TW200902054A

TW200902054A - Novel method and compostions

Info

Publication number: TW200902054A
Application number: TW097107216A
Authority: TW
Inventors: Gerald Hermann Voss
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2009-01-16
Also published as: SI2137210T1; MX2009009342A; WO2008107370A1; CY1118372T1; JP6110347B2; JP2010520177A; EP2998316B1; JP2015028031A; JP2016014023A; CN101675068A; EP2137210A1; KR20100015379A; CA2679410A1; HRP20161606T1; CA2896131A1; SG194360A1; PL2137210T3; KR101532062B1; AU2008223951A1; CN105106971A

Description

200902054 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於新穎疫苗組合物及其在刺激哺乳動物（尤其是人類）免疫反應中且具體而言在預防及治療由病原體引發之感染中的用途。具體而言，本發明係關於無需依靠複雜的初免-加強方案即能夠誘導受試者CD4+& τ細胞反應以及抗體反應之組合物。【先前技術】自19世紀末期開始，滅活完全有機體已用於成功地接種疫苗。最近，已採用涉及提取物、亞單位、類毒素及莢臈多糖投藥之疫苗。由於基因工程技術係可利用的，因此重組蛋白使用已成為較佳策略，其可消除許多與天然純化蛋白使用相關之風險。早期疫苗方法係基於投與可在活體内刺激某一免疫反應之蛋白。隨後，人們認識到：亦可藉由投與〇1^八來提高免疫反應，該DNA應能夠藉由宿主轉錄及轉譯至免疫原性蛋白中。哺乳動物免疫反應主要有兩種：體液反應及細胞介導反應。體液反應涉及循環抗體產生，該等循環抗體可結合對 /、/、有特異性之抗原，藉此中和該抗原並有利於其後續清除，該清除係藉由涉及其他細胞毒性細胞或吞噬細胞之過程來達成。B細胞負責產生抗體（血漿b細胞）以及維持免疫體液記憶（記憶B細胞），即，能夠在首次暴露（例如，藉由接種疫苗）於抗原多年後識別該抗原。細胞介導之反應涉 129296.doc 200902054 及許多不同細胞類別之相互影響，其中包括τ細胞。τ細胞可分成許多不同的亞類，主要為CD4+及Cd8+ Τ細胞。諸如巨噬細胞及樹突狀細胞等抗原呈遞細胞（APC)擔當免疫系統之哺兵，篩選外來抗原實體。當藉由APC檢測細胞外外來抗原時，此等抗原在該APC内部被吞噬（吞沒），在§亥APC中此等抗原被處理成更小的肽。此等肽隨後呈遞於在APC表面上之主要Π類組織相容性複合物（MHC η)分子上，在此處該等肽可被表現CD4表面分子之抗原特異性 T淋巴細胞（CD4+ T細胞）識別。當CD4+ T細胞在MHCII分子上於額外充足協同刺激信號存在下識別對其具有特異性之抗原時，該等CD4+ T細胞被激活且分泌大量細胞因子，該等細胞因子隨後可激活免疫系統之其他分支。概言之’視在抗原識別後CD4+ T細胞所產生反應類別而定，可將CD4+ T細胞劃分成T辅助細胞1 (Thl)或T輔助細胞2 (Th2)亞類。在識別肽-MHC „複合物後，Thl cd4+ τ細胞分泌介白素及細胞因子（例如，干擾素γ)，進而活化巨噬細胞以釋放諸如一氧化氮及活性氧/氮物質等毒性化學物質。IL-2及TNF-α亦經常歸類為Thl細胞因子。相反，Th2 CD4+ T細胞通常分泌諸如IL_4、江_5或IL_n等介白素。 T輔助細胞CD4+ T細胞之其他功能包括幫助激活B細胞以產生及釋放抗體。該等T輔助細胞CD4+ T細胞亦可參與抗原特異性CD8+ T細胞（除CD4+ T細胞外之另一主要丁細胞亞類）的活化。 CD8+ T細胞藉由主要！類組織相容性（MHC I)分子於適去 129296.doc 200902054 協同刺激信號存在下識別當呈遞於宿主細胞表面上時對其具有特異性之肽。為了呈遞於MHC I分子上，外來抗原需要直接到達該細胞内部（細胞溶質或細胞核），例如，當病毒或胞内細菌直接滲入宿主細胞時或在DNA疫苗接種之後，情況即是如此。在細胞内部，該抗原被處理成若干會被載至MHC I分子上之小肽並使之改道到達該細胞表面。當激活時，CD8+ T細胞分泌大量細胞因子，例如，可激活巨兔細胞及其他細胞之干擾素γ。具體而言，—亞類別之此等CD8+ Τ細胞在激活時分泌溶解及細胞毒性分子（例如，粒酶、穿孔蛋白）。此等CD8+ Τ細胞稱作細胞毒性丁細胞。最近’已闡述涉及細胞外抗原或其片段載至MHCI複合物上之另一抗原遞呈途徑並將其稱為”交又遞呈"。丁細胞反應之特性亦受在疫苗中所用佐劑之組成的影響。舉例而言，含有MPL及QS21之佐劑已顯示可激活Thi CD4+ T細胞以分泌ΙΡΝ_γ (st_rt等人，2〇〇6, μ (42-43):6483-92)。然而，衆所周知，佐劑在增強對蛋白抗原免疫反應方面頗/、彳貝值，因此，其通常不與DNA或基於dna之載體疫苗接種聯合使用。關於佐劑為何不與基於DNa_載體之聯合使用的解釋有若千假今。眘π μ a右r攸叹實際上’邊佐劑與該载體間之相互干擾可影響其穩定性。另彳，人們可能預計向減毒載體中添加佐劑可增加由此產物引發的致反應力。最後帑曰加基於DNA-載體之疫苗的免疫原性可促進中和抵抗栽 129296.doc 200902054 體自身之免疫反應，進而排除任一需要該基於載體之疫苗後續注射的加強作用。實際上，在針對預防惡性瘧原蟲 (尸感染之接種疫苗方案中，J〇nes等人（2〇〇1，了 Infect Diseases 183, 3〇3_312)曾報導在dna初免後組合使用NA重、'且蛋白及佐劑作為加強組合物之後出現不良結果。在其中加強組合物僅含有蛋白及佐劑之組中，寄生蟲血症之嚴重程度的確明顯降低。斷定在此方案中使用 DNA、重組蛋白及佐劑之組合會對寄生蟲血症治療結果以及抗體反應產生不良影響。另一方面，有關於增強佐劑化基於DNA之載體疫苗之功 ^^^^(Ganne# A Vaccine (1994) 12(13) 1 190-1 196) 〇具體而言，藉由添加油質佐劑增強複製缺陷型腺病毒-介導之疫苗的功效係與較高抗體水平相關但尚未報導對cd4 及CD8 T細胞反應的影響。無致病力病毒作為佐劑之用途已揭示於W02007/016715 中。未提及該病毒可含有任一異源聚核苦酸。人們通常認為為了獲得最佳保護性免疫需要刺激C D 4 + 及CD8 +細胞一者，尤其在諸如HIV感染等某些疾病中。為了以預防或治療方式誘導最佳免疫反應，需要刺激 CD4 +及CD8 +細胞二者。此係”初免-加強"接種疫苗策略之一個主要目標’其中交替投與基於蛋白之疫苗（主要誘導 CD4+ 丁細胞）與基於職-載體之疫苗（即，裸露d叫、病毒載體或諸如利斯特氏菌屬（listeria)等胞内細菌载體（主要誘導CD8+ T細胞）或反之亦然最有可能激活CD4 +及CD8+ τ 129296.doc 200902054 細胞反應。然而，儘管初免-加強疫苗策略通常可提高至更大或更為平衡反應，但需要接種疫苗一次以上及（確定地）兩次以上，此會造成麻煩或甚至不可行，尤其是在發展世界中所用群體免疫程序中。進而σ之，如上文所述，經常不可能加強病毒載體組伤’此乃因可抵抗載體自身之免疫性提高。因此，本發明之目標包括—個或多個下列目標：⑷提供一種可刺激CD4+及/或CD8+細胞及/或抗體生成且具體而言可消除或減少重複免疫需要之完全疫苗接種方案或疫苗組合物；（b)提供一種相對於只含有免疫原味多狀或只含有聚核苷酸之疫苗組合物或相對於涉及分開投與免疫原性多肽及聚核芽酸之習知初免·加強方案可更佳地刺激cd4+細胞及/或CD8 +細胞及/或抗體生成的疫苗接種方案及疫苗組勿（c)k t、種刺激或更佳地刺激Th 1反應之疫苗組合物i⑷提供-種其令最小化所需若干組份（具體而言，係病毋·）生載體）之劑量的疫苗組合物及疫苗接種方案；及（e) 更叙而σ，提供一種用於治療或預防由病原體造成疾病之有用的疫苗組合物及疫苗接種方案。"更佳地刺激，，意指增強反應之強度及/或持久性。【發明内容】因此’依照本發明，提供一種提高抵抗病原、體之免疫反應的方法，遠方法包括投與⑴一種或多種衍生自該病原體之第一免疫原性多肽；（ii) 一種或多種腺病毒載體，其包 129296.doc 200902054 括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽之異源聚核苷酸；及（iii)佐劑；其中該一種或多種第一免疫原性多肽、該一種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與。依照本發明之具體態樣，提供一種包含下列之疫苗組合物：（i) 一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽； (u)種或多種腺病毒載體，其包括一種或多種編碼一種或夕種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（iii)一種佐劑。亦提供一種包含下列之免疫原性組合物：（i) 一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽；（ii) 一種或多種腺病毒載體’其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（iii)佐劑。該等疫苗及免疫原性組合物可適當地刺激病原體特異性 CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞及/或抗體生成。 ”病原體特異性CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞及/或抗體” 意指可特異性地識別整個病原體或其一部分（例如，免疫原性亞單位）之CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞及/或抗體。 "特異性地識別π意指該CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞及/或抗體可以免疫特異性方式而不是非特異性方式識別該病原體（或其部分）。亦提供一種刺激哺乳動物免疫反應之方法，其包括對受試者投與免疫學上有效量之此組合物。亦提供此組合物在製備用於刺激哺乳動物免疫反應之藥 129296.doc -10- 200902054 物中的用途。亦提供用於刺激哺乳動物免疫反應之此組合物。亦提供—種刺激哺乳動物生成病原體特異性CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞及/或抗體之方法，其包括對該哺乳動物投與（1)一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽； (π)—種或多種腺病毒載體，其包括一種或多種編碼一種或夕種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（Hi)佐劑；其中該一種或多種第一免疫原性多肽、該一種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與，例如，藉由投與免疫學上有效量之上述組合物。亦知:供上述組合物在製備用於刺激哺乳動物生成病原體特異性CD4+及/或CD8 +細胞及/或抗體之藥物中的用途。例如’刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞或抗體生成。適且地’刺激2種且尤其是3種CD4+ T細胞及/或CD8+ T 細胞及/或抗體生成。適宜地，刺激CD8+ T細胞生成。適宜地，刺激cD4 +及 CD8+ T細胞生成。適宜地，刺激CD4 +及CD8+ τ細胞及抗體生成。或者，適宜地’刺激CD4+ T細胞生成。適宜地，刺激 CD4 +及抗體生成。或者適宜地’刺激抗體生成。適宜地，本發明之方法欲提供足以實現用於提高免疫反應之完全方法的步驟（儘管若需要可重複該方法）。因此，適宜地’該等方法並不涉及使用初免劑量之任一免疫原性 129296.doc 200902054 多肽或編碼任一免疫原性多肽之聚核苷酸（例如，呈諸如腺病毒載體等載體形式）。舉例而言，提供一種提高抵抗病原體之免疫反應的方法’其係由下列構成：⑷投與⑴—種或多種衍生自該病原體之第一免疫原性多肽；（ii)一種或多種腺病毒載體，其包括-種或多種編碼—種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及(iii)佐劑；其中該一種或多種免疫原性多肽、該—種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與；及（b)視情況重複步驟（a)。倘若重複可產生改良免疫反應，料錢該方法之步驟 (例如，重複一次）。無需重複即可獲得足夠反應，至少就 τ細胞反應而言。亦提供-種提高抵抗病原體之免疫反應的方法，其包括 ⑻投與⑴-種或多種衍生自該病原體之第—免疫原性多肽；⑴)-種或多種腺病毒载體’其包括一種或多種編碼 \ 種或夕種何生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苦^，及（U1)佐劑；纟中該—種或多種第—免疫原性多肽《亥#或夕種腺病4載體及該佐劑係伴隨投與；且其中該方法不涉及投與任1刀免劑量之免疫原性多肽或編碼免疫原性多肽之聚核苷酸。亦提供-種套組，其包括⑴—種或多種衍生自病原體之二-免疫原性多肽；(ii)一種或多種腺病毒載體，其包括

種或夕種編碼一種表多種;千A 裡次夕禋何生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苦酸；及㈣佐劑；且具體而言包括⑴ 129296.doc 200902054 一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽及佐劑；及 Ο) —種或多種第二腺病毒載體，其包括一種或多種編碼種或多種衍生自該病原體之免疫原性多肽的異源聚核苷酸；該套組用於本發明之方法。本心明之組合物及方法可用於預防初次接受試驗之受試者由病原體引發之感染，或預防先前受病原體感染之受試者重複感染或治療受病原體感染之受試者。【實施方式】 / ί._ 本文所用術語|，伴隨"意指其中該一種或多種免疫原性多肽該種或多種腺病毒載體及該佐劑在不超過12小時時 1内（例如在不超過1小時時間内），通常在某個時機（例如’在—次拜訪健康專業人員之過程中）投與，舉例而言，該一種或多種免疫原性多肽、該—種或多種腺病毒載體及該佐劑係相繼或同時投與。本文所用術語”抗原決定部位”係指免疫原㈣基酸序列抗原决疋部位可指通常具有6_8個胺基酸之最小胺基酸序列，該最小序列在自直自缺 t 』牡目八自然狀恶移除時具有免疫原性’例如’當移植到異源性多肽中時。抗原決㈣位亦可指具有免疫原性之蛋白部分，其中含有抗原決^部位之多肽祕原(或時常稱為”多肽抗原，，)。多肽或抗原可含有一個或多個（例如，2個或3個或更多人 X文夕個）戴然不同的抗原決疋部位。術語"抗原決定部位” 成盖B細胞及τ細胞抗原決定邛位。術語”Τ細胞抗原決定部位 ^ Α 证/函盍Τ細胞抗原決疋4位及CD8+ Τ細胞抗原決定部 ' I位（有時亦稱作CTL抗原 129296.doc -13- 200902054 決定部位）。 , 免疫原性多肽”係指具有免疫原性（亦即，其能夠在 ::動物中引起免疫反應)且因此含有-個或多個抗原決定卩位（例如，τ細胞及/或B細胞抗原決定部位）之多肽。免疫原性多肽可含有—種或多種多肽抗原，例如，在諸如融合蛋白等非天然排列中。免疫原’!·生多肽通常可為藉由（例如）在諸如細菌宿主、酵母菌或經培養哺乳動物細胞等異源宿主中表現產生的重組蛋白。術°°衍生自病原體之多肽’’意指部分或全部含有天然存在於病原體中之序列或具有與該序列高度一致（例如，在至少10個，例如，至少20個胺基酸區段内有95%以上一致性）之序列的多肽（即，抗原）。免疫原性多肽可含有一個或多個（例如，丨、2、3或4個）多狀抗原。除非另有說明，否則"免疫反應，，可為細胞反應及/或體液反應。在一個本發明之實施例中，該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種實質上與該一種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種相同。舉例而言，該至少一種第一免疫原性多肽中的一種及該至少一種第二免疫原性多敗中的種在一種或其他免疫原性多肽之長度範圍内具有90%或以上（例如，95%或以上，例如，98%或99。/。或以上）之總體序列一致性。 129296.doc -14- 200902054 在本發明之另一實施例中，該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種含有至少一種與在該一種或多種第二免疫原性多肽之一種或多種中所含抗原實質上相同的抗原。舉例而言，該至少一種第一免疫原性多肽中的一種及 S亥至少—種第二免疫原性多肽中的一種在20個或更多個胺基酸（例如，40個或更多個胺基酸，例如，6〇個或更多個胺基酸）之區段内具有9〇%或以上（例如，95%或以上，例如’ 98❶/。或99%或以上）之總體序列一致性。適宜地’一種或多種第一免疫原性多肽包括至少一個τ 細胞抗原決定部位。適宜地，一種或多種第二免疫原性多肽包括至少一個T 細胞抗原決定部位。適且地，該一種或多種第一免疫原性多肽包括至少一個 B細胞抗原決定部位。適宜地，該一種或多種第二免疫原性多肽包括至少一個 B細胞抗原決定部位。在本發明之另一實施例中，該一種或多種第一免疫原性夕肽中的一種或多種及該一種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種共享一個或多個等同B細胞及/或τ細胞抗原决定。卩位。適且地，該等共享一個或多個長度為1 〇個或更多個胺基酸（例如，15個或更多個胺基酸，例如，Μ個或更多個胺基酸）之等同胺基酸序列。在本發明之另-實施例中，該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種實質均不同於或不含有任一與該一種 129296.doc •15- 200902054 或多種第二免疫原性多肽之一種或多種相同的抗原，舉例而言，其在20個或更多個胺基酸（例如，40個或更多個胺基酸，例如，60個或更多個胺基酸）之區段内具有小於90% 之總體序列-致性。因此，該等不可共享任一 B細胞或T細胞抗原決定部位。舉例而言，該等不可共享長度為丨〇個或更多個胺基酸 (例如’ 1 5個或更多個胺基酸，例如，25個或更多個胺基酸）之任一等同胺基酸序列。 /

在一個本發明之具體實施例中，第一免疫原性多肽及第二免疫原性多肽在相同排列或不同排列中（例如，在不同排列中）含有相同抗原。”不同排列，，意指其可以不同順序排列及/或其可分開。在本發明之另一具體實施例中，第一免疫原性多肽及第二免疫原性多肽係相同的。本發明之組合物可含有—種第—免疫原性多肽作為該組合物之唯-免疫原性多肽。或者，本發明之組合物可含有種以上第-免疫原性多肽，例如，2種或3種或4種或更多種免疫原性多肽。本發明之組合物可包括一種腺病毒载體。或者’其可包括-種以上腺病毒载體，例如’ 2種腺病毒載體。在本發明之組合物中，主 _ , . ^ ^ ^ 腺病t载體可包括一編碼一種第一免疫原性多肽之異源聚核口又4考其可包括一種以上在一個以上啓動子控制下一卜起編碼一種以上第二疫斤性多肽之異源聚核n 免及京性多本發明之組合物亦可用而且對於預防性疫苗接種而言 129296.doc -16· 200902054 於已經感染病原體之個體並對確立感染產生改良免疫控制。當該病原體係HIV時，情況尤其如此。在Ηιν,=开j 中’據信，此控制可藉由特異性地識別mv感染細胞之 CD8-陽性Τ細胞來達成。此CD8_陽性丁細胞反應可藉由 ϊπν特異性CD4_陽性輔助細胞τ細胞之存在來維持。3因此’兩種免疫反應誘導係特別有用的且可藉由組合不同疫苗組合物來達成。佐劑化蛋白與重組腺病毒之組合特別：加·可又jnj•於上述疫苗接種之感染HIV的患者在接種疫苗時可處於聰感染之初步感染、潛伏期或末期。該等患者在接種疫苗時可以或者可未經抵抗病原體之其他治療介入 (在HIV情形中-例如’高效抗逆轉錄病毒療法）。抗原朴用於本發明之抗原衍生自病原體。病原體包括病毒、細 "原生動物及其他對哺乳動物（包括人）有害的寄生有機

擬作為多肽或編碼本發明多肽之聚核苦酸投與的適宜多肽抗原包括衍生自下列之抗原：卿（例如，聊介人如，、一，、心饵、卿或 /、何生物或即刻早期蛋白，例如，來自咖或簡之 1 二、二Ο,4、·6)、巨細胞病毒(尤其是人類〜病母，例如，gB或其衍生物)、愛潑斯坦巴爾病毒 (/:主“〜us)(例如，⑽或其衍生物）、格帶狀

