TW200815597A - Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof - Google Patents
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Description
200815597 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於在多能幹細胞中維持自我更新表現型。 斤提供的方法和組合物適於培養和分離多能幹細胞,如胚 胎幹(ES)細胞,尤其是哺乳動物(包括大鼠、小鼠、牛、 綿豬和人類)幹細胞。特定而言,本發明係關於大鼠、 J亂$人頒多旎細胞的自我-更新培養物,及關於其方法和 組合物。 _ 【先前技術】 活體外多能幹細胞培養在含有血清和白血病抑制因子 (LIF)之培養基的存在之建立與維持係已熟知的等人 (j988) Nature 336:688_9())。這類方法已被用於維持得自小 鼠之”許可(permissive ),,品系的多能胚胎幹(ES)細胞超過 。午夕代。夕旎幹細胞培養物的維持和自我更新係在幹細胞 係餵養細胞(feeder eell)或其萃取物(通常是小鼠纖維母 細胞)的存在下培養中進一步支持。在這類條件下,有可 _ 能使人類ES細胞維持在多能狀態下,培養超過許多代。 在許多情況下,ES細胞僅可或最好使用含有血清或血 清萃取物的培養基(並因此是不確定的)維持,或使用需 要其他細胞(如用於維持人類ES細胞之纖維母細胞餵養 細胞)存在的細胞培養條件,並因此是不確定的。但任何 不確定的組份,無論在培養基中或是由例如餵養細胞產 生,均可能干擾或妨礙研究Es細胞繁殖和分化。這阻礙 了 ES細胞及其後代之治療和其他應用之良好製造實行的 5 200815597 發展。有些限定的ES細胞培養基是已知的,但需要另類 和較佳改良的限定培養基。 在申請者先前的申請案,WO_A-03/095628和較晚尚未 公開的申請案中,在包括(l)gpl30之激動劑(例如LIF)和 (2)TGF-/3超家族(例如BMP4)或Id信號路徑之激動劑的不 含血清培養基中培養多能幹細胞,如ES細胞,係用來促 進幹細胞的自我更新多代。在gpl3〇信號的存在下,Tgf_ 冷超家族或Id信號路徑之激動劑驚人地提供了自我更新的 刺激,而非前_分化信號。然而,始終想要在使多能細胞維 持在自我更新狀態方面之改善的效力,以及使多能細胞移 出離開饒養細胞或離開餵養細胞條件化培養基。
Sato N,等人,Nat· Med 2〇〇4,!月 1〇⑴第 55 63 頁, 描述肝糖合酶激酶3(GSK3)抑制劑,6_溴靛紅_3、肟,在含 有血清之培養基中,對小鼠和人類ES細胞的影響。然而, 僅在極短的期間内觀察到這些影響,太短以致於無法獲得 的確定結論,且在研究中使用的不確定培養基中之未知因 素的影響可能很重要。本發明人已經嘗試但無法重現結 果’事實上已發現結果與所描述的那些相反。 為了製備ES細胞培養基,以儘可能純的形式提供個 別培養基組份係所欲的。然而,大多數培養基組份是細胞 介素’其純度受累於需要在細胞系統中製造它們,然後從 生產液體培養基中移除可能的污染物。其他與某些細胞介 素有關的問題是它們具有狹窄的有效和無毒性濃度範圍。 具有較大範圍及/或在較高濃度下毒性較低的培養基組份將 6 200815597 是極為有用的。細胞介素在儲存時亦可能有有限的穩定 性,並尋找更穩定的培養基組份。 本發明的目標是克服或至少改善技術領域中之問題, 最好是提供另一種,更佳是改善的適合多能幹細胞之培養 方法以及培養基,其能夠支持該幹細胞的自我更新持續多 代。本發明更進一步的目標是提供另一種培養系統,其允 許活體外維持多能幹細胞培養物,直到以受控制之方式誘 導該細胞分化為止。本發明再更進一步的目標是提供方法 和組合物,其促進多能幹細胞的衍生和分離,並有助於其 從難以分離ES細胞之生物,或尚未從其中分離出多能幹 細胞之生物中衍生和分離。 【發明内容】 發明概述 根據本發明,多能幹細胞(如E S細胞)係培養在(較 佳是不含血清)包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑,或MEK 抑制劑和FGF受體之拮抗劑的培養基中。較佳的是,培養 基包括MEK抑制劑、GSK3抑制劑和FGF受體之拮抗劑(例 如小分子GSK3抑制劑和小分子MEK抑制劑和小分子FGFR 拮抗劑)。幹細胞的自我更新多代係藉此促進。因此,GSK3 和MEK的抑制、MEK和FGF受體信號的抑制,或GSK3、 MEK和FGF受體信號的抑制,在多能細胞中提供了自我 更新的刺激。 本發明有許多應用。可使用 GSK3和MEK、MEK和 FGFR,或GSK3、MEK和FGFR抑制的組合,使多能細胞 7 200815597 (尤其是ES細胞)生長,且在其已經衍生或生長在餵養 者的情況中,使多能細胞(尤其是ES細胞)適應在沒有 餵養細胞或一層餵養細胞(通常稱為餵養者或餵養細胞) 下生長。在培養中擴展幹細胞的方法,包括在GSK3抑制 劑和MEK抑制劑的存在下,在MEK抑制劑和FGF受體之 拮抗劑的存在下,或更佳的在GS〇抑制劑、MEK抑制劑 和FGF文體之拮抗劑的存在下培養細胞。可製備含有一或 多種GSK3抑制劑和MEK抑制劑、一或多種MEK抑制劑 和FGFR拮抗劑、且視需要一或多種MEK抑制劑、仍以 抑制劑和FGFR拮抗劑的培養基。可使用GSK3抑制劑和 MEK抑制劑、使用MEK抑制劑和FGFR拮抗劑、或使用 GSK3抑制劑、MEK抑制劑和FGFR拮抗劑來衍生ES細胞。 根據本發明第一項觀點,GSK3和MEK的抑制,更佳 的是全部三種GSK3和MEK和FGF受體的抑制,在多能 細胞中可用來促進細胞的自我更新。 【實施方式】 發明之詳細說明 提到多能細胞,包括但不限於提到胚胎幹(ES)細胞。 多能細胞,包括ES細胞的獨特特徵,包括表現多個與發 育之多能階段有關的基因、分化成代表出現在起源動物中 之任何和所有組織類型之細胞的能力、提供嵌合體的能 力、以及特別是提供嵌合體之生殖種系的能力。例如,會 預期真正的多能細胞,如ES細胞,表現許多(若非全部 的話)的多能-相關基因Nanog、〇ct4、FGF4、Sox-2和驗 8 200815597 性磷酸酶。特定而言,廣泛地認為Nanog、〇ct4和Sox_2 的表現,提供一細胞為ES細胞的決定性初步指標。亦廣 泛地認為在嵌合體中的生殖種系傳導(gemiine mission ),以及產生包括來自所有三個原始胚層(即 ^胚層、中胚層和外胚層)之分化細胞的畸㈣或畸胎癌的 月匕力,為一細胞為e S細胞的決定性指標。 提到GSK3抑制作用,意指抑制一或多個GSK3酵素。 因此,GSK3抑制劑可抑制GSK3酵素家族的一個成員、多 個成員或全部成員。GSK3料的家族為已熟知的,、並包 括但不限於GSK3-a和GSK3·々。己經描述了許多變體(參 見,例如 Schaffer 等人;Gene 2〇〇3; 3〇2(12):73 81)。在特 定的具體事實中,抑制GSK3_々。⑵心抑制劑亦為合 適的,而通常用.在本發明中的抑制劑抑制兩者。已知各種 GSK3抑制劑,舉例來說,抑制劑CHIR 98014、CHIR 99021、
