SU975797A1 - Method for isolating leucineaminopeptitdase from aspergillus oryzae - Google Patents

Description

Изобретение относится к способам получения фермента лейцинаминопепти·? дазы (К.Ф.3.4.11.1.), применяемой в молекулярной биологии для исследования аминокислотной последовательности в белковых молекулах, для получения аминокислот и в медицине.The invention relates to methods for producing the enzyme leucine aminopept Dases (K.F.3.4.11.1.), used in molecular biology to study the amino acid sequence in protein molecules, to obtain amino acids and in medicine.

Известны способы получения лейцинаминопептизады из животного и растительного сырья, например, из почки . свиньи £ 1J и из семян гороха £ 2 JKnown methods for producing leucine aminopeptides from animal and plant materials, for example, from the kidney. pigs £ 1J and from pea seeds £ 2 J

Однако эти способы основаны на использовании дефицитного или пищевого сырья и не имеют промышленного значения.However, these methods are based on the use of scarce or food raw materials and do not have industrial significance.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения пейцинаминопептидазы с помощью микроорганизмов, в частности из плесневого гриба Aspergillus oryzal[3]·The closest in technical essence is a method for producing peycinaminopeptidase using microorganisms, in particular from mold Aspergillus oryzal [3] ·

Способ заключается в том, что неочищенный Ферментный раствор предвари2 тельно очкацают групповой обработкой ^амберлитом, фракционируют сульфатом аммония, осаждают риванолом.Полученный осадок двухкратно экстрагируютThe method consists in preliminarily scouring the crude enzyme solution by group treatment with amberlite, fractionating with ammonium sulfate, and precipitating with rivanol. The resulting precipitate is extracted twice.

Э,5 Н ацетатным буфером с pH 5,0. В ⁵ охлажденном экстракте осаждают белки, добавляя охлажденный ацетон до 67%** ной концентрации. Осадок растворяют в воде. Последующую ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят при линейном гриденте 0-0,4 М NaCt в 0,01 Н йосфатном буфере с pH 7>0.E, 5 N acetate buffer with a pH of 5.0. Proteins are precipitated in the ⁵ chilled extract by adding chilled acetone to a 67% ** concentration. The precipitate is dissolved in water. Subsequent ion-exchange chromatography on DEAE-cellulose is carried out with a linear 0-0.4 M NaCt gradient in 0.01 N phosphate buffer with a pH of 7> 0.

После концентрирования на ультрафильт· ре лейцинаминопептидазную йракцию наносят на колонку с сефадексом 0-100 и повторно гельфильтруют на колонке с сефадексом Г»-200 в 0,1 М ацетатном буфере с pH 6,5. Потом проводят хроматографию на диэтиламиноэтил-сефа₂₀ дексе А-50 с фосфатным буфером (pHAfter concentrating on ultrafilter · leucine aminopeptidase fraction, it is applied to a Sephadex 0-100 column and re-gel filtered on a Sephadex G ”-200 column in 0.1 M acetate buffer with a pH of 6.5. Then, chromatography was performed on diethylaminoethyl-seph ₂₀ dex A-50 with phosphate buffer (pH

7,0) при линейном градиенте 0-0,4 М NaC|. Очистку завершают повторной гельфильтрацией на сефадексе G-200 в 0_r1 М ацетатном буфере с pH 6,5.7.0) with a linear gradient of 0-0.4 M NaC |. The purification is completed by repeated gel filtration on Sephadex G-200 in 0 _r 1 M acetate buffer with a pH of 6.5.

Полученный препарат замораживают до -15°С.The resulting preparation is frozen to -15 ° C.

Общая активность лейцинаминопептидазы (в экстракте - 2090 ед., в полученном препарате - 262 ед.) - 13%. 5The total activity of leucine aminopeptidase (in the extract - 2090 units, in the resulting preparation - 262 units) - 13%. 5

Удельная активность лейцинаминопептидазы в экстракте - 0,181 ед./мг белка, в полученном препарате 4,54 ед./мг белка (субстрат трипептид Лей-Гли-Гли). Вычисленная сте- ю пень очистки - 25.The specific activity of leucine aminopeptidase in the extract is 0.181 units / mg protein, in the resulting preparation 4.54 units / mg protein (Lei-Gly-Gly tripeptide substrate). The calculated degree of purification is 25.

