SU946389A3 - Способ получени тромбиноподобных ферментов - Google Patents

Description

39 Нерастворимый гепарин можно полу чить взаимодействием гепарина извес ным способом через его аминогруппы с реакционноспособными группами полимерного нерастворимого в воде вещества - носител , св зыва  его, тем самым, ковалентно с носителем. Нерастворимый гепарин можно, например , получить предлагаемым способом путем св зывани  гепарина с агарозой по цианогенбромидному методу, путем св зывани  с путресцинагарозойипо тифосгеновому методу или путем св зывани  с эпсилонаминокапроилагарозой по карбодиимидному методу.. В качестве носител  можно примел ть и целлюлозу и ее соответствующие производные, т.е. путресциновую и эпсилонаминокапроилцеллюлозу. Нерастворимый гепарин целесообразно получать и путем взаимодействи  гепарина с поперечно сшитой цианогенбромидной агарозой в виде шариков или бусин стандартной величины. Обработку исходного материала нерастворимым гепарином {т.е. св зывание тромбиноподобного фермента зме иного  да с гепарином) и отщепление фермента из нерастворимого гепарина можно вести по порци м путем размеши вани  исходного материала, растворенного в воде, водном буферном раст воре, водном растворе электролита бе . буферного действи  или, в крайнем случае, с небольшим буферным действи ем или же содержащем как буфер, так нейтральную соль, например хлористый натрий, вместе с родственным адсорбентом (т.е. нерастворимым гепарином ) с последующей фильтрацией, или же, предпочтительно, хроматографией по химическому родству на колонне. В качестве электролитов пригодны неорганические и органические соли, например хлористый натрий, хлористый аммоний, сульфат магни , сульфат ам:мони , ацетат натри , хлористый каль ций, бикарбонат аммони , формиат аммони , триэтиламингидрохлорид; или же органические кислоты, как например уксусна , винна  или лимонна ; или же основани , как например гидроокись аммони , триметиламин, триэтиламин . При хроматографии по химическому родству нерастворимый гепарин заливают в колонну, диаметр которой соответствует примерно одной дес той ее пысопы, и эквилибрируют той же водной средой, в которой растворен исходный материал. На выходе из колонны целесообразно установить фотометрический расходомер, измер ющий и автоматически записывающ-ий оптическую плотность выход щих элюатов при надлежащем диапазоне волн (280 или 2S нм) . Злюаты, предпочтительно , разбивают на фракции посредством автоматического коллектора фракций и собирают. Хроматографию по химическому родству ведут следующим образом. Исходный материал (сырой змеиный  д или его фракцию) раствор ют в воде, водном буферном растворе или водном растворе электролита, например растворе хлористого натри , или же водном растворе, содержащем как буфер так и нейтральную соль, например хлористый натрий. Раствор фильтруют до прозрачности или центрифугируют и затем заливают в колонну. Колонну до тех пор промывают той же водной средой , что и та, в которой растворен исходный материал, до тех пор, пока в выход щем элюате больше нельз  обнаружить поглощающие УФ-лучи вещества. Затем колонну промывают водным алюентом, например буферным раствором или электролитным раствором или раствором, содержащим как буфер так и нейтральную соль, например хлористый натрий, концентраци  которого превышает таковую водНОЙ среды, в которой растворен исходный материал, с целью отщеплени  тромбиноподобного фермента змеиного  да от нерастворимого гепарина. Промывают до тех пор, пока не элюируетс  поглощающее УФ-лучи вещество. Затем промывают еще раз буферным раствором , раствором электролита или раствором, содержащим как буфер, так и нейтральную соль, например хлористый натрий, отличающимс  концентрацией , достаточной дл  удалени  без остатка из колонны веществ, более сильно св занных с нерастворимым гепарином, чем тромбиноподобные ферменты, так что по,сле осаждени  адсорбент по родству снова можно регенерировать и использовать дл  нового процесса. В качестве буферных растворов пригодны водные растворы солей неорганических или органических оснований с неорганическими или органическими кислотами или же соли амфотерных веществ, развивающих буферное действие в пределах рН 4-10. В частности , пригодны нетоксич-ные вещества или их смеси, не содержащие ароматических групп и поэтому не поглощающие свет длиной волн 280 или нм и которые тем самым, не мешают проведению УФ-фотометрического контрол  процесса хроматографии, в частности буферы на основе глицина /гидроокиси натри , уксусной кислотыгидроокиси натри , лимонной кислоты/ гидроокиси натри , триэтаноламина сол ной кислоты, лизина / сол ной- кислоты , глици.лглицина/сол ной кислоты, фосфата натри , а также летучие в вакууме буферные системы как буферы на основе формиата аммони , ацетата аммони , этилендиаминтетраацетата .