aR-A0144_18、TDZD_8、SB216763 和沾415286。其他的 抑制劑為已知的,並可用在本發明中。此外,已經定出GSR、 /5活性位置之結構的特徵,並已經確認出與專一和非-專一 抑制劑產生交互作用的關鍵殘基(Bertrand等人;】Μ"扪d 3;333(2):393,7)。該結構特徵容許輕易地確認出額外 的GSK抑制劑。 呆呰具體事實的抑制劑是對GS3^和GsK3_a專一 的,實質上不抑制㈤且實質上不抑制_2。較佳的是, 抑制劑對人類GSK3相對於錢此及/或人類ede二有 至少⑽倍’更佳的是至少_倍,極佳的是至少_件 9 200815597 的選擇性,以IC5G值@之比例來測量;在此處,提到GSK3 IC50 值意指人類GSK3- /5和GSK3- α的平均值。利用CHIR 99021 和CHIR 98014觀察到良好的結果,兩者皆是對GSK3專一 的。在 Bennett C,等人,J_ Biol· Chem·,第 277 冊,第 34 號,2002年8月23日,第30998-31_4頁中,以及在Ring DB 等人,Diabetes,第 52 冊,2003 年 3 月,第 588-595 頁 中描述了 GSK3抑制劑的實例。使用CHIR 99021的適當濃 度是在0.01至100的範圍内,較佳是〇·1到20,更佳的是 〇·3到10微莫耳濃度。 亦可使用RNA介導之干擾(RNAi),便利地達成GSK3 抑制作用。典型地,將與整個GSK3基因或其部分互補的 雙股RNA分子導入多能細胞内,因此促進了 GSK3-編碼性 mRNA分子的專一降解。該轉錄後機制結果降低或廢止了 標靶GSK3基因的表現。使用RNAi達成GSK3抑制作用的 適當技術和草案係已知的。 提到MEK抑制劑,在本文中意指一般的MEK抑制劑。 因此,提到^ MEK抑制劑意指蛋白質激酶之MEK家族成員 的任何抑制劑,包括MEK1、MEK2和MEK3。亦提到MEK1、 MEK2和MEK3抑制劑。MEK抑制劑可抑制MEK激酶家 族的一個成員、數個成員或所有成員。技術領域中已知的 適當之MEK抑制劑的實例,包括但不限於MEK1抑制劑 PD1843 52 和 PD98059,MEK1 和 MEK2 之抑制劑 U0126 和 SL327,以及在 Davies 等人(2000)(Davies SP,Reddy H, Caivano M,Cohen Ρ·某些常用蛋白質激酶抑制劑的專一性 10 200815597 和作用機制(Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors.) Biochem J. 351, 95-105)中討論的那些。特定而言,當與其他已知的MEK 抑制劑比較時,已經發現PD184352具有高度的專一性和 效力。在 Zhang 等人(2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 10:2825-2828 中描述了 其他的 MEK 抑 制劑和MEK抑制劑的種類。 亦可使用RNA-介導之干擾(RNAi),便利地達成MEK _ 激酶的抑制作用。通常,將與整個MEK基因或其部分互 補的雙股RNA分子導入多能細胞内,因此促進了 MEK-編 碼之mRNA分子的專一降解。該轉錄後機制結果降低或廢 止了標靶MEK基因的表現。使用RNAi達成MEK抑制作 用的適當技術和草案係已知的。 已知許多確認激酶抑制劑,包括GSK3抑制劑和MEK 抑制劑的測定。例如,Davies等人(2000)描述了激酶測定, 其中在肽受質和放射性標示之ATP的存在下培養激酶。受 ⑩ 質被激酶磷酸化的作用,導致將標示併入受質内。將每個 反應各一等分固定在磷纖維素紙上,並以磷酸沖洗,移除 自由的ATP。然後測量在培養之後的受質活性,並提供激 酶活性的指標。可使用這類測定迅速地判定,在有或無候 選激酶抑制劑之下的相對激酶活性。Downey等人(1996) J Biol Chem.; 271(3 5):21005-2101 1 亦描述了 激酶活性的測 定,其可用來判定激酶抑制劑。 提到纖維母細胞生長因子(FGF)受體(FGFR)的拮抗 11 200815597 劑,意指FGF受體的多肽或小分子或其他拮抗劑,其典型 地會抑制FGFR1及/或FGFR2。因此,FGF受體拮抗劑可 以是FGF受體家族之一個、數個或所有成員(包括但不限 於 FGFR1、FGFR2、FGFR3 和 FGFR4 )的拮抗劑。FGF 受 體家族的成員通常包括三個類-免疫球蛋白功能域,並出現 酸性胺基酸的區域(酸性盒子),其可參與FGF家族成員與 FGF受體的結合作用。在某些情況下,僅包括兩個類-免疫 球蛋白功能部位的分子亦可能具有FGF受體的功能。許多 FGFR拮抗劑為已知的,包括但不限於 SU5402和 PD173074。許多FGFR拮抗劑為已知的,例如SU5402和 PD173074。SU5402的適當濃度是在微莫耳濃度的範圍内, 如從0.1-20uM,較佳的是0.5-lOuM,尤其是在1·5ιιΜ的 範圍内。吾人已經發現PD173074可取代SU5402,並在低 大約100-倍的濃度下完全有效,與其對FGF受體之較高親 和力一致。因此,PD173074的適當濃度是在1-200ηΜ的 範圍内,較佳的是從5-100ηΜ,尤其是在10-50ηΜ的範圍 内。亦已知藉著顯性抑制突變FGF受體的轉殖基因表現, 會抑制FGF受體傳訊。然而,在本發明之具體事實中,較 佳是使用小分子拮抗劑,而非以轉殖基因為基礎的拮抗作 用。 確認FGF受體之拮抗劑的適當測定是已知的。例如, 可使用其中經由FGF受體傳訊激活報導基因表現的細胞 株,評估可能拮抗劑的活性。 有利地發現ΜΕΚ抑制劑與GSK3抑制劑併用,而更佳 12 200815597 的是還有FGF受體拮抗劑,改善了 ES細胞的繁殖。 