Наряду с обеспечением высокой удельной активности известный способ имеет недостатки - сравнительно низкий выход по общей активности, вызван· 15 ₍ный длительным и многоступенчатым ^процессом выделения, в котором возниЬ кают потери, и недостаточно высокую степень очистки,Along with providing high specific activity, the known method has drawbacks - a relatively low yield in total activity caused by a 15 ₍ long and multi-stage separation process in which losses occur and an insufficiently high degree of purification,

Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки, упрощение процесса выделения.The purpose of the invention is to increase the yield and degree of purification, simplifying the isolation process.

Поставленная цель достигается способом получения лейцинаминопептидазы ₂₅ из Aspergillus oryzae,включающим экстракцию фермента буфером, осаждение его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтил целлюлозе с элюцией буфером, _Μ содержащим НаС1, причем в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-67%, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят дважды, при этом сорбцию фермента проводят в статических ³⁵ условиях при объемном соотношении Фермент: сорбент 1:(.1,3-1,5), элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом ЫаС1 от 0,2 до 0,5 И в буфере, а между хро-*° матографическими стадиями ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62^σ0 в течение ΙΟΙ 2 мин.The goal is achieved by a method of producing leucine aminopeptidase ₂₅ Aspergillus oryzae, comprising extracting the enzyme buffer, its precipitation with an organic solvent followed by chromatography on DEAE cellulose eluting with buffer, _Μ containing NaS1, wherein the organic solvent used in the precipitation at a concentration of ethanol 60-67%; chromatography on DEAE-cellulose is carried out twice, while the sorption of the enzyme is carried out in static ³⁵ conditions with a volume ratio of Enzyme: sorbent 1 :(. 1.3-1.5), elution of the enzyme they are carried out under dynamic conditions with a stepwise NaCl gradient from 0.2 to 0.5 I in the buffer, and between the chromatographic stages the enzyme-containing solution is subjected to heat treatment at 60-62 ^σ 0 for ΙΟΙ 2 min.

Обычно используют 0,005 М веро-. ⁴⁵ нальный буфер с pH 7,9“В,О·Typically, 0.005 M vero is used. ⁴⁵ buffer with pH 7.9 “B, O ·

Этим достигается повышение качества сорбции фермента на ионообменной целлюлозе, которую осуществляют смешиванием ферментного раствора с сор- ⁵⁰ бентом в статических условиях. Про- _k ведением десорбции Фермента в динамических условиях при ступенчатом градиенте достигается четкость разделения белков. Отличия в условиях сорб- ⁵⁵ ции и десорбции сокращают время проведения стадий ионообменной хроматографии и рехроматографии. Увеличение степени очистки на этих стадиях пот зволяет отказаться от гельфильтрации на сефадексе и упростить процесс.This improves the quality of the sorption of the enzyme on ion-exchange cellulose, which is carried out by mixing the enzyme solution with sorbent ⁵⁰ under static conditions. _K pro- conducting desorption enzyme under dynamic conditions with a stepped gradient separation of proteins achieved clarity. The differences in the conditions of ⁵⁵ tion sorption and desorption steps reduce the time of ion exchange chromatography and rehromatografii. An increase in the degree of purification at these stages of sweat eliminates gel filtration at Sephadex and simplifies the process.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.The proposed method is as follows.

