuuuu <210> 34 <2U> 60 <212> RNA <213〉 人工的 <220> <223> pRP38-2_shRNAmunc!8c_3 <400> 34 cuagaaaaac gccagaaacc cagagcuaau ucucuugaaa uuagcucugg guuucuggcg <210> 35 <211> 60 <212> RNA <213> 人工的 <220〉 <223> pRP39-l_shRNAmuncl8c_4 <400> 35 uuuggcugaa uaaacccaag gauaauucaa gagauuaucc uuggguuuau ucagcuuuuu <210> 36 <211> 60 <212> RNA <213> 人工的 <220> <223> pRP39-2_shRNAmuncJ8c_4 <400> 36 cuagaaaaag cugaauaaac ccaaggauaa ucucuugaau uauccuuggg uuuauucagc 012 3 ο 111 I n u 222ΛΖ 2 < < < V < > 的 A工 3760- 6- 136226-序列表.doc 200932907 <223> pRP9-1_shRNAcon t ro1 <400> 37 uuugcacaag cuggaguaca acuacuucaa gagaguaguu guacuccagc uuguguuuuu 60 <210> 38 <211> 60 <212> RNA <213>人工的 <220> <223> pRP9-1_shRNAcon t ro1 <400> 38 cuagaaaaac acaagcugga guacaacuac ucucuugaag uaguuguacu ccagcuugug 60 <210> 39 <211> 592 <212> PRT <213>智人 <400> 39
Met Ala Pro Pro Val Ala Glu Arg Gly Leu Lys Ser Val Val Trp Gin 15 10 15
Lys lie Lys Ala Thr Val Phe Asp Asp Cys Lys Lys Glu Gly Glu Trp 20 25 30
Lys lie Met Leu Leu Asp Glu Phe Thr Thr Lys Leu Leu Ala Ser Cys 35 40 45
Cys Lys Met Thr Asp Leu Leu Glu Glu Gly lie Thr Val Val Glu Asn 50 55 60
He Tyr Lys Asn Arg Glu Pro Val Arg Gin Met Lys Ala Leu Tyr Phe 65 70 75 80 lie Thr Pro Thr Ser Lys Ser Val Asp Cys Phe Leu His Asp Phe Ala 85 90 95
Ser Lys Ser Glu Asn Lys Tyr Lys Ala Ala Tyr lie Tyr Phe Thr Asp 100 105 110 ⑩
Phe Cys Pro Asp Asn Leu Phe Asn Lys lie Lys Ala Ser Cys Ser Lys 115 120 125
Ser He Arg Arg Cys Lys Glu lie Asn lie Ser Phe He Pro His Glu 130 135 140
Ser Gin Val Tyr Thr Leu Asp Val Pro Asp Ala Phe Tyr Tyr Cys Tyr 145 150 155 160
Ser Pro Asp Pro Gly Asn Ala Lys Gly Lys Asp Ala lie Met Glu Thr 165 170 175
Met Ala Asp Gin lie Val Thr Val Cys Ala Thr Leu Asp Glu Asn Pro 180 185 190
Gly Val Arg Tyr Lys Ser Lys Pro Leu Asp Asn Ala Ser Lys Leu Ala 195 200 205 136226-序列表.doc 200932907
Gin Leu Val Glu Lys Lys Leu Glu Asp Tyr Tyr Lys lie Asp Glu Lys 210 215 220
Ser Leu lie Lys Gly Lys Thr His Ser Gin Leu Leu lie lie Asp Arg 225 230 235 240
Gly Phe Asp Pro Val Scr Thr Val Leu His Glu Leu Thr Phc Gin Ala 245 250 255
Met Ala Tyr Asp Leu Leu Pro He Glu Asn Asp Thr Tyr Lys Tyr Lys 260 265 270
Thr Asp Gly Lys Gla Lys Glu Ala lie Leu Glu Glu Glu Asp Asp Leu 275 280 285
Trp Val Arg He Arg His Arg His lie Ala Val Val Leu Glu Glu lie 290 295 300
Pro Lys Leu Met Lys Glu lie Ser Ser Thr Lys Lys Ala Thr Glu Gly 305 310 315 320
