JP2007124982A - Cell culture solution and method for cell culture - Google Patents
Cell culture solution and method for cell culture Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007124982A JP2007124982A JP2005322444A JP2005322444A JP2007124982A JP 2007124982 A JP2007124982 A JP 2007124982A JP 2005322444 A JP2005322444 A JP 2005322444A JP 2005322444 A JP2005322444 A JP 2005322444A JP 2007124982 A JP2007124982 A JP 2007124982A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell culture
- cells
- water
- cell
- synthetic polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、さまざまな細胞の培養に使用することができる細胞培養液およびその細胞培養液を使用した細胞培養方法に関するものである。 The present invention relates to a cell culture solution that can be used for culturing various cells and a cell culture method using the cell culture solution.
疾病により機能不全になった臓器や組織の再生あるいは白血病や固形癌などの治療を目的として、生体外で細胞を培養して組織を再建しあるいは細胞に機能を付加し、これを患者の生体内に移植して治療を行う再生医療や細胞医療の研究が近年進められており、ここにおいて、様々な種類の細胞を培養する技術が求められている。 In order to regenerate organs and tissues that have become dysfunctional due to disease, or to treat leukemia or solid cancer, etc., cells are cultured in vitro to reconstruct tissues or add functions to cells. In recent years, research on regenerative medicine and cell therapy for transplanting and treating cells has been promoted, and here, techniques for culturing various types of cells are required.
細胞を培養するためには一般的に、シャーレやフラスコなどの平面状の細胞培養基材あるいは高密度の細胞培養を行うために中空糸やスポンジなどの多孔性の三次元状細胞培養基材を用いた培養が行われている。しかしながら、ある種の細胞においては、疎水性の細胞培養基材表面に対して、細胞増殖因子などの細胞培養に必須なタンパク質の物理吸着や細胞自体の接着が問題となり、細胞の増殖性や機能発現に影響を受けることが問題となることがある。特に、比表面積の大きい多孔性の三次元状細胞培養基材を用いて細胞培養を行う場合、このような問題が顕著に起こる傾向がある。 In order to culture cells, a flat cell culture substrate such as a petri dish or flask or a porous three-dimensional cell culture substrate such as a hollow fiber or sponge is generally used for high-density cell culture. The culture used is performed. However, in certain types of cells, physical adsorption of proteins essential for cell culture, such as cell growth factors, and adhesion of the cells themselves are problematic on the surface of hydrophobic cell culture substrates. Being affected by expression can be a problem. In particular, when cell culture is performed using a porous three-dimensional cell culture substrate having a large specific surface area, such a problem tends to occur remarkably.
従来、このように細胞培養基材表面の疎水性が原因として起こるタンパク質の物理吸着や細胞の接着の問題に対して、一般的には、細胞培養基材表面を親水性化することによる対応が行なわれている。具体的には、細胞培養基材にプラズマ処理やコロナ放電処理を施しあるいは水に対して親和性のある親水性物質を被覆処理することにより、このような疎水性表面における吸着性を原因とする問題を回避する方法が提案されている（特許文献１〜３参照。）。しかしながら、このような被覆処理には、細胞培養基材の種類に応じて個別に処理条件の検討を行う必要があり、特に、上記したような多孔性の三次元状細胞培養基材では、完全に均一な被覆処理を行うことが難しく、また長時間の培養において一度被覆した親水性物質が剥落してしまうという問題があった。
Conventionally, the problem of physical adsorption of proteins and cell adhesion caused by the hydrophobicity of the surface of the cell culture substrate has been generally addressed by making the cell culture substrate surface hydrophilic. It is done. Specifically, the cell culture substrate is subjected to plasma treatment or corona discharge treatment, or is coated with a hydrophilic substance having an affinity for water, thereby causing the adsorptivity on such a hydrophobic surface. A method for avoiding the problem has been proposed (see
また一方では、血清を添加した細胞培養液を用いて細胞を培養すると、血清中のタンパク質が疎水性の細胞培養基材表面に物理吸着されることにより、上記したような細胞培養基材表面の疎水性に起因する問題が回避できると言われているが、その効果は不明である。また、このようなタンパク質を使用すると、細胞培養液の温度やｐＨ、細胞培養基材の表面の性質など様々な条件により、タンパク質の構造変化や変性などの影響を受けやすく効果がばらつくため、好ましくないとされている。 On the other hand, when cells are cultured using a cell culture solution to which serum is added, proteins in the serum are physically adsorbed on the surface of the hydrophobic cell culture substrate. Although it is said that problems due to hydrophobicity can be avoided, the effect is unknown. In addition, the use of such a protein is preferable because it is easily affected by changes in the structure or denaturation of the protein depending on various conditions such as the temperature and pH of the cell culture medium and the surface properties of the cell culture substrate. It is said that there is no.
また、患者に細胞を移植して治療を行う再生医療や細胞医療において、血清を添加した細胞培養液を用いて細胞を培養すると、血清に含まれる様々な因子が細胞を移植する際に患者体内に混入する恐れがあり、これにより感染症などのリスクが向上する。このため、血清のような生体由来の未精製物資を細胞培養液に添加することは好ましくないとされている。
本発明の目的は、上記従来技術の欠点を解消せんとするものであり、免疫系細胞や幹細胞の培養のような従来の培養方法では細胞培養基材表面の疎水性相互作用に起因するタンパク質の吸着現象や細胞の接着が障害となり、効率よく培養できなかった細胞の培養を簡便に改善することができる細胞培養液およびその細胞培養液を使用した細胞培養方法を提供することにある。 The object of the present invention is to eliminate the above-mentioned drawbacks of the prior art, and in conventional culture methods such as culturing immune system cells and stem cells, proteins derived from hydrophobic interactions on the surface of cell culture substrates are used. It is an object of the present invention to provide a cell culture solution and a cell culture method using the cell culture solution that can easily improve the culture of cells that could not be cultured efficiently due to an adsorption phenomenon and cell adhesion.
本発明の他の目的は、特に、細胞培養用の基材を使用し、基材として多孔性で三次元状の細胞培養用基材を使用する場合に、被覆処理などの条件検討が必要性とされず、また、煩雑な処理を行う必要がない細胞培養方法を提供することにある。 Another object of the present invention is that it is necessary to study conditions such as coating treatment, particularly when a cell culture substrate is used and a porous, three-dimensional cell culture substrate is used as the substrate. In addition, an object of the present invention is to provide a cell culture method that does not require complicated processing.
本発明の細胞培養液と細胞培養方法は、上記課題を解決するために、以下に示される構成を有するものである。
（１）水溶性の合成ポリマーを添加してなる細胞培養液。
（２）水溶性の合成ポリマーが、水に対して親和性のある官能基を有する合成ポリマーである前記（１）に記載の細胞培養液。
（３）水に対して親和性のある官能基を有するユニットが、水溶性の合成ポリマー鎖中に５０以上含まれている前記（２）に記載の細胞培養液。
（４）水に対して親和性のある官能基が、水酸基および／またはエーテル基であることを特徴とする前記（２）または（３）に記載の細胞培養液。
（５）水溶性の合成ポリマーが、非イオン性である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養液。
（６）水溶性の合成ポリマーが、ポリアルキレングリコールである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養液。
（７）水溶性の合成ポリマーが、ポリビニルアルコールである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養液。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞培養液を使用する細胞培養方法。
（９）細胞培養用基材として多孔性基材を使用する前記（８）記載の細胞培養方法。
（１０）多孔性基材が中空糸状の多孔性基材である前記（９）記載の細胞培養方法。
（１１）細胞増殖因子、接着因子またはサイトカインに依存的に機能発現する細胞の培養に使用される前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の細胞培養方法。
（１２）細胞塊を形成する細胞の培養に使用される前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の細胞培養方法。
In order to solve the above problems, the cell culture solution and the cell culture method of the present invention have the following configurations.
(1) A cell culture solution to which a water-soluble synthetic polymer is added.
(2) The cell culture solution according to (1), wherein the water-soluble synthetic polymer is a synthetic polymer having a functional group having an affinity for water.
(3) The cell culture solution according to (2), wherein 50 or more units having a functional group having an affinity for water are contained in the water-soluble synthetic polymer chain.
(4) The cell culture solution according to (2) or (3) above, wherein the functional group having an affinity for water is a hydroxyl group and / or an ether group.
(5) The cell culture solution according to any one of (1) to (4), wherein the water-soluble synthetic polymer is nonionic.
(6) The cell culture solution according to any one of (1) to (5), wherein the water-soluble synthetic polymer is polyalkylene glycol.
(7) The cell culture solution according to any one of (1) to (5), wherein the water-soluble synthetic polymer is polyvinyl alcohol.
(8) A cell culture method using the cell culture solution according to any one of (1) to (7).
(9) The cell culture method according to (8), wherein a porous substrate is used as the cell culture substrate.
(10) The cell culture method according to (9), wherein the porous substrate is a hollow fiber-shaped porous substrate.