在較佳的具體事實中,使用在大約O.luM到大約25uM 之間的MEK抑制劑。更佳的是,使用在大約0. luM到大 約5uM之間的MEK抑制劑,再更佳的是從大約0·2ιιΜ到 2uM 〇 根據本發明的特佳培養基包括0.8uM PD184352、3uM CHIR99021及/或3uM SU5402。特佳的培養基包括0.8uM PD184352、3uM CHIR99021 和 3uM SU5402,較佳是在 N2B27 培養基中。可最佳化SU5402之濃度以配合不同的多能細 胞株,典型是在l-5uM(例如2uM)的範圍内。 在下文的實施例中,吾人已經在GSK3抑制劑連同MEK 抑制劑的存在下,而在特定的實施例中還有FGF受體之拮 抗劑,培養小鼠ES細胞,以促進自我更新。在其他特定 的實施例中,在培養中促進小鼠多能細胞之自我更新的方 法,包括抑制GSK3和MEK,或抑制GSK3、MEK和FGF 受體。 視需要亦可使用激活性gp 130下游信號,進一步藉著 抑制GSK3和MEK而提高自我更新之促進。有時將激活 gp 13 0下游信號之分子稱為gp 13 〇活化劑或gp 13 〇激動劑。 可藉著使用通過gp 130而產生作用的細胞介素,例如LIF 受體的細胞介素或其他激動劑,達成激活一或多個gp 13 〇 下游信號路徑。能夠經由gp 130產生作用,並因此激活gpl30 信號轉導的細胞介素,包括但不限於LIF、纖毛神經營養 因子(CNTF)、心肌營養素(cardiotrophin)、抑瘤素 13 200815597 (oncostatin)M、IL-6 加 sIL-6 受體、高 il-6 ( hyper IL-6) 和IL-11。適當之細胞介素包括模擬肽、融合蛋白或嵌合 體,其可經由gP130結合及/或激活信號發送。細胞介素經 由gp 13 0產生作用的角色,在血清的存在下完全確立,但 那些細胞介素保持未分化細胞的能力,在沒有血清時是有 限的。 本發明的優點是在GSK3抑制劑、MEK抑制劑、視需 要還有FGF受體拮抗劑的存在下,可使多能細胞生長在限 定的培養基中。與使用GSK3抑制劑、MEK抑制劑和:FGF 文體拮抗劑之組合有關的特殊優點,是培養基不必含有其 他的生長因子,如胰島素、N2B27或gpl3〇激動劑(例如 LIF)。因此,本發明能夠在不含血清、血清萃取物、餵養 細胞和餵養細胞萃取物的培養基中,以另類方式及/或改良 地培養E S細胞。 已經報告得自許多哺乳動物來源的所宣稱之胚胎幹細 胞,包括小鼠(Bradley 等人(1984) Nature 309:255-56)、美 洲貂(Mol Reprod Dev(1992) 12 月;33(4):418_31)、豬和綿 羊(J Reprod Fertil SuPPl(i991); 43:255-6〇)、倉鼠(Dev Bi〇l(1988) 5 月;127⑴:224_7)和牛(R〇ux 八_ Dev
Biol(1992); 在本文中之特定實施例使用小 鼠和人類ES細胞,還有得自初級外長物(〇utgr〇wths)的大 鼠細胞。應明瞭本發明之方法和組合物適合改編以培養其 他哺乳動物的多能細胞培養物,因此包括靈長類,尤其是 人類、齧齒動物,尤其是小鼠和大鼠,以及禽類多能幹細 14 200815597 胞’尤其是ES細胞。
本發明之第二項觀點,提供培養多能細胞(尤其是ES 細胞)的方法以促推ώ 1^ &運自我更新,其包括將細胞維持在含有 下列的培養基中: (1) GSK3之抑制劑;和 (2) MEK之抑制劑。 車乂仏的疋’該方法包括將細胞維持在含有下列的培養 基中: (1) GSK3之抑制劑; (2) MEK之抑制劑;和 (3) FGF受體之拮抗劑。 通系可使用本發明之方法使多能細胞(包括ES細胞) 生長在不含血清且不含血清萃取物的培養基中,該細胞先 别已經在血清或血清萃取物的存在下繼代。較佳的是,這 類方法亦在沒有餵養細胞及/或餵養細胞萃取物之下完成。 例如’可完成ES細胞的培養,包括下列步驟: -在培養中’視需要在一層餵養細胞上,將Es細胞維 持在多能狀態下; -繼代該E S細胞至少一次; -從培養基中撤除血清或血清萃取物,並撤除餵養者(若 有的話),使得該培養基不含银養者、金清和血清萃取物; 並 -隨後在GSK3之抑制劑、MEK抑制劑、視需要還有 FGFR拮抗劑的存在下,將ES細胞維持在多能狀態下。 15 200815597 更可視需要,可在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和gpl3〇 下游信號路徑之活化劑的存在下,將細胞維持在多能狀態 下。 本發明亦提供獲得ES細胞之轉染族群的方法,包括: -以編碼可選擇標記之構築體轉染ES細胞; -將ES細胞種入培養盤; -在MEK抑制劑、GSK3抑制劑、視需要還有FGFR拮 抗劑的存在下培養該ES細胞;並 -選擇表現該可選擇標記的細胞。 更可視需要,在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和gpl30 下游信號路徑之活化劑的存在下培養細胞。 可選擇標記可編碼抗生素抗藥性、細胞表面標記或其 他的可選擇標記,像是例如在EP-A-0695351中描述的, 且較佳包括編碼以可操作之方式與啟動子連接之可選擇標 冗的核苷酸序列,該啟動基因在想要的細胞中優先表現可 ^擇標記。 在更進一步的具體事實中,本發明提供培養多能,特 別是ES細胞的方法,包括下列步驟:將個別的細胞移至 培養容器中,如培養盤上個別的孔,並在GSK3抑制劑、 MEK抑制劑、視需要還有FGFR拮抗劑的存在下培養該細 胞,以便獲得多能,尤其是ES細胞的選殖族群,它們全 都是單一細胞的後代。可視需要,亦可在gp i 3 〇下游信號 路徑之活化劑的存在下培養該細胞。 一旦獲得ES細胞穩定的均質培養物,便可改變培養 16 200815597 條件,指揮細胞分化成—或多種選自外胚層、中驻層或内 胚層細胞命運的細胞類型。添加或撤除細胞介素和傳訊因 子’可能得以以高效率衍生特定的分化細胞料 將μ細胞維持在經由gpl30產生作用之細胞介素、= 抑制劑和GSK3抑制劑的存在下’然後撤除細胞介素但保 持GSK3抑制劑和MEK抑制劑,及/或加入更多能夠指揮 分化的信號分子’使ES、細胞朝向非_神經外胚層命運的分 化。或者,可將細胞維持在MEK抑制劑和gsk3抑制劑的 存在下,然後藉著撤除一或兩個抑制劑,及/或加入能夠指 揮分化之信號分子來指揮分化。上述方法全都視需要包括 獲得及/或分離為該製程之產物的經分化細胞的步驟。 