Амилоризин П 10 X экстрагируют 3 ч 0,00-5 М верональным буфером с pH 7»9“ §j1 при комнатной температуре. Центрифугируют 25“35 мин при 5.500-6000 об/ /мин. Центрифугат охлаждают и добавляют охлажденный до -20^С этиловый спирт до конечной концентрации 60-6?%. Через 20 мин -осадок отделяют центрифугированием, которое осуществляют 20-25 мин при 5500-6000 об/мин и 0-4®С, и растворяют в двойном объеме 0,005 М веронального буфера с pH 7,9“ 8,1. Нерастворенный осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях. Полученный центрифугат смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3-1,57 и заполняют колонку. НеЬорбированные белки и лейцинаминопеп#· тидазнонеактивные белки отмывают 0,2 Н раствором NaC1 в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют 0,5 М раствором ПаС1 в том же буфере, диализируют и нагревают до 6О-62^СС, выдерживают [при этой температуре 10-12 мин, быстро охлаждают до 0-4^0, смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,3“1»5) и заполняют в колонку. Отмывание колонки и десорбцию фермента проводят как и первую хроматографию. Полученный препарат концентрируют с сухим сефадексом G-75.Amilorizin P 10 X is extracted for 3 hours with a 0.00-5 M veronal buffer with a pH of 7–9 “§j1 at room temperature. Centrifuge 25 “35 min at 5.500-6000 rpm. The centrifugate is cooled and ethyl alcohol cooled to -20 ^ C is added to a final concentration of 60-6?%. After 20 minutes, the precipitate was separated by centrifugation, which was carried out for 20-25 minutes at 5500-6000 rpm and 0-4 ° C, and dissolved in a double volume of 0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9 "8.1. The undissolved precipitate is separated by centrifugation under the same conditions. The resulting centrifugate is mixed with a balanced buffer DEAE-cellulose in a volume ratio of 1: (1.3-1.57 and fill the column. Non-absorbed proteins and leucinamine-peptidine-inactive proteins are washed with a 0.2 N solution of NaC1 in a 0.005 M Verona buffer with pH 7, 9-8,1. the active fraction was desorbed with 0.5 M solution PaS1 in the same buffer, dialysed and heated to 6D-62 ^C. C., kept [at this temperature for 10-12 min, rapidly cooled to 0-4 = 0, mixed with buffer balanced DEAE-cellulose in a volume ratio of 1: (1.3 “1” 5) and filled into the column. and the desorption of the enzyme is carried out as the first chromatography. The resulting preparation is concentrated with dry Sephadex G-75.

Выход по активности - 25% (активность в экстракте - 8,68 ед., в полученном препарате - 2,17 ед.).The yield in activity is 25% (activity in the extract is 8.68 units, in the resulting preparation - 2.17 units).

Степень очистки - 38 (удельная активность экстракта - 0,00815, полученного препарата - 0,31 ед/мг белка по субстрату Лей-И-нитроанилид).The degree of purification is 38 (the specific activity of the extract is 0.00815, the obtained preparation is 0.31 u / mg protein on a Lei-I-nitroanilide substrate).

Пример 1. 50 г амилоризина П 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М верональном буфере с pH 7»9“8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют 25“35 мин при 5 »56,0 тыс.об/мин.Example 1. 50 g of amylorizin P 10 X was extracted in 250 ml of 0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9–8.1.1 for 3 hours at room temperature. Centrifuged 25 “35 min at 5” 56.0 thousand rpm.

Экстракт (215 мл) охлаждают до 0-4°С и добавляют 502 мл 96%-ного этилового спирта, охлажденного до -20°С, до конечной концентрации 67%. _s Через 20 мин осадок отделяют центри фугированием при 5,5“6,0 тыс.об/мин при(-2) 2 )°С и растворяют в 100 млThe extract (215 ml) was cooled to 0-4 ° C and 502 ml of 96% ethanol cooled to -20 ° C were added to a final concentration of 67%. _s After 20 min, the precipitate is separated by centrifugation at 5.5 “6.0 thousand rpm at (-2) 2) ° C and dissolved in 100 ml

0,005 М веронального буфера с pH 7.9 8,1. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при тех же уело- s виях.0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9 8.1. Insoluble precipitate is separated by centrifugation at the same conditions.

Полученные 135 мл центрифугата смешивают в течение часа с 175 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,3) и за-»0 полняют в хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 Н раствора NaC1 в 0,005 Н верональном буфере с pH 7,9-8,1. Активную фракцию 15 десорбируют, пропуская через колонку 1 л 0,5 Н раствора NaCI в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содер-20 жащие максимально активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 И веронального буфера с pH 7,9“ 8,1 в течение 24 ч. Во время диализа буферный раствор меняют 4 раза! 15The resulting 135 ml of centrifugate was mixed for one hour with 175 ml of buffer-balanced DEAE-cellulose (in a volume ratio of 1: 1.3) and filled into a chromatographic column. Unsorbed and ballast proteins are washed with two liters of a 0.2 N solution of NaC1 in a 0.005 N veronal buffer with a pH of 7.9-8.1. The active fraction 15 is desorbed by passing through a column of 1 L of a 0.5 N NaCl solution in the same buffer. The first 20 ml of the eluate is discarded (do not have leucine aminopeptidase activity), the next 320 ml, containing the maximum active enzyme, are collected and dialyzed against 5 L of 0.0005 I veronal buffer with a pH of 7.9 “8.1 for 24 hours. During dialysis, the buffer solution is changed 4 times! fifteen

Диализированный раствор нагревают до 6О-62°С и выдерживают при этой температуре 10 мин, потом быстро охлаждают до 2-6°С.The dialyzed solution is heated to 6O-62 ° C and maintained at this temperature for 10 minutes, then quickly cooled to 2-6 ° C.