(11) The cell culture method according to any one of (8) to (10), which is used for culturing cells that function in a manner dependent on cell growth factors, adhesion factors, or cytokines.
(12) The cell culture method according to any one of (8) to (10), which is used for culturing cells forming a cell mass.
本発明によれば、水溶性の合成ポリマーが添加された細胞培養液を使用することにより、煩雑な条件検討や処理を行うことなく、好適には多孔性の三次元状細胞培養基材上で免疫系細胞や幹細胞などの再生医療や細胞医療で使用される細胞を効率良く培養することができる。また、本発明によれば、生体由来の未精製物質を使用することがないため保存安定性が高く、また、培養細胞に感染源となる因子が混入する心配がないため、培養細胞をそのまま治療に使用する細胞として使用することができる。 According to the present invention, by using a cell culture solution to which a water-soluble synthetic polymer is added, preferably on a porous three-dimensional cell culture substrate without performing complicated conditions examination and treatment. Cells used in regenerative medicine and cell medicine such as immune system cells and stem cells can be efficiently cultured. In addition, according to the present invention, the storage stability is high because an unpurified substance derived from a living body is not used, and the cultured cells are treated as they are because there is no fear of contamination of the cultured cells with factors that cause infection. It can be used as a cell to be used for.
本発明の細胞培養液は、水溶性の合成ポリマーを添加してなる細胞培養液である。この細胞培養液を細胞培養基材と接触させて細胞を培養する場合に使用すれば、細胞培養液に添加した水溶性の合成ポリマーが細胞培養基材表面に物理的に吸着されることにより、細胞培養液中に含まれる細胞増殖因子、接着因子およびサイトカインなどのタンパク質が細胞培養基材表面に物理的に吸着されることを抑制することが可能であり、また、培養する細胞自体の細胞培養基材表面への接着も抑制し、細胞が接着したとしても、ピペッティング、洗浄およびすすぎなどの操作で容易に細胞を脱着することが可能となる。
The cell culture solution of the present invention is a cell culture solution obtained by adding a water-soluble synthetic polymer. If this cell culture solution is used to cultivate cells in contact with the cell culture substrate, the water-soluble synthetic polymer added to the cell culture solution is physically adsorbed on the cell culture substrate surface, It is possible to suppress physical adsorption of proteins such as cell growth factors, adhesion factors and cytokines contained in the cell culture medium to the surface of the cell culture substrate, and cell culture of the cells to be cultured Adhesion to the substrate surface is also suppressed, and even if cells adhere, it becomes possible to easily detach and attach cells by operations such as pipetting, washing and rinsing.
この際、細胞培養液中に添加された水溶性の合成ポリマーが、細胞培養液中に常に一定量存在していることにより、細胞培養基材表面に一度吸着した水溶性の合成ポリマーが細胞培養基材から解離したとしても、すぐに細胞培養液中に存在する水溶性の合成ポリマーの吸着が起きるため、吸着と解離が常に繰り返されるような状態となる。このため、水溶性の合成ポリマーが常に細胞培養基材表面を被覆したような平衡状態を保つことができるため、疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害する効果を常に保つことが可能となる。ここでいう吸着とは、水との親和性が低いために起きる疎水性相互作用により物質と物質が物理的に結合している状態を指している。 At this time, since the water-soluble synthetic polymer added to the cell culture medium is always present in a certain amount in the cell culture medium, the water-soluble synthetic polymer once adsorbed to the cell culture substrate surface is Even if it is dissociated from the base material, the water-soluble synthetic polymer present in the cell culture medium is immediately adsorbed, so that the adsorption and dissociation are always repeated. For this reason, since the water-soluble synthetic polymer can always maintain an equilibrium state in which the surface of the cell culture substrate is coated, the effect of inhibiting the adsorption phenomenon caused by the hydrophobic interaction can always be maintained. . The term “adsorption” as used herein refers to a state in which a substance is physically bound by a hydrophobic interaction that occurs due to low affinity with water.
上記のような目的のため、例えば、アルブミン、グロブリンおよびフィブリノーゲンなどの生体由来のポリマーが使用されることがあるが、これら生体由来のポリマーは細胞培養に使用している途中で分解され機能が低下する恐れがある。このためポリマーは、酵素や細胞や微生物によって分解あるいは吸収され難いポリマーであることが必要である。本発明で使用される水溶性のポリマーは、タンパク質や核酸や糖などの生体由来の物質ではなく、有機化学的な手法でモノマーを重合した合成ポリマーである。 For the above purpose, for example, polymers derived from living organisms such as albumin, globulin and fibrinogen may be used. However, these polymers derived from living organisms are degraded during use in cell culture and their functions are reduced. There is a fear. For this reason, the polymer needs to be a polymer that is difficult to be decomposed or absorbed by enzymes, cells, or microorganisms. The water-soluble polymer used in the present invention is not a biological substance such as protein, nucleic acid, or sugar, but a synthetic polymer obtained by polymerizing monomers by an organic chemical technique.
生体由来の物質は、細胞培養液中の酵素、細胞および微生物などにより分解や吸収を受けやすいため、長期の保存安定性が低いが、本発明で用いられる水溶性の合成ポリマーは、細胞培養液中に添加しても分解および吸収されにくく、長期間にわたっての保存安定性が高い。また、合成ポリマーは、高温での高圧蒸気滅菌処理やガンマ線、電子線および紫外線などの放射線処理などさまざまな過酷な処理に対しても比較的高い安定性を有す。また、合成ポリマーは、生体由来の物質のように不純物および感染性の因子を含有している可能性がないため、培養した細胞に対するこのような危険因子の汚染や混入の可能性が低く、細胞培養用として好ましく使用することができる。 A substance derived from a living body is easily decomposed and absorbed by enzymes, cells, microorganisms, and the like in a cell culture solution, so that long-term storage stability is low, but the water-soluble synthetic polymer used in the present invention is a cell culture solution. Even if it is added inside, it is difficult to be decomposed and absorbed, and the storage stability over a long period is high. Synthetic polymers also have relatively high stability against various harsh processes such as high-pressure steam sterilization at high temperatures and radiation processes such as gamma radiation, electron beams and ultraviolet radiation. Synthetic polymers are unlikely to contain impurities and infectious agents unlike substances derived from living organisms, so the risk of contamination and contamination of such risk factors to cultured cells is low. It can be preferably used for culture.
細胞培養液は、細胞を増殖および／または発育させるために供せられる栄養素および／または液体の混合物を指し、栄養素としてアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖などが含まれている。このような細胞培養液としては、例えば、Minimum Essential Medium（MEM、ミニマム基礎培地）、Basal Medium Eagle(BME、イーグル基礎培地)、Media 199（１９９培地）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(D-MEM、ダルベッコ変法イーグル培地)、α−Minimum Essential Medium（α-MEM、アルファミニマム基礎培地）、F-10 Nutrient Mixture（Ham’s F-10、ハムエフ１０培地）、F-10 Nutrient Mixture（Ham’s F-12、ハムエフ１２培地）、RPMI1640（アールピーエミアイ１６４０）、L-15（エル１５）、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM、イスコブス変法ダルベッコ培地)、ES medium（イーエス培地）、MCDB 131 Medium（エムシーディービー１３１培地）、CMRL 1066 Meida（シーエムアールエル１０６６培地）、DM-160 Medium(ディーエム１６０培地)、Fisher Medium（フィッシャー培地）、StemSpan Medium(ステムスパン培地)、StemPro Medium（ステムプロ培地）、Hybridoma Serum Free Medium(ハイブリドーマ無血清培地)と呼ばれる市販の細胞培養液、あるいはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ハンクス緩衝液などの各種緩衝液およびよびこれらの混合物を用いることができるが、培養の目的とする細胞に最適な細胞培養液を使用すれば良く、これらに限定されない。 A cell culture medium refers to a mixture of nutrients and / or liquids that are provided to grow and / or develop cells, and includes amino acids, vitamins, inorganic salts, sugars, and the like as nutrients. Examples of such cell culture solutions include Minimum Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), Media 199 (199 medium), Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, Dulbecco). Modified Eagle Medium), α-Minimum Essential Medium (α-MEM, Alpha Minimum Basic Medium), F-10 Nutrient Mixture (Ham's F-10, Hamf 10 Medium), F-10 Nutrient Mixture (Ham's F-12, Ham F) 12 media), RPMI1640 (RPMI 1640), L-15 (L15), Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), ES medium, MCDB 131 Medium, MCDB 131 Medium ), CMRL 1066 Meida (CMRL 1066 medium), DM-160 Medium (DM 160 medium), Fisher Medium (Fisher medium), StemSpan Medium (Stemspan medium), S Commercial cell culture solution called temPro Medium, Hybridoma Serum Free Medium, or phosphate buffer, acetate buffer, Tris-HCl buffer, carbonate buffer, glycine-HCl buffer Various buffer solutions such as citrate buffer solution, HEPES buffer solution, MOPS buffer solution, Hank's buffer solution and mixtures thereof can be used, but it is sufficient to use the cell culture solution most suitable for the cells to be cultured. However, it is not limited to these.