本發明更進一步的觀點提供細胞培養基。一種培養基 可供多能,尤其是ES細胞的自我-更新,該培養基包括GSK3 之抑制劑、MEK之抑制劑、且視需要還有FGFR拮抗劑。 该培養基亦可視需要包括gp 13 〇下游信號路徑的活化劑。 本發明其他的培養基為幹細胞培養基,其包括GSK3之抑 制劑、MEK抑制劑、且視需要還有FGFR拮抗劑。所有的 培養基較佳都包括基礎培養基。在某些較佳的具體事實 中,所有的培養基都不含gp 13 0之激動劑,因此較佳不含 UF。 種這 本發明提供不含血清和血清萃取物的培養基 類的培養基包括: -基礎培養基, -MEK抑制劑; 17 200815597 •GSK3抑制劑;和 -鐵-運載蛋白; 其中該培養基視需要不含血清和血清萃取物。 该培養基較佳也包括FGFR拮抗劑。該培養基亦可視 需要包括gp 130下游信號路徑的活化劑。 對於夕犯幹細胞,尤其是大鼠或小鼠細胞,較佳的培 養基可不含血清和gpl30激動劑,並包括MEK抑制劑、GSK3
抑制劑和FGF受體之拮抗劑。可按照在本文中描述的,進 行培養基組份的取代。 基礎培養基是供給細胞碳及/或維生素及/或礦物質之 $要來源的培養基。基礎培養基通常不含蛋白質,且不能 T自己支持細胞的自我更新。鐵運載蛋白提供鐵的來源或 提供從培養基中攝取鐵的能力。適當的鐵運載蛋白包 鐵蛋白和脫鐵運鐵蛋白(ap〇transferrin)。較佳的是,培養 基更包括一或多個胰島素或類_胰島素生長因子和白蛋白 (最好是重組的),或白蛋白取代物,且不含餃養細胞和健 養細胞萃取物。培養基亦可包括細胞〉周亡之抑制劑,或任 何促進多能細胞維持培養的其他組份。 -種本發明的特殊培養基包括Mek抑制劑、GS以抑 制劑、胰島素、白蛋白和運鐵蛋白,彳或無額外的基礎培 養基。在該培養基令,可視需要納人uf,並可藉著其他 _30信號的活化劑取代,雖然較佳的培養基包、m 受體結合性細胞介素,LIF,其適當濃度通常是在 毫升到购單位/毫升之間,更佳的是在單位/毫升到5〇〇 18 200815597 單位/毫升之間,再更佳的是在100單位/毫升的範圍中。 GSK3和MEK抑制劑較佳係按照本文中的詳細說明。 本發明更提供從胚細胞中衍生多能細胞的方法,其包 括: (1) 獲得胚細胞; (2) 在MEK抑制劑、GSK3抑制劑、與可視需要還有F(}f 叉體之拮抗劑的存在下培養該胚細胞,以獲得内細胞團; (3) 使該内細胞團解離;
(4) 從解離的内細胞團中分離一個或多個細胞;並 (5) 在MEK抑制劑、GSK3抑制劑、與視需要還有 叉體之拮抗劑的存在下,培養經分離之一個或多個細胞。 ^丄可視需要,在MEK抑制劑、GSK3抑制劑和辟13〇下 私^號之活化劑的存在下培養經分離之—個或多個細胞。 亦可出現FGF受體之拮抗劑。 平乂狂的定 是持續…天的期間。較佳是在不含企清之培養基中培 養經分離之-個或多個細胞。通f,細胞係以團塊之 =接種至培養盤。亦較佳係在不含血清之培養基(視需; 缺少BMP受體之激動劑)中培養胚細胞。 ^更佳的是,根據本發明,以黏性培養完成細 養,其可藉著在培養受皙μ a ° 乂 、又貝上納入細胞附著蛋白而提升。 又4土者係根據本發明以單;a iiL i I # '、 需要細胞亦可巾:Γ來科多能細胞,雖然視 '"養中或以前_細胞聚集體之方 長;細胞亦可在小珠哎复 八生 次其他適當之骨架,如膜或其他夂維 19 200815597 結構上生長。 在本發明之實施例中使用的培養基,較佳亦包括血清 白蛋白。此可用於經過純化,或最好是重組之形式,若是 重、且开y式’其具有不含可能之污染因子、細胞介素等等的 叙培養基不需含有血清白蛋白,並可按照wnes等人 的描述,省略該組份或藉著其他巨大的蛋白質或藉著合成 聚合物(聚乙烯醇)置換之。 本發明特佳的培養基是完全確定的培養基。該培養基 不含任何不確定的組份,也就是所謂其内容物為未Z的了 或其可能含有不確定或未指定之變化因子的組份。使用完 全確定之培養基的優點是可衍生出培養和後續操作多能細 胞的有效且-致之草案。此外,亦發現可達成以較高之效 2和較大的預料性將細胞維持在多能狀態下,且在使用確 疋之培養基培養的細胞中,反應分化信號而誘導分化時, 比使用不確定之培養基更為均一。 本么月亦提供可用來作為培養基添加物的濃縮物,以 及用來製備培養基之組份的套組,所得的培養基是根據本 考X月的。本發明的一個套組包括第一和第二個容器,第— ^ 3有MEK抑制齊j,而第二個含有GSK3抑制齊j。較佳的 是,該套組包括第三個容器,含有F(JF受體之枯抗劑。套 ::可視需要包括再一個含“pl3〇下游信號之活化劑的 谷益。套組係較佳地調配的,以致於可將每個容器的内容 物加至培養基中’以獲得本發明之培養基。套組較佳含有 其個別組份的濃縮母溶液。 20 200815597
本發明之方法亦包括獲得分化細胞的方法,其包括按 照描述培養多能細胞,並容許或引起該細胞分化,其中該 細胞含有可選擇標記,其能夠在想要的分化細胞中,與其 他細胞-類型,包括多能幹細胞相比較,以不同的方式表現, 藉著可選擇標記的差異表現造成優先分離想要的分化細 胞,及/或使其存活及/或***。可選擇標記可在想要的分 化細胞中表現,但在其他細胞類型中不表現,或表現水平 可能在想要的分化細胞和其他細胞類型之間有差異,藉此 谷ό午遠擇可選擇標兄的表現。分化細胞可以是組織幹細胞 或祖先細胞,並可以是分化至終點的細胞。 通常,本發明還延伸至藉著下列任何本發明描述之方 法所獲得的細胞。本發明之細胞可用在用於藥物發現的分 析中。本發明之細胞也可用於細胞治療,並因此本發明之 方法包括使用ΜΕΚ之抑制作用和GSK3之抑制作用,視需 要還有FGF信號之拮抗作用的組合,以衍生及/或維持多 能細胞,自其衍生可供細胞治療用之細胞,並在細胞治療 中使用那些細胞。視需要,使用沒有gpl3〇下游信號之活 化劑的組合。 本發明更進一步之觀點,係關於MEK和fgf受體之 抑制,視需要與GSK3之抑制倂用的用途,其係用於促進 多能細胞的自我-更新。吾人已經發現MEK抑制劑與FGp 受體之拮抗劑的組合,有效地支持多能細胞在沒有添加细 胞介素或生長因子之不含血清的培養基中生長。 因此’本發明更進一步的觀點提供培養基,其包括“ΕΚ 21 200815597 劑和FGF受體之拮抗劑。臟抑制劑和⑽ =劑如同在本發明其他方面的相關說明。同樣地,培養 =可包括額相組份或因+,如同在本發明其他方 相關說明。 =發明的另—項觀點係提供祖抑制劑和FGF受體 之拮抗劑的用途’其係用以製造多能細胞用的培養基。
