SU673184A3 - Способ получени антибактериального и антикокцидиозного вещества - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО И АНТИКОКЦИДИОЗНОГО ВЕЩЕСТВА Т. пл. - 2 О О С (в приiSope . - . -лера; г / i20 ,, - -188 оС; let - -100 , ,л L J «« -(во ieeex елуча х С-1%, метанол -378 УФ-спектр не специфиченt ИК-спектр (таблетка .с КВр), смJ 3440 с.), 3030 (плечо) j 2960 (с.), 2938 (с.), 2880 (с.), 2855 (плечо)-, (о. сл , 2060 (о.сл , 1945 (о. 1900 (о. ел.), 1785 (плечо), (с.), 1632 (ср.), 1622 (плечо), (о.сл.), 1458 (с.), 1055 (пле1380 -(с.) , 1325 (ср.) , 1315 (плечо), 1295 (плечо) , 1272 (ср.), 1225 (ел.) , -1200 (о. ел), 1172 (ср.), 1140 (ср.), .1115 (плечо), 1100 (плечо ), 1085 (с.) , 1070Мплечо) , 1045 (плечо) ,i 1038 (с.), 1012 (ср.) 980 (с.), 958 (с.), 935 (ср.) 915 (ср.), 880 (ел.), 865 (о. ел.), 845 (о. ел.), 825 (еЛ.), 792(ср.), 775 (ел.), 735 (сл, 700 (ел.), 675 (плечо), 655 (сл, 630 (плечо) , 615 (ср.),565 (плечо), 525 (ср.), 495 (ср.), 465 (о. .ел.), 445 (еЛ.). тех наеиликагеле: Rf 0,45 в системе этилацетат-циклогексан-вода-бутанол (50:50:25:5 по объему) и В| 0,55 в системе хлористый метилен метанол (94:6 по объему). 30.504 RP про вл ет бактериологическую актив ность, особенно на некоторых бактери х при применении окрашивани  по Граму.. Бактериостатическую активность 30.504 ЕР определ ют метоДом разбавлени  как минимальную концентрацию, необходимую дл  подавлени  роста бактерий . .. Минимальна  бактериостатическа  концентраци , мкг/см :

St.duneus

Staphytococcus aur4w6

Sapeina Euleq

Streptococcus fqecqEis

Streptococcus .. ... ,

шталФлДиг (институт Пастера)0,2

DipCococetjs phcurnorviat

(институт Пастера)штамм Тил 0,05

Neifeseffo catarnhat s ; (институт.Пастера)

Bocittus toneus

uaciEEtis 5t;btitis

Wycobact rium 5pecies

sthef fch a coti

ShigieEEa cWwnteptoe Shiga L.

(институт;Пастера)

боЕтолебСа panatyphi А (институт Пастера) .штамм 209РАТСС-6538Р

0,2

штаьад Смит

0,5.

АТСС 9341

0,9

АТСС 8043

0,1

А 152,

Or 1

АТСС 6630

0,2

АТСС 6633

АТСС 607

АТСС 9637 150

150

штамм. Uo.casse

SatmoneLta SchoUmuetten

paratyphi В (институт Пастера)

Proteus VuEEfans

Pseudomonas aerurffnosa L МГ/КГ дл  цыпл т при единичном приеме. Антикокцидиоэна  активность про вл етс  при скармливании цыпл там, зараженным, например, Eimeria tenelic и Eimeria ocervulina , пищи, содержащЬй 0,005-0,04. вес,% 30.S04 RP. 30.504 ВР обладает антимал рийной активностью при экспериментальном заражении плазмоди  мыши и цыпленка. Гриб-продуцент-штамм it-epiomyccs Minoriu был вычелен из пробы . почвы,- вз той в Индии, ему присвоен номер DS 25..881.: Проба штамма передана Северной областной исследовательской лаборатории США сельскохоз йственного депар .тамента в Пеории, Ш (США), где зарегистрирована как NRRL 5.785. Этот штамм, имеющий характеристики которые не позвол ют его идентифицировать с каки 1-либо уже описанньам видом, нужно рассматривать как новый вид, названный Sir-eptomyces oHinoTiuff DS 25.881. Его можно сравнивать со trepiomyce fiygro ciopieu CWakjSmon .A.Actinomi/fete, The Wlliams and}fJiLkir Companij, Bottimore, У.2Л9б, riianu&i of Deierminalive BotierfcCo y, The WiUiam anal IVitfting , BaiUmore, изд.. 1957),так как подобно последнем irepioTn4te aUinoriu$ DS 25.881развивает растительный мицелий в р.бщем от желтого или серо-желтого , до желто-коричневого или коричнево-желто го цвета и имеет воздушный спорЪобразный мицелий серого цвета. Он не об разует меланина в органических средах не производит , медленно разжижает желатину, на которой он не образуе растворимый пигмент (на совокупности этих питательных сред, а также на синтетических органических питатёльных средах), он или не образует растворйлий пигмент, или образует только слабо окрашенный пигмент от желто-коричневатого , до коричнево-желтого цвета . Кроме этого, treptomyce gatlinaпм DS25 . на агаре Хикке  и Треснера производит растворикый фиоле тово-розово- коричневый пигмент. OT ireptomyt e Ьн отличаетс  формой спорофоров и тем что ни в каком случае в его воздушном споровом мицелии;не образуетс 