また、細胞培養液には、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清などの血清および血漿成分が含まれていても含まれていなくても良いが、含まれていない場合に本発明の細胞培養液はより大きな効果が期待できる。また、細胞培養液には、サイトカインや増殖因子および分化因子などの細胞の増殖や分化に係わる機能発現を促進する精製されたタンパク質を添加しても良い。 The cell culture solution may or may not contain serum and plasma components such as bovine serum, fetal bovine serum, horse serum, and human serum. The cell culture solution can be expected to have a greater effect. Moreover, you may add the refine | purified protein which accelerates | stimulates the function expression regarding proliferation and differentiation of cells, such as a cytokine, a growth factor, and a differentiation factor, to a cell culture solution.
上記のような目的から、本発明で用いられる水溶性の合成ポリマーは、すなわち水に対して１ｐｐｍ以上の溶解性がある合成ポリマーであれば良いが、さらに疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害できる性状を有することが好ましい。このような性状を有するため、主鎖および／または側鎖に水に対する親和性のある官能基を有していることが好ましい。このような官能基を有することにより合成ポリマー鎖に対して細胞培養液中で水和現象が起き、疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害することが可能となる。 For the purpose as described above, the water-soluble synthetic polymer used in the present invention may be any synthetic polymer having a solubility of 1 ppm or more in water, but further exhibits an adsorption phenomenon caused by hydrophobic interaction. It preferably has properties that can be inhibited. In order to have such properties, it is preferable that the main chain and / or the side chain have a functional group having an affinity for water. By having such a functional group, a hydration phenomenon occurs in the cell culture medium with respect to the synthetic polymer chain, and it becomes possible to inhibit the adsorption phenomenon due to the hydrophobic interaction.
このような水に対する親和性のある官能基として水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エーテル基、アミド基、エステル基、ピリジン基、ピロリドン基、イミダゾール基、４級アンモニウム基、イミノ基、イミド基、メルカプト基、カルボニル基、シアノ基、メトキシ基などの水和基および極性基を含んでいることが好ましいが、細胞培養液中の他の物質と反応しないために、非反応性の官能基であることが好ましい。 Such functional groups with affinity for water include hydroxyl groups, amino groups, carboxyl groups, sulfonic acid groups, phosphoric acid groups, ether groups, amide groups, ester groups, pyridine groups, pyrrolidone groups, imidazole groups, and quaternary ammonium groups. It preferably contains a hydration group and a polar group such as an imino group, an imide group, a mercapto group, a carbonyl group, a cyano group, and a methoxy group, but does not react with other substances in the cell culture medium. A reactive functional group is preferred.
このような主鎖および／または側鎖に水に対する親和性のある官能基を有する水溶性の合成ポリマーとして、例えば具体的には、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（Ｎ-イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、セルロース、デキストラン、キチン、キトサン、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリオキシアルキレンメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ジアルキルアミノアルキルデキストラン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン及びこれらの誘導体の構造を構造の全部あるいは一部に含むような合成ポリマーや界面活性剤あるいはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンイノシトール、ホスファチジルコリンエタノールアミン、スフィンゴミエリン、およびレシチンあるいは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合物などのリン脂質やコレステロール構造を構造の一部または全部に含む合成ポリマーが挙げられる。 Examples of water-soluble synthetic polymers having a functional group having an affinity for water in the main chain and / or side chain include, for example, polyalkylene glycols such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol and polypropylene glycol, and polyvinyl pyrrolidone. , Poly (N-isopropylacrylamide), poly (2-hydroxyethyl methacrylate), cellulose, dextran, chitin, chitosan, polyhydroxyalkyl methacrylate, polyoxyalkylene methacrylate, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid , Polylysine, polyethyleneimine, polyalkyleneimine, polyallylamine, polyvinylamine, dialkylaminoalkyldextran, polyhistidine, Synthetic polymers, surfactants or phosphatidylcholines, phosphatidylserines, phosphatidylcholineinositols, phosphatidylcholineethanolamines, sphingomyelins, and lecithins or 2-methacryloyl containing polyarginine, polyornithine and their derivatives in all or part of the structure Examples thereof include a synthetic polymer containing a phospholipid such as an oxyethyl phosphorylcholine polymer or a cholesterol structure in part or all of the structure.
特に、水に対する親和性を十分に確保して含水性が高く、ポリマー鎖の分子運動により疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害するために、水に対する親和性のある官能基を有するユニットが、合成ポリマー鎖中に好ましくは５０ユニット以上であり、より好ましくは１００ユニット以上含まれていることが望ましい。水に対する親和性のある官能基を有するユニットが５０ユニット未満では水に対する親和性が十分に得られなく、また、水溶液中でのポリマー鎖の運動が限定されるため、疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害することが難しくなる。ここで言うユニットとは、例えば、ポリマーに対するモノマーに対応するような最小単位の構成構造を指し、すべてが同じ種類のユニットであっても良いし、同じ種類のユニットでなくても良い。このようなユニットとしては、具体的には、例えば、アルキレングリコール、ビニルアルコール、２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。 In particular, a unit having a functional group having an affinity for water is used in order to sufficiently secure the affinity for water and to have a high water content and to inhibit the adsorption phenomenon caused by the hydrophobic interaction due to the molecular motion of the polymer chain. The synthetic polymer chain preferably contains 50 units or more, more preferably 100 units or more. If the unit having a functional group having an affinity for water is less than 50 units, sufficient affinity for water cannot be obtained, and the movement of the polymer chain in an aqueous solution is limited, resulting in hydrophobic interaction. It becomes difficult to inhibit the adsorption phenomenon. The unit here refers to, for example, a structure of a minimum unit corresponding to a monomer for a polymer, and all may be the same type of unit or may not be the same type of unit. Specific examples of such units include alkylene glycol, vinyl alcohol, 2-hydroxyethyl methacrylate, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, and the like.
また、これら水溶性の合成ポリマーは、官能基としてカルボキシル基やスルホン酸基などのアニオン性官能基を有する合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸など）や、イミノ基やアミノ基などのカチオン性の官能基を有する合成ポリマー（例えば、ポリエチレンイミンやポリリジンなど）のようなイオン性の合成ポリマーと、このようなイオン性の官能基を持たない、あるいはカチオン性官能基とアニオン性官能基の電荷バランスがつりあった非イオン性の合成ポリマーに分類することができるが、本発明においては、イオン性の合成ポリマーは、細胞に対する接着性など細胞のさまざまな機能に影響を与えることが懸念されるため、非イオン性の合成ポリマーを用いることが好ましい。 In addition, these water-soluble synthetic polymers include synthetic polymers having anionic functional groups such as carboxyl groups and sulfonic acid groups as functional groups (for example, polyacrylic acid), and cationic functional groups such as imino groups and amino groups. There is a charge balance between an ionic synthetic polymer such as a synthetic polymer having a group (for example, polyethyleneimine, polylysine, etc.) and no ionic functional group, or a cationic functional group and an anionic functional group. Although it can be classified into a balanced nonionic synthetic polymer, in the present invention, since an ionic synthetic polymer is feared to affect various functions of cells such as adhesion to cells, non-ionic synthetic polymers are It is preferable to use an ionic synthetic polymer.
以上のような観点から、本発明で用いられる水溶性の合成ポリマーとしては、極性かつ非イオン性の官能基である水酸基および／またはエーテル基を官能基として含む合成ポリマーであることが好ましく、その中でも特に、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール構造を主鎖や側鎖の一部または全部に含むような合成ポリマー、あるいはポリビニルアルコールやポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）のように側鎖に水酸基を持つポリマー構造を主鎖や側鎖の一部または全部に含むような合成ポリマーが好ましい。中でも、入手の容易さや水に対する溶解性の点からポリアルキレングリコールあるいはポリビニルアルコールを使用することがより好ましい態様であり、ポリアルキレングリコール中のアルキレンの炭素数としては１以上５以下が好ましく、より好ましくは２または３である。 From the above viewpoint, the water-soluble synthetic polymer used in the present invention is preferably a synthetic polymer containing a hydroxyl group and / or an ether group as a functional group, which is a polar and nonionic functional group. In particular, a synthetic polymer containing a polyalkylene glycol structure such as polyethylene glycol or polypropylene glycol in part or all of the main chain or side chain, or a side chain such as polyvinyl alcohol or poly (2-hydroxyethyl methacrylate). A synthetic polymer containing a polymer structure having a hydroxyl group in the main chain or a part or all of the side chain is preferable. Among them, polyalkylene glycol or polyvinyl alcohol is more preferable from the viewpoint of availability and solubility in water, and the number of carbon atoms of alkylene in the polyalkylene glycol is preferably 1 or more and 5 or less, more preferably. Is 2 or 3.
