SU975797A1 - Способ выделени лейцинаминопептидазы из aSpeRGILLUS oRYZae - Google Patents

Description

Изобретение относится к способам получения фермента лейцинаминопепти·? дазы (К.Ф.3.4.11.1.), применяемой в молекулярной биологии для исследования аминокислотной последовательности в белковых молекулах, для получения аминокислот и в медицине.

Известны способы получения лейцинаминопептизады из животного и растительного сырья, например, из почки . свиньи £ 1J и из семян гороха £ 2 J

Однако эти способы основаны на использовании дефицитного или пищевого сырья и не имеют промышленного значения.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения пейцинаминопептидазы с помощью микроорганизмов, в частности из плесневого гриба Aspergillus oryzal[3]·

Способ заключается в том, что неочищенный Ферментный раствор предвари2 тельно очкацают групповой обработкой ^амберлитом, фракционируют сульфатом аммония, осаждают риванолом.Полученный осадок двухкратно экстрагируют

Э,5 Н ацетатным буфером с pH 5,0. В ⁵ охлажденном экстракте осаждают белки, добавляя охлажденный ацетон до 67%** ной концентрации. Осадок растворяют в воде. Последующую ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят при линейном гриденте 0-0,4 М NaCt в 0,01 Н йосфатном буфере с pH 7>0.

После концентрирования на ультрафильт· ре лейцинаминопептидазную йракцию наносят на колонку с сефадексом 0-100 и повторно гельфильтруют на колонке с сефадексом Г»-200 в 0,1 М ацетатном буфере с pH 6,5. Потом проводят хроматографию на диэтиламиноэтил-сефа₂₀ дексе А-50 с фосфатным буфером (pH

7,0) при линейном градиенте 0-0,4 М NaC|. Очистку завершают повторной гельфильтрацией на сефадексе G-200 в 0_r1 М ацетатном буфере с pH 6,5.

Полученный препарат замораживают до -15°С.

Общая активность лейцинаминопептидазы (в экстракте - 2090 ед., в полученном препарате - 262 ед.) - 13%. 5

Удельная активность лейцинаминопептидазы в экстракте - 0,181 ед./мг белка, в полученном препарате 4,54 ед./мг белка (субстрат трипептид Лей-Гли-Гли). Вычисленная сте- ю пень очистки - 25.

Наряду с обеспечением высокой удельной активности известный способ имеет недостатки - сравнительно низкий выход по общей активности, вызван· 15 ₍ный длительным и многоступенчатым ^процессом выделения, в котором возниЬ кают потери, и недостаточно высокую степень очистки,

Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки, упрощение процесса выделения.

Поставленная цель достигается способом получения лейцинаминопептидазы ₂₅ из Aspergillus oryzae,включающим экстракцию фермента буфером, осаждение его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтил целлюлозе с элюцией буфером, _Μ содержащим НаС1, причем в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-67%, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят дважды, при этом сорбцию фермента проводят в статических ³⁵ условиях при объемном соотношении Фермент: сорбент 1:(.1,3-1,5), элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом ЫаС1 от 0,2 до 0,5 И в буфере, а между хро-*° матографическими стадиями ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62^σ0 в течение ΙΟΙ 2 мин.

