SU1751200A1 - Method for fixing primary hepatocytes for extracorporal loop of artificial liver system - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи . Сущность изобретени : первичные гепатоциты фиксируют непосредственно на поверхности носител  - пенистого отжрытопористого гидрофильного полиуретана.Uses: biotechnologists. The essence of the invention: primary hepatocytes are fixed directly on the surface of the carrier - foamy, open-cell hydrophilic polyurethane.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к носител м дл  культивировани  клеток человека и животных, и может найти применение в медицине дл  создани  устройств искусственной печени.The invention relates to biotechnology, in particular, carriers for the cultivation of human and animal cells, and can be used in medicine for creating artificial liver devices.

Проблема носителей дл  культивировани  субстрат-зависимых клеток  вл етс  одной из актуальных в клеточной биологии и биотехнологии, при этом, нар ду с биоафин- ностью и нетоксичностью, в р де случаев важнейшей характеристикой  вл етс  развитость поверхности субстрата, позвол юща  создавать высокое отношение поверхности культивировани  к его объему. Так, известен носитель, состо щий из физиологически приемлемой сетки волокон, имеющих пористость 40-95% и поры размером 10-100 мкм или открытопористую пенистую структуру.The problem of carriers for the cultivation of substrate-dependent cells is one of the topical issues in cell biology and biotechnology, while, in addition to bioaffinity and non-toxicity, in some cases the most important characteristic is the development of the surface of the substrate, which allows to create a high ratio of surface cultivation to its scope. Thus, a carrier is known, consisting of a physiologically acceptable mesh of fibers having a porosity of 40-95% and a pore size of 10-100 microns or an open-cell foam structure.

Получение и поддержание краткосрочной первичной культуры печени in vitro  вл етс  трудной и не до конца решенной задачей, так как гепатоциты обладают повышенной требовательностью к услови м культивировани  и, особенно, к носителю, к которому они прикрепл ютс . Адгези  первичных гепатоцитов на негоризонтальных поверхност х особенно затруднена вследствие их высокой склонности к седиментации и неустойчивости к механическим воз-, действи м. Существует способ присоединени  гепатоцитов к коммерческому микроносителю на декстрановой основе (Цитодекс), покрытому коллагеном, с использованием в модельном устройстве искусственной печени.Obtaining and maintaining a short-term primary culture of the liver in vitro is a difficult and not fully accomplished task, since the hepatocytes have increased demands on the culture conditions and, especially, on the carrier to which they are attached. Adhesion of primary hepatocytes on non-horizontal surfaces is particularly difficult due to their high tendency to sedimentation and instability to mechanical effects. There is a way to attach hepatocytes to a commercial dextran-based microcarrier (Cytodex) coated with collagen using an artificial liver in a model device.

Однако в такой системе гепатоциты располагаютс  на наружной стороне сферической поверхности и легко подвергаютс  механическому разрушению трущимис  друг О друга частицами микроносителей, а также могут смыватьс  током окружающей жидкости. Сами частицы создают значительное гидродинамическое сопротивление току жидкости и тем самым сильно ограничивают скорость протока жидкой среды через колонку с микроносителем.However, in such a system, the hepatocytes are located on the outer side of the spherical surface and are easily subjected to mechanical destruction by particles of microcarriers rubbing against each other, and can also be washed away by the flow of the surrounding liquid. The particles themselves create a significant hydrodynamic resistance to the flow of a liquid and thereby severely limit the flow rate of a liquid medium through a column with a microcarrier.

Цель изобретени  - уменьшение трав- матизации клеток и поддержание полноценного массообмена гепатоцитов с омывающей средой.The purpose of the invention is to reduce cell trauma and maintain full-fledged mass exchange of hepatocytes with the washing medium.

Цель достигаетс  тем, что согласно способу фиксации первичных гепатоцитов, включающему посадку гепатоцитов на поверхность носител , в качестве носител  используют открытопористый гидрофильныйThe goal is achieved in that according to the method of fixation of primary hepatocytes, including the planting of hepatocytes on the surface of the carrier, an open-cell hydrophilic

ftполиуретан , непосредственно на поверх ность которого фиксируют гепатоциты.polyurethane, directly on the surface of which is fixed hepatocytes.

Сущность заключаетс  в применении в качестве нового субстрата-носител  дл  первичных гепатоцитов биосовместимого, нетоксичного, технически простого, функционально эффективного, доступного и дешевого пол иэфирно-полимочеви иного препарата с открытопористой пенистой структурой. Структура данного матрикса представл ет собой нерегул рную систему пор, разделенных тонкими пленочными перегородками , с отверсти ми между ними 100-500 мкм. Гепатоциты, проника  через отверсти  в перегородках, задерживаютс  внутри пор и прикрепл ютс  к стенкам енут- ри. Таким образом достигаетс  защитный эффект от внешних механических воздействий на клетки и в то же врем  сохран етс  свободный массообмен их с окружающей жидкой средой. Существенным преимуществом  вл етс  и простота технологии получени  такой системы культивировани  гепатоцитов.The essence is to use as a new carrier substrate for primary hepatocytes a biocompatible, non-toxic, technically simple, functionally effective, affordable and cheap polyester polyurea and other drug with an open-cell foam structure. The structure of this matrix is an irregular pore system, separated by thin film partitions, with openings between them of 100-500 microns. Hepatocytes, penetrating through the openings in the septa, are retained within the pores and attached to the walls of the enutri. In this way, a protective effect from external mechanical effects on the cells is achieved, while at the same time their free mass exchange with the surrounding liquid medium is maintained. A significant advantage is the simplicity of the technology for producing such a hepatocyte culture system.

