TR201807352T4 - Granülosit koloni stimülatör faktörünün saflaştırılmasına yönelik proses, G-CSF. - Google Patents

Abstract

Kromatografiyi kullanan bir saflaştırma dizisinde G-CSF (Granülosit Koloni Uyarıcı Faktör) saflaştırma prosesi olup, aşağıdaki adımlar ile karakterize edilir; - negatif yüklü 2-(benzoilamino) bütanoik asit ligand içeren bir multimodal reçine kullanılarak en az bir kromatografi gerçekleştirilir, - G-CSF, multimodal reçineye 4 ila 6,2 arasında bir pH değerinde bağlanır ve - G-CSF, pH 5.5 ila 6.5 arasında elüte edilir ve burada elüsyon, 0.1 M ila 2.0 M aralığındaki bir konsantrasyona sahip olan arginin ile gerçekleştirilir, -isteğe bağlı olarak, G-CSF'ye yönlendirilen bir mayadan türetilmiş F ab fragmanının kullanıldığı bir afinite ligandı kromatografi adımı ile kombinasyon halindedir.

Description

TARIFNAME GRANÜLOSIT KOLONI STIMÜLATÖR FAKTÖRÜNÜN SAFLASTIRILMASINA YÖNELIK PROSES, G-CSF Mevcut bulus, kromatografiyi kullanan rekombinant insan Granülosit Koloni Uyarici Faktörünün (rhG-CSF) saflastirilmasi islemiyle ilgilidir. Proteinlerin dogal kaynakli kaynaklardan saflastirilmasi, ilgilenilen proteinin çogu zaman sadece eser miktarda mevcut oldugu ve lipitler, proteinler ve hatta hücre fragmanlari gibi diger biyopolimerlerin eslik ettigi bir zorluktur. Üstelik, ilgi konusu proteinler çogunlukla saflastirilmasina yönelik proses asamalari sirasinda kaybolan bir biyolojik fonksiyon ile iliskilidir. Proteinler gibi biyopolimerlerin saflastirilmasina yönelik yöntemlerin deposu büyüktür. Çökelme yöntemlerinin yani sira çesitli materyaller üzerinde kromatografik yöntemler bilinmektedir. Siklikla, malzemeler organik iyonlar, protonlanmis aminler veya kismen veya tamamen alkillenmis aminler gibi katyonlar gibi kimyasal kisimlarla modifiye edilir. Bu gibi malzemeler anyon degistiriciler olarak kullanilir. Fakat, ayni zamanda, katyon degistiriciler, sekil, molekül agirligi ve özellikle yükü gibi ilgili proteinin fiziksel özelliklerine bagli olarak aritma yöntemlerine yönelik kullanilabilir. Alternatif olarak veya kombinasyon halinde afinite kromatografisi kullanilir. Önceki teknikte, geleneksel iyon degisim kromatografisi reçineleri (örnegin SP, CM, Q veya DEAE Sepharose® FF iyon degisimi kromatografisi reçineleri gibi) nispeten düsük tuz konsantrasyonu (iletkenlik, osmolalite ve benzerleri) içinde, tipik olarak 0.01-0.15M tuz (NaCl ve benzerleri) konsantrasyon araliginda gerçeklestirilen bir dezavantajin, bir proteinin sadece reçineye baglanmasi olabilecegi bilinmektedir. Bazi uygulamalarda, nispeten yumusak saflastirma kosullarinin, proteinlere dogru bir iyon degistirme kromatografisi adimi, ayrica bir miktar artmis iyonik mukavemette bir kromatografi reçinesine dogrudan (daha fazla seyreltilmeden) uygulanabilmesine yönelik bir talep olacaktir. Arttirilmis bir iyonik mukavemet, bir protein çözeltisinde protein stabilitesine yönelik; özellikle, rekombinant üretilmis protein ürünlerinin hasatinda oldugu gibi veya potansiyel proteinleri hedef proteini olumsuz yönde etkileyebilecek potansiyel proteazlarin bulundugu plazma türevli ürünlerde ham protein preparasyonunda önemli bir avantaj olabilir. Örnegin proteazlar, genellikle fizyolojik kosullarda (çogu hücre sisteminde oldugu gibi), diger bir deyisle, yaklasik olarak pH 7 ve yaklasik 0.15M'lik bir tuz konsantrasyonunda en iyi sekilde çalisir. Proteazlar, örnegin, tuzun