Дл  применени  в прерывистом способе далее пригодны буферы на основе гидрокарбоната натри , гидрокарбоната аммони , однако они дл  хроматографических операций непригодны из-за выделени  СО. Тромбиноподобные ферменты из различных змеиных  дов обладают разным родством к нерастворимому гепарину, св занному нерастворимым наполнителем. В соответствии с этим состав буферов биологического происхождени  следует согласовывать с выдел емыми ферментами .

Чем меньше концентраци  буферного или электролитного раствора или раствора буфер-нейтральна  соль, тем лучше фермент св зываетс  с нерастворимым гепарином.

Однако при низкой концентрации максимальной  вл етс  неспецифическа  способность гепарина св зывать белки, концентрации надо подбирать такими, при которых св зываетс  тромбиноподобный фермент, остальные же белки проход т через колонну без задержки. Дл  каждого отдельного  да оптимальные услови  по концентрации могут быть определены простыми предварительными экспериментами.

Св зывание всех исследованных тромбиноподобных ферментов из змеиных  дов происходит при концентраци х буферных растворов или электролитных растворов или растворов буфер-нейтральна  соль в пределах диапазона мол рности 0,01-0,5 и рН -10 в зависимости от рода  да.

Дл  отщеплени  тромбиноподобных ферментов из змеиных  дов, св занных с нерастворимым гепарином, примен ют буферные растворы или электролитные растворы или растворы буфернейтральна  соль, обладающие более высокой концентрацией, чем раствор, используемый дл  св зывани  фермента к нерастворимому гепарину. Предпочтительно примен ют тот же раст-. вор буфера, что и дл  св зывани  фермента к нерастворимому гепарину, однако концентрацию его повышают путем добавлени  сильно диссоциирующей соли нейтрального характера, предпочтительно хлористого натри , таким образом, что св занный фермент отщепл етс  от нерастворимого гепарина .

0 Поскольку в некоторых змеиных  дах содержатс  и другие вещества с родством к нерастворимому, гепарину , концентрацию используемого дл  элюировани  раствора, предпочтительно , довод т до значени , при котором тромбиноподобный фермент отщепл етс , другие же вещества с более сильным родством остаютс  св занными с нерастворимым гепарином .

Отщепление всех св занных с нерастворимым гепарином тромбиноподобных ферментов из змеиных  дов провод т предпочтительно при концентраци х диапазона от 0,1-2 молей и при рН диапазона t-IO.

Удаление всех св занных с нерастворимым гепарином компонентов  дов с родством к гепарину, превышающим таковое тромбиноподобных .ферментов , целесообразно проводить с применением буферных растворов или растворов электролита или растворов буфер/нейтральна  соль, с мол рностью 0, и диапазоном рН -10. Предпочтительно концентрацию первого буферного раствора, используемого дл  св зывани  фермента,.и нерастворимый гепарин, довод т путем добавлени  нейтральной соли, предпоч..титель

но хлористого натри , до желательного значени . Адсорбент перевод т в рабочее состо ние путем промывки первым буферным раствором, использованным дл  св зывани  фермента с нерастворимым гепарином.