Lys Thr Ser Leu Scr Ala Leu Thr Gin Leu Met Lys Lys Met Pro His 325 330 335
Phe Arg Lys Gin He Thr Lys Gin Val Val His Leu Asn Leu Ala Glu 340 345 350
Asp Cys Met Asn Lys Phc Lys Leu Asn lie Glu Lys Leu Cys Lys Thr 355 360 365
Glu Gin Asp Leu Ala Leu Gly Thr Asp Ala Glu Gly Gin Lys Val Lys 370 375 380
Asp Ser Met Arg Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Asn Lys Asn His Asp 385 390 395 400
Asn Cys Asp Lys He Arg Ala He Leu Leu Tyr lie Phe Ser He Asn 405 410 415
Gly Thr Thr Glu Glu Asn Leu Asp Arg Leu 31c Gin Asn Val Lys lie 420 425 430
Glu Asn Glu Scr Asp Met lie Arg Asn Trp Ser Tyr Leu Gly Val Pro 435 440 445 lie Val Pro Gin Ser Gin Gin Gly Lys Pro Leu Arg Lys Asp Arg Ser 450 455 460
Ala Glu Glu Thr Phe Gin Leu Ser Arg Trp Thr Pro Phe lie Lys Asp 465 470 475 480 lie Met Glu Asp Ala lie Asp Asn Arg Leu Asp Ser Lys Glu Trp Pro 485 490 495
Tyr Cys Ser Gin Cys Pro Ala Val Trp Asn Gly Ser Gly Ala Val Ser 136226-序列表.doc 200932907 500 505 510
Ala Arg Gin Lys Pro Arg Ala Asn Tyr Leu Glu Asp Arg 515 520 525
Scr Lys Leu lie Val Phe Val lie Gly Gly lie Thr Tyr 530 535 540
Arg Cys Ala Tyr Glu Val Ser Gin Ala His Lys Ser Cys 545 550 555
Lys Asn Gly Ser Glu Val Glu Val lie 560 lie Gly Ser Thr His Val Leu Thr Pro Lys Lys Leu Leu Asp Asp lie 565 570 575
Lys Met Leu Asn Lys Pro Lys Asp Lys Val Ser Leu lie Lys Asp Glu 580 585 590
<210> 40 <211> 2522 <212> RNA <213>智人 <400〉 40 accccaacgc cgcuucugcg gccaaaguag guugggagug gaagguggug gcugcugcuc egeagugueg ggaagaugge gccgccggug gcagagaggg ggcuaaagag eguegugugg cagaagauaa aagcaacagu guuugaugac ugcaagaaag aaggcgaaug gaagauaaug cuuuuagaug aauuuaccac uaagcuuuug gcaucguguu gcaaaaugac agaucuucua gaagaaggua uuacuguugu agagaauauu uauaagaacc gugaaccugu cagacaaaug aaagcucuuu auuucaucac uccgacauca aagucuguag auuguuucuu acaugauuuu gcaaguaaau cggagaacaa guauaaagca gcauauauuu acuucacuga cuuuugcccu gauaaucucu uuaacaaaau uaaggcuucu ugcuccaagu caauaagaag auguaaagaa auaaauauuu ccuucauucc acaugaaucu cagguguaua cucuugaugu accagaugca uucuauuacu guuauagucc agacccuggu aaugcaaagg gaaaagaugc cauuauggaa acaauggcug accagauagu uacagugugu gccaccuugg augaaaaucc eggaguaaga uauaaaagua aaccucuaga uaaugccagu aagcuugcac agcuuguuga aaaaaagcuu gaagacuacu acaagauuga ugaaaagagc cuaauaaagg guaaaacuca uucacagcuc uuaauaauug aueguggeuu ugauccugug uccacugucc ugcaugaacu gaccuuucag gcaauggcau augaucuacu accaauugag aaugauacau acaaauauaa