また、上記した水溶性の合成ポリマーの分子量は、合成ポリマーの吸着性と水に対する溶解性の観点から、好ましくは１００〜５００００００であり、より好ましくは１０００〜５０００００であり、さらに好ましくは３０００〜１０００００である。分子量が１００未満であると、細胞培養基材表面に対する合成ポリマーの吸着性が低下する傾向があり、また、分子量が５００００００を超えると、水に対する溶解性が低下する。また、ポリビニルアルコールについては、そのケン化率が細胞培養基材に対する吸着性および細胞培養に対する効果に与える影響が高い。このため、ケン化率は８０％〜９８％であることが好ましく、より好ましくは８５％〜９５％である。ケン化率が９８％を超えると、ポリビニルアルコール自体の細胞培養基材に対する吸着性が悪くなり効果が損なわれることがあり、また、ケン化率が８０％未満では、ポリビニルアルコールが細胞培養基材に吸着したとしても、それによる細胞培養液中のタンパク質の吸着抑制効果や培養細胞に対する接着抑制という期待される効果が得られにくくなる。 In addition, the molecular weight of the above-described water-soluble synthetic polymer is preferably 100 to 5000000, more preferably 1000 to 500000, and still more preferably 3000 to 100000 from the viewpoint of the adsorptivity of the synthetic polymer and the solubility in water. It is. When the molecular weight is less than 100, the adsorptivity of the synthetic polymer to the surface of the cell culture substrate tends to decrease, and when the molecular weight exceeds 5000000, the solubility in water decreases. Moreover, about polyvinyl alcohol, the influence which the saponification rate has on the adsorptivity with respect to a cell culture base material and the effect with respect to cell culture is high. For this reason, the saponification rate is preferably 80% to 98%, more preferably 85% to 95%. If the saponification rate exceeds 98%, the adsorptivity of the polyvinyl alcohol itself to the cell culture substrate may be deteriorated and the effect may be impaired, and if the saponification rate is less than 80%, the polyvinyl alcohol is used as the cell culture substrate. Even if adsorbed on the cells, it is difficult to obtain the expected effect of suppressing the adsorption of proteins in the cell culture solution and suppressing the adhesion to cultured cells.
また、本発明で使用される水溶性の合成ポリマーは、水溶性が確保できればその中に疎水性領域を含んでいても良い。疎水性領域とは水との親和性が低い領域を指し、このような疎水性領域が合成ポリマー中に存在することにより、その領域がアンカーのような役割を担い、合成ポリマーが細胞培養基材に吸着しやすくなる。このような疎水性領域の構造として、アルキル基、フェニル基、ナフタレン基、フッ素基などの無極性および疎水性の官能基を主鎖や側鎖に持つ構造が挙げられる。具体的には、ポリアルキル、フッ素化ポリアルキル、ポリスチレン、ポリフェニレン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリフェニルアラニン、ポリプロリン、ポリトリプトファン、ポリチロシン、ポリバリン、アルキルシリルなどの構造が挙げられるが、これらの構造に限定されない。また、これらの構造は、水溶性の合成ポリマー構造の末端部に存在しても中央部に存在していてもどちらでも良い。 In addition, the water-soluble synthetic polymer used in the present invention may contain a hydrophobic region in the water-soluble synthetic polymer as long as the water-solubility can be secured. Hydrophobic region refers to a region with a low affinity for water, and when such a hydrophobic region is present in a synthetic polymer, the region serves as an anchor, and the synthetic polymer is a cell culture substrate. It becomes easy to adsorb. Examples of the structure of such a hydrophobic region include structures having non-polar and hydrophobic functional groups such as alkyl groups, phenyl groups, naphthalene groups, and fluorine groups in the main chain and side chains. Specific examples include polyalkyl, fluorinated polyalkyl, polystyrene, polyphenylene, polyleucine, polyisoleucine, polyphenylalanine, polyproline, polytryptophan, polytyrosine, polyvaline, alkylsilyl, and the like. It is not limited to. In addition, these structures may be present at the terminal part or the central part of the water-soluble synthetic polymer structure.
また、上記のような水溶性の合成ポリマーの細胞培養液に対する添加濃度は、１〜１０００ｐｐであることが好ましく、より好ましくは５〜５００ｐｐｍであり、さらに好ましくは１０〜２５０ｐｐｍである。添加濃度が１ｐｐｍ未満では、細胞培養基材表面に水溶性の合成ポリマーが十分量吸着することができずに、タンパク質の吸着抑制や細胞接着抑制などの効果が低下してしまう恐れがある。逆に、添加濃度が１０００ｐｐｍを超えると、培養細胞に対する毒性や細胞機能に対する影響が懸念される。また、水溶性の合成ポリマーは、細胞培養液中において、吸着抑制したいタンパク質の濃度以上に添加されていることが好ましい。 Moreover, it is preferable that the addition density | concentration with respect to the cell culture solution of the above water-soluble synthetic polymers is 1-1000pp, More preferably, it is 5-500 ppm, More preferably, it is 10-250 ppm. If the addition concentration is less than 1 ppm, a sufficient amount of the water-soluble synthetic polymer cannot be adsorbed on the surface of the cell culture substrate, and effects such as protein adsorption inhibition and cell adhesion inhibition may be reduced. On the other hand, when the added concentration exceeds 1000 ppm, there is a concern about toxicity to cultured cells and influence on cell functions. Moreover, it is preferable that the water-soluble synthetic polymer is added in the cell culture solution at a concentration higher than the protein to be adsorbed.
水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液を用いることにより、様々な細胞を培養することができる。培養に供される細胞としては、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系肝細胞、中胚葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、胚性幹細胞等の幹細胞や、幹細胞を目的の細胞に分化させた細胞、あるいは免疫系細胞、血球系細胞、神経細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、角化細胞、角膜細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、表皮細胞、肝細胞、膵β細胞、心筋細胞、骨髄細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞などの生体由来の細胞、あるいはＮＩＨ３Ｔ３（エヌアイエイチスリーティースリー）細胞、３Ｔ３−Ｌ１（スリーティースリーエルワン）細胞、３Ｔ３−Ｅ１（スリーティースリーイーワン）細胞、Ｈｅｌａ（ヒーラ）細胞、ＰＣ−１２（ピーシーツェルブ）細胞、Ｐ１９（ピーナインティーン）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵母）細胞、ＣＯＳ（シーオーエス）細胞、ＨＥＫ（エッチイーケー）細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２（ヘップジーツー）細胞、Ｌ９２９（エルナインツーナイン）細胞、Ｃ２Ｃ１２（シーツーシーツェルブ）細胞、Ｄａｕｄｉ（ダウディ）細胞、Ｊｕｒｋａｔ（ジャーカット）細胞、ＫＧ−１ａ（ケージーワンエー）細胞、ＣＴＬＬ−２（シーティーエルエルツー）細胞、ＮＳ−１（エヌエスワン）細胞、ＭＯＬＴ−４（エムオーエルティーフォー）細胞、ＨＵＴ７８（エッチユーティーセブンティエイト）細胞、ＭＴ−４（エムティーフォー）細胞などの株化細胞、あるいは抗体産生細胞である各種ハイブリドーマ細胞株、あるいはこれら細胞を遺伝子工学的に改変した細胞などが挙げられる。 By using the cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added, various cells can be cultured. Examples of cells to be cultured include stem cells such as hematopoietic stem cells, neural stem cells, mesenchymal hepatocytes, mesodermal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, embryonic stem cells, and the like, and differentiate the stem cells into target cells. Cells or immune cells, blood cells, neurons, vascular endothelial cells, fibroblasts, epithelial cells, keratinocytes, corneal cells, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, epidermal cells, hepatocytes, pancreas Cells derived from living organisms such as β cells, cardiomyocytes, bone marrow cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, NIH3T3 cells, 3T3-L1 cells, 3T3-E1 cells Ewan) cells, Hela cells, PC-12 (PC Zerb) cells, P19 (Pineteen) cells, CHO (Chinese Hams) -Oocyte) cells, COS cells, HEK cells, Hep-G2 cells, L929 cells, C2C12 cells, Daudi ( Daudi cells, Jurkat cells, KG-1a cells, CTLL-2 cells, NS-1 cells, MOLT-4 cells , Cell lines such as HUT78 (HQ78) cells, MT-4 (MT4) cells, various hybridoma cell lines that are antibody-producing cells, or cells obtained by genetically modifying these cells. .
特に、水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液による効果のひとつが、サイトカインや増殖因子および接着因子などのタンパク質の細胞培養基材に対する吸着の抑制にあることから、細胞増殖因子やサイトカインに依存的、すなわち細胞増殖因子やサイトカインが細胞表面のレセプターと相互作用して増殖や分化という機能発現を行う細胞に対して好適に用いることができる。すなわち、細胞増殖因子やサイトカインが細胞培養基材に吸着してしまうと、細胞表面のレセプターに供給されないため、細胞の遺伝子発現に伴う機能発現が阻害されてしまう。 In particular, one of the effects of the cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added is the suppression of adsorption of proteins such as cytokines, growth factors and adhesion factors to cell culture substrates. It can be suitably used for cells that are dependent on cytokines, that is, cell growth factors and cytokines interact with cell surface receptors and express functions such as proliferation and differentiation. That is, if a cell growth factor or cytokine is adsorbed to the cell culture substrate, it is not supplied to the receptor on the cell surface, so that the functional expression associated with cell gene expression is inhibited.