6731846

Продолжение табл. 1

штамм

150

150

150 черных блест щих зон, характерных дл  ireptomijces hydfo CoplCu. , 1герЬгт)усе altinariu . DS25.88l может быть сравним с irepto-mii(;e$ aureofaci еп$. .. , который совсем не производит меланина, обычно образует растительный мицелий от желтого до желто-оранжевого или коричневатого цвета, имеет серый воздушный споровый мицелий. . Кроме того, trepiomyceS oureoTocienS не образует растворимый пигмент на многочисленных J,питательных средах, лишь в некоторых случа х он образует растворимый пигмент от. желтого до коричневатого цвета, вообше достаточно слабого. В некоторых случа х растительный мицелий irejotomycTes oureofof fen окрашиваетс  в коричнево-красный-пурпурный цвет, но здесь речь идет о пигменте, не диффундирующем в среду, который не может соответствов.ать растворимому фиолетово-розово-;коричневатрму пигменту , который производит 3ire|i omuceS OtHnariu DS25.881. trejf)torny ieg aufeofacieng не разжижает желатину, на которой он.. образует кремовый растительный мицелый , и не коагулирует и не пептонизирует сн тое молоко, тогда как $trepiomyce gcjUinoriu DS 25.881-разжижает,желатину, на которой он образуеткоричнево-желтый мицелий, и дает чистую пептонизацию и регул рность сн того молока. Таким образом, ffipeplomyce galtinoriu DS25.881 отличаетс  также и от этого вида. Способность gfrepto7пусе$ gattinaritif Df/ 25. sSi усваивать различные источники .углерода и азота определ ют методом Придхама и Готтлиб.а (-0. of Bacieniotopy, 56, 107-114, 1948) при замене либо глюкозы на различные источники углерода , -либо (ЫНц) SO/, на различные источники азота. ireptomiiCee poftinorfuS DS 25; 881, D-ксилозу, Ь-арабанозу, ь -рамнозу, D-глюкозу, D .тгалактозу, D-фруктозу, D-маннозу, лактозу, мальтозу, сахарозу , трегалозу, целлобиозу, декстрин, крахмал, гликоген, глицерин,Б-маннит, инозит, салицин, усваивает; 15-рибозу ,L -сорбозу, рафинбэу, инулин, эритритол, адонитол, дульцит, D-сорбит не усваивает: NaNO, 6 ( NHg) ьОц , (НН„)2 НРО/, .мочевину, L-гаспарагин, глюкозалин, гликоколь, lD-аланин, 1;В-валин,ЬВ-аспарагйновую кислоту,L -глутаминовую кислоту, Ь-аргинин, L-лизин, ЬВ-серии,ЬВ-треонин , LD-метионин, ЬВ-фенилаланин, L-тирозин, 1.В-ПРОЛИН, L -оксипррлин, L-триптофан усваивает: саркозин, таурин , бетаин не усваивает. Дл  выделени  штамма $iref iomycef : аШпаНиё DS 25.881 суспендируют небольшое количество почвы, вз той в Индии, в дистиллированной, стерильной воде, разбавл ют суспензию до различных концентраций и нанос т на поверхность чашки Петри, содержащей питательную агаровую среду. После инкубации,в течение нескольких дней при колонии, которые хот т выде лить дл  дальнейшего изучени , извле кают и пересаживают в питательную аг ровую среду. $ircpiom(ie$ аШпапц. DS 25.881 образует споры от цилиндри ческих до  йцевидных, размером 1,01 ,2 мкм, 0,8-1,0 мкм. Эти спорофорыоб1разу бт грозди, споровые волокна, редкие и гибкие на концах, или принима  слегка скрученную фор1му, или образу  спиральный Bfttok, или случайно несколько витков ;Н6 своему способ у размножени  посрёдствбм спор этот родоначальник, .вида классифицируетс  в разделе Section RetrnocutuTti по классификации Пpидxaмa.tre|эiomчce aldna , АгарХикке  и ХороТреснёра ша  Переход от светло-кбрйч-s нево-желтого к Коричнево-фиолетовому Дос- Желтый Агар Беннета 1;аточно хороша  .