eklenmesi ve/veya pH degerinin degistirilmesi ile çalisma kosullarinin degistirilmesi araciligiyla inhibe edilebilir, bununla birlikte, her iki parametre, geleneksel iyonik kromatografi basamaginin gerçeklestirilmesine yönelik kritiktir ve bu nedenle bunlarin kombinasyonlarinda siklikla kullanilmasi imkansizdir. Proteazlarin etkilerini en aza indirmek üzere hangi kosullarin saglanabilecegi bir saflastirma yönteminin çikarma sistemi kullanilarak, böcek hücrelerinde üretilen polipeptitlere yönelik bir üretim yöntemini açiklar. Bir örnekte, böcek hücre kültürü, enfeksiyondan hemen önce (örnegin, enfeksiyondan bir saat önce) bir Iipit karisimi ile takviye edilir. Polipeptitler, saflastirma prosesinin baslarinda anyon degisimi veya karisik mod kromatografisi kullanan bir yöntem kullanilarak böcek hücre kültüründen izole edilir. Bu proses basamagi, böcek hücresi kaynakli endoglikanazlari ve proteazlari uzaklastirmaya yönelik olarak yararlidir ve dolayisiyla enzimatik bozulmaya bagli olarak istenen polipeptidin kaybini azaltir. Baska bir örnekte, karisik modlu kromatografi, böcek-hücre kültür sivisinin hizli bir sekilde islenmesine ve polipeptidin yakalanmasina izin vermeye yönelik sürekli akis seklinde boya-Iigand afinite kromatografisi ile birlestirilir. Yine bir baska örnekte, bir polipeptit, bir uçucu hücre kültür sivisindan, esasen endoglikanaz ve proteolitik aktiviteleri olmayan bir polipeptit çözeltisi üreten tek bir birim prosesinde içi bos fiber filtrasyonu, karisik mod kromatografisi ve boya-Iigand afinitesini birlestiren bir proses kullanilarak izole edilir. Baska bir örnekte, izole edilmis polipeptitler, istege bagli olarak bir glikosiltransferaz ve modifiye edilmis bir nükleotid seker kullanilarak bir polimer (örnegin, PEG) gibi bir modifiye edici gruba konjuge edilen bir böcek spesifik belgede, peptitlerin, özellikle, tek olmayacak sekilde, bir peptit çözeltisinden, endotoksinlerin uzaklastirilmasina yönelik bir prosesi, söz konusu proses yönelik reaktifler ve söz konusu islem ile elde edilen saflastirilmis peptide sahip bir kit halinde saflastirilmasina yönelik bir islem açiklar. Dasari Venkata Krishna Rao ve digerleri insan granülosit koloni uyarici faktör) verimini arttirmaya yönelik gelistirilmis bir proses kontrol stratejisini kullanan bir saflastirma yöntemini açiklar. Bu çalismada, toplam verim 2.18 g/I olan 2% 99'Iuk bir saflik elde edilmistir. Ürünün saflastirma sirasinda analizi, deterjanlarin, LPS'nin (Iipopolisakkaritler) %72'sini ve HCP'Ierin (konakçi hücre proteinleri) %98'ini nükleik asit çikarmadan çikardigini göstermistir. Sistein konsantrasyonu, protein yeniden katlanmasinda anahtar bir parametre olmustur. SEC (boyut ayirma kromatografisi) kolonundaki yatak yüksekligi ve HETP (yükseklik esdeger teorik plakalar) degeri, degerlendirilmistir ve çözünürlüge etkisi arastirilmistir.

SEC sirasinda formülasyon, ürün verimini zaman ve proses maliyetlerinden tasarruf ederek arttirmaya yönelik olarak oldukça önemli bulunmustur. Quan Bai ve digerleri (SAX) ile Escherichia ooli'de ifade edilen rekombinant insan granülosit makrofaj koloni stimülasyon faktörünün (rhGM-CSF) renatürasyonunu ve saflastirilmasini inceler. Mobil fazdaki pH degerlerinin, GSH/GSSG konsantrasyonlarinin ve üre konsantrasyonlarinin, rhGM-CSF'nin SAX ile renatürasyon ve saflastirilmasi üzerindeki etkileri arastirilmistir.

