199906 Α6 Β6 五、發明说明（ 發明背景 ί請先閱埼计面之注意事邛再填艿本頁) 活用種種天然或合成高分子材料來包復微生物完整細 胞的固定化微生物或游索技術，在i 9 8 〇年代以降，備受注 目。而且已有不少實際應用於工當生產的成功例，例如高 朵焚循衆，6 - APA ’ L -氛基狻等生化產品的生產。通常使 用於固定化擔體的代表性高分子材料爲聚丙域·醢胺 (polyacrylamide)，鹿角藤膠（K_carrageenan),裼藤膠鋼 (sodium alginate)及復脂（agar)等。聚丙烯醯胺较其他 高分子價廉’常被採用。但是，校難製成有利於一般連續 反應器的球形颗粒，而且其單體分子及聚合促進則等皆具 毒性，不利於微生物活細胞之固定化操作。鹿角藤勝雖然 成肜容路、毒性低，但是價格较高爲其主要缺點。褐藤膠 雖也1¾’格低廉’容易貌成球形，但是，在含有磷睃鼗，麵 及钟等陽離子的反應液中，膠®强度相當不捣定，甚至崩 解u另外，议;勝體的择械強度又嫌太弱，不適>合長期操 作。因此，若欲將固定化菌艘技術有效應用於生化商品的 工業化製程，汜其是最近備受注Θ的廢水處理领域，其成 功與否之闕级，乃在於對橄生物不具毒性，成本低廉及具 有强紉機械強度之拋體材料的開發。 聚 C 烯醇（Polyvinyl a]cohol·，PVA) ’ 是由醋駿 c 燦 單體經聚合，醇化而成的水溶性樹腊。P v A不具毒性甚至 到·人體亦公認無害，製形容易，板械強度高，而且是低價 童產的工常化高分子原料。因此’非常適合作爲固定化菌 體的擔體。 本紙ft尺度適用中a β家標i'MCNS) f 4規格(210X297公釐} 199906 A6 B6 Μ濟部4-央櫺f-局®:工消合作it-'p^ 五、發明說明（） 現有的PVA固定化菌體技術及缺點 近年來’歐美文廠及日本的專利公報已公佈種種有闞 利用PVA進行微生物固定化之技術。譬如將PVA水溶液與微 生物ί昆合後施以凍結真空乾燥或以冷凍回溫法進行莜勝固 定（日本專利特開昭57-14129,特開昭61-139385) 〇旄以紫 外線照射’形成光交聯（phot〇Crosslinking)結構的莜膠 方法（日本專利特開平1 -454372)。另外亦有將PVA水溶液 與微生物菌體混合液，置於狍和硼睃水溶液接觸形成架橋 結構的徒膠技術（日本專利特開昭。上述方法 雖可狸得高強度之膠體作爲固定化菌體之擔體，但卻仍有 不少缺點有待改良。在冷凍乾螈方法中，須將材料冷凍保 持在-3〇〜-8〇t：的低溫下，而後須祀燥脱水至一定的含水 率，此種冷凍-解凍-脱水的步驟，不僅费時甚久，而且手 •續繁雜，托费能源。光交聯法則大抵以製成薄膜時所利用 之方法，不利於一般的菌體固定化程序之使用。再者， PVA·硼酸法中，微生物-?“的混合物則須與硼睃接觭浸清 I2〜24小時，方能獲得相當強度的膠體，否則膠徹脆弱。 總而言之，上述既有抆術的共同缺點有，第一，固定 化程序费時長久，手績繁雜，需要大嗤的生產設備方可量 產，導致生產成本的提升，吟低生產力。第二，低溫、真 空及堋睃皆不甚適合微生物生存之環境。尤其硼睃更具毒 性，長時間的製作裎序皆可能引起微生物活性的低降。北 野清之曾提出利用PVA與微生物菌馓混合物，置於硫睃盥 溶液中接觸之方法，企圓改良上述缺點（日本專利特開昭 -4 - (諳先Μί*卄面之注意事項再琪寫本π) ·».· •打· 線· 本紙張尺度適《中ΗΒ家樣孕(CNS>T4規格(210X297公釐） Μ濟部屮央標'f局Μ工>·«*·»?合作杜卬拟 199906 五、發明说明（） 64-549〇，64乃的1)。此方法雖然有效地縮短了固定化程 序所需時間，然而所使用的凝膠溶液濃度相當高，須以 30%硫酸鈾或硫酸銨溶液進行’如果此濃度過低時顆粒 成形不易，強度亦不佳。因此，所需材料成本即校高；而 成膠過程中高i類濃度亦對橄生物生化活性甚有不良影響 〇 本發明所提出硼酸-磷皎服二陪段成膠之方法，首先 置於:3¾至狍和滚度的硼酸溶液中姐時間成形，再於3·2〇% 磷酸盟溶液中強化。成形相當容易，且磷睃盏價格低廉， 亦爲微生物能源代謝來源，不具生物毒性。此外，盟類使 用濃度低’卟低成本。