aacagaugga aaagaaaagg aggccauccu ugaagaagaa gaugaccucu ggguuagaau ucgacaucga cauauugcgg uuguguuaga ggaaauuccc aagcuuauga aagaaauuuc aucaacaaag aaagcaacag aaggaaagac aucacuuagu gcucuuaccc ageugaugaa aaagaugccc cauuuccgaa aacagauuac uaagcaaguu guccaucuua acuuagcaga agauugcaug aauaaguuca agcuuaauau agaaaagcuc ugcaaaacug aacaggaccu ggcacuugga acugaugcag aaggacagaa ggugaaagau uccaugcgag uacuccuucc aguucuacuc aacaaaaauc augauaauug ugauaaaaua agagcaauuc uacuuuauau cuucaguauu aauggaacua cggaagaaaa uuuggacagg uugauccaga auguaaagau agaaaaugag 60 120 】80 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 136226·序列表.doe -9-
200932907 agugacauga uucguaacug gaguuaccuu gguguuccca uuguucccca aucucaacaa Sgcaaaccgu uaagaaagga ucggucugca gaagaaacuu uucagcucuc ucgguggaca ccuuuuauca aagauauuau ggaggaugcu auugauaaua gauuagauuc aaaagaaugg ccauauuguu cccagugucc agcaguaugg aaugguucag gagcuguaag ugcucgccag aaacccagag cuaauuauuu agaagaccga aaaaaugggu caaagcugau uguuuuugua auuggaggga ucacauacuc ugaagugcgu ugugcuuaug aaguuucuca ggcacauaaa uccugugaag uuauuauugg uucuacacau guuuuaacac ccaaaaagcu guuggaugau auaaagaugc ugaauaaacc caaggauaaa gucuccuuaa uuaaagauga auagcauuuc uuuuuggagg guuuagagau ucuuacuaau auguugaacu aaaauagaaa gaaaauguug cugucaugua auuuaaacaa uguaaauauu uuauggaaua auggcuuuuc aaauacauuu cuuaaggaac uguuuaugau uauuacugga uuugucauuu uugauaauuu aaauauugcu gcugcuuugu agaugaugag aagaaauguu aaagugcuuu cuaaaaggaa auuuuuucac cuuuggagga gaauauauua gaguuguggg uaauuuuuca cagccaccua uguacauacu aauuacccau uggauacuua uaucuaaaag ucucaugcug aaguauaguu uuugggaaag aaugauuuua aauaaagaga uuguaaaagu aaaaaacugu aaauguauau guaugauaga auuguuuccu cuaaguguag uuuuucuuuc aacuaaaauu caguuuaugu guaaaauaau ucagucauua auagaaaugg agugauuuca caguguguac uguuuugcca cauacuucua aagaacacaa uuuuauauaa uuuugaaauc auguauguuu aaauuagaaa accaaaaauc augaacauuc uaagagaaaa uaaauauaga auuuaaaaaa uuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa <210> 41 <211> 642 <212> PRT <213> %人 <400> 41
Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ser lie Arg 15 10 15 參
Glu Arg Gin Thr Val Ala Leu Lys Arg Met Leu Asn Phe Asn Val Pro 20 25 30
His lie Lys Asn Ser Thr Gly Glu Pro Val Trp Lys Val Leu lie Tyr 35 40 45
Asp Arg Phc Gly Gin Asp lie lie Ser Pro Leu Leu Ser Val Lys Glu 50 55 60
Leu Arg Asp Met Gly lie Thr Leu His Leu Leu Leu His Ser Asp Arg 65 70 75 80