Родство нерастворимого гепарина к тромбиноподобным ферментам из змеиных  дов при низкой температуре максимально и снижаетс  с повышением температуры. Это  вление можно использовать дл  инициировани  св зывани  фермента к нерастворимому гепарину при низкой температуре, напри мер в охлаждаемой лед ной водой колонне , равно как и отм еплени  фермен та повышением температуро в охлаждаю щей или обогревательной рубашке колонны , например цо kO°C,c применение одного единственного буферного раствора посто нной концентрации и посто  нного значени  рН. Отщепление фермента от нерастворимого гепарина осуществл ют при пос то нной концентрации водной среды на буфере и/или нейтральной соли путем повышени  или снижени  значени  рН выше или, соответственно, ниже такового , при котором происходит св зывание фермента с нерастворимым гепарином . рН дл  каждого фермента определ ют проведением простых предварительных опытов. Содержание тромбиноподобного фермента из змеиного  да в элюатах, полу ченных при хроматографии на колонне определ етс  опытом по све;ртыванию, предпочтительно на фибриногене. В качестве опыта по свертыванию пригодно, например, определение времени свертывани  в секундах по добавлении ,0,2 мл разбавленного элюата к 0,2 мл 0,4 -ного фибриногена (круп ного рогатого скота) при рН 7,k и 37 С. Простое определение времени свертывани  пригодно дл  получени  графика профил  активности в виде кривых элюировани . По той же технике с применением тромбинового стандартного препарата или с применением стандартного препарата дл  данного тромбиноподобного фермента из змеиного  да калибровочной кривой активности можно получить из времени свертывани  в количественных дан ,ных .(единицы National Institute of Heatth (NIH) или единицы Ancrod или единицы Batroxobin). Содержание тромбиноподобного фермента можно определить и фотометрическим путем с применением синтетического хромогенового тромбинового субстрата, например Tos-Gly-Pro Arg-pNA.tiC в ферментных единицах. Одна единица (U) в таком случае обозначаСт количество фермента, отщепл ющее в услови х опыта в течение 1 мин и 1 м моль субстрата. Из собранных активных фракций затем удал ют нежелательные буферные вещества и соли путем диализа полностью или частично. Одновременные обессоливание и концентрацию собранных активных фракций осуществл ют ультрафильтрацией, например с применением мембраны Diafto-Membran иМ-2. Необходимость обессоливани  и концентрации фракции, содержащей тромбиноподобный фермент из змеиного  да, зависит от рода примен емого буфера, обработанного хроматографией количества вещества и назначени  продукта. При использовании нетоксичных буферных систем, как например глицина /NaOH/NaC дл  получени  тромбиноподобных ферментных препаратов дл  экспериментального и/или терапевтического дефиброгенировани  дл  возможности получени  из собранных активных фракций элюата известными способами изотонического стерильного, не содержащего . пирогена раствора, требуетс  только частичное обессоливание или же его не требуетс  вовсе. Частичное обессоливание  вл етс  достаточным и в том случае, когда содержащийс  в элюате тромбиноподобный фермент змеиного  да нужно повторно хроматографировать с целью дальнейшей очистки, в таком случае достаточно доведение концентрации буфера или соли элюата до более низкого значени , необходимого дл  св зывани  по химическому родству, чтобы фермен оказалось возможным снова св зать с нерастворимым гепарином. Пример1. 9г гепарин-натри  специфической биологической активности 1б2 международных единиц на мг раствор ют в 1 л О,1-мол рного натрийбикарбонатного буфера, содержащего 0,5 мол /л хлористого натри  и рН которого равн етс  8,3- В раствор добавл ют AS г CNBr-сефарозы В, которой перед тем дают набухнуть и очиститьс  в 0,001 н сол ной кислоте . Смесь 2 ч перемешивают. По окончании реакции смесь фильтруют на стекл нном нутче типа G-3, отфильтрованный продукт сефароза-гепарин промывают п ть раз нотрийбикарбонатным буфером указанного состава по 300 мл. Дл  насыщени  еще содержащихс  реакциоиноспособных групп CNBr сефарозу-гепарин 2 ч.