ここでいう細胞増殖因子は、各種の細胞が分泌し、それ自身や他の細胞の***や発達、分化を促すタンパク質を指し、サイトカインは、生体内の組織の細胞が産生して細胞間の相互作用に関与する生理活性因子を指し、接着因子は、細胞の接着に係わる因子を指している。このような細胞増殖因子やサイトカインに依存的に増殖し分化するという機能発現を行う細胞としては、免疫系細胞や血球系細胞などが挙げられ、具体的には、例えば、Ｔリンパ細胞、Ｂリンパ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＮＫＴ細胞等、造血幹細胞、好塩基球、好酸球、巨核球、肥満細胞、単球、マクロファージ、神経幹細胞、神経細胞、血管細胞、肝細胞および胚性幹細胞等が挙げられる。 Cell growth factor here refers to a protein that is secreted by various cells and promotes the division, development, and differentiation of itself and other cells. Cytokines are produced by cells of tissues in the body and interact with each other. It refers to a bioactive factor involved in the action, and the adhesion factor refers to a factor related to cell adhesion. Examples of such cells that express the function of growing and differentiating depending on cell growth factors and cytokines include immune cells and blood cells, and specific examples include T lymphocytes and B lymphocytes. Cells, NK cells, dendritic cells, NKT cells, etc., hematopoietic stem cells, basophils, eosinophils, megakaryocytes, mast cells, monocytes, macrophages, neural stem cells, neurons, vascular cells, hepatocytes and embryonic stem cells Etc.
また、水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液による効果のひとつが、培養細胞の細胞培養基材表面に対する接着の抑制にあることから、本発明の細胞培養液は液浮遊系細胞の培養に対して好適に用いることができ、さらに、接着を引き金として分化などの望まれない機能の発現が誘導されてしまうような細胞、あるいは細胞が集合した凝集体を形成し、直径５０〜５００μｍの球状の細胞塊を形成して増殖あるいは機能発現する細胞の培養に対して好ましく用いることができる。ここでいう球状とは、完全な球状でなくても良く、ある程度楕円球状や扁平状になっていたり、表面に凹凸があったりしてもよい。上記のような細胞として、神経幹細胞や間葉系幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞などの幹細胞や血球系細胞、肝細胞、膵β細胞、心筋細胞、グリア細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞および骨細胞等が挙げられ、これらの細胞に対して、本発明で用いられる水溶性の合成ポリマーが添加された細胞培養液を好ましく用いることができる。 In addition, since one of the effects of the cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added is the suppression of adhesion of cultured cells to the cell culture substrate surface, the cell culture solution of the present invention is a liquid suspension cell. In addition, a cell in which expression of an undesired function such as differentiation is induced by adhesion is induced or an aggregate in which the cells are aggregated is formed with a diameter of 50 to 50. It can be preferably used for culturing cells that form a spherical cell mass of 500 μm and proliferate or function. The spherical shape here does not have to be a perfect spherical shape, and may be an oval or flat shape to some extent, or may have irregularities on the surface. As such cells, stem cells such as neural stem cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, embryonic stem cells, blood cells, hepatocytes, pancreatic β cells, cardiomyocytes, glial cells, epithelial cells, fibroblasts, cartilage Examples thereof include cells and bone cells, and a cell culture solution to which the water-soluble synthetic polymer used in the present invention is added can be preferably used.
水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液を使用することにより細胞培養基材への吸着を抑制することができるタンパク質としては、例えば、サイトカインとして、インターロイキン-1α、インターロイキン-1β、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6 、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-13、インターロイキン-14、インターロイキン-15、インターロイキン-16、インターロイキン-17、インターロイキン-18、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、）顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＭＣＰ−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｋ−２／Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）などが挙げられる。 Examples of proteins that can suppress adsorption to a cell culture substrate by using the cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added include, for example, interleukin-1α and interleukin-1β as cytokines. , Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12, Interleukin-13 , Interleukin-14, interleukin-15, interleukin-16, interleukin-17, interleukin-18, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, granulocyte stimulating factor (G-CSF) granulocyte / macrophage colony Stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulation Factor (M-CSF), MCP-1, erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), Flk-2 / Flt-3 ligand (FL) and the like.
また、細胞増殖因子および細胞分化因子としては、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、オステオネクチン、アンジオポイエチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、腫瘍壊死因子-β、ノッチリガンド（デルタ１（Ｄｅｌｔａ−１）、デルタ３（Ｄｅｌｔａ−３）、デルタ４（Ｄｅｌｔａ−４）、ジャッジド１（Ｊａｇｇｅｄ−１）、ジャッジド２（Ｊａｇｇｅｄ−２））等が挙げられる。また、細胞接着因子としては、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、カテニンやカドヘリン等のカドヘリンファミリー、Ｉ−ＣＡＭなどのＩｇスーパーファミリー、セレクチンファミリー、シアロムチンファミリーなどが挙げられるが、これらに限定されない。上記のタンパク質は、細胞培養液中に添加したものでも、細胞から分泌されたものでも、いずれのタンパク質に対しても有効である。 Examples of the cell growth factor and cell differentiation factor include vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), and platelet-derived growth factor (PDGF). ), Transforming growth factor-β (TGF-β), osteonectin, angiopoietin, hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF) ), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), nerve growth factor (NGF), leukemia inhibitory factor (LIF), stem cell growth factor ( SCF), bone morphogenetic protein (BMP) interferon-α, interferon-β, interferon-γ, tumor destruction Death factor-α, tumor necrosis factor-β, Notch ligand (Delta 1 (Delta-1), Delta 3 (Delta-3), Delta 4 (Delta-4), Judged 1 (Jagged-1), Judged 2 (Jagged) -2)) and the like. Examples of the cell adhesion factor include collagen, proteoglycan, fibronectin, laminin, cadherin family such as catenin and cadherin, Ig superfamily such as I-CAM, selectin family, sialomucin family, and the like. Not. The above protein is effective against any protein added to the cell culture medium or secreted from the cell.
水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液は、細胞培養基材と接触させて細胞を培養する細胞培養方法に好適に用いることができる。このような細胞培養基材としては、例えば、フラスコ、シャーレ、ウェル、プレート、多穴ウェル、多穴プレート、スライド、フィルム、シート、ディスク、バック、カラム、タンクおよびボトルなどの細胞培養基材面として平面状のものや、中空糸、不織布、スポンジ、紙、編み地、繊維状および粒子状などの細胞培養基材面として、三次元状のものを使用することができる。 The cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added can be suitably used for a cell culture method in which cells are cultured by contacting with a cell culture substrate. As such cell culture substrate, for example, the surface of cell culture substrate such as flask, petri dish, well, plate, multi-well, multi-well plate, slide, film, sheet, disk, back, column, tank and bottle As a cell culture substrate surface such as a flat one or hollow fiber, non-woven fabric, sponge, paper, knitted fabric, fiber or particle, a three-dimensional one can be used.
細胞培養基材の材質としては、例えば、ポリスチレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタラート、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、エポキシ樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリ塩化ビニル、合成ゴム、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルイミド、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、ポリアセタール、再生セルロース、酢酸セルロース、ＡＢＳ、ポリメチルペンテン、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリフェニレンエーテル、ポリ（４−メチルテンペン）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）などのプラスチック、セルロース、キチンおよびキトサンなどの有機系物質や、ガラス、セラミクス、ハイドキシルアパタイト、チタン、シリカ、シリコーンおよびカーボンなどの無機系物質や金属を使用することができる。 Examples of the material for the cell culture substrate include polystyrene, nylon, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, polybutylene terephthalate, polymethyl methacrylate, polyurethane, epoxy resin, polypropylene, polyethylene, polyisoprene, polybutadiene, polyvinyl chloride, Synthetic rubber, fluororesin, polytetrafluoroethylene, polysulfone, polyetherimide, polycarbonate, polyacrylonitrile, polyacetal, regenerated cellulose, cellulose acetate, ABS, polymethylpentene, poly (2-hydroxyethyl methacrylate), polyphenylene ether, poly ( 4-methyltenpen), polylactic acid, polyglycolic acid, plastics such as poly (β-hydroxyalkanoate), cellulose, It may be used and organic substances such as Chin and chitosan, glass, ceramics, Hyde hexyl apatite, titanium, silica, an inorganic material or a metal such as silicone and carbon.