Эмерсона Хоро- ЖёлтоБелесовата , очень плoxt) та  корич- g неватый развита 

Споры от цилиндрических до  йцевидных , размером 1,0-1,2 мкм 0,81 ,0 мкм, Спорофоры в виде грозди , споровые волокна редкие и гибкие,часто имеющие скрученную форму или образующие виток один спиральный или случайно несчолько витков

Слабо коричневато-желтый : . -.,.-.,-,..-..... . .: Светло-сера  Фиодетоводо темно-се- розово-корой , хорошо ричневаразвита  тый От белесова- Желто-коричнетой до Серова- вый той,очень плохо развита  8 DS 25.881 хорошо развиваетс  при 26 и ЗТ.С, но не при 50С. Он представл ет собой воздушно-споровый мицелий серого цвета. Окрашивавание его растительного мицели  в зависимости от среды желтое, или ,. желто-сероватое до желто-коричневого, или коричнево-желтое. За исключением свойственного ему производства растворимого фирлртово-розово-коричневого пигмента на агаре Хикке  и Треснера на питательных средах, где его наблюдали производит растворимый пигмент Малой интенсивности, мен ющий окраску от.желто-коричневатой или серр-коричневатрй до коричневожелтой . . При выращивании при 26 С на этих средах $treptomyce got{/norj.U$ DS 25.881 меланина не образует, не производит, к тирозиназе относитс  отрицательно, желатину разжижает, целлюлозу усваивает, нитриты из нитратов образует очень хорошо не толйсЬ на питательном нитритном бульоне , но и на синтетической среде, крахмал гидролизует, пептонизирует сн тое молоко без коагул ции с очень небольшим подкислением. Свойства 5treptoTT7yee$ at-tinoriue PS 2S881 после развити  в течение 2-3 недель при 26С (если нет противоречащих указаний) на питатель- . ных агарахИ в бульонах приведены в таблице.

То же

Агар-мука овс - Достана  экстракт точно томатов Прид- хороша 

То же Желтый

Умерен-Коричнена  во-желтый

Слаба  Слабо

желтокоричневатый

Очень Коричнеумерен-во-желна  тый

Очень Слабо слаба  желто .

корич- .

неватый Умерен- Светло-желЬ

тый

на 

Желтый

Достаточно хороша 

умеЖелтова-ренто-корична  неватый

Никакого

аили слабо коричневатый ита 

Очень слабый

желто-коричнева

тый

Никакого

Растворение малата слабое и медленное

Меланин не

Слабыйпроизводит желто-. коричневый

НикакогоТо же

есоСлабо сеГидролиз до крахмала ро-коричневый -сеположитель- темный . Споры от ой, цилиндриразческих до  йцевидных

размером 0,81 ,0 мкм. Споры в виде грозди , споровые волокна редкие и гибкие, часто имеющие скрученную форму или образующие один-спираль11

i Агар-крах- Очень Светмал-нитраты умело-же ( W-10) ренто-ко на  Синтетический СлаСлабы агар Чапе- ба  желто ка на Сахасеров P03e() тый Синтети- . то же ческий агар Чапека на глюкозе (W-1, где 3% сахарозы заменено на 1,5% глюкозы ) Синтети- Очень Слабы ческий агар умеЖелто Чапека в ренкорич глицерине на  невый ( W-1, тде 3% сахарозы заменено на 1,5% глицерина ) Бульон-крах- УмеОт се мал-нитраты ренго на ( W-19)2 на  корич го Синтетиче с- Очень Культ кий бульонслахлопь Чапека с саха- ба  образ розой бело (W-18)2 вата 

То же То же

Синтетический бульон Чапека с целлю- . лозой (W -18, где сахароза зг1менена ма;лемькими1 полосами фильровальной

673184

12 Продолжение таблицы.