До насто щего времени использование гидрофильного Тюлиэфирно-полимочевин- ного открытопористого пенополиуретана в качестве носител  дл  культивировани  эукариотических клеток, в том числе первичных гепатоцитов, не было известно.Until now, the use of hydrophilic Tuliester polyurea otnoraporosti polyurethane foam as a carrier for the cultivation of eukaryotic cells, including primary hepatocytes, was not known.

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

Гидрофильный открытопористый пенополиуретан механически измельчают в водной среде в измельчителе ткани с получением кусочков неправильной формы поперечным размером З-б мм. Суспензию пенополиуретана тщательно отмывают раствором детергента, водой, спиртом, стерилизуют автоклавированием в водной среде и отмывают питательной средой дл  культуры клеток, затем выдерживают 12 ч в питательной среде, содержащей 10% фетальной тел чьей сыворотки.Hydrophilic otkaroporisty polyurethane foam is mechanically crushed in an aqueous medium in a fabric shredder to produce irregularly shaped pieces with a transverse size of 3-mm. The polyurethane foam suspension is thoroughly washed with a detergent solution, water, alcohol, sterilized by autoclaving in an aqueous medium and washed with cell culture media, then kept for 12 hours in a nutrient medium containing 10% fetal calf serum.

Из суспензии формируют колонку с соотношением высоты к ее диаметру не менееFrom the suspension form a column with a ratio of height to its diameter of not less than

3,0-3,5 и удал ют избыток питательной среды , На колонку нанос т сверху суспензию свежевыделенных первичных гепатоцитов (1,5x10 клеток в 1 мл) крысы и медленно3.0-3.5 and remove excess nutrient medium. A suspension of freshly isolated primary hepatocytes (1.5x10 cells per 1 ml) of rat is applied on top of the column and slowly

профильтровывают ее через колонку {2- 3 мл/мин), собира  элюат снизу, Данную операцию повтор ют дважды. В результате не менее 50-60% клеток задерживаетс  на колонке.filtering it through a column (2-3 ml / min), collecting the eluate from below. This operation is repeated twice. As a result, at least 50-60% of the cells are retained on the column.

Жизнеспособность клеток, оставшихс  в среде после колонки, подтверждалась визуально под микроскопом, подсчетом клеток в суспензии до и после фильтровани  через колонку определ ли количество задержавшихс  клеток. В отработанных услови х в 100 мл скомпанованного матрикса-носител  задерживалось 30- 40x106клеток.The viability of cells remaining in the medium after the column was confirmed visually under a microscope, and the number of retained cells was determined by counting the cells in suspension before and after filtering through the column. Under used conditions, 30-40x106 cells were retained in 100 ml of the assembled carrier matrix.

Колонку промывают питательной средои , содержащей 10% фетальной тел чьей сыворотки и оставл ют в С02-инкубаторе на 18 ч дл  закреплени  клеток на носителе.The column is washed with nutrient medium containing 10% fetal bovine serum and left in a CO2 incubator for 18 hours to fix the cells on the carrier.

Контроль адгезии гепатоцитов на носителе осуществл лс  с помощью сканирующей электронной микроскопии образцов,Control of adhesion of hepatocytes on the carrier was carried out using scanning electron microscopy of samples

Таким образом, применением данного пенополиуретана достигаетс  высокое соотношение площади культивировани  первичных гепатоцитов к его объему,Thus, using this polyurethane foam, a high ratio of the area of cultivation of primary hepatocytes to its volume is achieved,

эффективна  защита заключенных внутри пор клеток от внешних воздействий, а также эффективность массообмена клеток с омывающей жидкой средой.effective protection of cells enclosed inside the pores from external influences, as well as the efficiency of mass transfer between cells and the washing liquid medium.

3535

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Способ фиксации первичных гепатоцитов дл  экстракорпорального контура мскус- ственной печени, включающий посадкуThe method of fixation of primary hepatocytes for the extracorporeal contour of the muscular liver, including гепатоцитов на поверхность носител , о т- личающийс  тем, что, с целью уменьшени  травматизации клеток и поддержани  полноценного массообмена гепатоцитов и среды, в качестве носител hepatocytes onto the surface of the carrier, which is characterized by the fact that, in order to reduce the traumatization of the cells and to maintain a full-fledged mass exchange of hepatocytes and the medium, as a carrier используют пенистый открытопористый гидрофильный полиуретан.use foamy open-cell hydrophilic polyurethane.