細胞培養基材としては、多孔性の三次元状の細胞培養基材が好ましく用いられる。ここでいう孔とは径が１ｎｍ以上の孔を指し、多孔性とは基材の表面あるいは基材を貫通する孔が多数存在することを意味し、多孔性の細胞培養基材を用いることにより、孔径が１ｎｍ〜１０ｎｍ程度であればタンパク質の透析効果が期待でき、１０ｎｍ〜０．２μm程度であればウィルスや特定分子量のタンパク質を除去する限外濾過としての効果が期待でき、０．１μm〜１μmで程度であれば菌体の除去フィルターとしての効果が期待できる。また、孔径が５μm以上であれば孔内に細胞が入り込むことが可能となるため、細胞を高密度で培養することが可能となる。以上のような効果が発現するような多孔性の細胞培養基材として、孔の数は用途に応じて様々な数に調整して良いが、孔が存在することにより細胞培養基材の比表面積が１．２倍以上になれば効果が発現される。 As the cell culture substrate, a porous three-dimensional cell culture substrate is preferably used. The term “pore” as used herein refers to a pore having a diameter of 1 nm or more, and the term “porous” means that there are a large number of pores penetrating the surface of the substrate or the substrate, and by using a porous cell culture substrate. If the pore size is about 1 nm to 10 nm, the dialysis effect of the protein can be expected. If the pore size is about 10 nm to 0.2 μm, the effect of ultrafiltration for removing viruses and proteins of a specific molecular weight can be expected. If it is about 1 μm, an effect as a filter for removing cells can be expected. In addition, if the pore diameter is 5 μm or more, the cells can enter the pores, so that the cells can be cultured at a high density. As a porous cell culture substrate that exhibits the above effects, the number of pores may be adjusted to various numbers depending on the application. If the ratio is 1.2 times or more, the effect is exhibited.
また、中空糸、すなわち芯が中空になっている糸状の多孔性細胞培養基材を使用すれば、広い膜面積を有する中空糸の膜面の孔を介して圧力損失無く栄養物質や老廃物の物質交換を行うことにより、細胞を効率よく培養することができる。 In addition, if a hollow fiber, that is, a filamentous cell culture substrate with a hollow core is used, nutrient substances and waste products can be removed without pressure loss through the pores of the membrane surface of the hollow fiber having a large membrane area. By performing mass exchange, cells can be cultured efficiently.
このような中空糸を細胞培養基材として用いた細胞培養は、例えば、下記のような方法で行うことができる。すなわち、ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８部とポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９部を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２部および水１部からなる溶液に加え、９０℃の温度で１４時間加熱溶解する。この製膜原液を、外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金から吐出し、芯液としてジメチルアセトアミド５８部および水４２部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過させた後、水１００％の凝固浴に導き、中空糸を得ることができる（膜面の孔径６−８ｎｍ）。このようにして得られた中空糸を、直径２．５ｃｍ、長さ１４ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に２０本充填した後、中空糸の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定して、細胞培養用モジュールを作製する。モジュールケース内の中空糸外腔側に細胞を播種し、さらに中空糸内腔面につながる両末端を回路につなぎ込み、水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液を温度３７℃に調整しながら、中空糸内腔側に循環しながら培養を行う。これにより、細胞の接着を抑制し、さらに細胞の存在する外腔側と細胞培養液が循環する内腔側とで効率よく栄養物質と老廃物を細胞培養機材に吸着させることなく物質交換することができるため、効率良く細胞を培養することができる。 Cell culture using such a hollow fiber as a cell culture substrate can be performed, for example, by the following method. That is, 18 parts of polysulfone (“Udel” (registered trademark) P-3500, manufactured by Teijin Amoco) and 9 parts of polyvinylpyrrolidone (“K30” (registered trademark), manufactured by BASF), 72 parts of N, N-dimethylacetamide and water Add to 1 part solution and heat dissolve at 90 ° C. for 14 hours. This film-forming stock solution was discharged from an orifice type double cylindrical die having an outer diameter of 0.3 mm and an inner diameter of 0.2 mm, and a solution consisting of 58 parts of dimethylacetamide and 42 parts of water was discharged as a core liquid, and a dry length of 350 mm was obtained. After passing, the hollow fiber can be obtained by leading to a 100% water coagulation bath (pore diameter of membrane surface: 6 to 8 nm). After filling 20 hollow fibers thus obtained into a cylindrical polycarbonate module case having a diameter of 2.5 cm and a length of 14 cm, a polyurethane potting agent is used so as not to block the hollow portion of the hollow fibers. Both ends are fixed to a module case to produce a cell culture module. Cells are seeded on the hollow fiber outer lumen side in the module case, both ends connected to the hollow fiber inner cavity surface are connected to a circuit, and the cell culture solution of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer is added is brought to a temperature of 37 ° C. While adjusting, culture is performed while circulating to the hollow fiber lumen side. As a result, cell adhesion is suppressed, and further, substance exchange between the outer cavity side where the cells are present and the inner cavity side where the cell culture medium circulates is performed without causing the nutrient substances and wastes to be adsorbed to the cell culture equipment. Therefore, cells can be cultured efficiently.
このような多孔性の細胞培養基材を用いる場合、細胞培養基材自体の比表面積が大きいために、細胞培養基材表面へのタンパク質の吸着や培養細胞自体の細胞培養基材への接着が培養を行う上で特に問題となることが多いが、このような多孔性の三次元状細胞培養基材に対しては、従来の親水性物質の被覆処理では被覆条件の設定が難しく、また完全に被覆することは難しい。また、被覆できたとしても長期間の培養に対する耐久性が問題となることがある。しかしながら、水溶性の合成ポリマーを添加した本発明の細胞培養液を用いることにより、細胞培養中に細胞培養液が細胞培養基材の孔を通過し、添加した水溶性の合成ポリマーが細胞培養基材表面に絶えず供給されるため、細胞培養基材表面を細胞培養に最適な状態に保つことが可能である。また、方法としても非常に単純であり、特に比表面積の大きくなる中空糸を用いた細胞培養を行う際には、コーティング手段を検討する必要もなく、非常に有効である。 When such a porous cell culture substrate is used, since the specific surface area of the cell culture substrate itself is large, protein adsorption to the cell culture substrate surface and adhesion of the cultured cell itself to the cell culture substrate are not possible. In many cases, this is a particular problem in culturing. However, it is difficult to set the coating conditions for such porous three-dimensional cell culture substrates with conventional coating of hydrophilic substances, and complete It is difficult to coat. Moreover, even if it can be coated, durability against long-term culture may be a problem. However, by using the cell culture medium of the present invention to which a water-soluble synthetic polymer has been added, the cell culture medium passes through the pores of the cell culture substrate during cell culture, and the added water-soluble synthetic polymer becomes the cell culture medium. Since it is constantly supplied to the surface of the material, it is possible to keep the surface of the cell culture substrate in an optimal state for cell culture. In addition, the method is very simple, and particularly when cell culture using a hollow fiber having a large specific surface area is carried out, it is not necessary to study the coating means and is very effective.
本発明の細胞培養液および細胞培養方法を用いて、疾病や疾患に対して有効な細胞を培養することにより、再生医療や細胞医療に使用する細胞製剤を製造することも可能である。細胞製剤とは、組織や細胞を加工した医薬品や医療用具を指し、また、細胞製剤の製造とは、細胞の分離、細胞の増殖、細胞への刺激、細胞への分化誘導および細胞のアポトーシス誘導など細胞を細胞製剤として疾病や疾患に対して有効な形態に加工するためのあらゆる工程を含んでいる。 It is also possible to produce cell preparations for use in regenerative medicine and cell medicine by culturing cells effective against diseases and diseases using the cell culture medium and cell culture method of the present invention. Cell preparations refer to drugs and medical devices processed from tissues and cells. Cell preparations refer to cell separation, cell growth, cell stimulation, cell differentiation induction, and cell apoptosis induction. All processes for processing cells as a cell preparation into a form effective for diseases and diseases are included.
細胞製剤を製造するには、まず、細胞群の供給源となる組織や体液などを採取する必要がある。これら細胞群の供給源は、ヒト由来の供給源が好ましいが、本発明ではこれに限定されない。また、幹細胞や免疫細胞を含む細胞群が供給源として好ましく、このような細胞群の供給源として、例えば、臍帯血、骨髄液、羊膜組織、胎盤組織、生殖巣、胎児組織、末梢血およびＧ−ＣＳＦ動員末梢血などが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。供給源として特に体液などを使用するときは、予め細胞培養前に遠心法、単位重力沈降法および遠心選別法などで細胞培養に余分な成分を排除した均一な細胞群を得ることが一般的である。また、さらに細胞培養前にフローサイトメトリー、磁気ビーズ法およびアフィニティーカラム法など細胞分離の方法を用いて、純度の高い幹細胞やある種の免疫細胞のサブセットにしておくことが好ましい。 In order to produce a cell preparation, it is first necessary to collect a tissue, a body fluid, or the like that is a supply source of a cell group. The source of these cell groups is preferably a human-derived source, but is not limited to this in the present invention. In addition, a cell group including stem cells and immune cells is preferable as a source. Examples of a source of such a cell group include umbilical cord blood, bone marrow fluid, amniotic tissue, placenta tissue, gonad, fetal tissue, peripheral blood, and G. -CSF mobilization peripheral blood etc. are mentioned, but this invention is not limited to these. When using body fluids as a supply source, it is common to obtain a uniform cell group that excludes extra components in cell culture by centrifugation, unit gravity sedimentation, and centrifugal sorting before cell culture. is there. Furthermore, it is preferable to make a subset of high-purity stem cells and certain immune cells using cell separation methods such as flow cytometry, magnetic bead method and affinity column method before cell culture.