而且比硫破盟法具有更桂的膠體初 性〇 本發明之目的即在於提出製作程序簡單，低成本，且 在短時間内即可獲得高耐水性、強韌機械強度，且具優異 生化活性的PVA凝膠固定化微生物或酵素，並將其廣泛應 用在廢水處理领域及生化產業上〇 發明內容與特點 本發明提供一種聚ϋ烯醇微生物成酵素固定化擔體之 改良製備方法’包含將聚G烯醉及微生物或酵素所形成之 混合物於一濃度爲3重量％至飽和的硎峻水容液中進行凝膠 化處理而產生一凝膠球體，其改久之處在於該凝膠化處理 時間爲10分鏜至2小時，該凝膠球體並接著以3 2〇重量％磷 酸或磷酸腹水溶液浸清3〇分鐘以上使其硬化而獲得聚乙烯 本纸ft尺度適用中Ββ家樣毕(CNS)甲4規格(210x297公釐） · ---- ..................................................Μ-.* .................ir...........* ...............St {請先Μ讀卄面之注意事項再填寫本頁) . 199906 Λ 6 Η 6 五、發明説明（） 醉微生物或酵素固定化擔髋。 本發明方法之原理與特微在於利用PVA分子中的氩氧 基與棚峨·分子間的離子银橋作用使之成形；而後，再將此 不甚強固的凝膠，浸清於磷酸或磷酸篮溶液中，利用PVA 與碑駿或磷睃毁間的醏化反應使膠體硬化，獲得讨水性強 ’機械強度高且幾乎不損害橄生物或酵素生化活性的固定 化逋體。本發明之製作流程可用第一囷表示。 本發明所使用的PVA，鹼化度7〇*以上，聚合度爲1〇〇〇 〜3〇00，而以鹼化度9S%以上及聚合度15〇〇〜2〇00者较爲 迤宜。聚合度遇低則膠體不稿定，過高則黏度升高不易處 理。該PVA係以一水溶液形式與該橄生物或酵素混合，合 適之PVA濃度則在10〜2〇重量％。堋酸成形時間以飽和堋酸 水溶液進行約I5〜3〇分鐘爲较佳。 磷睃或磷酸鬣水溶液之较佳濃度爲5·15重童*，浸溃 時間約需1〜2小時，即吁獲得理想成品。該磷敗盟水溶液 T使用磷酸鈉、磷酸氩餉、磷酸二氳餉、磷酸鉀、磷睃氮 鉀、麟酸二II鉀、鱗酸接、麟駿I錢或鱗駿二I铵。 本發明方法之另一較佳實施方式爲將該硼酸與磷駿或 磷酸盟水溶液混合，而同時進行該敖膠化與硬化，時間約 爲3〇分鐘至3小時，以I-2小時爲較佳0 本發明的特微在於首先在硼酸·溶液建立膠體基礎構银 ，由於接觸時間不長，使硼酸對橄生物或酵素可能的傷害 減至最低（橋本獎所提的硼酸法，須接觸15〜24小時，曰 本專利特開昭61 -100193 )。再蚩’膠體硬化過程使用具有 -6 - 本紙張尺度边用中國β家標準(CNS)規格(210x297公龙)
卞 Jii
經濟部十央標準而只工消费合作杜印¾
五、發明説明（ ；i9990b 緩衝作用的鱗敗毁溶液，而且鱗元素亦爲微生物能源代謝 之必需元素’所以對微生物而言不但無害且可能具有活化 微生物之功能。 根據本發明製麟得的PVA㈣遑合使用於酵素、工 業撇生物、廢水處理微生物菌尊及動植物細胞等的包復固 定化扶術。酵素而言，譬如澱粉水解酶、纖維素酶、蛋白 酶等。橄生物而言，酒精醱酵酵母、硝化細菌、脱硝細菌 以及活性污泥、厭氣消化污泥、甲坑化污泥、脱確污泥等 黴生物菌尊。以上所述皆爲本發明PVA莜膠方法的可行應 用對象。 發明之較佳具體實施例 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. 實施例 經濟部屮央標準局卩Η消赀合作杜印蚁 15重量％的1=以（鹼化度"％以上，聚合度2〇〇〇)水溶液 2〇g，與脱硝污泥的滾縮液（污泥滚度50g/1)20g充分搅拌 混合（脱硝污泥微生物取自實驗室生物脱氮程序中的脱硝 槽）。捋此PVA •污泥混合物滴入緩慢授：掉的飽和棚酸水溶 液中’形成直徑约的圓球膠體，並置於該溶液中2〇分 後，再取^轉移至8«㈣雜二1齡液技溃赠鐘 ，最後將㈣顆粒取出#。製成賴定⑽生物擔體 叫，與含有雜鉀及甲_主成例_人工廢水（姐 I滾度爲醇35Gppm)浪合，置於125ml的血清瓶 中，在無氧條件下進行批式脱㈤。經2小時料後人工廢 水的硝酸氮滚度降爲32pp® ° 訂· 線.