Asp Pro lie Pro Asp Val Pro Ala Val Tyr Phe Val Met Pro Thr Glu 85 90 95
Glu Asn lie Asp Arg Met Cys Gin Asp Leu Arg Asn Gin Leu Tyr Glu 100 105 110 136226·序列表.doc 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2522 •10· 200932907
Scr Tyr Tyr Leu Asn Phe lie Ser Ala lie Ser Arg Ser Lys Leu Gh 115 120 125
Asp lie Ala Asn Ala Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val Thr Gin Val Ala 130 135 140
Lys Val Phc Asp Gin Tyr Leu Asn Phe lie Thr Leu Glu Asp Asp Met 145 150 155 160
Phe Val Leu Cys Asn Gin Asn Lys Glu Leu Val Ser Tyr Arg Ala lie 165 170 175
Asn Arg Pro Asp lie Thr Asp Thr Glu Met Glu Thr Val Met Asp Thr 180 185 】90 lie Val Asp Ser Leu Phe Cys Phe Phc Val Thr Leu Gly Ala Val Pro 195 200 205 lie lie Arg Cys Ser Arg Gly Thr Ala Ala Glu Met Val Ala Val Lys 210 215 220
Leu Asp Lys Lys Leu Arg Glu Asn Leu Arg Asp Ala Arg Asn Ser Leu 225 230 235 240
Phe Thr Gly Asp Thr Leu Gly Ala Gly Gin Phe Ser Phe Gin Arg Pro 245 250 255
Leu Leu Val Leu Val Asp Arg Asn lie Asp Leu Ala Thr Pro Leu His 260 265 270
His Thr Trp Thr Tyr Gin Ala Leu Val His Asp Va! Leu Asp Phe His 275 280 285
Leu Asn Arg Val Asn Leu Glu Glu Ser Ser Gly Val Glu Asn Ser Pro 290 295 300
Ala Gly Ala Arg Pro Lys Arg Lys Asn Lys Lys Ser Tyr Asp Leu Thr 305 310 315 320 ❿
Pro Val Asp Lys Phe Trp Gin Lys His Lys Gly Ser Pro Phe Pro Glu 325 330 335
Val Ala Glu Ser Val Gin Gin Glu Leu Glu Ser Tyr Arg Ala Gin Glu 340 345 350
Asp Glu Val Lys Arg Leu Lys Ser lie Met Gly Leu Glu Gly Glu Asp 355 360 365
Glu Gly Ala lie Ser Met Leu Ser Asp Asn Thr Ala Lys Leu Thr Ser 370 375 380
Ala Va3 Ser Scr Leu Pro Glu Leu Leu Glu Lys Lys Arg Leu lie Asp 385 390 395 400
Leu His Thr Asn Val Ala Thr Ala Val Leu Glu His lie Lys Ala Arg 405 410 415 -11 - 136226-序列表.doc 200932907
Lys Leu Asp Val Tyr Phe Glu Tyr Glu Glu Lys lie Met Ser Lys Thr 420 425 430
Thr Leu Asp Lys Ser Leu Leu Asp lie lie Ser Asp Pro Asp Ala Gly 435 440 445
Thr Pro Glu Asp Lys Met Arg Leu Phe Leu lie Tyr Tyr lie Ser Thr 450 455 460
Gin Gin Ala Pro Ser Glu Ala Asp Leu Glu Gin Tyr Lys Lys Ala Leu 465 470 475 480
Thr Asp Ala Gly Cys Asn Leu Asn Pro Leu Gin Tyr lie Lys Gin Trp 485 490 495
Lys Ala Phe Thr Lys Met Ala Ser Ala Pro Ala Ser Tyr Gly Ser Thr 500 505 510
Thr Thr Lys Pro Met Gly Leu Leu Ser Arg Val Met Asn Thr Gly Ser 515 520 525
Gin Phe Val Met Glu Gly Val Lys Asn Leu Val Leu Lys Gin Gin Asn 530 535 540