перемешивают вместе с 1 л 0,5-иого этанолаиина в натрийбикарбонатном буфере указанного состава. Затем сефарозу-гепарин снова собирают на стекл нном нутче и еще трижды промывают натрийбикарбонатным буфером по 300 мл. После этого сефарозу-гепарин до тех пор домывают 0,1-мол рным натрийацетатным буфером рН ,0, пока рН фильтрата не будет доведен до 4,0. Наконец, ставший нерастворимым гепарин -промывают несколькими порци ми О,1-мол рного глицина /NaOH-буфера рН 8,5; заполн ют в колонну диаметром 2б мм и осаждают тем же самым буфером на основе глицина У гидроокиси натри . Колонну затем переналаживают на нисход щую хроматографию, высота колонны 29 см, тем самым содержание нерастворимого гепарина равн етс  примерно 153 мл. Выход из колонны подключают через фотометрический расходомер, настроенный на измерени волн диапазона 280 нм и оснащенный автоматическим самописцем, к сборнику фракций, установленному на сбор фракций по 350 капель„

30 г  да змеи Bothrops atrox раствор ют в бОО мл дистиллированной воды. Значение рН раствора довод т до 3,0 с помощью 1-н хлористого водорода и по истечении одного часа инкубационного процесса до с помощью 1-н гидроокиси натри . Полученный при этом продукт в виде хлопьев отдел ют центрифугированием и выбрасывают. В остаток , добавл ют раствор 15 г натрийсалицилата в 300 мл дистиллированной воды. рН раствора довод т до 3,0 с помощью 1-н хлористого водорода . По истечении 60 мин образовавшийс  осадок удал ют центрифугированием , раствор ют в 200 мл 0,1-мол рного буфера на основе глицина/ гидроокиси натри  со значением рН 8,5 и до тех пор промывают этим буфером на ультрафильтре, пока по добавлении хлористого железа - (III) х-валентного проба фильтрата не будет окрашиватьс  в фиолетовый цвет, т.е. не будет более содержать салициловой кислоты.

Оставшийс  на фильтре концентрат в количестве около 30 мл обрабатывают 0,1-мол рным буфером на основе глицина/гидроокиси натри  со значением рН 8,5 до достижени  объема

50 мл. Содержание батроксобиновых единиц (Ви) на мл составл ет в таком случае , продукт загружают -в подготовленную колонну из сефарозы-гепарина . Прополаскиванием 750 мл О,1-мол рного буфера на основе глицина/гидроокиси натри  со значением рН 8,5 (буфер 1) элюируют балластные вещества. Затем колонну элюируют

0-, 1-мол рным буфером на основе глицина-гидроокиси натри  со значением рН 8,5 (буфер П), содержащим 0,1 моль/л хлористого натри , до тех пор, пока не пройдет 1120 мл жидкости , при этом снова удал ют элюированием балластные вещества. После этого тромбинообразный фермент улавливают в виде двух абсорбирующих уф-лучи коагулирующих фибриноген

зон путем элюировани  с применением О,1-мол рного буфера на основе глицина/гидроокиси натри  со значением .рН 8,5 (буфер Ш), содержащего 0,25 мол /л хлористого натри , до количества протекающей жидкости -. 900 млн.I

Наконец, путем элюировани  с применением 600 мл буфера на основе глицина/гидроокиси натри  со значением рН 8,5 (буфер IV), содержащего 1 моль/л хлористого натри , удал ют вещества, оставшиес  св занными с сефарозой-гепарином.

Тромбиноподобный фермент (ба.трак собин) содержитс  в 800 мл элюата в концентрации 100 батраксобиновых единиц на мл. Выход в пересчете на нанесенные 112 000 батраксобиновые единицы (Ви) составл ет 71, Элюат концентрируют на ультрафильтре (Diaflomembran UM-2 Ami con) на 80 мл,после чего он служит в качестве концентрата батроксобина дл  получени  фармацевтического препарата с содержанием батраксобина в объеме 22 едини ц на миллилитр дл  терапевтического дефиброгенировани .

Пример2. 0,1 г  да змеи вида Agkistrodon contortrix раствор ют в 1,5 мл водного 6,1-мол рного буфера на основе глицина/гидроокиси натри  при рН 6,0. Раствор

Claims (2)