5

То же

То же

- «

Цроизврдит нитриты чрезвычайно Хорошо , целлюлозу .ХС1 аивает ный виток или случайно несколько витков лабо Крахмал гидг оричролизует еватоелтый икакоо или лабо елтоатый икакого ли очень лабо елтоваый лабый жело-коричеватый Производит нитриты чрез- . вычайно хорошо Никакого

ЖелтоУмеТрес- J и Данга коричренневатый на  Antibiotics Annua, 19бб-1957, р. 95 Waksman. 5.А. The Actinomycetes,, The Battimore, v. 30, p. 331, 1961. Растительный мицелий. Waksman Б.A. The Actinomycetes, Chr USA, 1950, p. 193-197, 1961 (цифра под которым среда указана в книге). Antibiotics and Cham., 2, 401,.1952. aksman . The Actinomycetes, The Baltimore, v. 2, W.42, p. 333, 1961. «Antibiotics Annuat, 1956-1957, p. 95 Manual of Methods for Pure Culture S American Bacteriologists, Geneva, И -76, 239-244, 19 Jj of Bacterio ogy. Процесс получени  30.504 ВР состоит в основном из культивировани  irepLomyfts attinanu DS 25.88lили его мутантов н питательной ере- . де в соответствующих услови х с последующим .выделением образовавшегос  рродукта. Культивирование кюжет быть осущ аствлено любыкви методами в аэробных услови х на поверхности или в глубине, предпочтительно в глубине, в различных аппаратах, используемых в производстве ферментов Обычно $trefjlomv de$ gotlfnoriu DSl25.881 культивируют на агаре, в колбе при перемаиивании, инЪкулируют в ферментёр и продолжают процесс в ферментере. Среда дл  ферментации должна содер-жать в основном источники усваивае- . S aS sseaSa lWs SiSSua feij sSssijj

течение 1 мес ца

Никакого

HjS не

же

производит . Hiams and Wilkins Company, . ca Botanica Company Waltham, Mass, W соответствует номеру, , fiams and Witkins Ccmpany, . y of Bacteria, Society of 18, V мых углерода и азота, минеральные элементы, в частности хлориды, -к в некоторых случа х регул торы роста. В качестве источников усваивае мого углерода можно использовать углеводы, такие, как сахароза, глюкоза 1Г мальтоза, декстрины, крахмал, многоатомные спирты, такие, как глицерин, некоторые органические кислоты, такие, как молочн.а  и лимонна  кислота. . Некоторые животные или растительные жиры, такие, как хлопковое или соевое масло/ могут успешно заменить углеводы или могут быть к ним :добавл(ены. Источником усваиваемого азота могут служить соли аммони , мочевина, .некоторые азотсодержащие кислоты, а fакже сложные вещества, содержгицие азот в форме протеида, например ка;--; ,:;:;;. - ::--:; r..