心肝丙5例如，gpl、Π、111及1E63)、或肝炎病毒（例如，肝火病毒（例如，B型肝炎表面抗原、、PreSi、preS2A 129296.doc .17- 200902054 表面包膜蛋白、B型肝炎核心抗原或ρ〇ι)、c型肝炎病毒 (例如，核心 El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、 NS5 A及B)及E型肝炎病毒抗原）或其他病毒病原體（例如，副黏病毒（paramyxoviruses):呼吸道合胞病毒（例如，ρ及 G蛋白或其衍生物））；或來自下列之抗原：副流行性感冒病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、人類乳頭瘤病毒 (例如，HPV6、11、16、18，如 LI、L2、El、E2、E3、 E4、E5、E6、E7)、黃病毒（例如，黃熱病病毒、登革熱病毒（Dengue Virus)、蜱傳腦炎病毒（Tick_borne encephamis virus)、日本腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus))或流行性感冒病毒（例如，血凝素、核蛋白、ΝΑ、或μ蛋白咬其組合）；或衍生自細菌病原體之抗原，例如，奈瑟菌屬 (iVdwerk 包括***（从心幻及腦膜炎雙球菌（见出&)，例如，轉鐵蛋白結合蛋白、乳鐵傳遞蛋白結合蛋白、PilC、黏附素）；膿鏈球（例如’ Μ蛋白或其片段、C5A蛋白酶、無乳鏈球菌（s. 、變形鏈球菌•則μ似）；杜克氏嗜血桿菌⑷ i/werep);莫拉菌屬（Μοπχ6//β πρ)，包括卡他莫拉菌（从加—⑷，亦稱作卡他布蘭漢球菌⑺脱… catarrhalis)(例如，高及低分子量黏附素及侵染素）；博德氏桿菌πρ)，包括百曰咳博德氏桿菌^ periwww)(例如，百曰咳桿菌黏附素（pertactin)、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛）、副百曰咳鏈球菌（Β. ρπαρπί似…）及支氣管敗血鮑特氏菌 129296.doc -18- 200902054 br〇nchiSeptica)，，分故桿菌屣（Mycobacterium s卯钆括結核分枝桿菌（Μ、牛型分枝桿菌（M办〇心）、麻風分枝桿菌（Μ· /印rae)、鳥型分枝桿菌（M aW_)、副結核分枝桿菌（Μ. ρπα仏仏）、齒垢分枝桿菌（从沿）；軍團菌屬（Z^z•⑽,//β ,沖），包括嗜肺軍團菌 (L. pneumophUa).’ 埃希氏 nM(£scherichia《㈣包括陽毒素大腸桿菌（eWW〇Xifc五⑺/ζ·)(例如，定居因子、不耐熱毒素或其衍生物、耐熱毒素或其衍生物）、腸出血性大腸桿菌、腸道病原性大腸桿菌（例如，志贺毒素樣毒素 (shiga t〇Xin-like toxin)或其衍生物）；弧 g 屬（m.〇卿），包括霍亂弧菌（K (例如，霍亂毒素或其衍生物）； w 氏桿菌屬（S/nge/Za spp) ’包括宋内氏志賀桿菌（s 50«似z)、jT乳志賀氏桿菌（s办“价⑺·邮）、福氏志贺氏桿菌GS. //以似〜·）；耶爾森氏菌屬（rer>w>n.a ，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌（F_ enteroc〇ntica)(例如，γ〇ρ蛋白）、鼠疫耶爾森氏菌（7. ρ如⑷、假結核耶爾森氏菌（广 pSeud〇tubercul〇sis、，，彎龟椁 nM(Campyl〇bacter 邛的包括空腸彎曲桿菌(C»m’)(例如，毒素、黏附素及侵染素) 及大腸彎曲桿菌（C, co/〇 ;沙門氏菌屬（〜〜，包括傷寒沙門氏菌（S.抑叫、副傷寒沙門氏菌^ 、豬霍亂沙門氏菌（& c/j〇/erflew⑷、腸炎沙門氏菌（=· e«ierzizt/^) ’利斯特氏菌屬，包括單核細胞增生利斯特菌（L.；螺旋桿菌屬（价…〇6⑽以 πρ)’包括幽門螺旋桿菌（汉pyl〇ri)(例如，脲酶、過氧化 129296.doc -19- 200902054 氣s#、工泡素）’假早胞囷屬，包括銅綠假單胞菌（Ρ. απ叹h〇lSa);葡萄球菌屬（&即知/〇c〇cc似印/7.)’包括金頁色葡甸球_(S. awrews)、表皮葡萄球菌（$ epiderniidis)，腸 ϊ表桌屬（Enterococcus spp.)，包括翼腸球囷（五· /aeca/b)、原腸球菌（_E. yaecz•謂）；梭狀芽孢桿菌屬 (C/oWW心謂βρ·)，包括破傷風梭狀芽孢桿菌（c. tetani)(例如’破傷風毒素及其衍生物）、肉毒梭狀芽孢桿菌（c όοίΜ/kwm)(例如，肉毒毒素及其衍生物）、難辨梭狀芽孢桿菌（C. (例如，梭狀芽孢桿菌毒素a或b及其衍生物）’芽胞才干鹵屬，包括炭疽芽孢桿菌（忍· ««i/zrac/OC例如，肉毒毒素及其衍生物）；棒桿菌屬 (C^>w化你η.臟柳?‘），包括白喉棒桿菌（c A>/2i/zerke)(例如’白喉毒素及其衍生物）；疏螺旋體屬（5〇rr以·α πρ.)，包括布氏疏螺旋體（5. Awrgc/or/'er/)(例如，〇spA、OspC、 DbpA、DbpB)、嘎氏疏螺旋體（5.•以例如，〇spA、 OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體（凡你e"/)(例如， OspA、OspC、DbpA、DbpB)、安氏疏螺旋體（方 ⑽(例如，〇spA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋體（5. 埃裏希氏體屬（五^户），包括馬埃裏希氏體（£.叫ιπ_)及人粒細胞埃裏希氏體病（Human Granulocytic Ehrlichiosis)之病因；立克次氏體屬⑻·c/te"心 MP) ’包括立氏立克次氏體（i?. WcA：ei/W/);衣原體屬，包括沙眼衣原體（C.加咖臟沿）、肺炎衣原體p脑綱、鶴鵡熱衣原體（C. psittaci) ·，鈎端螺旋體屬（Lepi〇spira 129296.doc -20- 200902054 哪），包括問號钩端螺旋體（z⑽㈣叫；密螺旋體屬 (π印〇加則包括蒼白密螺旋體（Γ （例如，稀有外膜蛋白）、齒垢密螺旋體（Γ.細―⑷、豬病疾密螺旋體σ· ;或衍生自寄生蟲，例如，瘧疾原蟲屬，包括惡性癔原蟲及間曰瘧原蟲（户 vzvflx)，弓形蟲屬（Γ〇χο/?/α_β )，包括鼠弓形蟲客仍扣）（例如，、WG3、巧叫；内阿米巴屬 (五…謂⑼〜spp.)，包括溶組織内阿米巴（五心·价勻；巴貝蟲屬πΡ·)，包括果氏巴貝蟲（反wi.cr〇⑴；錐蟲屬（7>沖㈣⑽〇maiSpp·)，包括克魯斯錐蟲（r crwW);賈第蟲屬（Gkr山·α ，包括蘭伯賈第蟲（G /謂⑽α);利什曼原蟲屬（/eb/zwam’a sp/?·)，包括碩大利什曼原蟲& major);肺囊蟲屬?；?；?.)，包括卡氏肺囊蟲 (•P. carim·/)，毛滴蟲屬（TWc/zomcma·? spp.)，包括***毛滴蟲（Γ. vagha/i·*?);血吸蟲屬（Schisostoma 印;?·），包括曼森血吸蟲（S. ma/^c>m_);或衍生自酵母菌，例如，念珠菌屬 (Ci3(«i/z‘<ia spp.)，包括白色念珠菌（C. a/hca如）；隱球菌屬 (Οχρ/ococcw·? πρ.)，包括新型隱球菌（C. weo/ormaw)。其他細菌抗原包括衍生自鏈球菌屬（*Sirepi〇c〇ccz^ VP)(包括肺炎鏈球菌（s·夕加謂〇⑴·μ))之抗原（PsaA、 PspA、鏈球菌溶血素、膽鹼-結合蛋白）及蛋白抗原肺炎球菌溶血素（Biochem Biophys Acta, 1989，67，1〇〇7 ; Rubins 等人，Microbial Pathogenesis, 25，337-342)及其突變體脫毒衍生物（WO 90/06951 ; WO 99/03884)。其他細菌抗原包 129296.doc -21 - 200902054 括衍生自嗜血桿菌屬αρ.)之抗原，該等嗜血桿菌包括B型流感嗜血桿菌（//. 5)(例如， PRP及其偶聯物）、非定型流感喷血桿菌〇cm //. (例如，OMP26);高分子量黏附素、P5、P6、蛋白D及脂蛋白D、及絲束蛋白和絲束蛋白衍生肽（US 5,843,464)或多次複製變型體或其融合蛋白。具體而言，本發明之方法或組合物可用於預防或治療病毒性病症，例如，彼等由B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒（HIV)或單純皰疹病毒引起者；細菌性疾病，例如，彼等由結核分枝桿菌 iwftercw/oibMTB)或衣原體屬引起者；及原生動物感染，例如，癔疾。應認識到：此等特定病態、病原體及抗原僅作為實例提及且並非意欲限制本發明之範圍。 TB抗原該病原體可為（例如）結核分枝桿菌 tuberculosis) ° 衍生自結核分枝桿菌之例示性抗原係（例如）α-晶狀體蛋白（HspX)、ΗΒΗΑ、Rvl753、Rv2386、Rv2707、Rv2557、 Rv2558、RPFs: Rv0837c、Rvl 884c、Rv2389c、Rv2450、 Rvl009、aceA (Rv0467)、ESAT6、Tb38-1、Ag85A、-B 或-C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、 HSP70、HSP75、HSP90、PPD 19kDa [Rv3763]、PPD、 38kDa [Rv0934])、PstSl 、 (Rv0932)、SodA (Rv3846)、 129296.doc -22- 200902054

Rv2031c、16kDa、Ral2、TbH9、Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、DPPD、mTCCl、mTCC2、hTCCl (WO 99/51748)及 hTCC2且尤其是 Mtb32a、Ra35、Ral2、 DPV、MSL、MTI、Tb38-1、mTCCl、TbH9 (Mtb39a)、 hTCCl、mTCC2及DPPD。衍生自結核分枝桿菌之抗原亦包括融合蛋白及其變型體，其中至少兩種或（例如）三種結核分枝桿菌多肽融合成較大蛋白。此等融合體可包括下列或由下列構成：Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、 DPV-MTI-MSL、Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)、Ral2-Tbh9-Ra35-Ag85B 及 Ral2-Tbh9-Ra35-mTCC2。可述及特定Ral2-Tbh9-Ra35序列係藉由WO 2006/1 1 7240之SEQ ID No 6以及其中彼序列之Ser 704突變產生除絲胺酸外之殘基（例如，Ala)之變體來界定，且其衍生物納入具有適當長度之N-末端His標記（例如， W02006/117240之SEQIDNo2或4)。亦可參見SEQIDNo 10，其係含有可選起始Μ及可選N-末端His-His標記（在2位及3位）之序列且其中Ala相對野生型Ser在706位發生突變。衣原體抗原該病原體可為（例如）衣原體屬，例如，沙眼衣原體（C trachomatis)。衍生自衣原體屬（例如，沙眼衣原體）之例示性抗原係選自 CT858、CT089、CT875、MOMP、CT622、PmpD、 PmpG及其片段、SWIB及任一該等之免疫原性片段（例如， 129296.doc -23- 200902054

PmpDpd及PmpGpd)及其組合。抗原之較佳組合包括 CT85 8、CT089及CT875。可採用的特定序歹ij及組合闡述於 WO 2006/104890 中。蠢原蟲ί抗原該病原體可為（例如）可造成瘧疾之寄生蟲，例如，瘧原蟲屬，例如，惡性癔原蟲（P /a/c/pafrwm)或間曰癔原蟲（Ρ Wvax) ° 舉例而言，衍生自惡性瘧原蟲之抗原包括環子孢子蛋白 (CS蛋白）、PfEMP-1、Pfs 16抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1及TRAP。可述及特殊雜化抗原係 RTS。RTS係一種雜合蛋白，其實質上包括藉由B型肝炎表面抗原preS2部分之四個胺基酸鏈接至B型肝炎病毒表面 (S)抗原的惡性瘧原蟲環子孢子（CS)蛋白之所有C-末端部分。當在酵母菌中表現時，RTS作為脂蛋白粒子產生，且當RTS與HBV之S抗原共表現時，其產生稱作RTS，S之混合粒子。RTS及RTS,S之結構揭示於WO 93/10152中。TRAP 抗原闡述於WO 90/01496中。其他瘧原蟲抗原包括惡性瘧原蟲 EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、Pf332、 STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、 Pfs48/45、Pfs230及其在其他瘧原蟲屬中之相似物。一個本發明之實施例係一種包含RTS,S或CS蛋白或其片段（例如，RTS, S之CS部分）與一種或多種其他瘧疾抗原之組合的組合物，該（等）瘧疾抗原可選自由G?〗W)MSP-1、MSP-3、AMA-1、Pfs 16、LSA-1或LSA-3組成之群。衍生自間 129296.doc -24- 200902054 曰瘧原蟲之可能抗原包括環子孢子蛋白（cs蛋白）及達菲抗原結合蛋白（Duffy antigen binding pr〇tein)及其免疫原性片 ^又例如’ PvRH (參見，例如，WO 02/12292)。因此，在一個本發明之適宜實施例中，該等第一及第二免疫原性多肽係選自衍生自惡性瘧原蟲及/或間日瘧原蟲之抗原。舉例而s ’該等第—及/或第二免疫原性多肽係選自衍生自惡性瘧原蟲及/或間日瘧原蟲之抗原，其係選自 RTS(例如，作為RTS，S)、環子孢子蛋白、MSp i、 MSP-3、AMA]、LSA]、lsa_3及其免疫原性衍生物或免疫原性片段。可述及的一種具體衍生物係稱作RTS之雜合蛋白，尤其在以稱作RTS,S之混合粒子形式呈遞時。例示性RTS序列示於seq ID No 14中。種例不性惡性癔原蟲CS蛋白衍生抗原示於SEQ ID No 12中。此特殊序列對應於惡性瘧原蟲（3D7菌株）之cSp序列’其亦含有來自7(58菌株（81_1()())之19痛入物。在一個本發明之具體實施例中，第一免疫原性多肽係 RTS，S且第二免疫原性多肽係來自惡性瘧原蟲之cS蛋白或其免疫原性片段。 HPV抗原該病原體可為例如人乳頭瘤病毒。口此用於本發明之抗原可衍生自例如被認為可造成生殖器疣之人乳頭瘤病毒（HPV)(HPV 6或HPV 11及其他）及/ 129296.doc -25- 200902054 或可造成子宮頸癌之HPV病毒（HPV16、HPV18、HPV 33、HPV51、HPV56、HPV31、HPV45、HPV58、HPV52 及其他）。在一個實施例中，生殖器疣預防或治療組合物之形式包括L1粒子或殼粒及包括一種或多種選自HPV蛋白 El、E2、E5、E6、E7、L1及L2之抗原的融合蛋白。在一個實施例中，融合蛋白之形式係：揭示於WO 96/26277中之L2E7及揭示於PCT/EP 98/05285 中之蛋白 D (1/3)-Ε7。較佳HPV子宮頸感染或癌症之預防或治療組合物可包括 HPV 16或18抗原。舉例而言，L1或L2抗原單體、或L1或 L2抗原一起以病毒樣粒子（VLP)提供，或單獨的L1蛋白單獨於VLP或殼粒結構中提供。此等抗原、病毒樣粒子及殼粒本身為已知。參見例如WO 94/00152、WO 94/20137、 WO 94/05792及WO 93/02184。舉例而言，可包括其他早期蛋白，單獨或以融合蛋白，如E7、E2或較佳E5 ;特佳實施例包含一種包括L1E7融合蛋白之VLP (WO 96/1 1272)。在一個實施例中，HPV 16抗原包括早期蛋白 E6或E7與一種蛋白D載體融合，自HPV 16形成蛋白D-E6或 E7融合體’或其組合；或E6或E7與L2之組合（WO 96/26277)。或者’ HPV 16或18早期蛋白E6及E7可以單一分子，較佳蛋白D- E6/E7融合體提供。此組合物可視情況提供HPV 18之E6及E7蛋白之一或兩者，較佳以蛋白D-E6 或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白之形式。另外’可採用其他HPV菌株，較佳菌株HPV 31或33之抗原。 H1V抗原 129296.doc -26- 200902054 該病原體可為例如HIV，如HIV-1。因此，抗原可選自HIV衍生之抗原，特別！Ηΐν-1衍生之抗原。

HiV Tat及Nef蛋白係早期蛋白，亦即，該等蛋白在感染早期且在結構蛋白不存在下表現。

Nef基因編碼一種早期輔助HIV蛋白，該蛋白已顯示具有若干活性。舉例而言，已知Nef蛋白可自細胞表面去除 CD4，HIV受體，儘管此功能之生物學重要性尚有爭論。另外，Nef可與τ細胞之信號路徑交互作用並誘發活性狀態，進而可促進更有效的基因表現。某些HIV分離株在此區域具有突變或缺失，可導致彼等不能編碼功能蛋白且嚴重影響彼等活體内複製及致病機理。該Gag基因自全長RNA轉譯以產生前體聚蛋白，該前體聚蛋白隨後被切割成3_5個衣殼蛋白：基質蛋白pi7、衣殼蛋白 P24及核酸結合蛋白（Fundamental Vir〇i〇gy，

Knipe DM and Howley μ 1996 2. Fields Virology 第 2 卷 1996)。

Gag基因可產生55_千道爾頓（kD)Gag前體蛋白，亦稱為 P55，其係自未拼接的病毒111][〇^八表現。在轉譯期間，p55 之N末端經肉豆蔻醯化，引起其與細胞膜之胞漿方面關聯。該膜關聯Gag多蛋白募集兩份病毒基因組RNa拷貝以及其他病毒與細胞蛋白，以引起病毒粒子自感染細胞表面出芽。在出芽|，p55在病毒成熟過程中藉由該病毒編碼之蛋白酶（Pol基因之產物）切割為四個命名為ma (基質 129296.doc -27- 200902054 [pi7])、CA (衣殼[P24])、NC (核衣殼㈣)及0⑷之較蛋白。除了 3個主要Gag蛋白（P17、P24及P9)以外，所有Gag前體均含有料其他區域，其經切割且作為各種大小之狀留存於病毒粒子中。料蛋白質具有不同作用，例如，_ 白在調節蛋白酶活性中具有期望作用且有助於蛋白水解處理之正確定時。 MA夕肽衍生自p552N_末端（肉豆蔻醯化終端）。大部分 MA分子保持對病毒粒子脂質雙層内表面之吸附，以穩定 4粒子。MA子集募集在病毒粒子深層内冑，在此處其成 ^護送病毒DNA到達細胞核之複合物的—部分。此等Μ 分：有利於病毒基因組之核轉運，因為MA上之親核信號係藉由細胞核輸入機制來識別。此現象容許感染未分裂細胞，此係逆轉錄病毒之一種與衆不同的性質。

P24(CA)蛋白形成病毒粒子之錐形核心。環孢素a經證明可與導致其納人HIV粒子中的p55之p24區域交互作用: 叫與環孢素A間之交互作用十分重要，因為環孢素a對該交互作用之破壞可抑制病毒複製。上Gag之NC區域負責特異性地識別mv之所謂包裝信號。該包裝信號係由四個靠近病毒RNA 51終端之莖環結構構成且足以介導異源RNA納入HIV-1病毒粒子中。Nc藉由兩個辞指基元介導之交互作用結合至㈣信號。NC純進逆轉錄。 P6多肽區域可介導？55 Gag與輔助蛋白vpr間之交互作 129296.d〇i -28- 200902054 用，此可導致Vpr納入正裝配之病毒粒子中。p6區域亦含有對自感染細胞有效釋放出芽病毒粒子所需所謂晚期結構域。

Pol基因編碼三種具有病毒在早期感染中所需活性之蛋白，即逆轉錄酶RT、蛋白酶及將病毒DNA整合於細胞 DNA中所需整合酶蛋白。Pol之主要產物係藉由病毒粒子蛋白酶切割以產生胺基末端RT肽及羧基末端整合酶蛋白，該胺基末端RT肽具有為DNA合成所必需活性（RNA及DNA-指導的DNA聚合酶，核糖核酸酶H)。HIV RT係全長RT (p66)與缺乏羧基末端RNase Η結構域之切割產物（p51)的異源二聚體。 RT係逆轉錄病毒基因組編碼的最高度保守蛋白質之一。RT之兩種主要活性係DNA Pol及核糖核酸酶Η。RT之 DNA Pol活性使用RNA及DNA作為可互換模板，且向所有已知DNA聚合酶一樣不能重新啓動DNA合成，而是需要預先存在的分子作為引物（RNA)。當DNA合成進行時，為所有RT蛋白所固有的RNase Η活性在移除RNA基因組之複製中早期起著十分重要的作用。其選擇性地降解來自所有RNA-DNA雜交分子之RNA。在結構上該聚合酶及ribo Η佔有獨立的非重叠結構域，在覆蓋Pol三分之二胺基的Pol内。 p66催化亞單位折叠成5個截然不同的亞結構域。該等結構域之胺基末端23使該部分具有RT活性。該等結構域之羧基末端係RNase Η結構域。 129296.doc -29- 200902054 在伯主細胞文感染後’逆轉錄病毒RNA基因組藉由存於感染粒子中之逆轉錄酶拷貝至直線型雙鏈dna中。該整人酶（參照 Skalka AM，99 Adv，Virus Res 52 271_273)識別: 毒DNA之終端，修理之並隨同病毒DNA到達宿主染色體位點以催化整合。宿主DNA之許多位點可為整合目標。儘管該整合酶足以催化活體外整合，但其並非與活體内病毒 DNA相關之唯一蛋白-自感染細胞分離得大蛋白_病毒DNa 複合物指示預先整合複合物。此有利於藉由子代病毒基因組獲得宿主細胞基因。 β亥整合酶係由3個截然不同的結構域（N末端結構域、催化核心及C末端結構域）組成。該催化核心結構域滿足聚核苷酸轉移化學之所有要求。因此’可用於本發明之HIV-1衍生抗原可選自（例如）Gag(例如，全長Gag)、pl7 (Gag之一部分）、p24 (Gag 之另一部分）、p41、p40、Pol(例如，全長p〇i)、RT (p〇1之一部分）、p51 (RT之一部分）、整合酶（？〇1之一部分）、蛋白酶（Pol之一部分）、Env、gpl2〇、gpl4〇或 gpl6〇、gp41、

Nef ' Vif ' Vpr、Vpu ' Rev、Tat及其免疫原性衍生物和其免疫原性片段，尤其是Env、Gag、Nef及Pol及其免疫原性衍生物和其免疫原性片段，包括p丨7、p24、RT及整合酶。 HIV疫苗可包括多肽及/或編碼對應多個不同hiv抗原（例如’ 2種或3種或4種或更多種可選自以上列表之HIV抗原）之多肽的聚核苷酸。若干不同抗原可（例如）包含於單一融合蛋白中。可採用一種以上第一免疫原性多肽及/或一種 129296.doc -30- 200902054 乂上第一免疫原性多肽，該等免疫原性多肽係HIV抗原或一種以上抗原之融合體。舉例而a ’抗原可包括Gag或其免疫原性衍生物或免疫原丨生片奴，融合至RT或其免疫原性衍生物或免疫原性片知' 融s至Nef或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，其中及融δ蛋白之Gag部分存在於該多肽之5,末端。可用於本發明之Gag序列可能不包括Gag p6多肽編碼序列。可用於本發明之Gag序列的特定實例包括pl7及/或p24 編碼序列。 RT序列可含有實質上可滅活任一逆轉錄酶活性之突變 (參見 WO 03/025003)。該RT基因係HIV基因組之較大尸〇/基因的組份。應理解.依照本發明，所用RT序列可存在於p〇l或至少對應於 RT之Pol片段中。此p〇1片段保留p〇1之主要CTL抗原決定部位。在一個具體實例中，RT僅作為p51或僅作為尺丁之片段包含。本發明之融合蛋白或組合物的RT組份視情況包括一突變以去除在原核表現系統十作為内部起始位點之位點。視情況，截短可用於本發明之Nef序列以去除編碼N末端區域之序列，即，去除30個至85個胺基酸，例如，去除6〇個至85個胺基酸，具體而言，去除N末端65個胺基酸（後— 截短在本文中稱作trNef)。另一選擇或另外，可對Nef進行修飾以去除肉豆蔻酸基化位點。舉例而言，可藉由刪除或取代來去除Gly 2肉豆寇酿基化位點。另一選擇或另外， 129296.doc -31 · 200902054 可對Nef進行修飾以藉由刪除或取代一個或兩個白胺酸來改變Leu 174及Leu 175之二白胺酸基元。二白胺酸基元在 CD4減量調節中之重要性闡述於（例如）Bresnahan P.A.等人 (1998) Current Biology，8(22): 1235-8 中。