^發明亦提供培養多能細胞,並獲得該多能細胞之經 :木知群的方法,其可如本發明其他方面的描述便利地完 =因此’本發明更進一步的觀點係提供培養多能細胞以 使促進自我更新的方法,1
/、匕括將該細胞維持在包括MEK 抑制劑和FGF受體之拮抗劑的培養基中。 本發明之相關觀點係提供培養多能細胞的方法, 括下列步驟: a -在培養中,視需要在一層餵養細胞上,將Μ細胞維 持在多能狀態, -將該ES細胞繼代至少一次· -從培養基中撤除灰清或血清萃取物(若有的話),並撤 除餵養者(若有的話),使該培養基不含餵養者、血清和血 清萃取物;並 -隨後在MEK抑制劑和FGF受體之抑制劑的存在下, 將該ES細胞維持在多能狀態下。 本發明更進-步的觀點係提供獲得ES細胞 族群的方法,包括: 、、、木 -以編碼可選擇標記之構築體轉染es細胞; 22 200815597 ^ -將該ES細胞種入培養盤; -在MEK抑制劑和FGF受體拮抗劑的存在下,培養該 ES細胞,並 -選擇表現該可選擇標記的細胞。 亦提供不含血清和血清萃取物的細胞培養基,其包 括: -基礎培養基, -MEK抑制劑 • -FGF受體之拮抗劑;和 -鐵-運載蛋白。 MEK抑制劑和FGF受體之拮抗劑的組合,亦可用來 衍生新的多能細胞株。因此,本發明更進一步的觀點提供 從胚細胞中衍生多能細胞的方法,其包括: (1) 獲得胚細胞; (2) 在MEK抑制劑和FGF受體之拮抗劑的存在下培養 該胚細胞,以獲得内細胞團; ® (3)解離該内細胞團; (4) 從解離的内細胞團中分離一個或多個細胞;並 (5) 在MEK抑制劑和FGF受體之拮抗劑的存在下,培 養該經分離之一個或多個細胞。 本發明亦包含套組,其包括第一和第二個容器,第一 個含有MEK抑制劑,而第二個含有FGF受體之拮抗劑。 該套組亦可包括其他如本文中描述的容器及/或組份。 本發明更進一步之觀點係提供MEK抑制劑和FGF受 23 200815597 體之结抗劑在促進多能幹細胞(尤其是表現N_g之多能 幹細胞)之自我-更新上的用途。相關之觀點則提供擴展幹 、、.田胞紅群的方法,其包括在MEK抑制劑# 受體之抬 抗制的存在下,培養幹細胞。
上文敘述了本發明的許多優點,或是顯而易見的。可 確認細胞培養組份為相對上無毒性,且為細胞可通透的。 在本發明之特定具體事實中使用@ MEK抑制劑、GSK3抑 制片1和FGFR括抗劑,可㈣_ ^ ^ # $ m &㈣ 胞介素的純化相比較。製造重組蛋白可能很責,而產生小 分子培養基組份可能較便宜且在料時較穩定,並具有較 廣大的有效濃度範圍。 〜在下文中陳述的特定具體事實,在不含血清之完全確 定的培養基中,使用CHIR99〇21、pDi84352、視需要還 有灿402之組合,並提供改良的小鼠es細胞之自我更新, 只有極少的分化。當在BMP的存在下培養Μ細胞時,偶 爾有一些神經發生的報告。古 X王扪報σ 乂在本發明之實施例中並未看 現在在特定的實施例中進—牛 一 T ^步敘述本發明,並藉著圖 不說明之。 在實施例中,名詞2丨培養基或2丨係用來表示包括卿 =丨和卿受體之拮抗劑的培養基。如丨培養基或Μ 你用來表示包括mek抑制劑、GSK1仏… 利GSK3抑制劑和FGF受體之 七抗劑的培養基。 24 200815597 資施例 GSK-3i8抑制费I、MEK抑制割、培巷基和ES細胞自 我-更新 使小鼠和人類ES細胞生長在各種條件下,除非另行 陳述,均使用N2B27培養基,並在有或無GSK-3 /3抑制劑 CHIR 99021、AR-A0144-18、SB216763 和 SB415286,以 及MEK抑制劑PD184352之下。 製備N2B27培養基: N2 ΙΟΟχ母液。10毫升:混合1毫升胰島素(終濃度2.5 毫克/毫升)與1毫升脫鐵運鐵蛋白(終濃度10毫克/毫升)、 0.67毫升BSA(終濃度5毫克/毫升)、33微升黃體激素(終 濃度2微克/毫升)、100微升腐胺(終濃度1.6毫克/毫升)、 10微升亞硒酸鈉(終濃度3uM)和7.187毫升DMEM/F12。 儲存在4°C下,並在1個月内使用。 DMEM/F12-N2培養基··在100毫升DMEM/F12中加 入l毫升N2 10 0x母液。在DMEM/F12培養基中之每個N2 組份的終濃度為:胰島素,25微克/毫升;脫鐵運鐵蛋白, 100微克/毫升;黃體激素,6毫微克/毫升;腐胺,16微克 /毫升;亞硒酸鈉,30nM ;BSA,50微克/毫升。儲存在4 °C下,並在1個月内使用。 神經基礎(Neurobasal) /B27培養基:在100毫升神 經基礎™培養基中,加入2毫升B27和0.5-1毫升200mML-穀胺醯胺。儲存在4°C下,並在1個月内使用。 N2B27培養基:以1:1之比例,混合DMEM/F12-N2 25 200815597 培養基與神經基礎/B27培養基。從0.1M母液中,加入/3 -髄基乙醇至〇· ImM之終濃度。儲存在4°C下,並在1個月 内使用。 實施例1 在不含血清的培養基中,MEK抑制劑加GSK-3々抑制 劑足以維持小鼠ES細胞在(1)N2B27培養基和(2)完全確定 之培養基(DMEM/F12-N2)中自我-更新-數據未顯示。在含 有MEK抑制劑、GSK-3 /3抑制劑和LIF的培養基中,ES 細胞的自我更新被進一步改善(數據未顯示)。 實施例2 已顯示PD 1843 52 ( —種MEK抑制劑)會增加Nanog 在ES細胞中的水平(數據未顯示)。此外,已顯示以PD1843 52 處理之Nanog-/-ES細胞無法顯示ES細胞自我-更新的提 高。事實上,這些細胞分化(數據未顯示)。這證實藉著 PD184352提高ES細胞自我·更新之表現型是由Nanog介 導。 PD1 84352在重編程式(reprogram )之影響亦係藉著 測定在細胞融合的背景中NS細胞轉變為多能來調查。 將RH ES細胞(其組成性地表現dsHed螢光蛋白和潮 黴素抗藥性)與胎兒衍生之神經幹細胞(NS TGFP)(其表 現經由IRES與嘌呤黴素抗藥性連接的融合蛋白TauGFP) 融合。在一組融合中,在融合之前和之後以3uM PD184352 處理RH細胞3天。在對照組中不加PD184352。在融合之 後2 4小時,挑選處理和未處理的原始雜交細胞,然後種入 26 200815597 培養盤(圖1 A-C)。3天後在ES培養基中加入潮黴素和嗓呤 黴素選擇。評分表現dsRed2和GFP螢光,並顯示出ES形 態學的菌落(圖1D和E)。結果顯示PD184352 提高了ES-NS 雜交細胞菌落形成45-倍。有趣的是,在PD1 843 52處理之 RH細胞中,每個種入培養盤之雜交細胞所形成之雜交細 胞菌落的百分比剛好比Nanog過度表現性ES細胞低2-倍 (2.25%對4%)。