Sonuçlar, yukaridaki üç faktörün, renatürasyonun ve rhGM-CSF'nin kitle geri kazaniminin verimliligi üzerinde dikkate deger etkilere sahip oldugunu gösterir.

Hareketli fazda GSH/GSSG'nin eklenmesi, rhGM-CSF'de dogru disülfit baglarinin olusumunu iyilestirebilir, böylece renatürasyon verimi artar. Ek olarak, rhGM-CSF'nin SAX ile kitle geri kazanimini arttirmaya yönelik, denatüre protein toplanmasini önlemek üzere mobil faza düsük konsantrasyonda üre ilave edilmistir. Optimal kosullar altinda, rhGM-CSF, SAX kolonu üzerinde sadece bir adimda 30 dakika içinde eszamanli saflastirma ile yeniden renatüre edilmistir. Shelly A. Pizarro (Protein Expr Purif. 2010 Aug; 72 (2): 184-913) in vivo anjiyogenez ve vasküler geçirgenligi indükleyen güçlü bir mitojen olan bir vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF165) hakkinda bilgi verir ve yara iyilesmesini hizlandirmaya yönelik terapötik uygulamalarda potansiyel göstermistir. Bu raporda tanimlanan proses, et suyu Iitresi basina yaklasik 9 g rh”Iik VEGF ve ilaç katkisinin formülasyonundan önce protein yeniden katlanmasi ve üç kromatografi adiminda bir asagi saflastirma prosesi üretebilen bir bakteri ekspresyon sistemini içerir. Periplazmik inklüzyon cisimciklerinde rhVEGF üretmek üzere yüksek hücre yogunluklu (HCD) beslemeli bir parti fermantasyon prosesi kullanilmistir. inklüzyon cisimcikleri, hücre Iizatindan hasat edilir ve saflastirmaya yönelik rhVEGF'yi çikarmak üzere tek asamali bir protein çözme ve yeniden katlama prosesine tabi tutulur. Yeniden katlama ve kromatografi dahil olmak üzere gelistirme açisindan gözlemlenen genel geri kazanim verimleri %30 ± 6 olmustur. Ev sahibi hücre safsizliklari, laboratuvarda ve büyük ölçüde demonstrasyon prosesi saglamliginda hedef seviyelerin altinda, sürekli olarak temizlenir. rhVEGF'nin tekrar katlanan ve saflastirilmis yapisi, kütle spektrometrisi tarafindan dogrulanmistir. N-terminal dizilemesi ve triptik peptit haritalamasi ile dogrulanirken, ürün varyantlari ile HPLC deneyleri ile analiz edilmistir. kromatografi reçinelerinin, besleme stoklarina meydan okumaya yönelik saflastirma araçlari olarak popülerlik kazandigini açiklar ve bir alkalin besleme stogundan Capto MMCTM üzerindeki rekombinant insan vasküler endotelyal büyüme faktörünü (rhVEGF) seçici olarak yakalamak üzere bir endüstriyel uygulamanin gelistirilmesini açiklar.

Capto MMCT'V' reçinesi, proteinler ile iyonik, hidrofobik ve hidrojen baglama etkilesimlerine katilma potansiyeline sahip olan ve oldukça çapraz baglanmis bir agaroz boncuk matrisine baglanmis bir Iigand içerir. VEGF, anjiyogenezde rol oynayan önemli bir büyüme faktörüdür ve yara iyilesmesi için terapötik uygulamalara sahiptir.