Leu Pro Val Thr Arg lie Leu Asp Asn Leu Met Glu Met Lys Ser Asn 545 550 555 560
Pro Glu Thr Asp Asp Tyr Arg Tyr Phe Asp Pro Lys Met Leu Arg Gly 565 570 575
Asn Asp Ser Ser Val Pro Arg Asn Lys Asn Pro Phe Gin Glu Ala lie 580 585 590
Val Phe Val Val Gly Gly Gly Asn Tyr lie Glu Tyr Gin Asn Leu Val 595 600 605
Asp Tyr lie Lys Gly Lys Gin Gly Lys His lie Leu Tyr Gly Cys Ser 610 615 620
Glu Leu Phe Asn Ala Thr Gin Phe lie Lys Gin Leu Ser Gin Leu Gly 625 630 635 640
Gin Lys <210> 42 <211> 2172 <212> RNA <213>智人 <400> 42 gggeagugge ucgugggagc caagauggcg geggeggegg cagcgacagc ageageagea gccaguauuc gggaaaggca gacaguggcu uugaagegua uguugaauuu caaugugccu cauauuaaaa acagcacagg agaaccagua ugsaagguac ucauuuauga cagauuuggc caagauauaa ucucuccucu gcuaucugug aaggagcuaa gagacauggg aaucacucug •12· 60 120 180 240 136226-序列表.doc 200932907
caucugcuuu augccaacug ucauauuauu gcagcguuag uuuauuacuu uaucgugcca auaguugaca ucaagaggaa cuaagagaug uuccagaggc cauacuugga aauuuggaag aacaagaagu ccauucccag gaugagguca aguaugcuuu cuugagaaaa auaaaggcaa acucuggaua aaaaugaggu uuggagcaau aucaaacagu accacuaaac gaaggaguga aaucuuaugg augcugcggg guuuuugugg gggaaacaag auaaaacagu acuuggaaug cuguaacagu uacuuaauau aaaaaaaaaa uacacucuga aagaaaauau uaaauuuuau cagcuagugc uggaagauga uuaacaggcc gccucuucug cagcagcaga caagaaacag ccuuauuagu cauaucaagc aaucuucagg cuuaugauuu aaguugcaga aacgacuuaa cugacaauac aaagacuuau gaaaauugga aaucucuucu uguuucuuau auaaaaaagc ggaaggcuuu caaugggucu agaaccuggu agaugaaguc gcaaugacag ugggaggagg gcaaacacau ugucacaacu uggauaaaug guccuaacag guauugauua aa ucgagauccu ugacagaaug uucugcuauu aguaacacaa uauguuugua agauaucaca cuuuuuuguu aaugguagca ucuuuuuaca ccuuguugac auuggugcac aguggaaaac aacuccgguu aucaguucag aagcauuaug cgcuaagcua ugaucuccau uguauauuuu agauauaaua cuauuauaua uuuaacugau uaccaagaug uuuaucacga uuugaaacag aaaccccgaa cucaguuccc caacuacauu uuuauauggc uggacaaaag uaaaaagaag ugaaaaucag aaagaaacau auuccagaug ugccaggauc ucaagaagua guagccaagg uuauguaauc gacacggaaa acucugggug gugaaacuas ggugauacac agaaacauag gauguacugg ucuccagcus gauaaauuuu caagaacuag ggacuagaag acaucagcug acaaauguug gaauaugaag ucagacccug agcacacagc gcaggaugca gccucagcuc gucaugaaua caaaaucuac acugaugacu agaaauaaaa gaauaucaga ugcagugagc uaacacagaa aaaaguuaga aguuauuugu uucagaaaua uuccugcagu uucgaaauca aacuggaaga uuuuugacca aaaauaagga uggaaacugu cuguuccuau acaagaaacu uuggagcugg auuuggcaac auuuccauuu gugcuagacc ggcaaaaaca