該結果顯示PD 184352不僅提高了 ES細胞 自我-更新,還提高了在細胞融合之背景中的重編程式。該 影響可能是由在經處理之RH細胞中增加的Nanog水平所 介導。因此,若Nanog是内源地表現,則可使用MEK抑 制劑向上調節Nanog,並達成相關的影響,如增加重編程 式。 實施例3 人類ES細胞係培養在補充有GSK-3抑制劑CHIR99021 和MEK抑制劑PD184352的培養基中。 在培養基中加入LIF,進一步改善了細胞的繁殖(數據 未顯示)。 實施例4 小鼠ES細胞係培養在補充有GSK-3抑制劑CmR99021 和MEK抑制劑PD184352的培養基中。 在培養基中加入LIF,進一步改善了細胞的繁殖(數據 未顯示)。 實施例5 使小鼠和人類 ES細胞生長在含有 CHIR99021、 27 200815597 ^ PD184352和SU5402的培養基中’如下製備·· 三種抑制劑/拮抗劑的_虞^4
化合物 原始濃度 稀釋 在加至 中時的終濃唐 CHIR99021 10mM 儲存在-20°C下Η年 以20微升一等分等分 母液。一開始以N2B27 培養基1:10稀釋 =lmM。儲存在4°C下。 以1:333將稀釋母液加 至培養基中,製成3uM 之終濃度 3uM 所有的細胞株 均使用該濃度 PD184352 10mM 儲存在-20°C下>1年 以10微升一等分等分 母液。一開始以N2B27 培養基1:100稀釋=1 毫升100uM。儲存在4 〇C下。 以1:125加至培養基 中,終濃度為0.8uM 0.8uM — 某些細胞株生長 在變化範圍在 〇.5_lUm的濃度 下 SU5402 5mM 儲存在_20°C下>1年 一開始1:10稀釋 =0.5mM 在 N2B27 中。 以1:250加至培養基 中,終濃度為2uM 2uM 某些細胞株可能 需要最佳化, 範圍=l-5uM 製備DMEM/F12-N2培卷某 培養基· 在 100 毫升 DMEM/F12(Gibco 42400-010)中加入 1 毫 升N2 ΙΟΟχ母液。N2中每個組份在DMEM/F12培養基中 的終濃度為: 胰島素25微克/毫升 腐胺 16微克/毫升
運鐵蛋白]>〇〇微克/毫升亞石西酸鈉 30nM 黃體激素 6毫微克/毫升BSA 50微克/毫升 製備神經基礎/B27 : 28 200815597 在 100毫升神經基礎培養基(Gibco 21 103-049)中加入 2 毫升 B27(Gibco 17504-044)和 1-2M L-穀胺醯胺(TC 儲存 1:100)。 製備N2B27培養基: 以 1:1之比例混合DMEM/F12-N2培養基和神經基礎 /B27培養基。使用該培養基稀釋所有的化合物與生長細 胞。 使用該培養基維持人類ES細胞,與從129品系小鼠 中衍生及維持ES細胞,以及從非-許可的小鼠品系CBA和 C56/BL6中衍生ES細胞。 實施例6 小鼠ES細胞係在FGF受體之抑制劑和MEK抑制劑的 存在下培養。使用選擇性藥理學抑制劑SU5402和PD184352 以抑制FGF受體酪胺酸激酶與分別經由 MEK1/2激活 Erkl/2。吾人發現添加任一抑制劑便足以在含有LIF但不 供應BMP4之N2B27培養基中加強ES細胞繁殖(數據未顯 示)。未分化的培養物可在這些條件下持續繼代,同時保持 多能標記0ct4、Nanog和Rexl的表現。神經承諾(neural commitment)並未發生,儘管Id基因表現比在以LIF加BMP 維持之培養物少很多的。 係種入未添加LIF之N2B27培養基中(其為正常誘發 有效地發展成神經的條件)的ES細胞,若添加SU5402或 PD184352,維持數天為Oct4陽性和Soxl陰性的(數據未 顯示)。然而,這些細胞必定在繼代之後分化及/或死亡。 29 200815597 欲降低可能的毒性副作用,吾人使用低2.5倍的劑量,並 將兩種抑制劑混合在一起。在含有0.8uM PD184352加2uM SU5402的N2B27中,一開始觀察到一些分化,但ES細胞 在繼代後存留並擴展(數據未顯不)。在這兩個抑制劑(2i)條 件中,比在LIF的存在下,存活能力更低,且族群加倍的 時間更慢,但有效地限制了分化。該發現暗示ES細胞自 我-更新的最低需求可能係偏離由FGF受體發出的分化信 號和Erk信號,同時避免危及細胞生長和存活。 _ 實施例7 吾人推論ES細胞在2i培養基中減少的生長,可能是 因為由pErk下游的Rsk釋放抑制性碟酸化之後的肝糖合酶 激酶3(GSK-3)之增加的活性。CHIR99021是完全定出特 徵、高度選擇性的GSK-3之小分子抑制劑,其在完全阻斷 GSK-3活性的濃度下,與週期素-依賴性激酶(CDKs)沒有交 互作用。當在血清的存在下加至培養基中時,吾人發現 CHIR99021(3uM)實際上促進了分化,即使是在LIF的存在 — 下。在不含血清的N2B27培養基中,分化反應減少,而且 有些菌落在形態學上呈現未分化,持續數天。然而,未分 化的細胞在繼代後不能存留。利用另外兩種廣泛使用的 GSK-3抑制劑,SB216763和SB415286觀察到類似的結果, 雖然兩者好像對ES細胞略有毒性。 然而,當將CHIR99021與2i混合時,分化反應完全 喪失。此外,CHIR99021調節對2i的反應,使得ES細胞 生長成密集的三維菌落,而非典型在LIF加血清/BMP或2i 30 200815597 中看到的平坦單層。在:r插^ 種抑制劑(h)中分化是微不足道 的,且ES細胞迅速地繁飱 ^ ^七 殖取重要的未分化菌落在繼代 後以高效率生長。兩個獨立 n a親代ES細胞株的衍生物, E14Tg2a和CGR8,顯示扁;丄 .貝不在3ι中有強健的長期擴展,且有 很少或沒有明顯的分化(數摅去 一 K數據未顯不它們表現〇ct4、Nan〇g 和Rex 1,但沒有顯示出可突 出j察覺的品系承諾標記(Hneage commitment marker) Gata4 > s〇vi -V' u ^ 一 5〇χ1或brachyury的表現(數
據未顯示)。在大量培養時,E S知日Θ1 · rK