Env抗原可以其全長（作為gpl6〇)或截短（作為gpi40或更短）（視情況，具有適宜突變以破壞介於gpl20與gp41間之切割位點基元）形式存在。該Env抗原亦可以其天然加工形式 (作為gp 120及gp41)存在。可單獨或一起作為組合使用 gpl60之此兩種衍生物。上述Env抗原可進一步展現缺失 (具體而言，係可變環缺失）及截短。亦可使用Env片段。例示性gp 120序列示於SEQ ID No 8中。例示性gp 140序列示於SEQ ID No 6中。本發明之免疫原性多肽可包括Gag、Pol、Env及Nef，其中存在此等自然抗原之至少75%、或至少90%或至少 95%(例如，96%)之CTL抗原決定部位。在包括如上文所定義P17/p24 Gag、p66 RT及截短Nef之本發明免疫原性多肽中，適宜地，存在自然Gag、Pol及 Nef抗原之96%的CTL抗原決定部位。一個本發明之實施例提供一種含有pl7、p24 Gag、p66 RT、截短Nef(缺乏編碼末端胺基酸1-85之核苷酸-"trNef") 之免疫原性多肽，順序為Gag、RT、Nef。在本發明之編碼免疫原性多肽之聚核苷酸中，適宜地，P24 Gag及P66 RT經密碼子優化。本發明之特定聚核苷酸構建體及對應多肽抗原包括： 129296.doc -32· 200902054 1· pl7 ’ p24 (經密碼子優化）Gag-p66 RT (經密碼子優化）. 截短Nef ; 2. 截短Nef-p66 RT (經密碼子優化）-pl7，p24 (經密碼子優化）Gag ; 3. 截短Nef-p 17，p24 (經密碼子優化）Gag-p66 RT (經密碼子優化）； 4. p66 RT (經密碼子優化）_pi7，p24 (經密碼子優化）Gag· 截短Nef ; 5. p66 RT (經密碼子優化）_截短Nef-pl7，p24 (經密碼子優化）Gag ; 6. pl7 ’ p24 (經密碼子優化）Gag-截短Nef-p66 RT (經密碼子優化）。例示性融合體係Gag、RT及Nef之融合體，具體而言，順序為Gag-RT-Nef (參見，例如SEq id No 2)。另一例示性融合體係pi 7、p24、RT及Nef之融合體，具體而言，順序為p24-RT-Nef-pl7 (參見’例如SEq id No 16，本文其他地方稱作"F4n)。在另一實施例中’免疫原性多肽含有Gag、RT、整合酶及Nef，具體而言’順序為Gag_RT_整合酶_Nef^(參見，例如 SEQ ID No 4)。在其他實施例中，該HIV抗原可為包含Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段及pl7 Gag及/或p24 Gag或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段之融合多肽，其中當pl7 及p24 Gag兩者均存在時在它們之間至少有一種HIV抗原或 129296.doc •33- 200902054 免疫原性片段。舉例而言，適宜地，N e f係全長N e f。舉例而言，適宜地，p 17 Gag及p24 Gag之全長分別為 p 1 7及 p24。在一個實施例中，該免疫原性多肽包括p17及p24 Gag二者或其免疫原性片段。在此構建體中，P24 Gag組份及pi7

Gag組份藉由至少一種另外HIV抗原或免疫原性片段（例如，Nef及/或RT或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段）分開。關於進一步詳述可參見WO 2006/013106。在包括p24及RT之融合蛋白中，在該構建體中p24在之前可為較佳，因為當抗原在大腸桿菌中單獨表現時，可觀察到p24之表現優於RT。本發明之某些構建體包括下列： 1. p24-RT-Nef-pl7 2. p24-RT*-Nef-pl7 3. p24-p5 1 RT-Nef-p 1 7 4. p24-p51RT*-Nef-pl7 5. pl7-p51RT-Nef 6. pl7-p51RT*-Ne 7· Nef-pl7 8· Nef-pl7，帶連接子 9. pl7-Nef 10. pl7-Nef，帶連接子。 *代表RT甲硫胺酸592突變為離胺酸。 129296.doc •34- 200902054 在另一態樣中，本發明提供HIV抗原之融合蛋白，其包括至少四個HIV抗原或免疫原性片段，其中該四個抗原或片段係或衍生自Nef、1>〇1及（}邛。較佳地，Gag係作為兩種單獨組份存在，其藉由該融合體之至少一種其他抗原分開。較佳地，Nef係全長Nef。較佳地，ρ〇ι係p66或 P51RT。較佳地，Gag係pl7及p24 Gag。在本發明之此態樣中，融合體之抗原組份的其他較佳特徵及性質係如本文所述。本發明此態樣之較佳實施例係如上已列舉之四組份融合體： 1· p24-RT-Nef-pl7 2. p24-RT*-Nef-pl7 3· p24-p51RT-Nef-pl7 4. p24-p51RT*-Nef-pl7 本發明之免疫原性多肽可具有存於對應於諸如Gag、RT 及Nef等特殊抗原之序列間的連接子序列。此等連接子序列之長度可為（例如）至多2〇個胺基酸。在特殊實例中，該等連接子序列可具有1個至10個胺基酸、或丨個至6個胺基酸’例如’ 4-6個胺基酸。此等適宜HIV抗原之其他描述可發現於w〇〇3/〇25()()3 中。本發明之HIV抗原可衍生自任一 HIV亞型，例如，亞型 A、亞型Β或亞型C。舉例而言，該等HIV抗原可衍生自亞型Α或Β，尤其是亞型β。 129296.doc -35- 200902054 在一個本發明之具體實施例中，第一免疫原性多肽係包括Gag及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多肽 (例如’ p24-RT-Nef-pl7)。在一個本發明之具體實施例中，第二免疫原性多肽係包括Gap及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物（例如，Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)之多肽。因此’在一個具體實施例中，包括Gap及/或p〇l及/或Nef 或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，p24-RT-Nef-P17)係第一免疫原性多肽及包括Gap及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)係第二免疫原性多肽。在本發明之另一具體實施例中，第一免疫原性多肽係 Env或其片段或衍生物，例如，gpi2〇、gpl40或gpl6〇(尤其是gp 120)。在一個本發明之具體實施例中，第二免疫原性多肽係包括Gag及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，p24-RT-Nef-pl7)。因此，在一個具體實施例中，Env或其片段或衍生物（例如’ gpl20、gpl40或gP160(尤其是gP120))係第一免疫原性多肽且包括Gag及/或Pol及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，p24-RT-Nef-pl7)係第二免疫原性多肽。在本發明之另一具體實施例中，第一免疫原性多肽係包括Gag及/或P〇l及/或Nef或任一該等之片段或衍生物之多狀 (例如，p24-RT-Nef-pl7)。在一個本發明之具體實施例中’第二免疫原性多肽係Env或其片段或衍生物，例如， 129296.doc -36- 200902054 gpl20、gpl40 或 gpl60(尤其是 gpl20)。因此，在一個具體實施例中，包括Gag及/或p〇l及/或Nef 或任一該等之片段或衍生物之多肽（例如，p24_RT_Nef_ pl7)係第一免疫原性多肽且Env或其片段或衍生物（例如， gpl2〇、gpl40或gpl60(尤其是gpl2〇))係第二免疫原性多肽。抗原之免疫原性衍生物及免疫原性片段上述抗原可以其免疫原性衍生物或免疫原性片段形式而非完整抗原形式採用。相對於自然抗原，本文所用術語"免疫原性衍生物"係指相對於其自然相似物以受限方式經修飾之抗原。舉例而 σ其可包括點突變，該點突變可藉由（例如）改良在原核系統中表現或藉由去除不期望活性（例如，酶活性）來改變蛋白之性質。然而，免疫原性衍生物應與自然抗原足夠相似以便該等免疫原性衍生物保留其抗原性質且保持能夠提回抵抗該自然抗原之免疫反應。給定衍生物是否提高此免疫反應可藉由適宜免疫學分析來量測，例如，eusa (針對抗體反應）或對細胞標記物使用適宜染色之流式細胞計 (針對細胞反應）。免疫原性片段係編碼至少一個抗原決定部位（例如，抗原決定部位）之片段，通常為具有至少8個胺基酸之肽。長度為至少8個（例如’ 8_1〇個胺基酸或至多2〇、5〇、6〇、 70 ι〇0、I50或200個胺基酸）之片段均被視為屬於本發明之範圍’只要該多肽顯示藉由該多肽保留抗原性，亦即， 129296.doc -37- 200902054 主要抗原決定部位（例如，CTL抗原決定部位）。腺病毒本毛明之腺病毒載體包括一種或多種異源聚核苷酸 (DNA) ’其編碼一種或多種免疫原性多肽。可用於本發明之腺病毒載體可衍生自多種哺乳動物宿主0 腺病毒（在本文中稱作”Ad”或”Adv")具有如不形態特徵.一十面體衣殼係由3種主要蛋白（六鄰體（H)、五鄰體基質（III)及纖維結（IV))以及許多其他次要蛋白（VI、、 IX、Ilia 及 IVa2)構成（RusseU w c 2〇〇〇, Gen ν_〇ι， 81:2573-2604)。該病毒基因組係、末端蛋白共價鍵結至5，末端之直線型雙鏈DNA，其具有反轉末端重複（ITR)。該病毒DNA與高驗性蛋白νπ及小肽（稱為咖）密切相關。另一蛋白V與此DNA-蛋白複合物封裝在一起且藉由蛋㈣對衣殼提供結構鏈接。此病毒亦含有病毒編碼蛋㈣，其為處理某些結構蛋白以產生成熟感染病毒所必需。分離1〇〇種以上截然不同的腺病毒血清型，其感染各種嗜乳動物物種，其中51種腺病毒血清型祕人類。因此，一種或多種腺病毒載體可衍生自病毒之實例係Adi、Ad2、Ad4、人類腺病毒。此等人源腺 Ad5、Ad6、Adi 1、Ad24、根據許多生型劃分成6個

Ad34、Ad35，尤其是 Ad5、Adn 及 Ad35。物、化學、免疫學及結構標準可將人類血清亞屬（A-F)。已經廣泛地儘管基於Ad5之載體用於許多基因療法試 129296.doc 38- 200902054 t’但由於普通人群中預先存在對自'然感染之免疫性，因及其他⑽腺病毒載體之使用受到限制。祕及1他 =成貝往往屬於最常見血清預防血清型。在治療期間作為暴鉻於載體之結果，可研發』呵發對現存载體之免疫性。對血清預防載體之此等類別先前在 J存在或發展免疫性可限制基因療法或疫苗接種之功效。替代腺病毒血清型因此在尋求能夠逃避宿主免疫反岸之其m、淹、¥ < 應之基因遞送系統中係十分重要的目標。 -種此類替代血清型係彼等衍生自非人類靈長類者，尤其是黑㈣腺病毒。參見，美國相第M83,716號，兑闡述兩種黑猩猩腺病毒之基因組。八已顯不黑獲獲（’，p an’’或”抬r+1? 次）腺病毒載體與人類腺病毒體可同樣有效地誘導韓其方等轉基因產物產生強免疫反應 (Fitzgerald等人，j.Immun〇1 17〇:1416)〇可自黑獲獲之腸系膜淋巴節分離非人類靈長類腺病毒。黑獲獲腺病毒與人類腺病毒亞型c足夠類似以便於在概 2 9 3細胞中複製e 1缺凑，戌盖、失病毒。而且，黑猩猩腺病毒在*** 發生學上截然不同於更常見人類血清型⑽及蝴。^ •39· 200902054 型可具有相同或不同來源。舉例而言，該等可衍生自一種以上人類血清型及/或一種以上非人類靈長類血清型。用於構建欣合腺病毒載體之方法揭示於W〇 2〇〇5/〇〇ι 中。有某些與將異源DNA***腺病毒中相關之尺寸限制。人類腺病毒能夠包裝至多105%之野生型基因組長度⑺扣等人，1993, J Vir〇l 67 (10)，5911-21)。已證實：人類腺病毒之包裝下限為75%之野生型基因組長度（Parks等人1995, 了

Virol 71(4), 3293-8)。可用於本發明之腺病毒的一個實例係截然不同於諸如 Ad2及Ad5等普遍存於人類群體中之天然血清型的腺病毒。此可避免誘導抵抗載體之強效免疫反應，因而會由於經由中和抗體及影響毒性阻止載體吸收而限制隨後投與相同血清型之功效。因此，该腺病毒可為非普遍天然人類病毒血清型之腺病毒。自動物分離得腺病毒具有免疫學上截然不同的衣殼' 六鄰體、五鄰體及尾絲組份但在系統發生學上密切相關。具體而言，該病毒可為非人類腺病毒，例如，猿腺病毒且特定§之，係黑猩猩腺病毒，例如，pan 5、6、7或9。此等菌株之實例闡述於w〇〇3/〇〇〇283中且可自美國典型培養物保藏中心（10801 University Boulevard，馬納薩斯，弗吉尼亞2011G-2209)及其他來源獲得。期望黑獲係―⑽W州]、Pan6[ATCCVR_592]/Pa^7 [ATCC VR-593]。據信，黑獲獲腺病毒之使用優於人類腺病#灰清型之使 129296.doc -40- 200902054 用，此乃因在目標群體中之缺乏對腺病毒之預存免疫性，特定言之’缺乏交又中和抗體。黑㈣腺病毒與預存中和抗體反應之交叉反應僅存於2%之目標群體t，而在某此候選人類腺病毒載體中，該交又反應存於35%之目標群體中。該等黑獲獲腺病毒截然不同於更為常見人類亞型如及祕，但與亞㈣之人類Ad4(不為普遍亞型)關聯更為密切。Pan 6與pan 5、7及9關聯不太密切。本發明之腺病毒可為複製缺陷型。此意味著與野生型病毒相比，本發明腺病毒在非互補細胞（n〇n_c〇mpiemen一中複製的能力降低。此可歸因於病毒突變(例如，藉由刪除複製所涉及基因，例如，刪除Ela、Elb、曰4 基因）。本發明之腺病毒載體可衍生自包括功能性E1缺失之複製缺陷型腺病毒。因此’由於不具備表現腺病毒Ela及Elb之能力，即’缺失Ela及Elb功能，本發明之腺病毒載體可為複製缺陷型。該等重組腺病毒在其他基因中亦可具有功能缺失[參見WO 03/000283]，舉例而言，缺失£3或以基因。可自形成重組病毒之-部分的腺病毒序列消除腺病毒延遲早期基因E3。狀重組腺病毒粒子生成而言，以之功能並非必需。因此，不必要替換此基因產物之功能以包裝用於本發明之重組腺病毒。在一個具體實施例中，該等重組腺病毒具有功能缺失E1及E3基因。此等載體之構建闡述於 R〇y等人，Human Gene Therapy 15:519-530, 2004 中。亦可構建具有E4基因功能缺失之重組腺病毒，但可能需 129296.doc -41 - 200902054 要保留E4 ORF6功能。本發明之腺病毒載體亦可在延遲早 ,月基因E2a中含有缺失。亦可在腺病毒基因組之晚期基因之任個中產生缺失。類似地，中期基因以及IVa 之缺失可為有用的。可在其他結構或非結構腺病毒基因中產生其他缺失。上述缺失可分別使用，即，可用於本發明之腺病毒序列可僅 3有E1缺失。或者，可以任一組合使用可有效地破壞其生物活性之整個基因或其部分缺失。舉例而言，在一個例示性載體t，s亥等腺病毒序列可具有E丨基因及E4基因缺失、或E1、£2&及趵基因缺失、或扪及们基因缺失（例如，eu 及Elb之功能缺失及至少一部分E3缺失）、或Ei、£〜及£4 基因缺失、具有或不具有E3缺失等等。此等缺失可為此等基因之部分或完全缺失且可與其他突變（例如，溫度敏感突變）組合使用以獲得期望結果。

該等腺病毒載體可使用其中該病毒能夠複製之任一適宜細胞系產生。具體而言’可使用能提供自病毒載體丟失且造成其複製特徵受損之因子（例如，E丨及/或E4)的互補細胞系。此細胞系尤其可為但不限於HeLa [ATCC登錄號CCL

2]、A549 [ATCC 登錄號 CCL 185]、HEK 293、KB [CCL 17]、Detroit [例如 ’ Detroit 510、CCL 72]及 WI-38 [CCL 75]細胞。此等細胞系均可自美國典型培養物保藏中心 (10801 University Boulevard ’ 馬納薩斯，弗吉尼亞 20110-2209)獲得。可自其他來源獲得其他適宜親本細胞系，例如，PER.C6©細胞，代表為在ECACC中登記號為96022940 129296.doc • 42· 200902054 之細胞（歐洲動物細胞培養物收集中心（ECACC)，應用微生物學及研究中心（CAMR，UK))或Her 96細胞（Crucell)。編碼免疫原性多肽之聚核苷酸序列可經密碼子優化以用於哺乳動物細胞。此密碼子優化詳細地闡述於\v〇 05/025614中。某些HIV序列之密碼子優化進一步闡述於 WO 03/025003 中。

在一個本發明之實施例中，聚核苷酸構建體包括N_末端前導序列。信號序列、跨膜結構域及細胞質結構域各自均可視情況存在或缺失。在一個本發明之實施例中，所有此等區域存在但經修飾。用於本發明腺病毒載體之啓動子可為來自HCMV IE基因之啓動子，舉例而言，其中包括含外顯子i之HCMV压基因的5'未轉譯區且完全或部分排除内含子A，如在 02/36792中戶斤述。當若干抗原融合成一融合蛋白時，此蛋白可在單獨啓動子控制下藉由聚核苷酸編碼。在本發明之替代實施例中’若干抗原可藉由各啓動子分開表現，1¾等啓動子各自可為相同的或不同的。在本發明之又-實施例巾’某些抗原可形成融合體，鏈接至第一战動2且其他抗原可鏈接至第二啓動子，該第二㈣子可^ 該第一啓動子相同或不同。一、因此，該腺病毒載體可包括— 箄#頦人I , 或夕個表現盒，每個該等表“在-個啓動子控制下編碼—種抗原。另另外’該腺病毒載體可包括_ ―、擇或 -夕個表現益’母個該等 129296.doc -43· 200902054 =現盒在-個啓動子控制下編碼—種以上抗原，該等抗原糟此作為融合體表現。每個表現盒在該腺病毒載體中可存於一個以上的基因座中。可將擬表現之聚核芽酸或編竭免疫原性多肽之聚核苦酸 ***任—腺病毒缺失區域中，例如’***E1缺失區域中。儘呂兩種&更多種編碼免疫原性多狀之聚核#酸可作為融合體鏈接，但所得蛋白可作為融合蛋白表現，或其可作為獨立蛋白產物表現，或其可作為融合蛋白表現且隨後在後來分解成較小亞單位。佐劑佐劑概述於 Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant pp ach eg Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995中。 ’ 適且佐劑包括鋁鹽，例如，氫氧化鋁或磷酸鋁，但亦可為鈣鹽、鐵鹽或辞鹽，或可為醯化酪胺酸或醯化糖、陽離子或陰離子衍生多糖或聚填腈之不溶性懸浮液。在本發明之調配物中，較佳地，佐劑組合物優先誘導

Thl反應《然而，應理解，並不排除其他反應，包括其他體液反應。已知某些疫苗佐劑尤其適於刺激Thl或者Th2-型細胞因子反應。傳統上’在疫苗接種或感染後免疫反應之 Th 1. Th2平衡之最佳指標包括直接量測用抗原再刺激後τ淋巴細胞體外產生的Th 1或Th2細胞因子及/或量測抗原特異性抗體反應之IgGl:IgG2a比率。 129296.doc 44· 200902054 因此’ Th 1型佐劑係一種可刺激分離τ細胞群體在活體内 (如在▲•清中所量測）或在活體外（當該等細胞在活體外受到抗原再刺激時所量測細胞因子）產生大量Thi型細胞因子並誘導與Thl型亞型相關之抗原特異性免疫球蛋白反應的佐劑。可經调配以產生適用於本發明之佐劑的較佳Th丨_型免疫刺激劑包括且不限於下列物質：類鐸受體（Toll like receptor)(TLR) 4配體，尤其是諸如脂質A衍生物等激動劑，具體而言，係單磷醯脂a或更具體而言，係3脫醯基單磷醯脂a (3 D-MPL)。 3 D -MPL係由GlaxoSmithKline以商標MPL®出售且主要促進特徵為產生IFN-g之CD4+ T細胞反應（Th 1細胞即1型表現型CD4 T輔助細胞）。其可按照揭示於gb 2 220 21 1 A中之方法來產生。在化學上，其係3-脫醯基單鱗醯脂a與3， 4，5或6醯化鏈之混合物。較佳地，在本發明之組合物中’使用小粒子3 D-MPL。小粒子3 D-MPL具有可使其經由0.22 μιη過遽器無菌過滤之粒徑。此等製劑闡述於國際專利申請案第WO 94/21292號中。脂質a之合成衍生物為已知且認為係TLR 4激動劑，包括但不限於：〇]^174(2-脫氧-6-〇-[2-脫氧-2-[(11)-3-十二烧氧基四_癸醯基胺基]-4-0-麟醯基- β-D-11比喃葡萄糖基]_2-[(r)_3 -經基四癸醯基胺基]-a-D- 11比。南葡萄糖基碌酸二氫鹽），（w〇 95/14026) ◦Μ 294 DP (3S，9R)-3-[(R)-十二烷氧基四癸醯基胺基]_ 129296.doc -45- 200902054 4-氧代基-5-氮雜-9(R)-[(R)_3-羥基四癸醯基胺基]癸_ ι，ι〇-二醇，ι，ι〇_雙（磷酸二氫鹽）（w〇 99/643〇1 及 w〇 00/0462) OM 197 MP-Ac DP (3S_，9R)_3_[(R)_十二烷氧基四癸醯基胺基]-4-氧代基-5-氮雜-9-[(R)-3-經基四癸醯基胺基]癸_ 1，10-二醇，1-磷酸二氫鹽10_(6_胺基已酸鹽）（w〇 01/46127) 可用之其他TLR4配體係胺基葡萄糖苷罐酸烧基酯（aikyl Glucosaminide phosphates)(AGPs)，例如，彼等揭示於w〇 9850399或US 6303347中（亦揭示用於製備人〇1>3之方法）者或AGPs之醫藥上可接受之鹽（如揭示於us 6764840中者）某些AGPs係TLR4激動劑，且某些為TLR4拮抗劑。據信，二者均可用作佐劑。皂苷亦為本發明之較佳Th 1免疫刺激劑。皂苷係熟知佐劑且教示於：Lacaille-Dubois，M and Wagner H. (1996. — 篇關於皂苷之生物及藥理活性的評論D phyt〇inedicine ,第 2卷’第363-386頁）。舉例而言，Quii a (衍生自南美樹種奎拉雅屬皂樹（Quillaja Saponaria Molina)之樹皮）及其組份闡述於 US 5,057,540 及"Saponins as vaccine adjuvants",

Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2).1-55 及 EP 0 362 279 B1 中。溶血性皂苷 QS21 及 QS 1 7(經HPLC純化之Quil A組份）已被闡述為強效全身性佐劑’且其生產方法揭示於美國專利第5,〇57,540號及歐洲專利第0 362 279 B1號中。在該等參考文獻中亦闡述了用作 129296.doc -46- 200902054 全身疫苗強效佐劑之QS7 (Quil-A之非溶血性組份）的用途。QS21之用途進一步闡述於Kensil等人，（1991. j. Immunology vol 146, 43 1-43 7)中。QS21與聚山梨醇酯或環糊精之組合亦已知（WO 99/10008)。包含QuilA組份（例如，（^21及（^7)之微粒佐劑系統闡述於^0 96/33739及 WO 96/11 711中。一種此系統稱為Iscom且可含有一種或多種皂皆。特定言之，本發明之佐劑包括類鐸受體（TLR) 4配體（尤其是3D-MPL)與皂苷之組合。其他適宜佐劑包括TLR 9配體（激動劑）。因此，另一較佳免疫刺激劑係含有未曱基化CpG二核苷酸（"CpG”）之免疫刺激性寡核苷酸。CpG係存在於DNA中之胞"密咬-鳥。票呤核苷一核苷酸基元之縮寫。在此項技術中已知CpG係佐劑，當藉由全身及黏膜途徑投與時（WO 96/02555，歐洲專利 468520 號，Davis 等人，J 1998，160(2):870- 876 ; McCluskie及 Davis，《/· /w卿⑽/.，1998，161(9):4463- 6) °在歷史上’曾觀察到BCG之DNA組份可發揮抗腫瘤作用。在進一步研究中，衍生自BCG基因序列之合成寡核普酸已表明能夠誘導免疫刺激作用（在活體外及活體内均可）。此等研究之學者推斷某些回文序列（包括中心基元）具有此活性。CG基元在免疫刺激中之主要作用隨後闡明於Krieg之公開文獻（Nature 374，第546頁，1995)中。詳細分析表明該CG基元必須處於某一序列文本中且該等序列在細菌DNA中常見但在脊椎動物〇ΝΑ中罕見。該免疫刺 129296.doc -47· 200902054 激序歹】通书為.Π票吟、°票吟、C、G、σ密咬、σ密α定，其中 °亥CG基元未經甲基化，但已知其他具有免疫刺激性之未曱基化CpG序列且可用於本發明。在某些六核苷酸組合中，存在回文序列。此等基元之若干個可作為一種基元之重複或不同基元之組合存在於同— 寡核苦酸中。一個或多個此等含有寡核苷酸之免疫刺激序列之存在可激活各種免疫子集’包括自然殺傷細胞（其產生干擾素γ且具溶細胞活性）及巨噬細胞（w〇〇ldrige等人，第89卷（ηο· 8)，1977)。其他含有不具有此一致序列之序列的未甲基化CpG現在亦已表明具有免疫刺激性。當將CpG調配於疫苗中時，其通常存於游離溶液中與游離抗原一起投予（W0 96/02555;McCluskie&Davis，如上文所述）’或共價結合至抗原（WO 98/16247)或與諸如氫氧化銘等載劑一起調配（（Hepatitis surface antigen) Davis 等人’如上文所述；Brazolot-Millan等人，Λ^/. USA，1998, 95(26)，15553-8)。可能相關之其他TLR9激動劑包括含有寡核苷酸之免疫刺激CpR基元及含有寡核苷酸之YpG基元（Idera)。上述此等免疫刺激劑可與載劑一起調配，該等載劑可為 (例如）月曰貝體、水包油乳劑及/或金屬鹽，包括銘鹽（例如’氫氧化鋁）。舉例而言，3D_MPL可與氫氧化鋁（歐洲專利〇 089 454)或水包油乳劑（界〇 95/17210)—起調配；奶21 較佳地可與含有膽固醇之脂質體（W〇 96/33739)、水包油

乳劑（WO 95/17210)或明礬（W0 98/15287)—起調配；CpG 129296.doc •48- 200902054 可與明恭（Davis專人’如上文所述；Brazolot-Millan，如上文所述）或與其他陽離子載劑一起調配。免疫刺激劑之組合亦為較佳，具體而言，係單磷醯脂A 與息苷衍生物之組合（WO 94/00153 ; WO 95/17210 ; WO 96/33739 ； WO 98/56414 ； WO 99/12565 ； WO 99/1 1241)-更具體而言’係揭示於wo 94/00153中之QS21與3D-MPL 之組合。或者’ CpG與皂苷（例如，QS21)之組合亦形成可用於本發明之強效佐劑。或者，皂苷可調配於脂質體或 Iscorn中’且可與免疫刺激性募核苷酸組合。因此，舉例而言，適宜佐劑系統包括單磷醯脂A(較佳地’ 3D-MPL)與鋁鹽之組合（例如，在w〇 00/23105中所述）。加強系統包括單鱗醯脂A與皂苷衍生物之組合，具體而言’係（^21與30-1^1^之組合，如'^0 94/00153所揭示，或包括其中QS21受含有膽固醇之脂質體（Dq)抑制之反應原性較弱的組合物，如WO 96/33739所揭示。此組合可另外包括免疫刺激性寡核苷酸。因此’實例性佐劑包括QS21及/或MPL及/或CpG。在水包油乳劑中包含QS21、3D-MPL及生育酚之尤其強效佐劑調配物闡述於W0 95Π7210中，且其係用於本發明之另一較佳調配物。

另一較佳調配物包括單獨的或與鋁鹽在一起的CpG寡核苷酸。 X 在本發明之另一態樣中，提供一種製備本文所述疫苗調 129296.doc -49- 200902054 配物之方法，其中該方法包括將一種或多種本發明之第免疫原性多肽與適宜佐劑混合在一起。用於本發明調配物之尤佳佐劑係如下： i) 3D-MPL+QS21於脂質體中（參見例如下文佐劑B)

ii) 明礬（Alum) + 3D-MPL

iii) 明礬+QS2 1於脂質體中+3D-MPL

iv) 明礬 +CpG v) 3D-MPL + QS2 1 +水包油乳劑

vi) CpG

vii) 3D-MPL+QS21(例如於脂質體中）+CpG viii) QS21+CpG。較佳地，該佐劑係以脂質體、isc〇m或水包油乳劑之形式存在。在一個本發明之實例性實施例十，該佐劑包括水包油乳劑。在本發明之另一個實例性實施例中，該佐劑包括脂質體。適且地，該佐劑組份不含任何病毒。因此，適宜地，可用於本發明之組合物除該一種或多種腺病毒載體外不含任何病毋該種或多種腺病毒載體包括一種或多種編碼一種或多種街生自病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸。組合物、劑量及投藥在本發明之方法中，該（等）免疫原性多肽、該（等）腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與。 L吊該佐劑可與免疫原性多肽共同調配。適宜地’該匕卜亦可與欲投與之任何其他免疫原性多肽共同調配。 129296.doc -50- 200902054 因此，在一個I發明之實施例中，冑供_種提高免疫反應之方法’該方法包括投與⑴―種或多種第—免疫原性多肽與-種佐劑共同調配；及（ii)_種或多種腺病毒載體，其包括-種或多種編碼-種或多種第二免疫原性多狀之異原炎核，丨中—種或多種第—免疫原性多肽及佐劑以及種或多種腺病毒載體係伴隨投與。共同調配”意指該第-免疫原性多肽與該佐劑包含於同一組合物（例如醫藥組合物）中。通常，該腺病毒載體包含於組合物（例如醫藥組合物）中。或者’該—種或多種第—免疫原性多肽、該—種或多種腺病毒载體及一種佐劑共同調配。 —因此，按照本發明提供包括一種或多種免疫原性多狀、種或多種腺病毒載體及一種佐劑之組合物。。本發明之組合物及方法可涉及—種以上免疫原性多狀及/ ，種以上腺病毒載體之用途。使用多種抗原尤其有利於，高抵抗某些病原體（例如，HIV、結核分枝桿菌及遽原蟲 )之保濩性免疫反應。本發明之組合物可包括—種以上佐劑。。本發明所用組合物及方法通f可包括載劑，例如，水性緩衝載劑。可包含諸如糖等保護性組份。二合，應以足以達成下列之量投與：轉導目標細胞及提 :句転度基因轉移和表現且形成病原體特異性免疫反應藉此提供㈣或治療益處而不會造成過度副作用或產生醫學上可姑、◊ ^ 接文之生理作用，此可藉由彼等熟習醫學技術者 129296.doc -51 - 200902054 來測定。習知及醫藥上可接受之投藥途徑包括但不限於直接遞送給視網臈及其他眼内遞送方法、直接遞送仏肝、吸入、經鼻内、靜脈内、肌内、氣管内、皮下、皮内、表皮、直腸、經口及其他非經腸投藥途徑。若需要，可對各繼徑加以組合或調整，此視基因產物或條件而定。投 _途徑主要視所治療病症之性f而定。最適宜地，該途徑為經肌内、皮内或表皮。 ' 較佳目標組織係肌肉、皮膚及黏膜。皮膚及黏臈係其中經常會遇到最具感染性抗原之生理位點。 /、當該第-免疫原性多肽、佐劑及腺病毒載體不在一起調配時，可藉由相同投藥途徑或藉由不同投藥途徑投與不同調配物（例如，多肽/佐劑及腺病毒載體調配物）。組合物在該等方法中之劑量將主要視諸如下列等因素而定：所治療病症、個體之年齡、重量及健康狀況且因此可在各個體之間有所變化。舉例而言，治療有效之成人或獸用劑量通常介於約100 至約100 mL之载劑所含粒子濃度係自約1Xl〇6至約1X1015個粒子、約1><1〇11至1><1〇13個粒子、或約lxio9至Ιχίο12個病毒粒子以及大約M〇〇〇盹或約2-100 (例如，大約4_40料）免疫原性多肽。劑量可視動物個頭大小及投藥途徑而有所變化。舉例而言，對於肌内注射而言，每一位點之適宜人用或獸用劑量（對於重約 80 kg動物）係介於約ΙχΙΟ9至約5χ1〇η個病毒粒子及4_4〇畔蛋白/mL。一名熟習此項技術者可調節此等劑量，視投藥途徑以及採用該組合物之治療或疫苗應用而定。 129296.doc -52- 200902054 佐劑之量可視佐劑及免疫原性多肽之性質、所治療病況及個體之年齡、重量和健康狀況而定。通常，對於人類投藥而δ，1-100叫（例如，1〇_5〇盹每個劑量）之佐劑量可為適宜的。 ~ 適宜地，可藉由在本發明方法中單獨伴隨投與本發明之組合物來達成足夠免疫反應。然而，倘若藉由在第二或後續時機（例如，在一個月或兩個月後）投與另一劑第一免疫原丨生多肽、佐劑及腺病毒載體來進一步增強該免疫反應，則此方案屬於本發明之範圍。吾人發現良好病原體特異性CD4+及/或CD8+ Τ細胞反應通常可在本發明方法中單次伴隨投與本發明之組合物後提向。然而’吾人發現良好病原體特異性抗體反應可能需要第二次或進一步伴隨投與本發明之組合物。本發明之各組份可加以組合或與任一適宜醫藥賦形劑 (例如，水、缓衝液及諸如此類）一起調配。實例 (；佐劑製備 1)按照如在WO 95/17210中所述方案製備水包油乳劑。該乳劑含有：42.72 mg/ml角鯊稀、47.44 mg/ml生育酚、19.4 mg/ml Tween 80。所獲得油滴具有大約180 nm之大小。將Tween 80溶於磷酸鹽緩衝鹽水（pbs)中，產生2%存於 PBS中之溶液。為提供1 〇〇 ml兩倍濃度乳劑，將5克DL α生育酚及5 ml角鯊烯旋渦振盪直至徹底混合。加入90 ml 129296.doc •53· 200902054 PBS/Tween溶液且徹底混合。然後使所得乳劑通過注射器且最後藉由使用Ml 10S微流體化機器實施微流體化。所得油滴具有大約1 80奈米之大小。 2) 用QS21及MPL製備水包油乳劑將大量無菌乳劑加入PBS中以達成500 μΐ乳劑/ml(v/v)之最終濃度。隨後添加3 D-MPL。隨後在每兩次添加組份期間添加QS2 1，將中間體產物攪拌5分鐘。在1 5分鐘後，檢查pH且若需要用NaOH或HC1將調解pH至6.8+/-0.1。3D-MPL及QS21之最終濃度均為100 pg/m卜 3) 脂質體MPL之製備在真空下（或者，在惰性氣體流下）乾燥存於有機溶劑中之脂質（例如，來自蛋黃或合成之磷脂醯膽鹼）及膽固醇和3 D-MPL·之混合物。然後加入水溶液（例如，磷酸鹽緩衝鹽水）並振盪容器直至所有脂質均處於懸浮狀態。然後將此懸浮液微流體化直至脂質體大小減小至約1 〇〇 nm，且然後藉由0.2 μιη過據器進行無菌過渡。可使用擠出或超聲處理替代此步驟。通常，膽固醇：填脂酿膽驗比率係1:4(w/w)，且加入水溶液以獲得10 mg/ml之最終膽固醇濃度。 MPL之最終濃度係2 mg/ml。脂質體具有大約1〇〇 nm之尺寸且稱為SUV(單層小囊泡）。脂質體本身隨時間穩定且無融合能力。 4) 佐劑B ("adj B”）之製備向PBS中添加大量無菌SUV。PBS組合物係Na2HP04: 9 129296.doc -54- 200902054 mM ; ΚΗ2Ρ〇4: 48 mM ; NaCl: 100 mM pH 6.1。向該 SUV 中添加QS21之水溶液。3D-MPL及QS21之最終濃度均為 1 00 pg/ml。此混合物稱為佐劑B。在每兩次添加組份期間，將中間體產物攪拌5分鐘。檢查pH且若需要用NaOH或 HC1將其調節至6.1+/-0.1。 p24-RT-Nef-P17蛋白（”F4")之製備如在WO 2〇06/013106，實例1中所述密碼子優化方法製備F4。含有Gag-RT-Nef轉基因之黑猩猩腺病毒Pan7(’'Pan7GRN") 的製備

Gag、RT、Nef質粒之構建. 質粒 p73i-Tgrn

Tgrn質粒***片段之全長序列在SEQ ID No 1中給出且該質粒構建圖示於圖1中。此質粒含有p 1 7 p24 (經密碼子優化）Gag、p66 RT (經密碼子優化且滅活）及截短Nef。如在WO 03/025003，實例1-13中所述製備質粒P73i-Tgrn。 E1/E3缺失Pan 7腺病毒之構建如在WO 2006/120034，實例1中所述製備E1/E3缺失Pan 7腺病毒。可以類似方式構建載體之其他血清型。在此及其他Pan 腺病毒血清型中El、E3及E4缺失之構建全面闡述於WO 03/0046 124中。其他相關資訊亦可在Human Gene Therapy 1 5:519-530 中獲得。

Gag、RT、Nef序列至腺病毒中之*** 129296.doc -55- 200902054 如在WO 2006/120034，實例3中所述，使用質粒P73i· Tgrn，將GRN表現盒***E1/E3缺失Pan 7腺病毒中以產生 C7-GRNC。C7-GRNc係在本文所述實例中所用Pan7GRN腺病毒組份。實例1 分別經腺病毒組份（Pan7GRN)及蛋白組份（F4/佐劑B)免疫或經共同調配在一起之腺病毒及蛋白組份免疫之小鼠的免疫原性研究所用小鼠菌株係CB6F1且每次使用3隻小鼠。對於用F4/ 佐劑B (P)免疫而言，注射1/10之人用劑量，即’注射存於 50 pL佐劑B中之9 pg F4蛋白。對於用Pan7GRN (A)免疫而言，注射存於50 kL鹽水（用於注射溶液之0.9% NaCl)中之 ΙΟχΙΟ8個病毒粒子。Pan7GRN黑猩猩腺病毒攜帶編碼Gag (G)、RT (R)及 Nef (N)之基因。疫苗接種方案係如下：組第0天第21天第42天第63天一 1 - F4/adj B F4/adj B _ 2 Pan7GRN Pan7GRN _ 3 F4/ adj B F4/adj B Pan7GRN Pan7GRN 4 Pan7GRN Pan7GRN F4/adj B F4/adi B . 5 — - - F4/adi B/ Pan7GRN _ 6 - F4/adj B/ Pan7GRN F4/adi B/ Pan7GRN 7 - adj B adj B 8 - - - 一 _ 因此，可見：在第1組和第2組中，藉助2次分別注射蛋白（PP)或腺病毒（AA)來對該等小鼠實施免疫。第3組和第4 組之小鼠接受習知初免-加強方案：依次接受蛋白及腺病毒（PPAA)或以相反方式（AAPP)而在第5組及第6組中’小 129296.doc -56· 200902054 鼠接受一次或兩次本發明之蛋白與腺病毒之組合 (combo)。第7組小鼠僅接受佐劑對照而第6組小鼠未接受試驗。實施下列示值讀出：抗體反應（對來自每個組每只動物個體之血清實施 ELISA)： -抵抗F4之抗體反應（圖4) -抵抗？4組份？24、11丁、如[及1317細胞反應（圖2-3)之抗體反應（圖5-8): -藉由在用若干P24、RT、Nef或P17肽池重新刺激脾細胞過夜後在進行表面及胞内細胞因子染色後藉由流式細胞儀量測。母次將每個組3只小鼠之脾細胞彙集在一起分析。對於第1組及第2組而言’在對應最終免疫後21天對試樣進行量測。對於其餘各組而言’在對應最終免疫後2 i天、 5 6天及112天進行量測。結果：結果示於下圖2-8中。 X軸標籤對應如下： pp-在第二次免疫後之第1組動物 AA-在第二次免疫後之第2組動物 PP A A-在第四次免疫後之第3組動物 AAPP-在第四次免疫後之第4組動物 Combo-在免疫後之第5組動物 129296.doc •57- 200902054