aaucuuacag gggaagauga uuaguucuuu ccacugcugu aaaaaauaau augcaggaac aagcaccuuc accuuaaucc cggccagcua caggaucaca cuguuacucg auagauauuu auccauucca aucuuguuga uuuuuaaugc gaaccuuacu agagcaauau uaauuuuuaa aaauuucaac auacuuugua acuauaugaa uauugcaaau auaucucaau gcuuguuuca uauggacacu aaucagaugu ucgagaaaau ccaauucagc uccuuuacau aaacaggguu aaagagaaaa uaaaggaagu agcacaggaa aggagccaua gccagaacuc uuuagaacau gagcaaaacu uccagaagau ugaggcugau uuuacaauau uggcagcacu guuugugaug uauuuuggac ugaucccaaa agaggccauu cuacauaaag uacacaguuc augauaaucu guuuccuucu ggaaauuaua auuguuaaaa 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2172 <210> 43 <211> 376 <212> PRT <213> %人 <400> 43 -13- 136226-序列表.doc 200932907
Met Val Val Val Ala Ala Ala Pro Asn Pro Ala Asp Gly Thr Pro Lys 15 10 15
Val Leu Leu Leu Ser Gly Gin Pro Ala Ser Ala Ala Gly Ala Pro Ala 20 25 30
Gly Gin Ala Leu Pro Leu Met Val Pro Ala Gin Arg Gly Ala Ser Pro 35 40 45
Glu Ala Ala Ser Gly Gly Leu Pro Gin Ala Arg Lys Arg Gin Arg Leu 50 55 60
Thr His Leu Ser Pro Glu Glu Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Lys Asn 65 70 75 80
Arg Val Ala Ala Gin Thr Ala Arg Asp Arg Lys Lys Ala Arg Met Ser 85 90 95
Glu Leu Glu Gin Gin Val Val Asp Leu Glu Glu Glu Asn Gin Lys Leu 100 105 110
Leu Leu Glu Asn Gin Leu Leu Arg Glu Lys Thr His Gly Leu Val Val 115 120 125
Glu Asn Gin Glu Leu Arg Gin Arg Leu Gly Met Asp Ala Leu Val Ala 130 135 140
Glu Glu Glu Ala Glu Ala Lys Gly Asn Glu Val Arg Pro Val Ala Gly 145 150 155 160
Ser Ala Glu Ser Ala Ala Gly Ala Gly Pro Val Val Thr Pro Pro Glu 165 170 175
His Leu Pro Met Asp Ser Gly Gly He Asp Ser Ser Asp Ser Glu Ser 180 185 190
Asp lie Leu Leu Gly lie Leu Asp Asn Leu Asp Pro Val Met Phe Phe 195 200 205
Lys Cys Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ser Leu Glu Glu Leu Pro Glu Val 210 215 220
Tyr Pro Glu Gly Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Val 225 230 235 240
Gly Thr Ser Ser Ala Lys Leu Glu Ala lie Asn Glu Leu lie Arg Phe 245 250 255
Asp His lie Tyr Thr Lys Pro Leu Val Leu Glu lie Pro Ser Glu Thr 260 265 270
Glu Ser Gin Ala Asn Val Val Val Lys lie Glu Glu Ala Pro Leu Ser 275 280 285
Pro Ser Glu Asn Asp His Pro Glu Phe lie Val Ser Val Lys Glu Glu 290 295 300 • 14· 136226-序列表.doc 200932907 Pro Val Glu Asp Asp Leu Val Pro Glu Leu Gly lie Ser Asn Leu Leu 305 310 315 320
Ser Ser Ser His Cys Pro Lys Pro Ser Ser Cys Leu Leu Asp Ala Tyr 325 330 335