1. загружают в колонну ( мм, 16 мл) из гепарин-сефарозы. Колонну домывают тем же буфером до тех пор, пока сливаема  промывна  жидкость при 280 нм не показывает поглощени  света. Затем колонну прополаскивают 0,1-мол рным глициновым буфером со значением рН 6,0; содержащим 0,75 мол  хлористого натри  на литр, до тех пор, пока из колонны больше не вымы ваетс  какое-либо количество поглощ щего УФ-лучи продукта. Этот содержа щий балластные продукты элюат выбра сывают. Затем путем элюировани  с применением О,1-мол рного глициново го буфера со значением рН 6,0 и содержащего 1,0 мол  хлористого натри  на литр выдел ют тромбинообразный фермент. Получают 22 мл элюата с коагулирующим действием на фибрин ген. Согласно измерению на синтетическом хромогенном субстрате (бензоил-Рго-РЬе-Агд-и-нитроанилиде ) ак тивность в общей сложности составл  ет б99б миллиединиц. Общее процентное содержание активного элюата составл ет 6,
2. 2. Очищенный таким образом тромбинообразный фермент из   змеи Agkistrodon con tort гix показывает при электрофорезе на полиакрил амидном геле в присутствии додецилсульфата натри  одну единственную зону; при испытании на ненагретой фибриновой пластине обнаруживают отсутствие фибринолитической активности . Затем концентрируют на ультрафильтре (DiafJomembran UM-2, Am icon) до объема 1-2 мл, В концентрат добавл ют 150 мг дактозы, затем разбавл ют дистиллированной водой до 30 мл, разливают по пузырь кам объемом в 1,О мл и лиофилизирую Получают 30 пузырьков с содержанием каждый по 200 миллиединиц фермента виде стабильного сразу же раствор ю щегос  продукта. В этом виде препарат пригоден дл  исследовани  фибри ноген-фибринового превращени  в физиологических и патологических услови х . Примерз. 0,1 г  да змеи вида Agkistrodon rhodostoma раствор ют в 1,5 мл водного 0,01-мол рного глицинового буфера со значением , рН 6,0. Раствор загружают в колонну (17x70 мм, 16 иг) из гепарина-сефарозы , осажденную тем же буфером. Затем ее промывают тем же буфером до тех пор, пока с помощью фотометри ческогк) расходомера в элюате больше нельз  обнаружить поглощающий уф-луч продукт. Затем колонну элюируют в цел х удалени  балластного материала О,01-мол рным глициновым буфером со значением рН 6,0, содержащим 0,25 мол  хлористого натри  на литр. Получают 120 мл этого раствора с содерж нием 27 единиц Anorod на миллилитр. Этот продукт показывает при электрофорезе на полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натри  одну единственную зону. Предлагаемый способ Позвол ет на колонне, дл  хроматографии объемом всего лишь 20 мл расщепить более 4 г сырого  да или эквивалентное количество предварительно очищенной фракции фермента, причем образуютс  тромбиноподобные ферменты высокой степени чистоты. Это соответствует приблизительно 40-кратной производительности ионообменной хроматографии на целлюлозных обменниках, примерно 00-кратной производительности гель-хроматографии и примерно 25-кратной производительности хрома-, тографии по химическому родству на п-аминобенз-амидин-сукцинил-диаминодипропиламиноагарозе . Эта сильна  способность образовывать св зи нерастворимого гепарина не только повышает производительность расщеплени  относительно небольшого устройства дл  хроматографии, но и обеспечивает то, что активные фракции элюата содержат фермент в значительно более высоких концентраци х по сравнению с ионообменной гельхроматографией , вследствие чего значительно сокращаетс  трудоемкость операций концентрировани  и обессоливани  элюатов. Согласно предлагаемому способу тромбиноподобные ферменты из змеиных  дов получают за небольшое число операций, легко проводимых, в большой степени автоматизирующихс  и хорошо регистрируемых. Применение токсичных элюентов не нужно. Формула изобретени  Способ получени  тромбиноподобных ферментов путем хроматографии змеиного  да, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа, змеиный  д в водном растворе или в буфере рН Ц-10 с содержанием 0,0i0 ,5 моль на литр хлористого натсЗи . обрабатывают гепарином, иммобилизиМ9+б3891 ,

   рованным через аминогруппы на инертном 1. Holteman and Weiss. Extraction носителе.и выдел ют целевой продукт. and Isolation of Thrombin ike EnzyИсточники информации,mes. J. BioE. Chem. 1976, 252,

   прин тые во внимание при экспертизе j. 1663-1669.