このような様々な加工を行った後、本発明の細胞培養液および細胞培養方法を用いて細胞培養を行うことにより、細胞製剤として必要な細胞を効率良く得ることができる。また、本発明の細胞培養液および細胞培養方法で細胞を培養した後に、再度細胞分離を行うことも可能である。そのようなプロセスを採用することにより、幹細胞や免疫細胞を増殖した細胞群から必要な細胞分離し、純度を高めることができるため、細胞製剤の製造方法に好適である。この製造方法により、目的とする有用な幹細胞や免疫細胞を効率よく得ることができ、効果の優れた細胞製剤を製造することができる。さらに、また、細胞分離の後に本発明の細胞培養液および細胞培養方法で再度細胞培養を行い、再び細胞分離を行うということも可能である。 After performing such various processes, cells necessary as a cell preparation can be efficiently obtained by performing cell culture using the cell culture solution and cell culture method of the present invention. It is also possible to perform cell separation again after culturing the cells with the cell culture solution and cell culture method of the present invention. By adopting such a process, necessary cells can be separated from the group of cells in which stem cells and immune cells are proliferated, and the purity can be increased. Therefore, this method is suitable for a method for producing a cell preparation. By this production method, intended useful stem cells and immune cells can be efficiently obtained, and a cell preparation with excellent effects can be produced. Furthermore, after cell separation, cell culture can be performed again using the cell culture solution and cell culture method of the present invention, and then cell separation can be performed again.
以下、本発明の細胞培養液および細胞培養方法について実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Examples of the cell culture solution and cell culture method of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）サイトカイン依存性細胞の培養１
１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、水溶性の合成ポリマーとしてＰＶＡ−１（ポリビニルアルコール、ナカライテスク社製、重合度５００、ケン化度８６．５〜８９％）あるいはＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール、片山化学工業社製、平均分子量２００００）を、それぞれ１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの割合で添加した。これらの細胞培養液に、ＩＬ−２に依存的に増殖するセルラインであるＣＴＬＬ−２を２×１０４個／ｍＬの濃度で懸濁し、２４ウェルプレートを用意して、１ｍＬ／ウェルで３ウェルずつ播種した後、すべてのウェルにＩＬ−２を２００Ｕ／ｍＬで添加して３日間培養し、各ウェルの総細胞数を血球計算盤により計測した。
(Example 1) Cytokine-
In RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum, PVA-1 (polyvinyl alcohol, manufactured by Nacalai Tesque, polymerization degree 500, saponification degree 86.5 to 89%) or PEG 20000 (polyethylene glycol, Katayama Chemical Co., Ltd., average molecular weight 20000) was added at a rate of 10 ppm, 100 ppm and 1000 ppm, respectively. In these cell cultures, CTLL-2, which is a cell line that grows dependent on IL-2, is suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL, a 24-well plate is prepared, and 3 mL at 1 mL / well. After seeding wells, IL-2 was added to all wells at 200 U / mL and cultured for 3 days, and the total number of cells in each well was counted with a hemocytometer.
結果は図１に示すとおりであり、水に対して親和性のある官能基を有するユニットが５０以上含まれる水溶性の合成ポリマーであるＰＶＡ−１（ユニット数：約５００）あるいはＰＥＧ２００００（ユニット数：約４５０）を細胞培養液に添加することにより、疎水性相互作用に起因する吸着現象を阻害することができ、細胞の増殖が良くなることが示された。 The results are as shown in FIG. 1, and are PVA-1 (unit number: about 500) or PEG 20000 (number of units) which is a water-soluble synthetic polymer containing 50 or more units having functional groups having affinity for water. : About 450) was added to the cell culture medium, it was shown that the adsorption phenomenon caused by the hydrophobic interaction can be inhibited and the cell growth is improved.
（比較例１）サイトカイン依存性細胞の培養２
１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、非水溶性の合成ポリマーとして酢酸セルロース（アルドリッチ社製、平均分子量６５０００）を、それぞれ１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの割合となる量を培地に添加して懸濁した。これら細胞培養液に、ＩＬ−２に依存的に増殖するセルラインであるＣＴＬＬ−２を２×１０４個／ｍＬの濃度で懸濁し、実施例１と同様の条件で３日間培養し、各ウェルの総細胞数を血球計算盤により計測した。その結果、非水溶性の合成ポリマーでは、細胞の増殖性に影響を与えることはなかった。
Comparative Example 1 Cytokine-dependent cell culture 2
To a RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum, cellulose acetate (Aldrich, average molecular weight 65000) as a water-insoluble synthetic polymer was added to the medium in amounts of 10 ppm, 100 ppm and 1000 ppm, respectively. It became cloudy. In these cell culture solutions, CTLL-2, which is a cell line that grows dependent on IL-2, is suspended at a concentration of 2 × 10 4 cells / mL, and cultured under the same conditions as in Example 1 for 3 days. The total number of cells in the well was counted with a hemocytometer. As a result, the water-insoluble synthetic polymer did not affect cell growth.
（実施例２）神経幹細胞の培養−１
妊娠１３日目のラット胎児脳の線状体から採取した神経幹細胞を、１×１０５個／ｍＬの細胞濃度でＤＦ培地に懸濁し、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍＬとＥＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加し、さらに、実施例１と同じＰＶＡ−１を、それぞれ０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、２５ｐｐｍおよび１００ｐｐｍの割合で添加して、それぞれ直径１０ｃｍの浮遊細胞用シャーレに１０ｍＬ添加して３日間培養した。培養後の位相差顕微鏡による観察により、神経幹細胞の細胞塊の大きさ（平均直径）および接着細胞率を計測したところ、０ｐｐｍでは細胞塊平均直径５０μｍで接着細胞率が４０％であり、５ｐｐｍでは細胞塊平均直径１２０μｍで接着細胞率が１０％であり、２５ｐｐｍでは細胞塊平均直径１５０μｍで接着細胞率が５％であり、１００ｐｐｍでは細胞塊平均直径２００μｍで接着細胞率が０％であり、水溶性の合成ポリマーであるＰＶＡの添加により接着細胞が減少し、細胞塊の形成性が向上されることが示された。
(Example 2) Neural stem cell culture-1
Neural stem cells collected from the striatum of rat fetal brain on day 13 of gestation are suspended in DF medium at a cell concentration of 1 × 10 5 cells / mL, and bFGF is 20 ng / mL and EGF is 20 ng / mL. Further, the same PVA-1 as in Example 1 was added at a ratio of 0 ppm, 5 ppm, 25 ppm, and 100 ppm, respectively, and 10 mL was added to each floating cell petri dish having a diameter of 10 cm, and cultured for 3 days. The size (average diameter) and the adherent cell rate of neural stem cells were measured by observation with a phase-contrast microscope after culturing. The cell mass average diameter was 50 μm at 0 ppm, and the adherent cell rate was 40%. The cell mass average diameter is 120 μm and the adherent cell rate is 10%. At 25 ppm, the cell mass average diameter is 150 μm and the adherent cell rate is 5%. At 100 ppm, the cell mass average diameter is 200 μm and the adherent cell rate is 0%. It has been shown that the addition of PVA, which is a synthetic polymer, reduces adherent cells and improves cell mass formation.
（比較例２）神経幹細胞の培養−２
実施例２と同様に、採取した神経幹細胞を１×１０５個／ｍＬの細胞濃度でＤＦ培地に懸濁し、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍＬ、ＥＧＦを２０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、ここに、生体由来ポリマーであるウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社製）を、それぞれ０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、２５ｐｐｍおよび１００ｐｐｍの割合で添加し、実施例２と同様にそれぞれ直径１０ｃｍの浮遊細胞用シャーレに１０ｍＬ添加して７日間培養した。培養後の位相差顕微鏡により観察すると、全てのシャーレにおいて細胞塊がシャーレ底面に接着し、分化が誘導されていた。
Comparative Example 2 Neural Stem Cell Culture-2
As in Example 2, the collected neural stem cells were suspended in DF medium at a cell concentration of 1 × 10 5 cells / mL, bFGF was added at a concentration of 20 ng / mL, and EGF was added at a concentration of 20 ng / mL. Bovine serum albumin (manufactured by Sigma Aldrich), which is a derived polymer, was added at a ratio of 0 ppm, 5 ppm, 25 ppm and 100 ppm, respectively, and 10 mL was added to a petri dish for floating cells each having a diameter of 10 cm as in Example 2 for 7 days Cultured. When observed with a phase-contrast microscope after culturing, the cell mass adhered to the petri dish bottom surface in all the dishes, and differentiation was induced.