15 зёин, лактоальбумин, глютен и их гидролизаты, мука из сои, арахиса, -рыбы, экстракты м са, дрожжей , растворимые дистилл ты, проросшее зерно Среди минеральных добавок некоторые могут играт-ь роль буфера или нейтрализата, например фосфаты щелоч ных или щелочноземельных металлов, карбонаты калци  или магни , Другие привод т к необходимому ионному равновесию дл  развити  Streptorrmces poffinqrfuS DS 25.881 и дл  выработки 30.504 КР , , например хлориды Р; сульфаты щелочных и щелочноземельных металлов. Наконец,некоторые действуют как специальные активаторы метаболически реакций $ireplomi/ces goff(nar(U;3 DS 25.881, это соли цинка, кобальта , железа, меди, марганца. Регул торами роста  вл ютс  природные витамины,например рибофлавин , фолиева  кисГлота, пантотенова  ки слота. При фермертадии рН 5,8-7,8, предпочтительно 6,2-7,4, температура 23ЗЗС , лучше 25-30С, аэраци  0,3-3 л воздуха на 1 л бульона 1 мин.; С максимальным выходом 30.504 ВР получают через 2-8 дней культивировани  в зависимости от состава питательной среды. Дл  выделени  30.504 ВР ферментативное сусло фильтруют при рН 3-6, предпочтительно 5, в присутствии фильтрующей добавки, экстрагируют осадок низшими сЬиртами, такими, как метанол, или хлорированными угле водородами, упаривают экстракт и фильтрат в вакууме, кристаллизуют остаток, иногда в присутствии оса-дитёл  при охлаждении. 30.504 Е1Р может быть очищен обычными методами, такими, как перекристаллизаци  или хроматографи ; Пример. Загружают в ферменте ( емкость 170 л) 1200 г пептона, 600 экстракта дрожжей, 1200 г моногидрата , 2400 г крахмала, частично гидролиэованного, и воду до объема 110 л, добавл ют 50 мЛ10 М едкого натр4 до рн 7,3 и стерилизуют (барботаж пара с температурой 122с течение 40 мин). После охлаждени  к ксЛденсации пара во врем  стерили . зации объем бульона 120 л, рН 6,9. Засевают 200 мл культуры Streptoтпусез altlnar $ DS25.88l при перемешиваний,, перемешивают 21 ч при аэрации стерильным воздухом. В ферментер (емкость 800 л) загр . жают 12,5 кг растворимых дистилЛ т6 кг сахарозы, 2,5 кг NaCf , t,0 ,,0, 0, л раствора ,а ( 20 г/л) и воду до объема 460 л, добавл ют 720 i-w 10 н. едкого натра до рн 7,5 и стерилизуют (барботаж пара с температурой в течение

16

673184 40 мин).После охлаждени  иконденсации па|эа во врем  стерилизации объем бульона 500 л, рН 6,40. Инокулируют 50 л культуры из ферментера емкостью 170 л, перемешивают мешалкой (205 об/мин) в течение 116 ч при 27°С и аэрации стерильным воздухом (20 ). Добавл ют 5 н. едкий натр (всего использовано 0,5 л) до рН до 6,5, В конце процесса рН 7,85 объем 470 л. 1000 л полученного после ферментации сусла перемешивают 30 мин после подкислени  7 л 6 н. 1сол ной кИслоты до рН 5, ввод т 35 кг фильтрующей добавки, фильтруют на фильтр-прессе, осадок промывают на фильтре 200 л воды, подкисленной сол ной кислотой (рН 5) , перенос т в 700 л метанола , добавл ют 470 мл 6 н. едкого натра до рН 7 и перемешивают 30 мин. Смесь фильтруют на фильтр-прессе, промывают осадок на фильтре 100 л метанола, фильтрат и промывные воды объедин ют и упаривают в вакууме (5 -10 мм рт от,) до объема 60 л, подкисл ют 580 мл 6 н. сол ной кислоты до рн 3 и перемешивают 10 мин с 40 л хлористогб метилена. Водную фазу последовательно экстрагируют 30 и 20 л хлористогб метилена, экстракты перемешивают с 9 л воды, подкисленной 20 мл 6 н. сол ной кислоты, до получени  водной фазы с рН 3. Органическую фазу промывают 18 л воды, добавл ют 20 мл 6 н. едкого натра до рН 9,5, смешиваютс экстрактом и упаривают в вакууме (5-10 мм рт. ст) до объема 1л. Полученный концентрат медленно выливают в , 10 л гексана, фильтруют и отдел ют 7,5 г неактивного нерастворимого вещества. Фильтрат упаривают до объема- л, перенос т в 1 л1 этилацетата , перемешивают в присутствии 1 л воды, добавл ют 6 н. сол ную кислоту до рН 3, органич.ескую фазу отдел ют и упаривают до объема-1 л. 30.504 ВР медленно кристаллизуетс  из раствора при 4. Его отфильтровывают , промывают 50 мл гексана при 4°С, сушат при в вакууме ( 5 10 мм и получают 76 г 30.504 PR в виде кислоты. Дл  очистки 76 г полученного продукта раствор ют э 1520 кАп ацетона, пе- , ремешивают 30 мин в присутствии активированного УГЛЯ, фильтруют и промывают фиШт1р100 МП ацетона. Фильтрат и промывные воды объедин ют, добавл ют 850 мл воды при медленном перемешивании и 0°С и оставл ют при . Кристаллы отфильтровывают, промывают 100 мл смеси, ацетона - вода -(1:3 по объему) и сушат при в вакууме (5-10 мм рт ст.)-, получа  68,5 г 3Q.504 ЙР.