Обычно используют 0,005 М веро-. ⁴⁵ нальный буфер с pH 7,9“В,О·

Этим достигается повышение качества сорбции фермента на ионообменной целлюлозе, которую осуществляют смешиванием ферментного раствора с сор- ⁵⁰ бентом в статических условиях. Про- _k ведением десорбции Фермента в динамических условиях при ступенчатом градиенте достигается четкость разделения белков. Отличия в условиях сорб- ⁵⁵ ции и десорбции сокращают время проведения стадий ионообменной хроматографии и рехроматографии. Увеличение степени очистки на этих стадиях пот зволяет отказаться от гельфильтрации на сефадексе и упростить процесс.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Амилоризин П 10 X экстрагируют 3 ч 0,00-5 М верональным буфером с pH 7»9“ §j1 при комнатной температуре. Центрифугируют 25“35 мин при 5.500-6000 об/ /мин. Центрифугат охлаждают и добавляют охлажденный до -20^С этиловый спирт до конечной концентрации 60-6?%. Через 20 мин -осадок отделяют центрифугированием, которое осуществляют 20-25 мин при 5500-6000 об/мин и 0-4®С, и растворяют в двойном объеме 0,005 М веронального буфера с pH 7,9“ 8,1. Нерастворенный осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях. Полученный центрифугат смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3-1,57 и заполняют колонку. НеЬорбированные белки и лейцинаминопеп#· тидазнонеактивные белки отмывают 0,2 Н раствором NaC1 в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют 0,5 М раствором ПаС1 в том же буфере, диализируют и нагревают до 6О-62^СС, выдерживают [при этой температуре 10-12 мин, быстро охлаждают до 0-4^0, смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3“1»5) и заполняют в колонку. Отмывание колонки и десорбцию фермента проводят как и первую хроматографию. Полученный препарат концентрируют с сухим сефадексом G-75.

Выход по активности - 25% (активность в экстракте - 8,68 ед., в полученном препарате - 2,17 ед.).

Степень очистки - 38 (удельная активность экстракта - 0,00815, полученного препарата - 0,31 ед/мг белка по субстрату Лей-И-нитроанилид).

Пример 1. 50 г амилоризина П 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М верональном буфере с pH 7»9“8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют 25“35 мин при 5 »56,0 тыс.об/мин.

Экстракт (215 мл) охлаждают до 0-4°С и добавляют 502 мл 96%-ного этилового спирта, охлажденного до -20°С, до конечной концентрации 67%. _s Через 20 мин осадок отделяют центри фугированием при 5,5“6,0 тыс.об/мин при(-2) 2 )°С и растворяют в 100 мл

0,005 М веронального буфера с pH 7.9 8,1. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при тех же уело- s виях.

Полученные 135 мл центрифугата смешивают в течение часа с 175 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,3) и за-»0 полняют в хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 Н раствора NaC1 в 0,005 Н верональном буфере с pH 7,9-8,1. Активную фракцию 15 десорбируют, пропуская через колонку 1 л 0,5 Н раствора NaCI в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содер-20 жащие максимально активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 И веронального буфера с pH 7,9“ 8,1 в течение 24 ч. Во время диализа буферный раствор меняют 4 раза! 15

Диализированный раствор нагревают до 6О-62°С и выдерживают при этой температуре 10 мин, потом быстро охлаждают до 2-6°С.

Инактивированные протеиназы отде- 30 ляют с помощью рехроматографии на ’ионообменной целлюлозе. Диализированный ферментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:1,3 и заполняют -в хроматографическую колонку. Несорбированые белки отмывают двумя литрами 0,2 И раствора НаС1 в 0,005 Н верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную фракцию ₀ десорбируют одним литром 0,5 И раствора NaCI в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содержащие максимально ’ активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 И веронального [буфера с pH 7,9-θ,Ι в течение 24 ч. iВо время диализа буферный раствор 'меняют 4 раза. _я

С целью концентрирования в 350 мл диализированного ферментного раствора помещают целлофановый мешочек с 40 г сухого сефадекса Г>~75. Через 24 ч к 5 мл концентрированного ферментного^Si раствора прибавляют 2,36 г сухого сульфата аммония (до 39? от 0,7 насыщения) и 0,0012 хлористого магния.

Общий выход по активности полученного препарата - 25? (активность экстракта - 8,84 ед., полученного препарата -,2,21 ед.). Степень очистки 32 (удельная активность экстракта 0,0079, полученного препарата 0,25 ед./мг белка по субстрату Лей-нитроанилид).

Пример 2. 50 г амилоризина П 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М верональном буфере с pH 7,9-8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют, осаждают белки спиртом, центрифугируют, растворяют осадок и вновь центрифугируют, как а примере 1.