Ser Asp Cys Gly Tyr Gly Gly Ser Leu Ser Pro Phe Ser Asp Met Scr 340 345 350
Ser Leu Leu Gly Val Asn His Ser Trp Glu Asp Thr Phe Ala Asn Glu 355 360 365
Leu Phe Pro Gin Leu lie Scr Val 370 375 ❹
<210> 44 <211> 1131 <212> RNA <213>智人 <400> 44 augguggugg uggcagccgc gccgaacccg gccgacggga ccccuaaagu ucugcuucug ucggggcagc ccgccuccgc cgccggagcc ccggccggcc aggcccugcc gcucauggug ccagcccaga gaggggccag cccggaggca gcgagcgggg ggcugcccca £gcgcgcaag cgacagcgcc ucacgcaccu gagccccgag gagaaggcgc ugaggaggaa acugaaaaac agaguagcag cucagacugc cagagaucga aagaaggcuc gaaugaguga gcuggaacag caagugguag auuuagaaga agagaaccaa aaacuuuugc uagaaaauca gcuuuuacga gagaaaacuc auggccuugu aguugagaac caggaguuaa gacagcgcuu ggggauggau gcccugguug cugaagagga sgcggaagcc aaggggaaug aagugaggcc aguggccggg ucugcugagu ccgcagcagg ugcaggccca guugucaccc cuccagaaca ucuccccaug gauucuggcg guauugacuc uucagauuca gagucugaua uccuguuggg cauucuggac aacuuggacc cagucauguu cuucaaaugc ccuuccccag agccugccag ccuggaggag cucccagagg ucuacccaga aggacccagu uccuuaccag ccucccuuuc ucugucagug gggacgucau cagccaagcu ggaagccauu aaugaacuaa uucguuuuga ccacauauau accaagcccc uagucuuaga gauacccucu gagacagaga gccaagcuaa ugugguagug aaaaucgagg aagcaccucu cagccccuca gagaaugauc acccugaauu cauugucuca gugaaggaag aaccuguaga agaugaccuc guuccggagc uggguaucuc aaaucugcuu ucauccagcc acugcccaaa gccaucuucc ugccuacugg augcuuacag ugacugugga uacggggguu cccuuucccc auucagugac auguccucuc ugcuuggugu aaaccauucu ugggaggaca cuuuugccaa ugaacucuuu ccccagcuga uuagugucua a 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1131 136226·序列表.doc 15-

Claims (1)

  1. 200932907 十、申請專利範圍： 1· 一種在細胞中產生所關注之異源蛋白質的方法，其包 含： a) 增加至少一種編碼來自SEc1/Munc18群蛋白質（…蛋 白質）之蛋白質的基因之表現，及 b) 實現該所關注之異源蛋白質的表現。 . 2.如請求項1之方法，其中在步驟b)中該所關注之異源蛋白 質的表現增加，較佳在步驟b)中該所關注之異源蛋白質 ❹ 的分泌增加。 3.如凊求項丨或2之方法，其中步驟a)中之一個基因編碼三 種MUnci8同功異型物（is〇f〇rms) :Muncl8a、b或 c之一， 較佳為Muncl8c(SEQ ID NO: 39)。 4·如明求項1或2之方法，其中步驟a)中之一個基因編碼 Sly-1(SEQ ID NO: 41)。 奢求項1或2之方法，其中步驟a)包含增加至少兩個編 碼SM-蛋白質之基因的表現，其中該等sm蛋白質係涉及 小/包運輸之兩個不同步驟。 6.如請求項5之方法，其中： a)個基因編碼一種調節小泡與細胞膜融合的SM蛋白 質， )第基因、編瑪一種調節小泡與高爾基複合體融合的SM 蛋白質。 如"月求項5之方法’其中Muncl8c(SEQ m N〇: 39)及Sly 聊QIDNo:41)之表現增加。 136226.doc 200932907 8.如凊求項丨或2之方法，其中步驟約包含： 1)增加編碼該SM蛋白質家族之一個成員的第一基因之表 現， π)增加編碼該SM蛋白質家族之另一成員的第二基因之表 現，及 出）增加編碼XBP-1之第三基因的表現。 9·如凊求項8之方法，其中Munci8c(sEQ id 1(SEQ ID NO: 41)及XBP_1(seq ID no: 43)之表現增 加。 