Combo x 2_在第二次免疫後之第6組動物在括弧中指明量測時間點（在最後一次免疫後之第21 天、第56天或第112天）。細胞反應（囷2-3): 在所分析各時間點’數據顯示主要觀測到抵抗p24、rT 及Nef之CD4+ T細胞反應。如在圖2a及2b中所示（左側圖片），在最後一次免疫後21 天’在兩次蛋白/佐劑免疫後對兩次腺病毒免疫觀測到最面CD4+ T細胞反應（第4組動物）。與用P24、RT或Nef肽重新刺激後注射兩次蛋白/佐劑相比，注射一次腺病毒/蛋白/ 佐劑之組合可誘導更高CD4+ T細胞水平。對於藉由rt及 Nef進行重新刺激而言，用腺病毒/蛋白/佐劑之組合進行兩次免疫較用該組合進行一次免疫可誘導稍微更高之CD4+ T細胞反應而對於p24而言，一次或兩次免疫之反應係等同的。在所分析各時間點時’主要觀測到抵抗p24及RT肽之 CD8+ T細胞反應且未檢測到有顯著量CD8+ T細胞對Nef或 P17有特異性。如在圖2a及2b(右側圖片）中所示，在用腺病毒/蛋白/佐劑之組合進行一次或兩次免疫後，在最後一次免疫後2 1天CD8+ T細胞反應係相似的。在以如下方式免疫之各組中所觀測到抵抗P24之CD8反應彼此相當且稍微低於兩次經蛋白免疫繼而兩次經腺病毒免疫之組的此CD8 免疫反應：（i)兩次經腺病毒免疫或（ii)兩次經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫或（iii) 一次或兩次經腺病毒/蛋白/佐 129296.doc -58- 200902054 劑之組合免疫。在一次或兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫之組中所觀測到抵抗RT之CD8反應係相當的且稍微低於以如下方式經免疫組之此CD8反應：（i)兩次經腺病毒免疫或（ii)兩次經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫或（丨丨丨）兩次經蛋白免疫繼而兩次經腺病毒免疫。在稿後時間點（在最後一次免疫後第56天及第u 2天）亦分析CD4及CD8 T細胞反應，當可測定該等反應之持久性時（圖3a及3 b)。主要觀測到抵抗p24、rt及Nef之CD4反應 (圖3a及3b，左側圖片）。在此等時間點時，在兩次經腺病母·免疫繼而兩次經蛋白免疫之動物中觀測到最高CD4反應。一次或兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫之小鼠的 CD4反應彼此相當且通常較在兩次經蛋白免疫繼而兩次經腺病毒免疫之組中所觀測到該反應更高。在稍後時間點，在一次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫之組中抵抗p24之CD8反應係最高的（圖3b，右側圖片）。其與兩次經蛋白免疫繼而兩次經腺病毒免疫之動物的^別反應相田且稍祕尚於以如下方式經免疫之動物的反應： ⑴兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫或⑴）兩次經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫。後兩者之CD8反應彼此相當。抵抗RT之CD8反應係最高的且在以如下方式經免疫之組中係相似的：⑴兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫或⑼兩 _人經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫。以如下方式經免疫、’抵抗RT之CD8反應稍微較低但彼此相當（圖3):⑴兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫或（Η)兩次經蛋白免疫繼 129296.doc -59- 200902054 而兩次經腺料免疫。如在圖3a中所示（右側圖片），未檢測到有顯著量CD8+ τ細胞對Nef或pl7有特異性。抗體反應：如在圖4至8中所示，所檢測到抗體反應主要針對性地抵抗P24 (圖5)、RT (圖6)及Nef (圖8)。抗刊（圖句反模擬所觀測到抵抗各？24、灯或歸組份之反應且可錄如下： -在以如下方式經免疫之組中檢測到較低抗體反應或無抗體反應⑴兩次經腺病毒免疫或（Η) 一次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫； .通常在最後免疫後21天於兩次經蛋白免疫之組中檢測到最高抗體反應。然而，在此組中亦觀測到個體間存在最高變異性。另外，對於抗七#血清學而言，當與其他組對比時，兩次經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫之組似乎顯示最高反應； -在以如下方式經免疫之組中所觀測得反應係相當的 (在最後免疫後第21天出現峰值）且隨後隨時間逐漸降低.（1)兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫或（丨丨）兩次經蛋白免疫繼而兩次經腺病毒免疫或（iii)兩次經腺病毒免疫繼而兩次經蛋白免疫。在所有組中，抵抗P17之抗體反應（圖7)十分低以致於不可檢測。結論. 總體而言，在4次免疫後在AApp治療組中觀測到最高抗 129296.doc -60· 200902054 原特異性細胞介導之免疫反應。然而，當在2次免疫後對比各組（即，AA、PP及2xc〇mb〇組）時，僅在兩次經蛋白/腺病毒/佐劑組合免疫之組中觀測到抗原特異性CD4及cd8 τ 細胞反應誘導。另外，在單次注射蛋白/腺病毒/佐劑組合之後達成類似水平之CD4及CD8 τ細胞反應。而且，就持久性而言，在用蛋白/腺病毒/佐劑組合進行第2次免疫後 1 12天所觀測得抗原特異性τ細胞反應與在AApp治療組中第4次免疫後112天所觀測得抗原特異性丁細胞反應係相當的。最後，為了獲得與在兩次經佐劑化蛋白免疫之各組 (通¥具有最向抗體反應之組）中所獲得者相當之抗體反應似乎需要用蛋白/腺病毒/佐劑組合進行2次免疫。實例2 經共同調配在一起之pan7GRN腺病毒及Μ蛋白/佐劑B免疫之小鼠的免疫原性研究所用小鼠菌株係CB6F1 ’每個組9只小鼠。用F4蛋白（注射1/10之人類劑量，即，9 gg_10xl08個Pan7GRN病毒粒子存於50 μΐ^佐劑B或佐劑B稀釋液（1/2、1/4或1/10)中之共同調配物對小鼠進行免疫一次。在免疫後21天測定抵抗 Nef、pl7、P24或RT肽池之CD4及CD8細胞反應（每個組3組脾，每組3個脾）。實施下列示值讀出：細胞反應（圖9): -藉由在用P24、RT、Nef或P17之肽池重新刺激脾細胞過伙後在進行表面及胞内細胞因子染色後藉由流式細胞儀 129296.doc -61 - 200902054 里測。將脾細胞彙集在一起分析（每個組3組脾，每組3個脾）。結果 · 在圖9中印· T W不結果表示在用P24或RT肽池重新刺激後所觀測得細胞反應。 X軸標籤對應如丁：

Adj B-經9 F4/l〇8vppan7GRN/未經稀釋佐劑B免疫之小鼠 1/2 Adj B-經 9 F4/108vpPan7GRN/稀釋佐劑 B(l/2)免疫之小鼠 1/4 Adj B-經 9 叫 F4/108vpPan7GRN/稀釋佐劑 B(l/4)免疫之小鼠 1/10 Adj B-經 9 F4/108vpPan7GRN/稀釋佐劑 B(l/10) 免疫之小鼠未接受試驗者-未接受試驗之小鼠（未免疫）結果表明主要觀測到抵抗p24及RT之CD4 (圖9，左側圖片）及CD8(圖9，右側圖片）反應，對rt有特異性之CD8 丁細胞反應較對P24有特異性反應為低。另外，結果表明在經未經稀釋佐劑B或其1/2稀釋液免疫之組中在免疫後第21 天抵抗p24及RT之CD4反應係相似的。當該佐劑以1 /4加以稀釋時’此等CD4反應往往會降低。當該佐劑b以1 /1 〇加以稀釋時，所觀測得CD4反應係與經佐劑B之1/4稀釋液免疫之組的CD4反應相似。抵抗p24之抗-CD8反應係相當的，而與該佐劑是否以1 /2加以稀釋無關。然而，當佐劑b 129296.doc •62· 200902054 以丨/^加以稀釋時，該反應降低且當佐劑8以1/1〇加以稀釋時更疋如此。相反’其中所用佐劑劑量沒有實際劑量範圍效應的抗-RT CD8反應未見此等趨勢。結論：藉由單次投與含有下列之組合物來誘導抵抗F4組份之 CD4 +細胞及CD8 +細胞：免疫原性多狀、含有編碼免疫原性多肽之異源聚核苷酸之腺病毒載體及佐劑，即使當佐劑 ^ 被稀釋時。佐劑稀釋液之影響係不同的，此視相關抗原特異H CD4或CD8反應而定。特定言之，所觀測得最高反應抵抗？24且抗_1324(：1)4及（：1)81[細胞反應，顯示與疫苗組合使用之佐劑劑量相關的劑量範圍作用。儘管對抗_RT CD4 T細胞反應可觀測到相同作用，但組合使用之佐劑劑量之劑I範圍作用對抗-RT CD8 Τ細胞反應不太明顯。最後，倘若我們考慮到總體抗原特異性CD4& CD8 τ細胞反應及低抗4種抗原之綜合反應，則可觀測劑量範圍。實例3 : .¾ 相繼經Pan7GRN或F4/佐劑B或經共同調配在一起之腺病毒及蛋白組份免疫之新西蘭白兔的免疫原性研究對於F4/佐劑B免疫而言，注射人用劑量，即，存於5〇〇佐劑Β中之90叫F4蛋白。對於Pan7GRN免疫而言，使用存於500 μι鹽水中之10><1〇1〇或1〇><1〇12個病毒粒子。對於共同 6周配在一起之腺病毒及蛋白組份免疫而言，使用9〇 gg F4蛋白’ 10x10"個Pan7 GRN病毒粒子，存於500 μί佐劑B中。疫苗接種方案係如下： 129296.doc -63- 200902054 組第0天第14天第126天 1 F4/ adj B F4/ adj B F4/adj B 2 Pan7GRN 1〇Ί〇 Pan7GRN 10 10 3 Pan7GRN l〇'l2 Pan7GRN 10 12 4 F4/adj B/ Pan7GRN 10Λ11 F4/adj B/ Pan7GRN lO'll F4/adj B/ Pan7GRN lO'll 每個組有3隻兔子，只是第1組僅包含2隻兔子。實施下列示值讀出：抗體反應（對來自每個組每隻動物個體之血清實施 ELISA)： -低抗F4之抗體反應 _抵抗？4組份924、11丁、仏[及卩17之抗體反應淋巴組織增殖性反應：藉由在培育最後16小時於經氚標記之胸苷存在下經 Nef、P17、P24及/或RT肽池活體外重新刺激之外周血液單核細胞（在密度梯度離心後自全血分離）所吸收經氚標記之胸苷來測定淋巴組織增生。結果：淋巴組織增生性反應：士在圖1G中所tf，在兩次經蛋白免疫之組中觀測到最高淋巴組織增生性反應。在該組之所有兔子中觀測到兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免癌之叙4 口兄/文疋動物的淋巴組織增生性反應。該淋巴組織增生性反庫眚叭u — 久愿貫際上在一次注射後達峰值且在第3次注射腺病毒/蛋白/佐 W疋組合後可再次重現（與該第—次注射後達類似水平），卜 }此表明刖兩次注射並未誘導可抑制對進一步類似注射所连町所產生任一反應之中和反應。就 129296.doc • 64 . 200902054 :強度而言，在經腺病毒/蛋白/佐劑之所硯測得該增生性反貞“ 兄及之免子中毒性粒子㈠應與在—次或兩次㈣12個腺病毒病在=之動物中所觀測得增生性反應係相當的且似由兩次經1〇1°個腺病毒病毒性粒子免疫之動物中所觀測得增生性反應毒/蛋白/佐劑…可、Λ表明使用腺病 = :::腺病毒/蛋白/佐劑之組合後，在第二目人ι蛋白免疫之動物（第1組）觀測得反庳相似。血清學：如在圖11中所示，在兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫之動物中所觀測得抗_F4抗體反應之動力學與自兩次經蛋白免疫之動物所觀測得抗_F4抗體反應之動力學係相似 :匕在第2人;主射後第7天已觀測到且隨後隨時間降低。而京尤強度而3，當與兩次經蛋白免疫之動物的抗反應相比時，兩次經腺病毒/蛋白/佐劑之組合免疫之動物的抗-F4反應在稍後時間點仍為更高（在第2次免疫後第21 天及第63天）。在經10w個腺病毒病毒性粒子免疫—次之兔子中沒有觀測到抗-F4抗體反應。在經10i2個腺病毒病毒性粒子免疫一次之兔子中，僅在免疫後第21天及第63天檢測到抗-F4反應。在此組中，在免疫後時間點（d77)第63天所觀測得反應之高可變性係由對不同F4組份（具體而言，係 P24及RT，如分別在圖12a及圖12b中所示）顯示較高效價之單動物（3只動物）造成的。抗-F4抗體反應主要包含乾向 129296.doc -65- 200902054 p24及RT之抗體及極少量Nef及p 1 7。結論 · 在兩次注射含有下列之組合物後可在兔子中誘導淋巴組織增生性及抗體反應：免疫原性多肽、含有編碼免疫原性多肽之異源聚核苷酸的腺病毒載體及佐劑。另外，我們已證實在第三次注射此組合物後可恢復淋巴組織增生性反應。最後，對腺病毒/蛋白/佐劑組合觀測到最佳抗體反應 (就強度及持久性而言）。實例4 F4 (密碼子優化）/佐劑B及C7-GRN在作為組合投與時在 CB6F1小鼠中之免疫原性。實驗設計兩次（第0天及第21天）用下文所列示不同組合對CB6F1小鼠實施免疫。以存於5 0 μΐ佐劑B中之9 pg F4co/隻動物之劑量（1/10人用劑量）使用F4co/佐劑B且以108個病毒性粒子/隻動物使用C7-GRN病毒。實例4之F4co係按照在WO 2006/013106，實例1中所述密碼子優化方法製備得。組合

C7-GRN C7-GRN/佐劑 B C7-GRN/F4co C7-GRN/F4co/佐劑 B F4co

F4co/佐劑B 129296.doc -66- 200902054 佐劑B C7空白 C7空白/佐劑B C7 空白 /F4co C7空白/F4co/佐劑B 免疫方案及免疫反應分析在第0天及第21天實施免疫。在第21天、第28天（在2次免疫後第7天）、第42天（在2次免疫後第21天）及第77天（在2 次免疫後第56天）實施胞内細胞因子染色（〗cs)。結果 HIV特異性CD4 T細胞反應結果示於下圖中：圖13. HIV-1特異性CD4 T細胞之量化。在四個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD3 CD4 T細胞之％。用許多涵蓋F4序列之肽在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素（Brefeidin)之前2小時，隨後過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成。每個數值係5組小鼠（每組3隻）之幾何平均值。圖14. F4特異性CD4T細胞在兩次免疫後7天之頻率的分佈。表示每個方案之F4特異性循環CD4 τ細胞在兩次免疫後7天之頻率。各點表示對一組小鼠（3隻）所獲得之數值。囷15· F4特異性CD4T細胞在兩次免疫後7天之細胞因子生成。表示5組小鼠（每組3隻）分泌IL_2及/或吓^^之料特異性CD4 T細胞的％。表示F4e〇/佐劑b (a)、F4c〇/佐劑b 129296.doc •67- 200902054 空白⑻及F4eG/佐劑B /C7_grn (c)免疫之結果。 F4特異丨生循％CD4 τ細胞之頻率在用F4c〇/佐劑B組合免疫兩人後第21天達2.82%且在免疫後56天降低至〇.91%(圖 13)。兩劑單獨C7_GRN病毒在最後免疫後第？！天產生 0.52%之F4特異性循環CD4 τ細胞且佐劑B之存在並不會改變此反應。除F4co/佐劑Β外空白載體C7或重組C7_grn病毒之存在既不會增加亦不會干擾料特異性CD4 ^細胞反應之頻率（在最後免疫後21天分別為3.58%及2 82%)。即使沒有實施統計學分析，總體分佈表明F4特異性CD4 T細胞反應之強度在二個方案F4co/佐劑B、F4co/佐劑B/C7空白與F4co/佐劑 B /C7-GRN之間沒有差別（圖！ 4)。如所預計，在不投與佐劑B時投與F4co並不會誘導大量F4特異性CD4 T細胞。細胞因子生成之特性曲線顯示在用F4C0/佐劑B免疫後， F4特異性CD4 T細胞分泌lFN-γ及IL-2。在免疫方案中添加 C7空白或C7-GRN並不會改變此特性曲線。因此’此等數據表明在用F4co/佐劑B組合免疫後獲得最大F4特異性CD4 T細胞反應且C7-GRN病毒之存在既不改良亦不改變此反應。抗原特異性CD8 T細胞反應結果示於下圊中：圖16. HIV-1特異性CD8 T細胞之量化。在四個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD3 CD8 T細胞之％。用涵蓋F 4之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞 129296.doc -68· 200902054 (PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）且藉由 ICS量測細胞因子生成。每個數值係5組小鼠（每組3只）之幾何平均值。圖17. F4特異性CD8 T細胞在兩次免疫後7天之細胞因子生成。表示5組小鼠（每組3只）分泌IL-2及/或IFN-γ之F4 特異性CD8 T細胞的％。表示C7-GRN (A)、C7-GRN/佐劑B (B)及C7-GRN+F4co/佐劑B (C)免疫之結果。在一次注射後，重組載體C7-GRN誘導高頻率之F4特異性循環CD8 T細胞（9，70%之CD8 T細胞總量，在免疫後21 天）（圖4)。第二次注射並不加強F4特異性CD8 T細胞反應。F4co/佐劑B組合誘導低至不可檢測F4特異性CD8 T細胞且向C7-GRN中添加此組合不會改良或減弱F4特異性 C D 8 T細胞反應。 F4特異性CD8 T細胞反應在向C7-GRN中添加佐劑B時延遲，但在第二次免疫後21天與單獨的C7-GRN或與C7-GRN/F4co/佐劑B組合達相同水平。無論C7-GRN載體係單獨抑或與F4co/佐劑B組合注射， F4特異性CD8 T細胞均主要分泌IFN-γ (圖17)。令人感興趣的是，F4特異性CD8 T細胞反應在最後免疫後可持續長達56天而不會降低，此表明C7載體產生高水平且持續的CD8 T細胞。結論 F4co/佐劑B疫苗在CB6F1小鼠中誘導高頻率的多功能 HIV特異性CD4 T細胞但無HIV特異性CD8 T細胞。在相同 129296.doc •69· 200902054 動物模型中，表現Gag、RT及Nef之重組腺病毒C7(Ad C7-GRN)誘導高抗原特異性CD8 T細胞反應及低至不可檢測之抗原特異性CD4 Τ細胞。F4/佐劑Β與Ad C7-GRN之組合在同時產生抗原特異性CD4及CD8 T細胞。3種組份，F4co、佐劑B與C7-GRN之組合在同時產生最高水平之抗原特異性 CD4及CD8 T細胞。組合F4/佐劑B與Ad C7-GRN對各細胞免疫反應分支之強度具有加和作用。在此模型中，抗原特異性CD4 T細胞反應對抗原特異性CD8 T細胞反應功能之作用仍待測定。實例5 表現惡性癔原蟲CSP蛋白CS2構建體之黑猩猩腺病毒 C7(C7-CS2)在單獨投與時的免疫原性實驗設計：用一劑量範圍（l〇1G、1〇9及1〇8個病毒性粒子）之表現CSP 瘧疾抗原之C7黑猩猩腺病毒經肌内一次免疫CB6F1小鼠且在藉由ICS (細胞内細胞因子染色）注射後第21天、第28天及第35天測定CSP特異性（C-端及N-端）CD4及CD8 T細胞反應。 CSP特異性CD4 T細胞反應結果示於下圖中：圖18. CSP特異性CD4 T細胞之量化。在三個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD4 T細胞之％。用涵蓋CSP N-端或CSP C-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後 129296.doc -70- 200902054 過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成。將對C-端及N-端肽池之反應相加且每個數值係5組小鼠（每組4隻）之平均值。囷19. CSP特異性CD8 T細胞之量化。在三個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD8 Τ細胞之％。用涵蓋CSP Ν-端或CSP C-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成。將對c-端及Ν-端肽池之反應相加且每個數值係5組小鼠（每組4隻）之平均值。此等結果表明l〇1G及1〇9劑量之C7-CS2可產生類似水平之CSP特異性CD4 T細胞反應（峰值〇.5°/❶）及類似水平之CSP 特異性CD8 T細胞反應（峰值8°/。）。在其中測試C7-CS2與 RTS，S之組合之免疫原性的後續實驗中選擇1〇ig之C7_cs2 劑量（參見下文）。實例6 C7-CS2及RTS，S當作為一組合投與時在CB6F1小鼠中之免疫原性實驗設計：用瘧疾疫苗候選者RTS，S (5 gg)存於50 μΐ佐劑B中之組合（在下圖中稱作Ρ-Ρ-Ρ)或RTS，S (5 μ§)及C7_CS2(1010個病毒性粒子）存於5〇 μΐ佐劑B中之組合（在下圖中稱作C-C-C) 經肌内三次免疫CB6F1小鼠。在下列時間點測定CSP特異性（C-端及N-端）CD4及CD8T細胞反應： -在2次免疫後7天 -在3次免疫後7天、21天、35天及49天 129296.doc -71 · 200902054 藉由ICS (細胞内細胞因子染色）測定CSP特異性T細胞反應。在第3次免疫後第14天及第42天亦藉由ELISA測定免疫動物血清之CSP特異性抗體反應。 CSP特異性CD4 T細胞反應其結果示於下圖中：圖20. CSP(N-端）特異性CD4 T細胞之量化。在五個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD4 T細胞之％。用涵蓋CSP N-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成（IFNg及/或IL-2)。每個數值係4組小鼠（每組7只）之平均值。圖21. CSP(C-端）特異性CD4 T細胞之量化。在五個時間點給出每個免疫方案中分泌IFN-γ及/或IL-2之CD4 T細胞之％。用涵蓋CSP C-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）、且藉由ICS量測細胞因子生成（IFNg及/或IL-2)。每個數值係4組小鼠（每組7只）之平均值。此等結果表明經3次注射組合[RTS,S+C7-CS2 101Q+佐劑B] 免疫之小鼠較經3次注射RTS,S +佐劑B免疫之小鼠顯示更高抗原特異性CD4 T細胞反應（抵抗CSP之C-端及N-端部分）。 CSP特異性CD8 T細胞反應結果示於下圖中：圖22. CSP(N-端）特異性CD8 T細胞之量化。在五個時間 129296.doc -72- 200902054 點給出每個免疫方案中分泌Ι]ρΝ_γ及/或IL-2之CD8 T細胞之％ °用涵蓋CSP Ν-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成（IFNg及/或IL-2)。每個數值係4組小鼠（每組7隻）之平均值。圖23. CSP(C-端）特異性CD8 T細胞之量化。在五個時間點給出每個免疫方案中分泌11?]^_丫及/或il-2之CD8 T細胞之％ °用涵蓋CSP C-端序列之肽池在體内刺激周邊血液淋巴細胞（PBL)(在添加佈雷菲德菌素之前2小時，隨後過夜）且藉由ICS量測細胞因子生成（IFNg及/或IL-2)。每個數值係4組小鼠（每組7隻）之平均值。此等結果表明經3次注射組合[rtS，S + C7-CS2 1〇10 +佐劑 B]免疫之小鼠較經3次注射RTS，S+佐劑B免疫之小鼠顯示更高抗原特異性CD8 T細胞反應（抵抗CSP之C-端及N-端部分）。 CSP特異性抗體反應結果示於下圖中：圖24. CSP特異性抗體效價之量化。在第3次免疫後第14 天及第42天收集來自小鼠之血清。藉由ELISA量測此等金清各自之抗-CSP抗體效價。所示數據係抗體效價幾何平均值±95%置信區間。此等結果表明經3次注射組合[RTS，S+C7_CS2 1〇10+佐劑 B]免疫之小鼠與經3次注射RTS，S +佐劑B免疫之小鼠顯示類似CSP特異性抗體效價。結論 129296.doc -73- 200902054 RTS，S/佐劑B疫苗誘導高頻率之CSP C-端特異性CD4 Τ 細胞但無CSP Κί-端特異性CD4 Τ細胞。另外，rtS，S/佐劑 B疫苗誘導低至不可檢測之csp c& N-端特異性CD8 T細胞。在相同動物模型中，表現CSP之重組腺病毒C7誘導高 CSP(C-端及N-端）特異性CD8 τ細胞反應及較低以以^端 and N_端）特異性CD4 T細胞反應。RTS，S/佐劑B與Ad C7-CS2之組合在同時產生高水平之csp(c_端及冰端）特異性 CD4及CD8 T細胞。組合RTS，S/佐劑B及Ad C7_CS2對各τ 細胞反應分支之強度具有加和作用。最後，RTS，S/佐劑B 與Ad C7-CS2之組合產生與藉由RTS，S/佐劑B誘導者相當之高水平CSP特異性抗體反應。在本說明書中所提及所有參考文獻（包括專利案及專利申請案）以引用方式盡可能全面地倂入本文中。在整個本說明書及下文之申請專利範圍中，除非上下文另有規疋，否則，詞語，，包括（comprise)"及變化形式（例如 ”comprises”及” c〇mprising”）應理解為暗指包含所述整數、步驟、整數群或步驟群，但並不排除任驟、整數群或步驟群》他正數步本說明書及中請專利範圍形式部分之中請案可用作優先於任何後續申請案之依據。該後續中請案之中請專利範圍可揭不本文所述特點中之任—特點或料特點之組合。並可為產品、組合物、方法或應料請專利範圍之形式，I 可包括（例如但不限於）下述申請專利範圍。 129296.doc -74· 200902054 序列 SEQIDNol: 〆

