SU553283A1 - Способ получени алкогольдегидрогеназы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиологии, а именно к способам иолученм  фермента -алкогольдегидрогеназы , примен емого в молекул рной биологии и медицине дл  лечени  нервных заболеваний, нанрнмер алкоголизма.

Известен сиособ получени  алкогольдегидрогеиазы из биомассы дрожжей, включаюиигй илазмолиз дрожжей толуолом, осаждение фермента сульфатом аммони  и его кристаллизацию.

Активность алкогольдегидрогеназы иосле первой нерекристаллизации 62,40 ед/мг белка 1.

Активность алкогольдегидрогеназы зависит от качества биомассы дрожжей.

Недостатком известного способа  вл етс  низкий выход, т. е. низка  активность алкогольдегидрогеиазы в первоначальном экстракте био.массы дрожжей, так как обработка биомассы иеред выделением дл  повышени  активности алкогольдегидрогеназы не ироводитс .

С целью повышени  выхода фермента по иредлагае.мому способу перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют пу-. тем культивировани  их на питательной среде , содержащей фосфат кали  в течение 1 - 6 ч, а затем в питательную среду ввод т этанол , витамины груииы В, соль цинка и осуществл ют культивирование в течение 3-6 ч.

2

Согласно оиисываемому способу проведе1П1ем культивировани  био.массы дрожжей с активностью 0,11-0,30 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 0,86-

1,80 ед/мг белка.

Выход алкогольдегидрогеназы повышаетс  благодар  дополнительному культивированию исходной биомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей провод т в две стадии. На первой стадии введением фосфата кали  происходит активаци  ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигаетс  путем частичного и обратимого блокировапи  окислительных железоферментов дрожжей , в результате чего дыхание клетки частично тормозитс  и поэто.му активируетс  анаэробна  фаза дыхани . На второй стадии добавлением этанола в качестве нндуктора

активности алкогольдегидрогеназы вместе с биологически активными веществами в фер .мептациониой среде осуществл етс  следующа  реакци :

1°С 30°С этанол - ацетальдегнд

фермент алкогольдегидрогеиаза; аэробные услови ; перемешивание.

Таким образом по предлагаемому способу провод т культивирование исходного дрожжевого сырь . Биомассу дрожжей (500 г прессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют в растворе фосфата кали  (2,7% КН2РО4) и при непрерывном перемешивании и аэрации культивируют 2-6 ч. Температура культивировани  25-35°С, рН среды 4,5-5,5. Затем к ферментационной среде добавл ют этанол, витамины группы В (, Be - биотин ) или их источники и соли цинка. Процесс культивировани  продолжают еще 3-6 ч. Активность алкогольдегидрогеназы в биомассе дролокей 1,8 ед/мг белка. Дрожжи плазмолизируют толуолом, фермент осаждают сульфатом аммони  с последующей его кристаллизацией .

Пример 1. В качестве исходного сырь  используют биомассу спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегидрогеназы 0,3 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивировани  примен ют питательную среду, состо щую из 81,0 г КН2РО4 и 1,5 л воды. Температура культивировани  30°С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3л/мин). Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинают вторую стадию культивировани  биомассы и в реактор добавл ют 150,0 мл этанола, 15,0 г экстракта дрожжей и 4,5 мг ZnCl2-6H2O. После этого процесс культивировани  дрожжей при данном режиме продолжают 6 ч.

Полученную биомассу дрожжей отдел ют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентраци  алкогольдегидрогеиазы в биомассе 1,8 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышаетс  с 0,3 до 1,8 ед/мг белка.

Дрожжи плазмолизируют толуолом, экстракт фракционируют сульфатом аммони  с последующей кристаллизацией фермента. Получают ферментативную активность алкогольдегидрогеназы 65,3 ед/мг белка.

Пример 2. В качестве исходного сырь  используют биомассу хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегндрогеназы 0,11 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л.

В первой стадии культивировани  примен ют питательную среду, состо щую из 81,0 г КН2РО4 и 1,5 л воды. Температура культивировани  30°С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин). Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинаетс  втора  стади , культивировани  био.массы дрожжей и в реактор добавл ют 180,0 мл этанола, 15,0 мг витамина BI, 15,0 мг витамина В2, 15,0 мг витамина Вб, 0,3 мг биотина и 4,5 мг ZnCl2-6H2O.

После этого процесс культивировани  дрожжей продолл ают 6 ч.

Полученную биомассу дролсжей отдел ют от культуральной л идкости на вакуумном фильтре. Концентраци  алкогольдегидрогеназы в биомассе 0,86 ед/мг белка.

В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышаетс  с 0,11 до 0,86 ед/мг белка. Алкогольдегидрогеназу из биомассы дрожжей выдел ют, как в примере 1.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение активности алкогольдегидрогеназы в биомассе до 0,86-1,80 ед/мг белка

Claims (1)

1. Журнал «Biochemical Journal, 1970, 118, 375.