1〇· —種細胞工程化之方法，其包含： a) 將或多種包含編碼至少兩種多肽之核酸序列的載體 系統引入細胞中，其中 I) 至少一種第一核酸序列編碼SM蛋白質，及 II) 第二核酸序列編碼所關注之蛋白質， b) 表現該所關注之蛋白質及該至少一種SM-蛋白質。 ❿11.如凊求項10之方法，其中該SM蛋自質為Munc l8同功異 型物之一，較佳ID NO: 39)，4Sly-1(SEQ ID NO: 41) 〇 •丨2·如請求㈣之方法，其中在步驟训中組合使用兩種咖_ f白f ’其中該等SM蛋自質涉及小泡運輸之兩個不同步 驟。 13·如請求項12之方法，其中： a)'—個基因編 — Λφ -im 4Λ· . 'A-t Ota /, l. 禋調Sp小泡與細胞膜融合的SM蛋白 質， 136226.doc 200932907 b)第二基因編碼一種調節小泡與高爾基複合體融合&SM 蛋白質。 14. 如請求項13之方法，其中組合使用之該兩種SM蛋白質 為 Munc-i8c(SEQ ID N〇: 39)&sly_1(SEQ ID N〇: 41)。 15. 如❺求項i〇或12之方法，其中在步驟a)i)中兩種SM蛋白 質與XBP-1組合使用。 .-I6.如請求項μ之方法，其中該等SM蛋白質為Munc_18c (SEQ ID NO. 39)及 Sly-1(SEQ ID NO: 41)與 XBp_i(SEQ ❹ ID NO: 43)組合。 17. 如請求項卜2及10至14中任一項之方法，其中該細胞為 真核生物細胞，較佳為脊椎動物細胞，最佳為哺乳動物 細胞。 18. 如請求項卜2及1()至14中任—項之方法，其中該所關注 之蛋白質為治療用蛋白質。 A如請求項18之方法，其中該所關注之蛋白質為抗體或抗 體片段。 0 2〇, 一種表現載體，其包含編碼至少兩種多肽之表現單元， 其中 a) 至少一種多肽為sm-蛋白質，及 b) 第二多肽為所關注之蛋白質。 •如請求項20之表現載體，其中該所關注之蛋白質為治療 用蛋白質’較佳為抗體或抗體片段。 22.如請求項20或21之表現載體’其中該等表現單元為多順 反子，較佳為雙順反子。 136226.doc 200932907 23. 如請求項2〇或21之表現載體’其中該sm—蛋白質為 18同功異型物：MUnc-18 a、b、c之一，較佳為厘⑽卜 18c(SEQ ID NO: 39)。 24. 如請求項20或21之表現載體，其中該SM_蛋白質為8卜_ 1(SEQ ID NO: 41)。 25. 如請求項20或21之表現载體，其中組合使用至少兩種 , SM-蛋白質。 26. 如請求項25之表現載體，其中該載體包含至少一個配置 Φ 如下之雙順反子表現單元： a) —個編碼SM蛋白質之基因， b) —個IRES元件及 c) 編碼SM蛋白質之第二基因。 27. 如請求項20或21之表現載體，其中至少兩種81^_蛋白質 與XBP-1組合使用’較佳為Munc-18c(SEQ ID NO: 39)及 Sly-1(SEQ ID NO: 41)與 XBP-1(SEQ ID NO: 43)組合。 28. 一種細胞，其表現至少兩種異源基因： a)至少一種編碼SM-蛋白質之基因，及 . b)另一編碼所關注之蛋白質的基因。 : 29.如請求項28之細胞’其中該所關注之蛋白質為治療用蛋 . 白質，較佳為抗體或抗體片段。 30. 如請求項28或29之細胞，其中該8^4蛋白質之表現量顯著 高於内源量，較佳1 〇〇/〇。 31. 如請求項28或29之細胞，其包含如請求項20至27中任一 項之表現載體。 136226.doc 200932907 32. 如請求項28或29之細胞，其中該細胞為真核生物細胞， 較佳為脊椎動物細胞，最佳為哺乳動物細胞。 33. 如請求項32之細胞，其中該細胞為CHO細胞，較佳為 CHO DG44細胞。 34. —種所關注之蛋白質，其較佳為藉由如請求項1至a中 任一項之方法所產生之抗體。 -· 35· 一種醫藥組合物’其包含一種適用於阻斷或降低一或多 種SM-蛋白質之活性或表現的化合物，及醫藥學上可接 〇 受之載劑。 36. 如請求項35之醫藥組合物，其中該化合物為聚核苷酸序 列。 37. 如請求項36之醫藥組合物，其中該聚核苷酸序列為 shRNA、RNAi、siRNA或反義 _RNA，較佳為 shRNA。 38·如請求項35至37中任一項之醫藥組合物，其中該SM_蛋 白質為 Munc-18c(SEQ ID NO: 39)或 Sly-1(SEQ ID NO·· 41)或該兩者之組合。 ® 39. —種識別SM-蛋白質功能調節劑的方法，其包含： a) 提供至少一種SM·蛋白質，較佳為Μι^·ΐ8ε， b) 使步驟a)之該SM_蛋白質與測試劑接觸， . c)測定增加或減少蛋白質分泌或細胞表面蛋白質之表現 相關之影響。 40. -種如請求項35至38中任_項之醫藥組合物的用途，其 係用於製造治療有此需要之患者的癌症、自體免疫疾病 及炎症之藥物。 136226.doc 200932907 41. 一種如請求項35至38中任—項之醫藥組合物的用途，其 係用於製造抑制或降低細胞之增殖或遷移的藥物。 42. —種SM·蛋白質或編碼SM-蛋白質之聚核苷酸在活體外 細胞或組織培養系統中增加所關注之蛋白質之分泌及/或 產生的用途。 e ❹ 43. 如請求項1、2及10至14中任― 44. 如請求項20或21之表現載體， 45. 如請求項28或29之細胞，其用 項之方法， 其用於診斷 其用於診斷
    46.如請求項35至37中任一項之醫藥 組合物，其用 於珍斷。 136226.doc
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