1 atgggtgccc gagcttcggt actgtctggt ggagagctgg acagatggga 51 gaaaattagg ctgcgcccgg gaggcaaaaa gaaatacaag ctcaagcata 101 tcgtgtgggc ctcgagggag cttgaacggt ttgccgtgaa cccaggcctg 151 ctggaaacat ctgagggatg tcgccagatc ctggggcaat tgcagccatc 201 cctccagacc gggagtgaag agctgaggtc cttgtataac acagtggcta 251 ccctctactg cgtacaccag aggatcgaga ttaaggatac caaggaggcc 301 ttggacaaaa ttgaggagga gcaaaacaag agcaagaaga aggcccagca 351 ggcagctgct gacactgggc atagcaacca ggtatcacag aactatccta 401 ttgtccaaaa cattcagggc cagatggttc atcaggccat cagcccccgg 451 acgctcaatg cctgggtgaa ggttgtcgaa gagaaggcct tttctcctga 501 ggttatcccc atgttctccg ctttgagtga gggggccact cctcaggacc 551 tcaatacaat gcttaatacc gtgggcggcc atcaggccgc catgcaaatg 601 ttgaaggaga ctatcaacga ggaggcagcc gagtgggaca gagtgcatcc 651 cgtccacgct ggcccaatcg cgcccggaca gatgcgggag cctcgcggct 701 ctgacattgc cggcaccacc tctacactgc aagagcaaat cggatggatg 751 accaacaatc ctcccatccc agttggagaa atctataaac ggtggatcat 801 cctgggcctg aacaagatcg tgcgcatgta ctctccgaca tccatccttg 851 acattagaca gggacccaaa gagcctttta gggattacgt cgaccggttt 901 tataagaccc tgcgagcaga gcaggcctct caggaggtca aaaactggat 951 gacggagaca ctcctggtac agaacgctaa ccccgactgc aaaacaatct 1001 tgaaggcact aggcccggct gccaccctgg aagagatgat gaccgcctgt 1051 cagggagtag gcggacccgg acacaaagcc agagtgttga tgggccccat 1101 cagtcccatc gagaccgtgc cggtgaagct gaaacccggg atggacggcc 1151 ccaaggtcaa gcagtggcca ctcaccgagg agaagatcaa ggccctggtg 1201 gagatctgca ccgagatgga gaaagagggc aagatcagca agatcgggcc 1251 ggagaaccca tacaacaccc ccgtgtttgc catcaagaag aaggacagca 1301 ccaagtggcg caagctggtg gatttccggg agctgaataa gcggacccag 1351 gatttctggg aggtccagct gggcatcccc catccggccg gcctgaagaa 1401 gaagaagagc gtgaccgtgc tggacgtggg cgacgcttac ttcagcgtcc 1451 ctctggacga ggactttaga aagtacaccg cctttaccat cccatctatc 1501 aacaacgaga cccctggcat cagatatcag tacaacgtcc tcccccaggg 1551 ctggaagggc tctcccgcca ttttccagag ctccatgacc aagatcctgg 1601 agccgtttcg gaagcagaac cccgatatcg tcatctacca gtacatggac 1651 gacctgtacg tgggctctga cctggaaatc gggcagcatc gcacgaagat 1701 tgaggagctg aggcagcatc tgctgagatg gggcctgacc actccggaca 1751 agaagcatca gaaggagccg ccattcctga agatgggcta cgagctccat 1801 cccgacaagt ggaccgtgca gcctatcgtc ctccccgaga aggacagctg 1851 gaccgtgaac gacatccaga agctggtggg caagctcaac tgggctagcc 1901 agatctatcc cgggatcaag gtgcgccagc tctgcaagct gctgcgcggc 1951 accaaggccc tgaccgaggt gattcccctc acggaggaag ccgagctcga 2001 gctggctgag aaccgggaga tcctgaagga gcccgtgcac ggcgtgtact 2051 atgacccctc caaggacctg atcgccgaaa tccagaagca gggccagggg 2101 cagtggacat accagattta ccaggagcct ttcaagaacc tcaagaccgg 2151 caagtacgcc cgcatgaggg gcgcccacac caacgatgtc aagcagctga 2201 ccgaggccgt ccagaagatc acgaccgagt ccatcgtgat ctgggggaag 2251 acacccaagt tcaagctgcc tatccagaag gagacctggg agacgtggtg 2301 gaccgaatat tggcaggcca cctggattcc cgagtgggag ttcgtgaata 2351 cacctcctct ggtgaagctg tggtaccagc tcgagaagga gcccatcgtg 2401 ggcgcggaga cattctacgt ggacggcgcg gccaaccgcg aaacaaagct 2451 cgggaaggcc gggtacgtca ccaaccgggg ccgccagaag gtcgtcaccc 2501 tgaccgacac caccaaccag aagacggagc tgcaggccat ctatctcgct 2551 ctccaggact ccggcctgga ggtgaacatc gtgacggaca gccagtacgc 2601 gctgggcatt attcaggccc agccggacca gtccgagagc gaactggtga 2651 accagattat cgagcagctg atcaagaaag agaaggtcta cctcgcctgg 2701 gtcccggccc ataagggcat tggcggcaac gagcaggtcg acaagctggt 2751 gagtgcgggg attagaaagg tgctgatggt gggttttcca gtcacacctc 2801 aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac 2851 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaaagaag -75- 129296.doc 200902054

2901 acaagatatc cttgatctgt 2951 attggcagaa ctacacacca 3001 ggatggtgct acaagctagt 3051 caataaagga gagaacacca 3101 tggatgaccc ggagagagaa 3151 gcatttcatc acgtggcccg 3201 ctga SEQ ID No 2: 1 MGARASVLSG GELDRWEKIR 51 LETSEGCRQI LGQLQPSLQT 101 LDKIEEEQNK SKKKAQQAAA 151 TLNAWVKWE EKAFSPEVIP 201 LKETINEEAA BWDRVHPVHA 251 TNNPPIPVGE IYKRWIILGL 301 YKTLRAEQAS QEVKNWMTET 351 QGVGGPGHKA RVLMGPISPI 401 EICTEMEKEG KISKIGPENP 451 DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS 501 NNETPGIRYQ YNVLPQGWKG 551 DLYVGSDLEI GQHRTKIEEL 601 PDKWTVQPIV LPEKDSWTVN TEEAELELAE 651 TKALTEVIPL 701 QWTYQIYQEP FKNLKTGKYA 751 TPKPKLPIQK ETWETWWTEY 801 GAETFYVDGA ANRETKLGKA 851 LQDSGLEVNI VTDSQYALGI 901 VPAHKGIGGN EQVDKLVSAG 951 FLKEKGGLEG IjIHSQRRQDI 1001 GWCYKLVPVE PDKVEEANKG 1051 AFHHVARELH PEYFKNC ggatctacca cacacaaggc tacttccctg gggccagggg tcagatatcc actgaccttt accagttgag ccagataagg tagaagaggc gcttgttaca ccctgtgagc ctgcatggga gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta agagctgcat ccggagtact tcaagaactg

LRPGGKKKYK LKHIVWASRE LERFAVNPGL GSEELRSLYN TVATLYCVHQ RIEIKDTKEA DTGHSNQVSQ NYPIVQNIQG QMVHQAISPR MFSALSEGAT PQDLNTMLNT VGGHQAAMQM GPIAPGQMRE PRGSDIAGTT STLQEQIGWM NKIVRMYSPT SILDIRQGPK EPPRDYVDRP liLVQNANPDC KTILKALGPA ATLEEMMTAC ETVPVKLKPG MDGPKVKQWP LTEEKIKALV YNTPVFAIKK KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ VTVLDVGDAY FSVPLDEDFR KYTAFTIPSI SPAIFQSSMT KIIiEPFRKQN PDIVIYQYMD RQHLLRWGLT TPDKKHQKEP PFLKMGYELH DIQKLVGKLN WASQIYPGIK VRQLCKLLRG NREILKEPVH GVYYDPSKDL· IAEIQKQGQG RMRGAHTNDV KQLTEAVQKI TTESIVIWGK WQATWIPEWE FVNTPPIiVKL· WYQLEKEPIV GYVTNRGRQK WTLTDTTNQ KTELOAIYLA IQAQPDQSES ELVNQIIEQL· IKKEKVYLAW IRKVLMVGFP VTPQVPLRPM TYKAAVDLSH LDLWIYHTQG YFPDWQNYTP GPGVRYPLTF ENTSLLHPVS LHGMDDPERE VLEWRFDSRL SEQ ID No 3: 1 atggccgcca gagccagcat 51 gaagatcaga ctgaggcctg 101 tggtgtgggc cagcagagag 151 ctggagacca ccgagggctg 201 cgtgaaaacc ggcaccgagg 251 ccctgtactg cgtgcaccag 301 ctggacaaga tcgaggagat 351 ggccgctgcc gacaccggcg 401 tcatccagaa tgcccagggc 451 accctgaatg cctgggtgaa 501 agtgatccct atgttcagcg 551 tgaacgtgat gctgaacatt 601 ctgaaggaca ccatcaatga 651 cgtgcaggcc ggacccatcc 701 gcgacatcgc cggcaccacc 751 accggcaacc ctcccatccc 801 cctgggcctg aacaagattg 851 atatcaagca gggccccaag 901 ttcaaggccc tgagagccga 951 gaccgagacc ctgctggtgc 1001 tgaaggccct gggcagcggc 1051 cagggagtgg gcggacccgg 1101 gagccaggcc cagcagacca 1151 gccagaagcg gatcaagtgc 1201 agaaactgca gagcccccag 1251 agggcaccag atgaaggact cctgagcggg ggcaagctgg acgcctggga gcggcaagaa gaagtaccgg ctgaagcacc ctggatcgct tcgccctgaa tcctagcctg ccagcagatc atgaaccagc tgcagcccgc agatcaagag cctgttcaac accgtggcca cggatcgacg tgaaggatac caaggaggcc ccagaacaag agcaagcaga aaacccagca acagcagcaa agtgagccag aactacccca cagatgatcc accagaacct gagccccaga agtgatcgag gaaaaggcct tcagccccga ccctgagcga gggcgccacc ccccaggacc gtgggcggac accaggccgc catgcagatg ggaggccgcc gagtgggaca gactgcaccc cccctggcca gatcagagag cccagaggca tccacccctc aagaacagct gcagtggatg tgtgggcaac atctacaagc ggtggatcat tgcggatgta cagccccgtg tccatcctgg gagcccttca gagactacgt ggaccggttc gcaggccacc caggacgtga agggctggat agaacgccaa ccccgactgc aagagcatcc gccacactgg aggagatgat gaccgcctgc ccacaaggcc agagtgctgg ccgaggccat acatcatgat gcagcggggc aacttcagag ttcaactgcg gcaaggaggg ccacctggcc gaagaagggc tgctggaagt gtggcaagga gcaccgagag gcaggccaat ttcctgggca 76- 129296.doc 200902054 r i 1301 agatttggcc tagcagcaag ggcagacccg gcaatttccc cca白agcaga 1351 cccgagccca ccgcccctcc cgccgagctg ttcggcatgg gcgagggcat 1401 cgccagcctg cccaagcagg agcagaagga cagagagcag gtgccccccc 1451 tggtgtccct gaagtccctg ttcggcaacg atcctctgag ccagggatcc 1501 cccatcagcc ccatcgagac cgtgcccgtg accctgaagc ccggcatgga 1551 tggccccaaa gtgaaacagt ggcccctgac cgaggagaag attaaggccc 1601 tgaccgaaat ctgtaccgag atggagaagg agggcaagat cagcaagatc 1651 ggccccgaga acccctacaa cacccccatc ttcgccatca agaagaagga 1701 cagcaccaag tggcggaaac tggtggactt ccgggagctg aacaagagga 1751 cccaggactt ctgggaagtg cagctgggca tcccccaccc tgccggcctg 1801 aagaagaaga agtccgtgac agtgctggat gtgggcgacg cctacttcag 1851 cgtgcccctg gacgagaact tcaggaagta caccgccttc accatcccca 1901 gcaccaacaa cgagaccccc ggagtgagat accagtacaa cgtgctgcct 1951 cagggctgga agggcagccc cgccatcttc cagagcagca tgaccaagat 2001 cctggagccc ttccggagca agaaccccga gatcatcatc taccagtaca 2051 tggccgccct gtatgtgggc agcgatctgg agatcggcca gcacaggacc 2101 aagatcgaag agctgagggc ccacctgctg agctggggct tcaccacccc 2151 cgataagaag caccagaagg agcccccttt cctgtggatg ggctacgagc 2201 tgcaccccga taagtggacc gtgcagccca tcatgctgcc cgataaggag 2251 agctggaccg tgaacgacat ccagaaactg gtgggcaagc tgaattgggc 2301 cagccaaatc tacgccggca ttaaagtgaa gcagctgtgc aggctgctga 2351 gaggcgccaa agccctgaca gacatcgtga cactgacaga ggaggccgag 2401 ctggagctgg ccgagaacag ggagatcctg aaggaccccg tgcacggcgt 2451 gtactacgac cccagcaagg acctggtggc cgagattcag aagcagggcc 2501 aggaccagtg gacctaccaa atctaccagg agcctttcaa gaacctgaaa 2551 accgggaagt acgccaggaa gagaagcgcc cacaccaacg atgtgaggca 2601 gctggccgaa gtggtgcaga aagtggctat ggagagcatc gtgatctggg 2651 gcaagacccc caagttcaag ctgcccatcc agaaggagac ctgggaaacc 2701 tggtggatgg actactggca ggccacctgg attcctgagt gggagttcgt 2751 gaacaccccc cctctggtga agctgtggta tcagctggag aaggacccca 2Θ01 tcctgggcgc cgagaccttc tacgtggacg gagccgccaa tagagagacc 2851 aagctgggca aggccggcta cgtgaccgac agaggcagac agaaagtggt 2901 gtctctgacc gagacaacca accagaaaac cgagctgcac gccatcctgc 2951 tggccctgca ggacagcggc agcgaagtga acatcgtgac cgactcccag 3001 tacgccctgg gcatcattca ggcccagccc gatagaagcg agagcgagct 3051 ggtgaaccag atcatcgaga agctgatcgg caaggacaaa atctacctga 3101 gctgggtgcc cgcccacaag ggcatcggcg gcaacgagca ggtggacaag 3151 ctggtgtcca gcggcatccg gaaagtgctg tttctggacg gcatcgacaa 3201 ggcccaggag gaccacgaga gataccacag caactggcgg acaatggcca 3251 gcgacttcaa cctgcctccc atcgtggcca aggagatcgt ggccagctgc 3301 gataagtgtc agctgaaggg cgaggccatg cacggccagg tggactgcag 3351 ccctggcatc tggcagctgg cctgcaccca cctggagggc aaagtgattc 3401 tggtggccgt gcacgtggcc agcggctaca tcgaggccga agtgattccc 3451 gccgagaccg gccaggagac cgcctacttc ctgctgaagc tggccggcag 3501 atggcccgtg aaagtggtgc acaccgccaa cggcagcaac ttcacctctg 3551 ccgccgtgaa ggccgcctgt tggtgggcca atatccagca ggagttcggc 3601 atcccctaca accctcagag ccagggcgtg gtggccagca tgaacaagga 3651 gctgaagaag atcatcggcc aggtgaggga ccaggccgag cacctgaaaa 3701 cagccgtgca gatggccgtg ttcatccaca acttcaagcg gaagggcggc 3751 attggcggct acagcgccgg agagcggatc atcgacatca tcgccaccga 3801 tatccagacc aaggaactgc agaagcagat caccaagatt cagaacttca 3851 gagtgtacta ccgggacagc agggacccca tctggaaggg ccctgccaag 3901 ctgctgtgga agggcgaagg cgccgtggtg atccaggaca acagcgacat 3951 caaagtggtg ccccggagga aggccaagat tctgcgggac tacggcaaac 4001 agatggccgg cgatgactgc gtggccggca ggcaggatga ggacagatct 4051 atgggcggca agtggtccaa gggcagcatt gtgggctggc ccgagatccg 4101 ggagagaatg agaagagccc ctgccgccgc tcctggagtg ggcgccgtgt 4151 ctcaggatct ggataagcac ggcgccatca ccagcagcaa catcaacaac 4201 cccagctgtg tgtggctgga ggcccaggaa gaggaggaag tgggcttccc 4251 tgtgagaccc caggtgcccc tgagacccat gacctacaag ggcgccttcg 4301 acctgagcca cttcctgaag gagaagggcg gcctggacgg cctgatctac 77- 129296.doc 200902054 4351 4401 4451 4501 4551 4601 4651 agccggaagc ctacttcccc ccctgacctt gtggagaagg ccagcacggc acagcaggct tacaaggact ggcaggagat gactggcaga cggctggtgc ccacagaggg atggacgatg ggccctgaag gctga cctggatctg attacacccc ttcaagctgg cgagaacaac aggagcggga cacagagccc tgggtgtacc tggccctgga tgcctatgga agcctgctgc agtgctgatc aggaactgca acacccaggg gtgcggtatc gcccgacgaa accctatctg tggaagttcg cccagagttc SEQ ID No 4: 1 51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 Θ01 851 901 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551

CKW ^ERM

QVPLRPMTYK GAFDLSHFLK DWQNYTPGPG VRYPLTFGWC

LRPGCKKKYR LKHLVWASRE LDF GTEEIKSLFN TVATLYCVHQ R3 DTGDSSKVSQ NYPIIQNAQG QMIHQNLSPR MFSALSEGAT PQDLNVMLNI VGGHQAAMQM GPIPPGQIRE PRGSDIAGTT STPQEQLQWM NKIVRMYSPV SILDIKQGPK EPFRDYVDRF LLVQNANPDC KSILKALGSG ATLEEMMTAC QQTNIMMQRG NFRGQKRIKC FNCGKEGHLA MKDCTERQAN FLGKIWPSSK GRPGNFPQSR PKQEQKDREQ VPPLVSLKSL FGNDPLSQGS VKQWPLTEEK IKALTEICTE MEKEGKISKX WRKLVDFREL NKRTQDFWEV QLGIPHPAGL· DENFRKYTAF TIPSTNNETP GVRYQYNVLP FRSKNPEIII YQYMAALYVG SDLEIGQHRT HQKEPPFLWM GYELHPDKWT VQPIMLPDKE YAGIKVKQLC RLLRGAKALT DIVTLTEEAE KQGQDQWTYQ IYQEPFKNLK VIWGKTPKFK KDPIIiGAETF AILLALQDSG IYIiSWVPAHK TMASDFNLPP KVILVAVHVA

LPIQKETWET YVDGAANRET SEVNIVTDSQ GIGGNEQVDK XEIVASC SGYIEAEVIP

FTSAAVKAAC WWANIQQEFG HLKTAVQMAV FIHNFKRKGG

MAARASILSG

LETTEGCQQI

LDKIEEIQNK

TLNAWVKVIE

LKDTINEEAA

TGNPPIPVGN

FKALRAEQAT

QGVGGPGHKA

RNCRAPRKKG

PEPTAPPAEL

PISPIETVPV

GPENPYNTPI

KKKKSVTVLD

QGWKGSPAIF

KIEELRAHLL

SWTVNDIQKL LELAENREIXi

TGKYARKRSA

WWMDYWQATW

KLGKAGYVTD

YALGIIQAQP

LVSSGIRKVL

DKCQLKGEAM

AETGQETAYF

IPYNPQSQGV

IGGYSAGERX

LLWKGEGAW

MGGKWSKGSI

PSCVWLEAQE

SRKRQEILDL

VEKATEGENN

YKDC

GKLDAWEKIR MNQLQPAVKT SKQKTQQAAA EKAFSPEVIP EWDRLHPVQA IYKRWIIIjGL QDVKGWMTET RVLAEAMSQA CWKCGKEGHQ FGMGEGIASL TLKPGMDGPK FAIKKKDSTK VGDAYFSVPL QSSMTKILEP SWGFTTPDKK VGKIiNWASQI KDPVHGVYYD HTNDVRQLAE IPEWEFVNTP RGRQKWSLT DRSESELVNQ FLDGIDKAQE HGQVDCSPGI LLKLAGRWPV VASMNKELKK IDIIATDIQT IQDNSDI] VGWPEIREI EEEVGFPVRP WVYHTQGYFP SLLHPICQHG

PSKDLVAEIQ WQKVAMESI PLVKLWYQLE ETTNQKTELH IIEKLIGKDK DHERYHSNWR WQIACTHLEG KWHTANGSN IIGQVRDQAE KELQKQ工TKI PRRKAKIliRD RRAPAAAPGV