Escherichia coli'de inklüzyon cisimleri olarak ifade edilir. Katilar, hücre Iizatindan hasat edilir ve rhVEGF, üre ve redoks ajanlarinin varliginda çözündürülür ve tekrar katlanir ve pH 9.8'dir. Capto MMCTM 'nin essiz karisik mod karakteristikleri, bu temel proteinin minimum yük kosullandirmasiyla yakalanmasini sagladi ve >%95'Iik verim ile asagi prosese yönelik konsantre bir havuz verdi ve konak hücre protein içerigini

Claims (1)

1. ISTEMLER Kromatografiyi kullanan bir saflastirma dizisinde rekombinant insan Granülosit Koloni Uyarici Faktörü (rhG-CSF) saflastirmaya yönelik bir proses olup. özelligi asagidaki adimlari içermesi ile karakterize edilmesidir; - Capto MMCT'V' reçinesi kullanilarak en az bir kromatografi gerçeklestirilir, - rhG-CSF, Capto MMCTM reçinesine 4 ile 6 arasinda bir pH degerinde baglanir; ve - rhG-CSF, pH 5.5 ila 6.5 arasinda elüte edilir ve burada elüsyon, 0.1 M ila 2.0 M araliginda bir konsantrasyona sahip olan arginin ile gerçeklestirilir, - istege bagli olarak, rhG-CSF'ye yönlendirilmis bir mayadan türetilmis Fab fragmaninin kullanildigi bir afinite Iigandi kromatografi adimi ile kombinasyon halindedir. Istem 1'e göre bir proses olup, özelligi asagidakilerden olusan gruptan seçilen maddelerin en az birini içeren bir tamponlama maddesinin kullanilmasidir: sodyum sitrat; histidin; 2-(4-(2-Hidr0ksietil)-1-piperazinil) -etan sülfonik asit (HEPES); 2-(N-Morfolino) etan sülfonik asit (MES); Tris bazi; ve sodyum asetat. Istem 1 veya istem 2'ye göre bir proses olup, özelligi iyonik olmayan deterjanin, kullanilan tamponlardan herhangi birinde bulunmasidir, bu iyonik olmayan Polisorbatlardan olusan gruptan seçilir. Istemler 1 ila 3'den herhangi birine göre bir proses olup, özelligi Capto MMCTM reçinesine bir yikama tamponunun uygulanmasi, kirletici maddelerin yikanmasi ve rhG-CSF'nIn çikarilmasindan önce rhG-CSF'nIn korunmasi ile karakterize edilmesi, yikama tamponunun, bir bazik yan zincire ve/veya Hofmeister serisine göre seçilmis bir tuza sahip olan bir amino asit içermesi ile karakterize edilmesidir. . Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir proses olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir: - Capto MMC kromatografisi; - zarfli virüslere yönelik kimyasal olarak inaktivasyon adimi; - mayada açiga çikan rhG-CSF'ye yönlendirilmis bir Fab fragmanina dayanan bir afinite reçinesi; - SP Sepharose veya Resource 8 gibi bir katyon degistirici; - Planova 20N gibi bir ortalama gözenek büyüklügü 20 nm olan bir patojen filtrasyon çikarma asamasi; - yaklasik 1-5 kDa'lik bir kesim ile ultra filtrasyon gibi bir tampon degisimi ve/veya konsantre etme adimi; - Superdex 75 gibi bir boyut ayirma kromatografisi reçinesi. . Istem 5ye göre bir proses olup, özelligi Capto MMCTM kromatografi adiminin, bir afinite kromatografisi adimi ile birlestirilmesi ile karakterize edilmesidir, burada afinite, rhG-CSF'ye yönlendirilmis bir mayadan türetilen Fab fragmani tarafindan saglanir ve afinite kromatografi reçinesinden elde edilen ürünün safligi %90'dan fazladir. . Istem 6'ya göre bir proses olup, özelligi boyut çikarma, anyon degisimi, katyon degisimi, hidrofobik etkilesim ve immobilize metal afinite kromatografisinden seçilen ilave kromatografi asamasinin(asamalarinin) gerçeklestirilmesi ile karakterize edilmesi, son ürünün safliginin, %99'dan fazla olmasi ile karakterize edilmesidir. . Istem 1 ila 7'den herhangi birine göre bir proses olup, özelligi, saflastirma dizisinin, ayrica, kimyasal bazli bir inaktivasyon adimi, boyut bazli bir çikarma adimi, kromatografi adimlari veya bunlarin kombinasyonlarinin kaldirilacak olan patojene yönelik farkli fizyolojik özelliklere dayanan kombinasyonlarini içeren patojen çikarma/inaktivasyon adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.