Инактивированные протеиназы отде- 30 ляют с помощью рехроматографии на ’ионообменной целлюлозе. Диализированный ферментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:1,3 и заполняют -в хроматографическую колонку. Несорбированые белки отмывают двумя литрами 0,2 И раствора НаС1 в 0,005 Н верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную фракцию ₀ десорбируют одним литром 0,5 И раствора NaCI в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содержащие максимально ’ активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 И веронального [буфера с pH 7,9-θ,Ι в течение 24 ч. iВо время диализа буферный раствор 'меняют 4 раза. _я Inactivated proteinases 30 are separated by rechromatography on ion exchange cellulose. The dialyzed enzyme solution was mixed for 1 hour with DEAE-cellulose-balanced buffer in a volume ratio of 1: 1.3 and filled into the chromatographic column. Unsorbed proteins are washed with two liters of a 0.2 I solution of NaCl in a 0.005 N veronal buffer with a pH of 7.9 “8.1. The active fraction _{0 is} stripped with one liter of 0.5 AND NaCl solution in the same buffer. The first 20 ml of the eluate is discarded (do not have leucine aminopeptidase activity), the next 320 ml containing the maximum 'active enzyme is collected and dialyzed against 5 L of 0.0005 I veronal [buffer with pH 7.9-θ, Ι for 24 hours. IВо dialysis time, the buffer solution is changed 4 times. _I

С целью концентрирования в 350 мл диализированного ферментного раствора помещают целлофановый мешочек с 40 г сухого сефадекса Г>~75. Через 24 ч к 5 мл концентрированного ферментного^Si раствора прибавляют 2,36 г сухого сульфата аммония (до 39? от 0,7 насыщения) и 0,0012 хлористого магния.In order to concentrate in a 350 ml dialyzed enzyme solution, a cellophane bag with 40 g of dry Sephadex G> ~ 75 is placed. After 24 hours, 2.36 g of dry ammonium sulfate (up to 39 от from 0.7 saturation) and 0.0012 magnesium chloride are added to 5 ml of concentrated enzyme ^Si solution.

Общий выход по активности полученного препарата - 25? (активность экстракта - 8,84 ед., полученного препарата -,2,21 ед.). Степень очистки 32 (удельная активность экстракта 0,0079, полученного препарата 0,25 ед./мг белка по субстрату Лей-нитроанилид).The total yield according to the activity of the obtained drug is 25? (the activity of the extract is 8.84 units, the obtained preparation is 2.21 units). The degree of purification is 32 (specific activity of the extract is 0.0079, the resulting preparation 0.25 units / mg protein on the Lei-nitroanilide substrate).

Пример 2. 50 г амилоризина П 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М верональном буфере с pH 7,9-8,1 в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют, осаждают белки спиртом, центрифугируют, растворяют осадок и вновь центрифугируют, как а примере 1.Example 2. 50 g of amylorizin P 10 X is extracted in 250 ml of 0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9-8.1 for 3 hours at room temperature. Centrifuged, precipitated proteins with alcohol, centrifuged, dissolved the precipitate and centrifuged again, as in example 1.

Полученные 130 мл центрифугата смешивают в течение часа с 195 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлоэой ( в объемных соотношениях 1:1,5) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 М раствора NaCI в 0,005 И верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную ферментную фракцию десорбируфт, пропуская через колонку 1 л 0,4 К раствора NaCI в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают Сне имеют лейцинаминопептидазной активности , следующие 340 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и тепловую обработку проводят аналогично первому примеру.The resulting 130 ml of a centrifugate was mixed for one hour with 195 ml of DEAE-celluloea equilibrated buffer (in a volume ratio of 1: 1.5) and the chromatographic column was filled. Unsorbed and ballast proteins are washed with two liters of a 0.2 M NaCI solution in 0.005 And veronal buffer with a pH of 7.9 “8.1. The active enzyme fraction of desorbiruft, passing through a column of 1 l of 0.4 K NaCl solution in the same buffer. The first 30 ml of the eluate is discarded. Sleep has leucine aminopeptidase activity, the next 340 ml, containing the most active enzyme, is collected. Dialysis and heat treatment are carried out similarly to the first example.