QNFRVYYRDS

YGKQMAGDDC

GAVSQDLDKH jDRFALNPSL

IIDVKDTKEA

RDPIWKGPAK

VAGRQDEDRS

GAITSSNINN

ERGGLDGLIY

FKLVPMEPDE

MDDEEREVLI WKFDSRLALK HRAQELHPEP SEQ ID No 5: 1 atgagggtga tggagatcca gcggaactgc cagcacctgc tgagatgggg 51 catcatgatc ctgggcatga ttatcatctg cagcaccgcc gacaacctgt 101 gggtgaccgt gtactacggc gtgcctgtgt ggagagatgc cgagaccacc 151 ctgttctgcg ccagcgacgc caaggcctac agcaccgaga agcacaatgt 201 gtgggccacc cacgcctgcg tgcctaccga tcccaaccct caggagatcc 251 ccctggacaa cgtgaccgag gagttcaaca tgtggaagaa caacatggtg 301 gaccagatgc acgaggacat catcagcctg tgggaccaga gcctgaagcc 351 ctgcgtgcag ctgacccccc tgtgcgtgac cctgaactgc agcaacgcca 401 gagtgaacgc caccttcaac tccaccgagg acagggaggg catgaagaac 451 tgcagcttca acatgaccac cgagctgcgg gataagaagc agcaggtgta 501 cagcctgttc taccggctgg acatcgagaa gatcaacagc agcaacaaca 551 acagcgagta ccggctggtg aactgcaata ccagcgccat cacccaggcc 601 tgccctaagg tgaccttcga gcccatcccc atccactact gcgcccctgc 651 cggcttcgcc atcctgaagt gcaacgacac cgagttcaat ggcaccggcc 701 cctgcaagaa tgtgagcacc gtgcagtgca cccacggcat caagcccgtg 751 gtgtccaccc agctgctgct gaacggcagc ctggccgaga gagaagtgcg 129296.doc 78- 200902054 801 gatcaggagc gagaacatcg ccaacaacgc caagaacatc atcgtgcagt 851 tcgccagccc cgtgaagatc aactgcatcc ggcccaacaa caatacccgg 901 aagagctaca gaatcggccc tggccagacc ttctacgcca ccgacattgt 951 gggcgacatc agacaggccc actgcaacgt gtccaggacc gactggaaca 1001 acaccctgag actggtggcc aaccagctgc ggaagtactt cagcaacaag 1051 accatcatct tcaccaacag cagcggcgga gacctggaga tcaccaccca 1101 cagcttcaat tgtggcggcg agttcttcta ctgcaacacc tccggcctgt 1151 tcaatagcac ctggaccacc aacaacatgc aggagtccaa cgacaccagc 1201 aacggcacca tcaccctgcc ctgccggatc aagcagatca tccggatgtg 1251 gcagcgcgtg ggccaggcca tgtacgcccc tcccatcgag ggcgtgattc 1301 gctgcgagag caacatcacc ggcctgatcc tgaccagaga tggcggcaac 1351 aacaattccg ccaacgagac cttcagacct ggcggcggag atatccggga 1401 caactggcgg agcgagctgt acaagtacaa ggtggtgaag atcgagcccc 1451 tgggcgtggc ccccaccaga gccaagagaa gagtggtgga gcgggagaag 1501 agagccgtgg gcatcggcgc cgtgtttctg ggcttcctgg gagccgccgg 1551 atctacaatg ggagccgcca gcatcaccct gaccgtgcag gccagacagc 1601 tgctgagcgg catcgtgcag cagcagagca atctgctgag agccatcgag 1651 gcccagcagc agctgctgaa gctgacagtg tggggcatca agcagctgca 1701 ggccagggtg ctggccgtgg agagatacct gagggaccag cagctcctgg 1751 gcatctgggg ctgcagcggc aagctgatct gcaccaccaa cgtgccctgg 1801 aatagcagct ggagcaacaa gagctacgac gacatctggc agaacatgac 1851 ctggctgcag tgggacaagg agatcagcaa ctacaccgac atcatctaca 1901 gcctgatcga ggagagccag aaccagcagg agaagaacga gcaggatctg 1951 ctggccctgg acaagtgggc caacctgtgg aactggttcg acatcagcea 2001 gtggctgtgg tacatcagat cttga

SEQ ID No 6: 1 MHVMEIQRNC QHLLRWGIMI LGMIIICSTA DNLWVTVYYG VPVWRDAETT 51 LFCASDAKAY STEKHNVWAT HACVPTDPNP QEIPLDNVTE EFNMWKNNMV 101 DQMHEDIISL WDQSLKPCVQ LTPLCVTLNC SNARVNATFN STEDREGMKN 151 CSFNMTTELR DKKQQVYSLF YRLDIEKINS SNNNSEYRLV NCNTSAITQA 201 CPKVTFEPIP IHYCAPAGFA ILKCNDTEFN GTGPCKNVST VQCTH6IKPV 251 VSTQLLLNGS LAEREVRIRS ENIANNAKNI IVQFASPVKI NCIRPNNNTR 301 KSYRIGPGQT FYATDIVGDI RQAHCNVSRT DWNNTLRLVA NQLRKYFSNK 351 TIIFTNSSGG DLEITTHSFN CGGEFFYCNT SGLFNSTWTT NNMQESNDTS 401 NGTITLPCRI KQIIRMWQRV GQAMYAPPIE GVIRCESNIT GLILTRDGGN 451 NNSANETFRP GGGDIRDNWR SELYKYKWK IEPLGVAPTR AKRRWEREK 501 RAVGIGAVFL GFLGAAGSTM GAASITLTVQ ARQLLSGIVQ QQSNLLRAIE 551 AQQQLLKLTV WGIKQLQARV LAVERYLRDQ QLLGIWGCSG KLICTTNVPW 601 NSSWSNKSYD DIWQNMTWLQ WDKEISNYTD IIYSLIEESQ NQQEKNEQDL 651 LALDKWANLW NWFDISKWLW YIRS SEQ ID No 7: atgaaagtga caccatgctc gggtcacagt ctattctgtg ttgggccaca tattgggaaa gaccagatgc atgtgtaaaa ataccactaa aggaaaggag agataaggtt caatagatga aggttgatac atcatttgaa ttctgaagtg gtcagcacag aggagaccag gaagaattat cagcacttgt 99agatgggg cttgggatgt tgatgatctg tagtgctgca gaacaattgt ctattatggg gtacctgtgt ggaaagaagc aactaccact catcagatgc taaagcatat gatacagagg tacataatgt catgcctgtg tacccacaga ccccaaccca caagaagtag tgtgacagaa tattttaaca tgtggaaaaa taacatggta atgaggatat aatcagttta tgggatcaaa gcttgaagcc ttaaccccac tctgtgttac tttagattgc gatgatgtga tagtactact accactagta atggttggac aggagaaata aaataaaaaa ctgctctttt aatatcacca caagcataag caaaaagaat atgcactttt ttataacctt gatgtagtac tgataatgct actaccaaaa ataaaactac tagaaacttt attgtaactc ctcagtcatg acacaggcct gtccaaaggt ccaattccca tacattattg tgccccggct ggttttgcga taacaataag acgtttgatg gaaaaggact atgtacaaat tacaatgtac acatggaatt aggccagtag tgtcaactca 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 129296.doc 79- 200902054 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1545 actgctgtta aatggcagtc tagcagaaga agaggtagta attagatctg acaatttcat ggacaatact aaaaccataa tagtacagct gaatgaatct gtagcaatta attgtacaag acccaacaac aatacaagaa aaggtataca tataggacca gggagagcct tttatgcagc aagaaaaata ataggagata taagacaagc acattgtaac cttagtagag cacaatggaa taacacttta aaacagatag ttataaaatt aagagaacac tttgggaata aaacaataaa atttaatcaa tcctcaggag gggacccaga aattgtaagg catagtttta attgtggagg ggaatttttc tactgtgata caacacaact gtttaatagt acttggaatg gtactgaagg aaataacact gaaggaaata gcacaatcac actcccatgt agaataaaac aaattataaa catgtggcag gaagtaggaa aagcaatgta tgcccctccc atcggaggac aaattagatg ttcatcaaat attacagggc tgctattaac aagagatggt ggtaccgaag ggaatgggac agagaatgag acagagatct tcagacctgg aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaagt tgaaccacta ggagtagcac ccaccagggc aaagagaaga gtggtgcaga gataa

SEQ ID No 8: MKVKETRKNY LFCASDAKAY DQMHEDIISL RKGEIKNCSF RLIHCNSSVM VSTVQCTHGI VAINCTRPNN KQIVIKLREH TWNGTEGNNT ITGLLLTRDG GVAPTRAKRR

QHLWRWGTML DTEVHNVWAT WDQSLKPCVK NITTSIRDKV TQACPKVSFE RPWSTQLLL NTRKGIHIGP FGNKTIKFNQ EGNSTITLPC GTEGNGTENE WQR

LGMLMICSAA HACVPTDPNP LTPLCVTLDC QKEYALFYNL PIPIHYCAPA NG5LA£] GRAFY； SSGGDPEIVR RIKQIINMWQ TEIFRPGGGD

\EEEW fAARKI

EQLWVTVYYG QEWLGNVTE DDVNTTNSTT DWPIDDDNA GFAILKCNNK IRSDNFMDNT IGDIRQAHCN HSFNCGGEFF EVGKAMYAPP MRDNWRSELY

^KEATTT 4WKNNMV

VPVWK YFNMWK TTSNGWTGEI TTKNKTTRNF TFDGKGLCTN KTIIVQLNES LSRAQWNUTL YCDTTQLFNS IGGQIRCSSN KYKWKVEPL 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 514 SEQ ID No 9: atgcatcaca cggccgcgtc cgataacttc cagctgtccc agggtgggca gggattcgcc 60 attccgatcg ggcaggcgat ggcgatcgcg ggccagatcc gatcgggtgg ggggtcaccc 120 accgttcata tcgggcctac cgccttcctc ggcttgggtg ttgtcgacaa caacggcaac 180 ggcgcacgag tccaacgcgt ggtcgggagc gctccggcgg caagtctcgg catctccacc 240 ggcgacgtga tcaccgcggt cgacggcgct ccgatcaact cggccaccgc gatggcggac 300 gcgcttaacg ggcatcatcc cggtgacgtc atctcggtga cctggcaaac caagtcgggc 360 ggcacgcgta cagggaacgt gacattggcc gagggacccc cggccgaatt catggtggat 420 ttcggggcgt taccaccgga gatcaactcc gcgaggatgt acgccggccc gggttcggcc 480 tcgctggtgg ccgcggctca gatgtgggac agcgtggcga gtgacctgtt ttcggccgcg 540 tcggcgtttc agtcggtggt ctggggtctg acggtggggt cgtggatagg ttcgtcggcg 600 ggtctgatgg tggcggcggc ctcgccgtat gtggcgtgga tgagcgtcac cgcggggcag 660 gccgagctga ccgccgccca ggtccgggtt gctgcggcgg cctacgagac ggcgtatggg 720 ctgacggtgc ccccgccggt gatcgccgag aaccgtgctg aactgatgat tctgatagcg 780 accaacctct tggggcaaaa caccccggcg atcgcggtca acgaggccga atacggcgag 840 atgtgggccc aagacgccgc cgcgatgttt ggctacgccg cggcgacggc gacggcgacg 900 gcgacgttgc tgccgttcga ggaggcgccg gagatgacca gcgcgggtgg gctcctcgag 960 caggccgccg cggtcgagga ggcctccgac accgccgcgg cgaaccagtt gatgaacaat 1020 gtgccccagg cgctgcaaca gctggcccag cccacgcagg gcaccacgcc ttcttccaag 1080 ctgggtggcc tgtggaagac ggtctcgccg catcggtcgc cgatcagcaa catggtgtcg 1140 atggccaaca accacatgtc gatgaccaac tcgggtgtgt cgatgaccaa caccttgagc 1200 tcgatgttga agggctttgc tccggcggcg gccgcccagg ccgtgcaaac cgcggcgcaa 1260 aacggggtcc gggcgatgag ctcgctgggc agctcgctgg gttcttcggg tctgggcggt 1320 ggggtggccg ccaacttggg tcgggcggcc tcggtcggtt cgttgtcggt gccgcaggcc 1380 tgggccgcgg ccaaccaggc agtcaccccg gcggcgcggg cgctgccgct gaccagcctg 1440 accagcgccg cggaaagagg gcccgggcag atgctgggcg ggctgccggt ggggcagatg 1500 ggcgccaggg ccggtggtgg gctcagtggt gtgctgcgtg ttccgccgcg accctatgtg 1560 atgccgcatt ctccggcagc cggcgatatc gccccgccgg ccttgtcgca ggaccggttc 1620 gccgacttcc ccgcgctgcc cctcgacccg tccgcgatgg tcgcccaagt ggggccacag 1680 gtggtcaaca tcaacaccaa actgggctac aacaacgccg tgggcgccgg gaccggcatc 1740 -80· 129296.doc 200902054 gtcatcgatc ccaacggtgt cgtgctgacc aacaaccacg tgatcgcggg cgccaccgac atcaatgcgt tcagcgtcgg ctccggccaa acctacggcg tcgatgtggt cgggtatgac cgcacccagg atgtcgcggt gctgcagctg cgcggtgccg gtggcctgcc gtcggcggcg atcggtggcg gcgtcgcggt tggtgagccc gtcgtcgcga tgggcaacag cggtgggcag ggcggaacgc cccgtgcggt gcctggcagg gtggtcgcgc tcggccaaac cgtgcaggcg tcggattcgc tgaccggtgc cgaagagaca ttgaacgggt tgatccagtt cgatgccgcg atccagcccg gtgatgcggg cgggcccgtc gtcaacggcc taggacaggt ggtcggtatg aacacggccg cgtcctag SEQIDNO10:

MHHTAASDNF QLSQGGQGFA IPIGQAMAIA GQIRSGGGSP TVHIGPTAFL GLGWDNNGN GARVQRWGS APAASLGIST CTVITAVDGA PINSATAMAD ALNGHHPGDV ISVTWQTKSG GTRTGNVTLA EGPPAEFMVD FGALPPEINS ARMYAGPGSA SLVAAAQMWD SVASDLFSAA SAFQSWWGL TVGSWIGSSA GLMVA^PY VAWMSVTAGQ AELTAAQVRV AAAAYETAYG LTVPPPVIAE NRAELMILIA TNLLGQNTPA IAVNEAEYGE MWAQDAAAMF GYAAATATAT ATLLPFEEAP EMTSAGGLLE QAAAVEEASD TAAANQLMNN VPQALQQLAQ PTQGTTPSSK LGGLWKTVSP HRSPISNMVS MANNHMSMTN SGVSMTNTLS SMLK3FAPAA AAQAVQTAAQ NGVRAMSSLG SSLGSSGLGG GVAANLGRAA SVGSLSVPQA WAAANQAVTP AARALPLTSL f TSAAERGPGQ MLGGLPVGQM GARAGGGLSG VLRVPPRPYV MPHSPAAGDI APPALSQDRF

ADFPALPLDP SAMVAQVGPQ WNINTKLGY NNAVGAGTGI VIDPNGWI/T NNHVIAGATD INAFSVGSGQ TYGVDWGYD RTQDVAVLQL RGAGGLPSAA IGGGVAVGEP WAMGNSGGQ GGTPRAVPGR WALGQTVQA SDSLTGAEET LNGLIQFDAA IQPGDAGGPV VNGLGQWGM NTAAS SEQID No 11: atgatgagaa aacttgccat cctcagcgtc agctctttcc tgttcgtgga 50 ggccctcttc caggagtatc agtgctacgg aagcagcagc aatacaaggg 100 tcctgaacga gctcaactat gacaacgctg gaacgaacct gtataacgag 150 ctggagatga actactatgg caagcaggag aactggtata gcctgaagaa 200 gaacagccgg tccctgggcg agaacgacga cggcaacaac aacaacggcg 250 acaacggcag ggagggcaaa gatgaggaca agagggacgg gaacaacgag 300 gataacgaga agctgcggaa gcccaagcac aagaaactca agcagcccgc 350 cgacgggaac ccggacccca atgcaaatcc caacgtcgac ccaaacgcaa 400 accctaacgt ggaccccaac gccaatccca acgtcgatcc taatgccaat 450 ccaaatgcca accctaacgc aaatcctaat gcaaacccca acgccaatcc 500 taacgccaac ccaaatgcca acccaaacgc taaccccaac gctaacccaa 550 atgcaaatcc caatgctaac ccaaacgtgg accctaacgc taaccccaac 600 gcaaacccta acgccaatcc taacgcaaac cccaatgcaa acccaaacgc 650 f aaatcccaac gctaacccta acgcaaaccc caacgccaac cctaatgcca 700 、 accccaatgc taaccccaac gccaatccaa acgcaaatcc aaacgccaac 750 ccaaatgcaa accccaacgc taatcccaac gccaacccaa acgccaatcc 800 taacaagaac aatcagggca acgggcaggg ccataacatg ccgaacgacc 650 ctaatcggaa tgtggacgag aacgccaacg ccaacagcgc cgtgaagaac 900 aacaacaacg aggagccctc cgacaagcac atcaaggaat acctgaacaa 950 gatccagaac agtctgagca ccgagtggtc cccctgctcc gtgacctgcg 1000 gcaacggcat ccaggtgagg atcaagcccg gctccgccaa caagcccaag 1050 gacgagctgg actacgccaa cgacatcgag aagaagatct gcaagatgga 1100 gaaatgcagct ctgtgttcaac gtcgtgaa ctccgccatc ggcctgtga 1149 SEQID No 12: MMRKLAILSV SSFLFVEALF QEYQCYGSSS NTRVLNELNY DNAGTNLYNE 50 LEMNYYGKQE NWYSLKKNSR SLGENDDGNN NNGDNGREGK DEDKRDGNNE 100 DNEKLRKPKH KKLKQPADGN PDPNANPNVD PNANPNVDPN ANPKVDPNAN 150 PNANPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNVDPNANPN 200 ANPNAWPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN PNANPNANPN ANPNANPNAN 250 PNANPNANPN ANPNANPNKN NQGNGQGHNM PNDPNHNVDE NANANSAVKN 300 NNNEEPSDKH IKEYLNKIQN SLSTEWSPCS VTCGNGIQVR IKPGSANKPK 350 DELDYANDIE KKICKMEKCS SVFNWNSAI GL 3 82 129296.doc -81 - 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2178 60 120 ieo 240 300 360 420 480 540 600 660 720 725 200902054 SEQ ID No 13: atgatggctc ccgatcctaa tgcaaatcca aatgcaaacc caaacgcaaa ccccaatgca aatcctaatg caaaccccaa tgcaaatcct aatgcaaatc ctaatgccaa tccaaatgca aatccaaatg caaacccaaa cgcaaacccc aatgcaaatc ctaatgccaa tccaaatgca aatccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca aatgcaaacc ccaatgcaaa tcctaataaa aacaatcaag gtaatggaca aggtcacaat atgccaaatg acccaaaccg aaatgtagat gaaaatgcta atgccaacag tgctgtaaaa aataataata acgaagaacc aagtgataag cacataaaag aatatttaaa caaaatacaa aattctcttt caactgaatg gtccccatgt agtgtaactt gtggaaatgg tattcaagtt agaataaagc ctggctctgc taataaacct aaagacgaat tagattatgc aaatgatatt gaaaaaaaaa tttgtaaaat ggaaaaatgt tccagtgtgt ttaatgtcgt aaatagttca ataggattag ggcctgtgac gaacatggag aacatcacat caggattcct aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct aattccagga tcaacaacaa ccaatacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaa 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1275

SEQ ID No 14; MMAPDPWANP NANPNANPNA NPNANPNAWP NANPNANPNA NPNANPNAMP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNK NNQGNGQGHN MPNDPNRNVD ENANANSAVK NNNNEEPSDK HIKEYLNKIQ NSLSTEWSPC SVTCGNGIQV RIKPGSANKP iCDELDYANDI EKKICKMEKC SSVFNWNSS IGLGPVTNME NITSGFLGPL LVLQAGFFLL TRILTIPQSL DSWWTSLNFL GGSPVCLGQN SQSPTSNHSP TSCPPICPGY RWMCLRRPII FLFILLLCLI FLLVLLDYQG MLPVCPiaPG STTTNTGPCK TCTTPAQGNS MFPSCCCTKP TDGNCTCIPI PSSWAFAKYL WEWASVRFSW LSLLVPFVQW FVGLSPTVWL SAIWMMWYWG PSLYSIVSPF IPLLPIFFCL WVYI 50 100 150 200 250 300 350 400 424 SEQ ID No 15: atggtcattg ttcagaacat acagggccaa atggtccacc aggcaattag tccgcgaact cttaatgcat gggtgaaggt cgtggaggaa aaggcattct ccccggaggt cattccgatg ttttctgcgc tatctgaggg cgcaacgccg caagacctta ataccatgct taacacggta ggcgggcacc aagccgctat gcaaatgcta aaagagacta taaacgaaga ggccgccgaa tgggatcgag tgcacccggt gcacgccggc ccaattgcac caggccagat gcgcgagccg cgcgggtctg atattgcagg aactacgtct acccttcagg agcagattgg gtggatgact aacaatccac caatcccggt cggagagatc tataagaggt ggatcatact gggactaaac aagatagtcc gcatgtattc tccgacttct atactggata tacgccaagg cccaaaggag ccgttcaggg actatgtcga ccgattctat aagacccttc gcgcagagca ggcatcccag gaggtcaaaa attggatgac agaaactctt ttggtgcaga atgcgaatcc ggattgtaaa acaattttaa aggctctagg accggccgca acgctagaag agatgatgac ggcttgtcag ggagtcggtg gaccggggca taaagcccgc gtcttacaca tgggcccgat atctccgata gaaacagttt cggtcaagct taaaccaggg atggatggtc caaaggtcaa gcagtggccg ctaacggaag agaagattaa ggcgctcgta gagatttgta ctgaaatgga gaaggaaggc aagataagca agatcgggcc agagaacccg tacaatacac cggtatttgc aataaagaaa 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 650 900 129296.doc -82- 200902054 aaggattcaa caaaatggcg aaagcttgta gattttaggg aactaaacaa gcgaacccaa gacttttggg aagtccaact agggatccca catccagccg gtctaaagaa gaagaaatcg gtcacagtcc tggatgtagg agacgcatat tttagtgtac cgcttgatga ggacttccga aagtatactg cgtttactat accgagcata aacaatgaaa cgccaggcat tcgctatcag tacaacgtgc tcccgcaggg ctggaagggg tctccggcga tatttcagag ctgtatgaca aaaatacttg aaccattccg aaagcagaat ccggatattg taatttacca atacatggac gatctctatg tgggctcgga tctagaaatt gggcagcatc gcactaagat tgaggaactg aggcaacatc tgcttcgatg gggcctcact actcccgaca agaagcacca gaaggagccg ccgttcctaa agatgggcta cgagcttcat ccggacaagt ggacagtaca gccgatagtg ctgcccgaaa aggattcttg gaccgtaaat gatattcaga aactagtcgg caagcttaac tgggcctctc agatttaccc aggcattaag gtccgacagc tttgcaagct actgagggga actaaggctc taacagaggt catcccatta acggaggaag cagagcttga gctggcagag aatcgcgaaa ttcttaagga gccggtgcac ggggtatact acgacccctc caaggacctt atagccgaga tccagaagca ggggcagggc caatggacgt accagatata tcaagaaccg tttaagaatc tgaagactgg gaagtacgcg cgcatgcgag gggctcatac taatgatgta aagcaactta cggaagcagt acaaaagatt actactgagt ctattgtgat atggggcaag accccaaagt tcaagctgcc catacagaag gaaacatggg aaacatggtg gactgaatat tggcaagcta cctggattcc agaatgggaa tttgtcaaca cgccgccact tgttaagctt tggtaccagc ttgaaaagga gccgatagta ggggcagaga ccttctatgt cgatggcgcc gcgaatcgcg aaacgaagct aggcaaggcg ggatacgtga ctaatagggg ccgccaaaag gtcgtaaccc ttacggatac caccaatcag aagactgaac tacaagcgat ttaccttgca cttcaggata gtggcctaga ggtcaacata gtcacggact ctcaatatgc gcttggcatt attcaagcgc agccagatca aagcgaaagc gagcttgtaa accaaataat agaacagctt ataaagaaag agaaggtata tctggcctgg gtccccgctc acaagggaat tggcggcaat gagcaagtgg acaagctagt cagcgctggg attcgcaagg ttcttgcgat ggggggtaag tggtctaagt ctagcgtagt cggctggccg acagtccgcg agcgcatgcg acgcgccgaa ccagccgcag atggcgtggg ggcagcgtct agggatctgg agaagcacgg ggctataact tccagtaaca cggcggcgac gaacgccgca tgcgcatggt tagaagccca agaagaggaa gaagtagggt ttccggtaac tccccaggtg ccgttaaggc cgatgaccta taaggcagcg gtggatcttt ctcacttcct taaggagaaa ggggggctgg agggcttaat tcacagccag aggcgacagg atattcttga tctgtggatt taccataccc aggggtactt tccggactgg cagaattaca ccccggggcc aggcgtgcgc tatcccctga ctttcgggtg gtgctacaaa ctagtcccag tggaacccga caaggtcgaa gaggctaata agggcgagaa cacttctctt cttcacccgg taagcctgca cgggatggat gacccagaac gagaggttct agaatggagg ttcgactctc gacttgcgtt ccatcacgta gcacgcgagc tgcatccaga atatttcaag aactgccgcc caatgggcgc cagggccagt gtacttagtg gcggagaact agatcgatgg gaaaagatac gcctacgccc ggggggcaag aagaagtaca agcttaagca cattgtgtgg gcctctcgcg aacttgagcg attcgcagtg aatccaggcc tgcttgagac gagtgaaggc tgtaggcaaa ttctggggca gctacagccg agcctacaga ctggcagcga ggagcttcgt agtctttata ataccgtcgc gactctctac tgcgttcatc aacgaattga aataaaggat actaaagagg cccttgataa aattgaggag gaacagaata agtcgaaaaa gaaggcccag caggccgccg ccgacaccgg gcacagcaac caggtgtccc aaaactacta a SEQ ID No 16:

MVIVQNIQGQ MVHQAISPRT LNAWVKWEE KAFSPEVIPM FSALSEQATP ODIiNTMLliTV GGHQAAMQML KETINEEAAE WDRVHPVHAG PIAPGQMREP RGSDIAGTTS TLQEQIGWMT NNPPIPVGEI YKRWIILGLN KIVRMYSPTS ILDIRQGPKE PFRDYVDRFY KTLRAEQASQ EVKNWMTETL LVQNANPDCK TILKALGPAA TLEEMMTACQ GVGGPGHKAR VLHMGPISPI ETVSVKLKPG MDGPKVKQWP LTEEKIKALV EICTEMEKEG KISKIGPENP YNTPVFAIKK KDSTKWRKLV DFRELNKRTQ DFWEVQLGIP HPAGLKKKKS VTVLDVGDAY 129296.doc -83- 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950 2000 2050 2100 2150 2200 2250 2300 2350 2400 2450 2500 2550 2600 2650 2700 2750 2800 2850 2900 2950 3000 3050 3100 3150 3200 3250 3300 3350 3400 3411 50 100 150 200 250 300 350 200902054

FSVPLDEDFR

KILEPFRKQN

TPDKKHQKEP

WASQIYPGIK

GVYYDPSKDL

KQLTEAVQKI

FVNTPPLVKL

WTLTDTTNQ

ELVNQIIEQL

WSKSSWGWP

CAWLEAQEEE

RRQDILDLWI

EANKGENTSL

NCRPMGARAS

NPGLLETSEG

TKEALDKIEE

KYTAFTIPSI

PDIVIYQYMD

PFLKMGYELH

VRQLCKIiLRG

IAEIQKQGQG

TTESIVIWGK

WYQLEKEPIV

KTELQAIYLA

IKKEKVYLAW

TVRERMRRAE

EVGFPVTPQV

VHTQGYFPDW

LHPVSLHGMD

VLSGGELDRW

CRQILGQLQP

EQNKSKKKAQ

NNETPGIRYQ

DLYVGSDLEI

PDKWTVQPIV TKALTEVIPL·

QWTYQIYQEP

TPKFKLPIQK

GAETFYVDGA

LQDSGLEVNI

VPAHKGIGGN

PAADGVGAAS

PLRPMTYKAA

QNYTPGPGVR

DPEREVLEWR

EKIRLRPGGK

SLQTGSEELR

QAAADTGHSN

YNVLPQGWKG

GQHRTKIEEL

LPEKDSWTVN

TEEAELELAE

FKNLKTGKYA

ETWETWWTEY

ANRETKLGKA

VTDSQYALGI

EQVDKLVSAG

RDLEKHGAIT

VDLSHFLKEK

YPLTFGWCYK

FDSRLAFHHV

KKYKLKHIVW

SLYNTVATLY

QVSQNY

SPAIFQSCMT

RQHLLRWGLT

DIQKLVGKLN

NREILKEPVH

RMRGAHTNDV

WQATWIPEWE

GYVTNRGRQK

IQAQPDQSES

IRKVLAMGGK

SSNTAATNAA

GOLEGLIHSQ

LVPVEPDKVE

ARELHPBYFK

ASRBLERFAV

CVHQRIBIKD 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1136 84- 129296.doc 200902054 【圖式簡單說明】圖1顯示質粒p73i_Tgrn構建之圖形表示；圖2-8顯示在實例1中所述實驗之結果，特定言之：圖2a、2b、3a、3b :在進行各種免疫方案後且在不同時刻時響應衍生自P24、RT、Nef及P1 7之若干肽池再刺激之 CD4+及CD8+T細胞反應；圖4 :對抗F4之抗體反應；圖5-8分別對抗F4組份p24、RT、pl7及Nef之抗體反應； (圖9顯示在實例2中所討論實驗之結果，特定言之：在進行各種免疫方案後響應若干衍生自卩24及RT之肽池再刺激的CD4+ T細胞反應；圖10-1 2顯示在實例3中所討論實驗之結果，特定言之：圖1 0顯示兔PBMC抵抗涵蓋F4序列之肽池的淋巴組織增殖性反應；圖11顯示抵抗F4之抗體反應的時程；圖12a及12b顯示分別抵抗F4組份p24及RT之抗體反應（第 I 77 天）；圖13顯示HIV-1特異性CD4 T細胞之量化；圖14顯示在兩次免疫後7天F4特異性CD4 T細胞頻率之分佈；圖15A至15C顯示在兩次免疫後7天F4特異性CD4 T細胞之細胞因子生成；圖16顯示HIV-1特異性CD8 T細胞之量化；圖17A至17C顯示在兩次免疫後7天F4特異性CD8 T細胞 129296.doc -85- 200902054 之細胞因子生成；圖18顯示CSP特異性CD4 T細胞之量化；圖19顯示CSP特異性CD8 T細胞之量化；圖20顯示CSP(N-端）特異性CD4T細胞之量化；圖21顯示CSP(C-端）特異性CD4 T細胞之量化；圖22顯示CSP(N-端）特異性CD8 T細胞之量化；圖23顯示CSP(C-端）特異性CD8 T細胞之量化；圖24顯示CSP特異性抗體效價之量化。序列表之概況胺基酸或聚核苷酸描述序列標識(SEQ ID No) HIV Gag-RT-Nef ("GRN，1)(亞型B) (cDNA) 1 HIV Gag-RT-Nef ("GRN”）（亞型B)(胺基酸） 2 HIV Gag-RT-整合酶-Nef ("GRIN")(亞型 A) (cDNA) 3 HIV Gag-RT-整合酶-Nef ("GRIN")(亞型A)(胺基酸） 4 HIV gpl40 (亞型 A) (cDNA) 5 HIVgpl40(亞型A)(胺基酸） 6 HIV gpl20 (亞型 B) (cDNA) 7 HIVgpl20(亞型B)(胺基酸） 8 TB抗原融合蛋白M72 (cDNA) 9 TB抗原融合蛋白M72 (胺基酸） 10 惡性瘧原蟲CS蛋白衍生抗原(cDNA) 11 惡性瘧原蟲CS蛋白衍生抗原(胺基酸） 12 惡性瘧原蟲CS蛋白衍生融合蛋白"RTS”(cDNA) 13 惡性瘧原蟲CS蛋白衍生融合蛋白nRTS” (胺基酸） 14 HIV p24-RT-Nef-pl7 (cDNA) 15 HIV p24-RT-Nef-pl7 (胺基酸） 16 上述序列可用作本發明例示性態樣中所用多肽或編碼多肽之聚核苷酸。該等多肽可由上述序列構成或包括上述序列。初始Met殘基係可選的。N-末端His殘基（包括緊跟初始Met之後的His殘基，如在SEQ ID No 9中）係可選的或可採用不同長度之N-端His標記（例如，通常可採用至多6個 129296.doc -86- 200902054

His殘基以便於分離該蛋」棘用相似^ . 序列之總長度範圍内具有明顯序：白，其在參考嫩。，例如，大於9G%，例如，大於㈣ ^如，大於之序列-致性），尤其#該 ° ’大於99% 災W丹有類似功能日且§* ( 而言“亥相似蛋白具有類似免疫原性時。舉例而言；耐文至多20(例如，至多1〇’如1-5)次取代(例如，保守取代）。可採用不同於彼等上文所述者且編碼相同蛋白或上述相似蛋白之核酸。可藉由習知方法（例如，使用blast) 測定序列一致性。在可述及的一個特定SEq ID No 1 6變體中，殘基398係Ser而非Cys。 129296.doc 87-

Claims

200902054 十、申請專利範圍： 1. -種組合在製備用於提高抵抗病原體之免疫反應之藥物的用途’其中該組合在各獨立容器中包括⑴一種或多種釘生自該病原體之第-免疫原性多肽；⑼-種或多種腺病母載體其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（丨丨丨）一種佐劑，其中該一種或多種第一免疫原性多肽、該—種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與。 2· —種組合在製備用於提高抵抗病原體之免疫反應之藥物的用途，其中該組合在各獨立容器中包括⑴一種或多種衍生自該病原體之第一免疫原性多肽與一種佐劑共同調配；及（ii)一種或多種腺病毒載體，其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；其中該一種或多種免疫原性多肽和佐劑與一種或多種腺病毒載體係伴隨投與。 3. 一種組合在製備用於刺激哺乳動物產生病原體特異性 CD4+及/或CD8+ T細胞及/或抗體之藥物的用途，其中該組合在各獨立容器中包括⑴一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽；（ii) 一種或多種腺病毒載體，其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（Ui)一種佐劑；其中該一種或多種第一免疫原性多肽、該一種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與。 4 · 種組合在製備用於提南抵抗病原體之免疫反應之藥物 129296.doc 200902054 的用途，其中該組合在各獨立容器中包括⑴一種或多種何生自該病原體之第—免疫原性多肽；一種或多種腺病毒載體，其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之弟一免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（丨丨丨）一種佐劑，其中該一種或多種免疫原性多肽、該一種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與；且視情況，重複該投藥。 5. 一種組合在製備用於提高抵抗病原體之免疫反應之藥物的用途，其中該組合在各獨立容器中包括⑴一種或多種衍生自該病原體之第一免疫原性多肽；（Η)一種或多種腺病毒載體’其包括一種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（iu) 一種佐劑’其中該一種或多種第一免疫原性多肽、該一種或多種腺病毒載體及該佐劑係伴隨投與；且其中沒有初免（priming)劑量的免疫原性多肽或編碼免疫原性多肽之聚核皆酸與該藥物一起投與。 6. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該一種或多種免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體及一種佐劑係共同調配。 7. 如請求項1至5中任一項之用途，其中刺激產生病原體特異性CD4+ T細胞和CD8+ T細胞及抗體。 8. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種實質上與該一種或多種第一免疫原性多狀中的一種或多種相同。 129296.doc 200902054 9.如請求項1至5 Φ紅 = 王> 中任一項之用途，其中該—種免疫原性多肽中姑—從1 > 夕 _ 中的—種或多種含有至少—種與該一種或夕第免疫原性多肽之一種或多種中所含抗相同的抗原。 10. 如β长項1至5中任_項之用途，其中該_種或多種第一免疫原性多肽包括至少-個Τ細胞抗原決定部位 (epitope) ° η.如請求項1至5中任-項之用途，其中該-種或多種第一免疫原性多肽包括至少一個B細胞抗原決定部位。 12. 如請求項1至5中任—項之用途’其中該一種或多種第一免疫原H多肽中的—種或多種及該_種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種共享一個或多個相同B細胞及/ 或T細胞抗原決定部位。 13. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種無實質上相同於或含有任

何與該一種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種共同之抗原。 14·如請求項⑴中任一項之用途’其中該一種或多種腺病毒載體衍生自人類腺病毒。 15.如請求項14之用途，其中該人類腺病毒血清型選自 Adi、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、Ad34 及 Ad35 ° 16.如請求項1至5中任一項之用途，其中該—種或多種腺病毒載體衍生自非人類靈長類腺病毒。 129296.doc 200902054 17·如請求項16之用途，其中該非人類靈長類腺病毒血清型選自黑猩猩腺病毒血清型Pan5、pan6、pan7及pan9。 1 8.如請求項i至5中任一項之用途，其中該病原體係HIV。 19·如請求項18之用途，其中該等免疫原性多肽含有選自下列之HIV衍生之抗原：Env、Nef、Gag及P〇l以及其免疫原性衍生物和免疫原性片段。 20_如請求項19之用途，其中第一免疫原性多肽係p24_RT_ Nef-p 1 7。 21. 如請求項19之用途，其中第二免疫原性多肽係Gag_RT_ Nef。 22. 如請求項丨至5中任一項之用途，其中該病原體係惡性瘧原轰（Plasmodium falciparum)反 / 或間 Q 癍原轰（pias_ modium vivax) 〇 23 ·如請求項22之用途，其中該等免疫原性多肽含有衍生自惡性瘧原蟲及/或間日瘧原蟲之抗原，該等抗原選自環子孢子（circumsporozoite)(cs)蛋白、Msp i、Msp_3、 AMA-1、LSA-1、LSA-3及其免疫原性衍生物或其免疫原性片段。 24·如請求項23之用途，其中一種/該免疫原性多肽係雜合 (hybrid)蛋白 RTS。 25·如請求項24之用途，其中RTS係以稱作尺以』之混合粒子形式存在。 26.如請求項23之用途，其中一種/該由聚核苷酸編碼之免疫原性多肽係惡性瘧原蟲之CS蛋白或其免疫原性片段。 129296.doc 200902054 27. 如凊求項1至5中任一項之用途，其中該病原體係結核分枝桿囷（Mycobacterium tuberculosis)。 28. 如請求項！至5中任一項之用途，其中該佐劑包括較佳之 Thl反應刺激劑。 29. 如請求項28之用途，其中該佐劑包括㈨门及/或3D_MpL 及/或CpG。 30. 如請求項29之用途’其中該佐劑包括QS21&3D_MpL。 31. 如請求項1至5中任一項之用途，其中該佐劑含有水包油乳劑。 32_如清求項1至5中任一項之用途’其中該佐劑含有脂質體。 ' 33. :種疫苗組合物’其包括⑴一種或多種衍生自病原體之第一免疫原性多肽；（ii)一種或多種腺病毒載體，其包括 -種或多種編碼-種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（iii)一種佐劑。 34. 如請求項33之疫苗詛人物，、口物其中§亥一種或多種第一免疫原性多肽中的一種忐夕去裡4夕種λ質上與該一種或多種第二免疫原性多肽中的—種或多種相同。 3 5 如清求項3 3或3 4之、危—^人丨疫田組合物，其中該一種或多種第一免疫原性多肽中的— 種或多種含有至少一種與該一種或多種第二免疫原性客 ’ 狀之一種或多種中所含抗原實質上相同的抗原。 3 6.如請求項3 3或3 4之谛—a人戈田组合物，其中該一種或多種第一免疫原性多肽包括 ^ ν 個Τ細胞抗原決定部位。 129296.doc 200902054 37.如請求項33或34之疫苗組合物，其中該一種或多種第一免疫原性夕肽包括至少一個B細胞抗原決定部位。 3 8.如請求項33或34之疫苗組合物，其中該一種或多種第一免疫原性夕肽中的一種或多種及該一種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種共享一個或多個相同B細胞及/ 或T細胞抗原決定部位。 39.如請求項33或34之疫苗組合物，其中該一種或多種第一免疫原性多肽中的一種或多種無實質上相同於或含有任何與該一種或多種第二免疫原性多肽中的一種或多種共同之抗原。 40·如請求項33或34之疫苗組合物，其中一種或多種腺病毒載體衍生自人類腺病毒。 41. 如請求項40之疫苗組合物，其中該人類腺病毒血清型選自 Adi、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、Ad34及 Ad35 ° 42. 如請求項33或34之疫苗組合物，其中一種或多種腺病毒載體衍生自非人類靈長類腺病毒。 43. 如請求項42之疫苗組合物，其中該非人類靈長類腺病毒血切型選自黑獲彳星腺病毒血清型Pan5、Pan6、Pan7及 Pan9 ° 44. 如明求項33或34之疫苗組合物，其中該病原體係ΗΙν。 45·如明求項44之疫苗組合物，其中該等免疫原性多肽含有選自下列之HIV衍生之抗原：Env、Nef、Gag、及P〇l及其免疫原性衍生物和其免疫原性片段。 129296.doc 200902054 46. 如請求項45之疫苗組合物 p24-RT-Nef-pl7。 47. 如請求項45之疫苗組合物 Gag-RT-Nef。其中第一免疫原性多肽係其中第二免疫原性多肽係 48.如β月求項33或34之疫苗組合物，其中該病原體係惡性瘧原蟲及/或間日癔原蟲。 49·如請求項48之疫苗組合物，其中該等免疫原性多肽含有衍生自惡性癔原蟲及/或間日癌原蟲之抗原，該等抗原選自環子孢子（CS)蛋白、Msp]、MSp_3、AH、 L S A 3及其免疫原性衍生物或其免疫原性片段。 50.如請求項49之疫苗組合物，其中一種/該免疫原性多㈣雜合蛋白RTS。 51. 如請求項50之疫苗組合物，其中RTS係以稱作尺乃』之混合粒子形式存在。 52. 如請求項49之疫苗組合物，其中一種/該由聚核苷酸編碼之免疫原性多肽係惡性癔原蟲之cs蛋白或其免疫原性片段。 53. 如凊求項33或34之疫苗組合物，其中該病原體係結核分枝桿菌。 54. 如請求項33或34之疫苗組合物，其中該佐劑包括較佳之 Thl反應刺激劑。 55. 如請求項54之疫苗組合物，其中該佐劑包括qs2丨及/或 3D-MPL及 / 或 CpG。 56·如請求項55之疫苗組合物，其中該佐劑包括qs2i及 129296.doc 200902054 MPL。其中該佐劑含有水包油其中該佐劑含有脂質 57.如請求項33或34之疫苗組合物，乳劑。 5 8.如請求項33或34之疫苗組合物體。 59. —種如請求項33至58中項之疫田組合物在製備用於刺激哺乳動物免疫反應之藥物的用途。 60. 如請求項33或34之疫苗紐人私甘、、· &物，其用於刺激哺乳動物免疫反應。牙套、且八包括⑴―種或多種衍生自病原體之第一免疫原！生夕肽，（u)—種或多種腺病毒载體，其& 多種編碼一種或多種衍生自該病原體之第二免疫原性多肽的異源聚核苷酸；及（iii)_種佐劑。 62. -種套組，其包括⑴_種或多種衍生自病原體之第一免疫原1·生夕肽及-種佐劑；及⑴卜種或多種第二腺病毒載體’其包括-種或多種編碼一種或多種衍生自該病原體之免疫原性多肽的異源聚核苷酸。 63·如請求項1至5及59中任-項之用途，其中該第一免疫原 I·生夕狀包括p24-RT-Nef-pl7，該佐劑包括於脂質體中之 3D-MPL及_，諸如本文佐劑B，且該腺病毒載體包括黑獲獲腺病毒血清型Pan7载體，其包括—個編碼免疫原性多肽Gag-RT-Nef之聚核苷酸，密碼子視情況優化。 64.如請求項⑴及59中任一項之用途，其中一種或兩種或所有忒等多肽、腺病毒載體及佐劑組份與醫藥上可接受 129296.doc 200902054 之賦形劑組合。 65.如請求項33或34之疫苗組合物，其中該第一免疫原性多肽包括P24-RT-Nef-P17，該佐劑包括於脂質體中之3D_ MPL及QS21 ’諸如本文佐劑B，且該腺病毒載體包括黑猩猩腺病毒血清型Pan7載體，該Pan7載體包括一個編碼免疫原性多肽Gag-RT-Nef之聚核苷酸，密碼子視情況優化。 66·如請求項33或34之疫苗組合物，其中一種或兩種或所有該等多肽、腺病毒載體及佐劑組份與醫藥上可接受之賦形劑組合。 67. 如請求項61或62之套組，其中該第一免疫原性多肽包括 P24-RT-Nef-P17，該佐劑包括於脂質體中之3D_Mpi^ QS21，諸如本文佐劑B，且該腺病毒载體包括黑猩猩腺病毒血清型Pan7載體’該Pan7載體包括一個編碼免疫原性多肽Gag-RT-Nef之聚核苷酸，密碼子視情況優化。 68. 如請求項61或62之套組，其中一種或兩種或所有該等多肽、腺病毒载體及佐劑組份與醫藥上可接受之織形劑組合0 129296.doc