尺度边用中國®家料(CNS)甲4W A6 B6 199906 五、發明說明（） *{請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) 相同的固定化微生物擔體進行重復批式脱硝試驗，每 天更新相同成份的人工廢水，並測得固定化橄生物的脱硝 速率’在第七天後達0.65mg N/g gel/h，此後，一直到第 3〇天之連續操作皆維持於此一速牟，生化活性相當鴉定。 再者利用橋本獎（日本專利特開昭01-100193)所提方法製 備相同污泥含量的固定化留體，在相同條件下，進行與此 實施例同樣之實驗。批式脱硝經2小時培養後，人工廣水 的硝酸氮泼度爲82ppm，而重復批式轼驗須在天後方達 到0.55mg N/g gel/h之脱硝速率，往後持續操作亦不甚鵪 定。 實施例2 2〇重量U^JPVA(鹼化度"％以上，聚合度2〇0〇)水溶液 ，與硝化污泥的波縮液（污泥滾度3〇g/l )，以1 : 1重量比例 均勻混合（硝化污泥微生物取自實驗室生物脱氮程序中的 硝化槽〉。PVA-污泥混合物進行與實施例（1)同樣之微生物 固定化程序。 觥濟部屮央標ill-ri負工消'ff合作杜卬« 製成之橄生物固定化擔骶（粒徂爲3mm)置於操作容猜 爲10 1的生物反應器中，迷續入流含2〇0ρρω氱氮的人工麼 水（流入量3〇 Ι/day)，擔體充填率爲25%，通氣量2〇 1/min 。經1〇天連續操作後，出流水之氟*氮滚度爲9ρρω ,並有 92%的氟氮被轉換成硝酸氮。 -8 - 本紙》尺度適用中國國家標1MCNS)T4規格(210x297公釐) 199906 A6 B6 經濟部屮处標"局W工消'^合作代卬製 五、發明説明（） 實施例3 以養猪事業廢水（COD濃度15〇〇〜2〇〇〇ppm,總氮滚度 200〜3〇〇ppm)馴化達“固月的活性污泥，經離心而得滾錄 污泥溶液，以1 : 1重量比例混合]_ g重量％ p VA (驗化度9 9 %以 上，聚合度2〇〇〇)的水溶液，此均勻混合液滴入含有5重量 %硼睃與10重量％磷酸二氩鉀的混合溶液中，浸清i小時形 成3mm粒徂的圓球膠體顆粒。製成的固定化橄生物擔體， 置於與實施例（2 )同樣的生物反應器中，進行養豬事業廢 水之處理，反應器操作條件與實施例（2)相同。經2〇天連 續操作後’出流水之COD滚度降至2〇0〜3〇〇ppm，總氮濃度 亦降爲120〜l80ppm。 實紇例4 2〇重量U0VA(鹼化度"％以上，聚合度2〇〇〇)水溶液 10呂’與碑酒酵母（Sacchramyces )離心泼縮液 (細胞滾度3〇g/l)10g充分攪拌混合，PVA-酵母菌體混合物 進行與實施例（1)同樣之微生物固定化程序。毂成的固定 化細胞擔體（粒徂爲hmUSg與含有3重量％葡萄糖的培養基 isomi混合，置於三角瓶中，於3〇。〇下振燙培養，經8小時 铰’培養液之酒精產生濃度爲10.2g/1。而以相同的菌體 量，於同樣培養條件下進行游離細胞的培養，經8小時後 ’培養液中之酒精產生濃度爲10.6gA。 -9 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) *装_ •訂· .線. 本紙張尺度遴用中B國家樣孕（CNS)甲4規格(210x297公釐） i 9 9 9 0 b A6 B6 五、發明說明（） 實施例5 20重量M〇PVA(鹼化度"％以上，取合度2〇00)水溶液 10g ,與類固酵轉換細菌（Arthrobacter simplex)波縮液 (細胞滾度2〇g/i)i〇g充分攪拌混合，此混合物進行與實施 例3同樣的橄生物固定化程序。製成的固定化橄生物擔體 (粒祖約爲2mm)l5g與含有0.2g/l氩化皮質酮 (hydrocortison)的培養基l5〇ml混合，置於容積5〇Oml的 三角瓶中振盪培養，進行類固醉的△ 1 -脱氩生化反應，經 5小時培養後，有90*的基質被轉生成昝體松 (prednisolone) 〇 實紇例6 is重量％PVA(鹼化度"％以上，聚合度2〇0〇)水溶液l〇g ，與3g的異澱粉水解酶（isoamylase)酵素液及2g的/9 -澱 粉水解蜂（卢-amy 1 as e)酵素液充分混合，並以實施例（1 ) 同樣的凝膠程序進行酵素固定化。製成的固定化酵素擔體 (粒徑約2mm)15g與含有5〇g/l液化澱粉的基質溶液l5〇ml混 合，置於容積5〇〇ml的三角瓶中振盪攪拌，進行澱粉水解 反應，於反應3小時後溶液中麥芽糖濃度可達4lg/l，基質 轉揍率约爲82*. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本资) .¾. .訂· 經濟部t处標';1,-^約工消';'合作代卬% 圖式之簡單説明 第一圖爲本發明之微生物或酵素固定化擔體的製造流 程圖 10 本纸張尺度適用中國國家梂rMCNS)T4規格（2丨0x297公釐）