При рехроматографии диализированный Ферментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой ( в объемных соотношениях 1:1,5) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 И раствора NaCI в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9“8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром 0,4 М раствором NaCI в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и концентрирование конечного продукта проводят аналогично первому примеру.During rechromatography, the dialyzed Enzyme solution is mixed for one hour with DEAE-cellulose balanced buffer (in volume ratios of 1: 1.5) and the chromatographic column is filled. Unsorbed and ballast proteins are washed with two liters of a 0.2 I solution of NaCI in a 0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9–8.1. The active fraction is stripped with one liter of a 0.4 M NaCl solution in the same buffer. The first 30 ml of the eluate is discarded (do not have leucine aminopeptidase activity), the next 330 ml containing the most active enzyme is collected. Dialysis and concentration of the final product are carried out similarly to the first example.

Общий выход по активности полученного продукта - 25? (активность экстракта - 8,91 ед., полученного препарата - 2,23 ед.). Степень очистки - 34 (удельная активность экстракта 0,0093, полученного препарата 975797The total yield of the activity of the obtained product is 25? (the activity of the extract is 8.91 units, the obtained preparation is 2.23 units). The degree of purification - 34 (specific activity of the extract of 0.0093, the resulting drug 975797

0,30 ед./мг белка по субстрату Лей-П-нитроанилид).0.30 units / mg protein on a Lei-P-nitroanilide substrate).

Пример 3· Экстракцию и осаждение белков этанолом проводят аналогично первому примеру. При ионообмен- 5 ной хроматографии 130 мл ферментного раствора смешивают в течение часа с 180 мл уравновешенной буфером ДЭАЭцеллюлозой (в объемных соотношениях ι 1:1,4) и заполняют хроматографичес- ·♦· кую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,3 М раствора NaC1 в 0,005 М верональном буфере с pH 7,9“θ,1. Ферментную фракцию десорбируют, пропуская ¹⁵ через колонку 1 л 0,4 И раствора NaC1. в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл элюата, содержащие наксималь- » но активный фермент, собирают. Диализ и термоинактивацию балластных белков проводят аналогично первому примеру. При рехроматографии диализированный ферментный раствор смешивают в тече- & ние часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,4), заполняют колонку, отмывают 0,3 И раствором NaC1 в 0,005 И верональном буфере с pH 7,9-8)1 и де-30 сорбируют 0,4 И раствором НаС1 в том же буфере. Собирают 330 мл (с 31-го по ЗбО-ый мл) элюата, содержащих максимально активный Фермент. Конечный продукт получают после диализа и кон- 35 центрирования'.Example 3 · Extraction and precipitation of proteins with ethanol is carried out analogously to the first example. In ion-exchange chromatography, 130 ml of the enzyme solution are mixed for one hour with 180 ml of DEAE-cellulose balanced with buffer (in volume ratios ι 1: 1.4) and the chromatographic column is filled in · ♦ · column. Unsorbed and ballast proteins are washed with two liters of a 0.3 M NaC1 solution in a 0.005 M veronal buffer with a pH of 7.9 “θ, 1. The enzyme fraction is desorbed by passing ¹⁵ through a column of 1 L of a 0.4 And NaCl solution. in the same buffer. The first 30 ml of the eluate is discarded (do not have leucine aminopeptidase activity), the next 330 ml of the eluate, containing the maximum active enzyme, is collected. Dialysis and thermal inactivation of ballast proteins is carried out similarly to the first example. During rechromatography, the dialyzed enzyme solution is mixed for 1 hour with DEAE-cellulose balanced buffer (in volume ratios of 1: 1.4), the column is filled, washed with 0.3 I with a NaC1 solution in 0.005 I of a verine buffer with a pH of 7.9- 8) 1 and de-30 sorb 0.4 And a solution of NaCl in the same buffer. 330 ml (from the 31st to the ZBO-th ml) of the eluate containing the most active enzyme are collected. The final product is obtained after dialysis and concentration '35.