T 細胞在3ι中以可與在LIF 加BMP中相比擬的加倍速率 芘您手擴展,且〇ct4_GFp陽性之未 分化細胞的比例仍維持9〇%以上。 因此’可在缺少血清或添加性細胞介素下使用%培養 基來培養E S細胞而不會分化。 實施例8 料調配物支持ES細胞自我_更新之充分性的嚴格測 試,是由個別細胞之未分化菌落的形成。在單一細胞沉積 之後,在N2B27加3i中的選殖效力為25%(98/384),比利 用LIF加BMP更高⑴〇/〇,23/m) _數據未顯示。這些菌落 表現Oct4-GFP,並可以未分化Es細胞之方式繼代。因此, 包括MEK抑制劑、FGF受體之抑制劑和GSK3抑制劑的培 養基能夠支持衍生自單一細胞之未分化ES細胞菌落的形 成0 實施例9 吾人檢查31是否能適合用於直接從胚胎中衍生新的ES 細胞,或反映已建立的品係之修改。直接將得自許可129 31 200815597 品系之胚細胞種入N2B27加3i之明膠-塗覆的塑膠盤上, 並培養5天。在隨後解離並再次接種内細胞團之後,從12 個胚胎的7個中獲得E S細胞菌落。擴大這些之中的三個, 並注射到胚細胞内。全都得到高比率的嵌合作用和生殖系 傳導(表1)。隨後,吾人從C57BL/6和非許可的CBA和 MF1品系中衍生出多個ES細胞,表示3 i有助於從外胚層 變遷成ES細胞。吾人斷論3i使ES細胞自對外源LIF和BMP/ 血清的需求解放,而沒有選擇或危及發育潛力。 表1 -在3i中衍生之ES細胞對嵌合體以及生殖系後代之產 生的貢獻 細胞株 所注射胚胎 的數目 活產之仔鼠 的數目 嵌合體 的數目# 測試-配對 的數目 傳導的數目1 CPS1 64 16 12 8(5m? 3f) 3f CPS2 21 5 4 3(lm? 2f) 2f CPS3 20 15 11 4(3m,If) 2m 32 1 藉著被毛顏色偵測的129/Ola ES細胞基因組的嵌合 作用和傳導 #認為是XX的ES細胞。 因此,將ES細胞可維持在GSK3抑制劑和MEK抑制 劑、MEK抑制劑和FGF受體之拮抗劑、或視需要GSK3抑 制劑、MEK抑制劑和FGF受體之拮抗劑的組合中,且本 發明亦提供其培養方法和培養基。 【圖式簡單說明】 圖1顯示在多能ES-NS雜交細胞菌落的形成中, PD1 84352之影響的分析。(A-C)-RHxNS TGFP融合之紅和 200815597 綠螢光的FACS分析。(A)在PEG處理之後24小時的融合 混合物;(B)在A中FACS挑選之雜交細胞的純度檢查。((:) 將在A中挑選的雜交細胞接種至培養盤,並按照每盤雜交 細胞的菌落百分比,對所形成之菌落評分。這些分數考慮 FACS挑選之細胞的純度。(D)數據的摘要。(E)雜交細胞菌 落形態學的實例。 圖2顯示根據本發明衍生並維持的老鼠ES細胞,並 藉著這些ES細胞顯示高效率的嵌合體貢獻。 _ 圖3顯示根據本發明生長的繼代4老鼠ES細胞;以 及 圖4顯示根據本發明生長的老鼠ES細胞,為Oct4陽 性的。 【主要元件符號說明】 無 參 33
Claims (1)
- 200815597 十、申請專利範圍: 1 · 一種培養基,其包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑。 2·如申請專利範圍第丨項之培養基,其更包括fgf受 體之拮抗劑。 3.如申請專利範圍第1項之培養基,其中該MEK抑制 劑為MEK1抑制劑。 4·如申請專利範圍第1項之培養基,其中該MEK抑制 劑係選自 PD184352 和 PD98059。 5·如申請專利範圍第1項之培養基,其中該GSK3抑 制劑為GSK-3点之抑制劑。 6_如申請專利範圍第1項之培養基,其中該GSK3抑 制劑對GSK3相對於對cdc2及/或erk2有選擇性。 7·如申請專利範圍第6項之培養基,其中該GSK3抑 制知彳對GSK3的選擇性勝過cdc2至少1 〇〇倍。 8·如申請專利範圍第6項之培養基,其中該GSK3抑 制劑對GSK3的選擇性勝過cdc2至少200倍。 9·如申請專利範圍第1項之培養基,其中該GSK3抑 制劑為 CHIR99021。 10·如申請專利範圍第1項之培養基,其更包括gp 130 激動劑。 11.如申請專利範圍第10項之培養基,其中該gp 130 /放動劑係選自LIF、CNTF、心肌營養素(cardiotrophin)、 抑瘤素(〇ncostatin)]VI、IL-6 加 sIL-6 受體和高 IL-6 ( hyper IL-6) 〇 34 200815597 12.如申請專利範圍 〇 甘士 4 ιςπ 貝之培養基,其中該gpl30 激動劑係選自LIF、sIL_6R 々、以及高IL_6。 1 3 ·如申請專利範 M .,, 国弟2項之培養基,其中該FGF受 體抬抗劑為FGFR1之拮抗劑。 其中該FGFRl 14+t_㈣範圍第13項之培養基 之拮抗劑為SU5402。 其中該FGFR1 15·如申請專利範圍第13項之培養基 之拮抗劑為PD173074。16 ·如申請專利||圚望彳 月号W乾tel弟1項之培養基,其更包括細胞凋 亡的抑制劑。 1 7 ·如前述申請專利筋圍φ 下月号不』靶111中之任一項之培養基,其包括 N2培養基及/或b27培養基。 1 8·如申明專利範圍帛2項之培養基,其中該MEK抑 為 PD1843 52’該 GSK3 抑制劑為 cmR99〇21,且該 fgfr 拮抗劑為SU5402。 H-種培養多能細胞的方法,其包括在包括mek抑 制劑和GSK3抑·之培養基中培養該細胞。 20.如申請專利範圍第19項之方法,其中該培養基更 包括F GF受體之拮抗劑。 •如申請專利範圍帛19項之方法,其中該細胞包括 小氣ES細胞。 22.如申請專利範圍帛19項之方法,其中該細胞包括 人類ES細胞。 23·如申e青專利範圍第jg夕士、l , , 木y項之方法,其中該細胞包括 35 200815597 大鼠多能細胞。 裡&蚕夕能細胞以促進自我 將該細胞維持在如申請專利範圍第i項新的方法,其包括 A如申請專利_第24項 ^培養基中。 含血清且不含血清萃取物。 去,其中該培養基不 26·如申請專利範圍第24項 鼠細胞。 、方法,其中該細胞為小27*如申請專利範圍第24 類細胞。 28·如申請專利範圍第24 鼠細胞。 項之方法,其中該細胞為人 項之方法,其中該細胞為大 29.如中请專利範圍第24項之方法,其中該多能幹細 胞表現Nanog。 3〇·如申請專利範圍帛24項之方法,其中該培養基更 包括FGF受體之拮抗劑。31.如申請專利範圍第3〇項之方法其中該多能幹細 胞表現Nanog。 32·—種培養ES細胞的方法,其包括下列步驟: a) 在培養中,視需要在一層餵養細胞上,將ES細胞維 持在多能狀態下, b) 繼代該E S細胞至少一次, c) 攸培養基中撤除任何血清或血清萃取物並撤除任何 餵養細胞,使得該培養基不含餵養細胞、血清和金清萃取 物;並 36 200815597 d)隨後將該ES細胞培養在包括M 』_ 、, 督#匕枯MEK抑制劑和GSK3 抑制劑的培養基中以維拷兮 土 丁 μ準狩该ES細胞在多能狀態下。 