Полученные 130 мл центрифугата смешивают в течение часа с 195 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлоэой ( в объемных соотношениях 1:1,5) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 М раствора NaCI в 0,005 И верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную ферментную фракцию десорбируфт, пропуская через колонку 1 л 0,4 К раствора NaCI в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают Сне имеют лейцинаминопептидазной активности , следующие 340 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и тепловую обработку проводят аналогично первому примеру.

При рехроматографии диализированный Ферментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой ( в объемных соотношениях 1:1,5) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 И раствора NaCI в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром 0,4 М раствором NaCI в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и концентрирование конечного продукта проводят аналогично первому примеру.

Общий выход по активности полученного продукта - 25? (активность экстракта - 8,91 ед., полученного препарата - 2,23 ед.). Степень очистки - 34 (удельная активность экстракта 0,0093, полученного препарата 975797

0,30 ед./мг белка по субстрату Лей-П-нитроанилид).

Пример 3· Экстракцию и осаждение белков этанолом проводят аналогично первому примеру. При ионообмен- 5 ной хроматографии 130 мл ферментного раствора смешивают в течение часа с 180 мл уравновешенной буфером ДЭАЭцеллюлозой (в объемных соотношениях ι 1:1,4) и заполняют хроматографичес- ·♦· кую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,3 М раствора NaC1 в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9“θ,1. Ферментную фракцию десорбируют, пропуская ¹⁵ через колонку 1 л 0,4 И раствора NaC1. в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл элюата, содержащие наксималь- » но активный фермент, собирают. Диализ и термоинактивацию балластных белков проводят аналогично первому примеру. При рехроматографии диализированный ферментный раствор смешивают в тече- & ние часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,4), заполняют колонку, отмывают 0,3 И раствором NaC1 в 0,005 И верональном буфере с pH 7,9-8)1 и де-30 сорбируют 0,4 И раствором НаС1 в том же буфере. Собирают 330 мл (с 31-го по ЗбО-ый мл) элюата, содержащих максимально активный Фермент. Конечный продукт получают после диализа и кон- 35 центрирования'.

Общий выход по активности конечного продукта - 25% (активность экстракта - 8,77 ед., полученного препарата - 2,79 ед.). Степень очйстки - 40 (удельная активность экстракта 0,00815, полученного препарата 0,31 ед./мг белка по субстрату Лейrh-нитроанилид).

Определение активности фермента.

За единицу активности лейцинамино·¹ пептидазы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1,0 мкмоль лейцин-И-нитроанилида в _и минуту при 37°С и pH 8,5«

Удельную активность лейцинаминопептидазщ вычисляют по формуле ^Λ Τ^'^,ΤΓ ·χ ^вя-^{/иг белка}' “ где 3.5 г оСГьен реакционной смеси в кювете, см^;

3,9 коэффициент экстинкции . , 1 мкмоль 'И-нитроанилина в условиях опыта;

t - время инкубации Фермента с субстратом;

0,1· *· объем раствора препарата, взятый на анализ, см·**;

х - концентрация белка в исходной растворе, мг/см^ (определяется по Лоури,).

Активность лейцинаминопептидаэы определена на субстрате Лей-И-нитроанилид отечественного производства.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в обеспечении производства фермента лейцинаминопептидазы, используемого в молекулярной биологии и медицине из дешевого микробиального сырья;, повышение общего выхода по активности, который по известному способу составляет 13%, а по предлагаемому - 25%. Кроме того, степень очистки увеличивается с 25 (по известному способу) до 38 (по предлагаемому) . В процессе выделения исключаются также стадии гельфильтрации на сефадексе R-100 и сефадексе G-200.

Claims (1)

1. Spacknan П.И., Snith E.L., 3. Hakadnl Т., Hasuno S,, Iguchf Ч. Prown D.U. Leuclne anfnopeptldase IV. j Purification of leuctne anonopepttdeOsolatlon and properties of the engy- se II frori Asp, oryzoe. Atyr. Blol. jme from swine RMnftv. J. Rlol. Chen., Chen, ,1973, Vol. 37, Mr, ii, p. 76719$5 , voK 212, Nr. 1, p. 255.; 77.

Nr. 1, p. 113-1t8,