Общий выход по активности конечного продукта - 25% (активность экстракта - 8,77 ед., полученного препарата - 2,79 ед.). Степень очйстки - 40 (удельная активность экстракта 0,00815, полученного препарата 0,31 ед./мг белка по субстрату Лейrh-нитроанилид).The total yield according to the activity of the final product is 25% (the activity of the extract is 8.77 units, the obtained preparation is 2.79 units). The degree of cleaning is 40 (the specific activity of the extract is 0.00815, the resulting preparation of 0.31 units / mg protein on the Leir-nitroanilide substrate).

Определение активности фермента.Determination of enzyme activity.

За единицу активности лейцинамино·¹ пептидазы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1,0 мкмоль лейцин-И-нитроанилида в _и минуту при 37°С и pH 8,5«One unit of activity leytsinamino · ¹ peptidase take such amount of enzyme which hydrolyses 1.0 micromole leucine-I-nitroanilide per minute at _and at 37 ° C and pH 8,5 «

Удельную активность лейцинаминопептидазщ вычисляют по формуле ^Λ Τ^'^,ΤΓ ·χ ^вя-^{/иг белка}' “ где 3.5 г оСГьен реакционной смеси в кювете, см^;The specific activity was calculated by the formula leytsinaminopeptidazsch ^{Λ Τ ^ '^, ΤΓ ·} χ ^Knitted - ^{/ u protein'} "where oSGen 3.5 g of the reaction mixture in the cuvette cm ^;

3,9 коэффициент экстинкции . , 1 мкмоль 'И-нитроанилина в условиях опыта;3.9 extinction coefficient. , 1 μmol 'of I-nitroaniline under experimental conditions;

t - время инкубации Фермента с субстратом;t is the time of incubation of the enzyme with the substrate;

0,1· *· объем раствора препарата, взятый на анализ, см·**;0.1 · * · the volume of the drug solution taken for analysis, cm · **;

х - концентрация белка в исходной растворе, мг/см^ (определяется по Лоури,).x is the protein concentration in the initial solution, mg / cm ^ (determined by Lowry,).

Активность лейцинаминопептидаэы определена на субстрате Лей-И-нитроанилид отечественного производства.The activity of leucine aminopeptides was determined on a domestic production Lei-I-nitroanilide substrate.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в обеспечении производства фермента лейцинаминопептидазы, используемого в молекулярной биологии и медицине из дешевого микробиального сырья;, повышение общего выхода по активности, который по известному способу составляет 13%, а по предлагаемому - 25%. Кроме того, степень очистки увеличивается с 25 (по известному способу) до 38 (по предлагаемому) . В процессе выделения исключаются также стадии гельфильтрации на сефадексе R-100 и сефадексе G-200.The technical and economic effect of the invention is to ensure the production of the enzyme leucine aminopeptidase, used in molecular biology and medicine from cheap microbial raw materials ;, increasing the overall yield by activity, which according to the known method is 13%, and according to the proposed one, 25%. In addition, the degree of purification increases from 25 (by a known method) to 38 (by the proposed). During the isolation, gel-filtration steps on Sephadex R-100 and Sephadex G-200 are also excluded.

Claims (1)

1. Spacknan П.И., Snith E.L., 3. Hakadnl Т., Hasuno S,, Iguchf Ч. Prown D.U. Leuclne anfnopeptldase IV. j Purification of leuctne anonopepttdeOsolatlon and properties of the engy- se II frori Asp, oryzoe. Atyr. Blol. jme from swine RMnftv. J. Rlol. Chen., Chen, ,1973, Vol. 37, Mr, ii, p. 76719$5 , voK 212, Nr. 1, p. 255.; 77.1. Spacknan, PI, Snith E.L., 3. Hakadnl, T., Hasuno S ,, Iguchf, C. Prown D.U. Leuclne anfnopeptldase IV. j Purification of leuctne anonopepttdeOsolatlon and properties of the engy-se II frori Asp, oryzoe. Atyr. Blol. jme from swine RMnftv. J. Rlol. Chen., Chen, 1973, Vol. 37, Mr, ii, p. 76719 $ 5, voK 212, Nr. 1, p. 255 .; 77. Nr. 1, p. 113-1t8,Nr. 1, p. 113-1t8,