33·如申請專利範圍第32項之方 ^ <乃凌,其中在步驟d)中 之培養基更包括gpl30下游信號路徑的活化劑。 34. 如申請專利範圍第32項之方法,其中在步驟❼中 之培養基更包括FGF受體拮抗劑。 35. 如申請專利範圍第32項之方法,其中該細胞為小 鼠細胞。 36. 如申請專利範圍第32項之方法,其中該細胞為人 類細胞。 3 7·—種獲得Es細胞之經轉染族群的方法,其包括: a) 以編碼可選擇標記之構築體轉染ES細胞; b) 將该E S細胞種入培養盤; c) 在包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑之培養基中培養 5亥ES細胞;並 d) 選擇表現該可選擇標記的細胞。 38·如申請專利範圍第37項之方法,其中步驟c)之培 養基更包括gpl 30下游信號路徑的活化劑。 39·如申请專利範圍第37項之方法,其中步驟c)之培 養基更包括FGF受體拮抗劑。 4〇·如申请專利範圍第37項之方法,其中該細胞為小 鼠細胞。 41.如申請專利範圍第37項之方法,其中該細胞為人 類細胞。 37 200815597 42.—種細胞培養基, 括·· 其不含血清和血 清萃取物,並包 a) 基礎培養基; b) MEK抑制劑; c) GSK3抑制劑;和 d) 鐵-運載蛋白。43·如申請專利範圍第42 下游信號路徑的活化劑。 44·如申請專利範圍第 受體之枯抗劑。 項之培養基, 42項之培養基 其更包括gp 13 0 ’其更包括FGF 45. 如申請專利範圍第42 素、白蛋白和運鐵蛋白。項之^。養基,其更包括胰島 46. 如申請專利範圍 , 洞亡之抑制劑。 項之培養基,其更包括細胞 ‘種攸胚、、、田胞中衍生多能細胞的方法,其包括:(a) 獲得胚細胞; (b) 在包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑的培養基中培 養該胚細胞,獲得内細胞團; (C)解離該内細胞團·, W從解離之内細胞團中分離一個或多個細胞;並 (e)在包括MEK抑制劑和GSK3抑制劑的培養基中培 養該經分離之-個或多個細胞。 ,48·如申睛專利範圍第47項之方法,其中步驟e)之培 養基更包括gP130下游信號的活化劑。 38 200815597 其中步驟e)之培 49·如申請專利範圍第47項之方法 養基更包括FGF受體之拮抗劑。 50. 如申請專利範圍第47項之古、+ ^ ,, 項之方法,其中步驟b)之捭 鮝基更包括LIF,並且該胚細胞係 ° 肥係培養2至4天的期間。 51. —種套組,其包括第一和 一 _ 弟一個容器,該第一個容 為包括GSK3抑制劑,而該第二 奋 谷為包括MEK抑制劑。 52. 如申請專利範圍第51項 甘士 # … I #組,其中該MEK抑制劑為MEK1抑制劑。 J ▲ 53·如申請專利範圍第51項之套組,其中該職 劑係選自 PD184352 和 pD98059。 54.如申請專利範圍第48項之套組,其中該⑽3抑 制劑為GSK-3沒之抑制劑。 55·如申請專利範圍第48項之套組,其中該Gs^抑 制劑對GSO相對於對cdc2及/或erk2有選擇性。 56·如申明專利範圍第55項之套組,其中該GSK3抑 制劑對GSK3之選擇性勝過cdc2至少〗〇〇_倍。 丄57.如申請專利範圍第56項之套組,其中該gsk3抑 制劑對GSK3之選擇性勝過cdc2至少2〇〇_倍。 58·如申請專利範圍第51項之套組,其中該GSK3抑 制劑為 CHIR99021。 ^ 59·如申請專利範圍第51項之套組,其更包括第三個 ' °。,其包括FGF受體之拮抗劑。 60.如申請專利範圍第59項之套組,其中該FGF受體 拮抗劑為FGFR1之拮抗劑。 39 200815597 61.如申請專利範圍第60項之套組,其中該FGFR1之 拮抗劑為SU5402。 62·如申請專利範圍第60項之套組,其中該FGFR1之 拮抗劑為PD173074。 63 ·如申請專利範圍第51項之套組,其更包括一容器, 其包括gpl30下游信號之活化劑。 ^ 64·如申請專利範圍第63項之套組,其中該gpl3〇下 _ 游乜唬之活化劑係選自UF、SIL-6R和IL-6、以及高IL-6。 65.—種擴展幹細胞族群的方法,其包括在包括mek 抑制劑和GSO抑制劑之培養基中培養該幹細胞。 66·如申請專利範圍第65項之方法,其中該培養基更 包括FGF受體之拮抗劑。 67·—種培養基,其包括ΜΕΚ抑制劑和fgf受體之拮 抗劑。 68. -種培養即細胞的方法,其包括下列步驟:a) 在培養中,視需要在—層餵養細胞上,將細胞對 持在多能狀態; b) 繼代該ES細胞至少一次; C)從該培養基中撤除任何1清或幻f萃取物,並撤β ^何饒養細胞,使得該培#基不含Μ養細胞、血清和^ 萃取物;並 ⑽後在包括臟抑制劑和FGF受體之抑制劑❾ 養基中培養該ES細胞以維持該^細胞在多能狀態下。 69. -種獲得以細胞之經轉染族群的方法,其包括: 40 200815597 a)以編碼可選擇標記之構築體轉染^8細胞; b )將該E S細胞種入培養盤; c)在包括MEK抑制劑和fgf受體拮抗劑之培養基中 培養該E S細胞;並 d)選擇表現該可選擇標記的細胞。 70· —種細胞培養基,其不含血清和血清萃取物,並包 括·· a )基礎培養基;b) MEK抑制劑; c) FGF受體之抑制劑;和 d) 鐵-運載蛋白。 71. —種從胚細胞中衍生多能細胞的方法,其包括: (a) 獲得胚細胞; (b) 在包括MEK抑制齋|知祕 I利Μ和FGF爻體之拮抗劑的培養基 中培養該胚細胞,以獲得内細胞團; (c) 解離該内細胞團; (d) 從解離之内細胞團中 T刀離一個或多個細胞;並 (e) 在包括ΜΕΚ抑制劑知一 市和FGF党體之拮抗劑的培養基 中培養該經分離之一個或多個細胞。 72·—種套組,其包括第一 > 和弟二個容器,該第一個含 有ΜΕΚ抑制劑,而第二個 ^ 文體之拮抗劑。 73·—種培養多能細胞以促進 將該細胞維持在包括MEK抑制制 /的方法’其包括 培養基中。 1州和咖受體之拮抗劑的 41 200815597 74. 如申請專利範圍第73項之方法,其中該多能幹細 胞表現Nanog。 75. —種擴展幹細胞族群的方法,其包括在包括MEK 抑制劑和F GF受體之拮抗劑的培養基中培養該幹細胞。 十一、圓式: 如次頁42
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