（実施例３）神経幹細胞の中空糸培養
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８部およびポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９部を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２部と水１部からなる溶液に加え、９０℃の温度で１４時間加熱溶解した。この製膜原液を、外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金から吐出し、芯液としてジメチルアセトアミド５８部と水４２部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導き、多孔性の中空糸を得た（膜面の孔径６−８ｎｍ）。この中空糸を直径２．５ｃｍ、長さ１４ｃｍの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に２０本充填した後、中空糸の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定して細胞培養用モジュールを作製した。得られた細胞培養用モジュール内中空糸外腔側に、神経幹細胞を１×１０５個／ｍＬの濃度でＤＦ培地に懸濁して３ｍＬ添加した。さらに、中空糸内腔面につながる両末端にシリコーンチューブの循環回路をつなぎ、回路にポンプおよび細胞培養液用のリザーバーを組み込んで、恒温器により細胞培養液を温度３７℃に調整しながら、中空糸内腔側に循環して培養を行えるような装置を２つ用意した。細胞培養液として、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ｍＬとＥＧＦを２０ｎｇ／ｍＬ添加したＤＦ培地２０ｍＬを２つ用意した。一方の細胞培養液に、何も添加せず、もう一方の細胞培養液には実施例１と同じ水溶性の合成ポリマーであるＰＶＡ−１を２０ｐｐｍ添加し、それぞれの装置の細胞培養液用のリザーバーに注入して細胞培養液を循環して１週間培養を行い、１週間後の細胞密度および生細胞率をトリパンブルー染色および血球計算盤により計測した。その結果、ＰＶＡ−１無添加の細胞培養液では細胞密度が１．８×１０６個／ｍＬとなったが、生細胞率が６２％であった。一方、ＰＶＡ−１を２０ｐｐｍ添加した細胞培養液では、細胞密度は２．７×１０６個／ｍＬであり、さらに生細胞率が９８％と改善されていることが示された。
(Example 3) Hollow fiber culture of neural stem cells 18 parts of polysulfone ("Udel" (registered trademark) P-3500 manufactured by Teijin Amoco) and 9 parts of polyvinylpyrrolidone ("K30" (registered trademark) manufactured by BASF) , N-dimethylacetamide was added to a solution consisting of 72 parts and 1 part of water, and dissolved by heating at 90 ° C. for 14 hours. This film-forming stock solution is discharged from an orifice type double cylindrical die having an outer diameter of 0.3 mm and an inner diameter of 0.2 mm, and a solution consisting of 58 parts of dimethylacetamide and 42 parts of water is discharged as a core liquid. After passing, it was led to a 100% water coagulation bath to obtain a porous hollow fiber (membrane surface pore diameter 6-8 nm). After filling 20 hollow fiber modules into a cylindrical polycarbonate module case with a diameter of 2.5 cm and a length of 14 cm, both ends are fixed to the module case with a polyurethane potting agent so as not to block the hollow part of the hollow fiber. Thus, a cell culture module was produced. 3 mL of neural stem cells were suspended in DF medium at a concentration of 1 × 10 5 cells / mL on the hollow fiber outer space side in the obtained cell culture module. In addition, a silicone tube circulation circuit is connected to both ends connected to the hollow fiber lumen surface, a pump and a cell culture medium reservoir are incorporated in the circuit, and the cell culture medium is adjusted to a temperature of 37 ° C. with a thermostatic chamber. Two devices were prepared that could circulate and culture to the thread lumen side. Two 20 mL DF media supplemented with 20 ng / mL bFGF and 20 ng / mL EGF were prepared as cell culture media. Nothing is added to one cell culture solution, and 20 ppm of the same water-soluble synthetic polymer PVA-1 as in Example 1 is added to the other cell culture solution. The cell culture medium was circulated through the reservoir and cultured for 1 week, and the cell density and viable cell rate after 1 week were measured by trypan blue staining and a hemocytometer. As a result, in the cell culture solution without PVA-1, the cell density was 1.8 × 10 6 cells / mL, but the viable cell rate was 62%. On the other hand, in the cell culture solution to which 20 ppm of PVA-1 was added, the cell density was 2.7 × 10 6 cells / mL, and the viable cell rate was further improved to 98%.
本発明の細胞培養液は、煩雑な条件検討や処理を行うことなく、好適には多孔性の三次元状培養基材上で免疫系細胞や幹細胞などの再生医療や細胞医療で使用される細胞を効率良く培養することができ、また、生体由来の未精製物質を使用することがないため保存安定性が高く、また、培養細胞に感染源となる因子が混入する心配がないため、培養細胞をそのまま治療に使用する細胞として使用することができ有用である。 The cell culture solution of the present invention is a cell used in regenerative medicine and cell medicine such as immune system cells and stem cells, preferably on a porous three-dimensional culture substrate, without performing complicated conditions examination and treatment. Can be cultured efficiently, and because it does not use unpurified substances derived from living organisms, it has high storage stability, and there is no risk of contamination with factors that cause infection in cultured cells. Can be used as cells for treatment as they are.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005322444A JP2007124982A (en) | 2005-11-07 | 2005-11-07 | Cell culture solution and method for cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005322444A JP2007124982A (en) | 2005-11-07 | 2005-11-07 | Cell culture solution and method for cell culture |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007124982A true JP2007124982A (en) | 2007-05-24 |
Family
ID=38148185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005322444A Pending JP2007124982A (en) | 2005-11-07 | 2005-11-07 | Cell culture solution and method for cell culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2007124982A (en) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012081470A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 株式会社資生堂 | Method for forming cell aggregate |
| JP2015047085A (en) * | 2013-08-30 | 2015-03-16 | 日油株式会社 | Method for producing cell aggregate, and screening method of medicine |
| JP2016521571A (en) * | 2013-06-11 | 2016-07-25 | プルーリオミクス・ベー・フェー | Medium composition for maturing cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells |
| WO2019093442A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | 日産化学株式会社 | Cell culture vessel |
| WO2019208120A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | 三菱製紙株式会社 | Cryopreservation solution and cryopreservation method |
| WO2020075534A1 (en) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | 一丸ファルコス株式会社 | Medium for growth of neuronal stem cells |
| WO2020116623A1 (en) | 2018-12-07 | 2020-06-11 | 関東化学株式会社 | Undifferentiated state-maintaining culture medium for pluripotent stem cells |
| US11470841B2 (en) | 2016-06-15 | 2022-10-18 | Nissan Chemical Corporation | Cryopreservation vessel |
-
2005
- 2005-11-07 JP JP2005322444A patent/JP2007124982A/en active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012187097A (en) * | 2010-12-13 | 2012-10-04 | Shiseido Co Ltd | Method for forming cell aggregate |
| WO2012081470A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 株式会社資生堂 | Method for forming cell aggregate |
| US10696947B2 (en) | 2013-06-11 | 2020-06-30 | Ncardia B.V. | Culture medium composition for maturating cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells |
| JP2016521571A (en) * | 2013-06-11 | 2016-07-25 | プルーリオミクス・ベー・フェー | Medium composition for maturing cardiomyocytes derived from pluripotent mammalian stem cells |
| JP2015047085A (en) * | 2013-08-30 | 2015-03-16 | 日油株式会社 | Method for producing cell aggregate, and screening method of medicine |
| US11470841B2 (en) | 2016-06-15 | 2022-10-18 | Nissan Chemical Corporation | Cryopreservation vessel |
| JPWO2019093442A1 (en) * | 2017-11-10 | 2020-09-24 | 日産化学株式会社 | Cell culture vessel |
| WO2019093442A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | 日産化学株式会社 | Cell culture vessel |
| WO2019208120A1 (en) | 2018-04-26 | 2019-10-31 | 三菱製紙株式会社 | Cryopreservation solution and cryopreservation method |
| KR20200131310A (en) | 2018-04-26 | 2020-11-23 | 미쓰비시 세이시 가부시키가이샤 | Cryopreservation solution and cryopreservation method |
| WO2020075534A1 (en) * | 2018-10-11 | 2020-04-16 | 一丸ファルコス株式会社 | Medium for growth of neuronal stem cells |
| JPWO2020075534A1 (en) * | 2018-10-11 | 2021-09-02 | 一丸ファルコス株式会社 | Neural stem cell growth medium |
| JP7322053B2 (en) | 2018-10-11 | 2023-08-07 | 一丸ファルコス株式会社 | Media for Neural Stem Cell Growth |
| WO2020116623A1 (en) | 2018-12-07 | 2020-06-11 | 関東化学株式会社 | Undifferentiated state-maintaining culture medium for pluripotent stem cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2007124982A (en) | Cell culture solution and method for cell culture | |
| KR101913374B1 (en) | Composition of bio-ink having improved physical and biological properties | |
| JP5792262B2 (en) | Irradiated membrane for cell growth | |
| EP2089511B1 (en) | In vitro expansion of postpartum-derived cells using microcarriers | |
| EP1925701B1 (en) | Sponge-like structural body and process for production thereof | |
| JP7002530B2 (en) | Compositions and Methods Using Small Motility Stem Cells | |
| CN106414722B (en) | In vitro expansion of erythroid cells | |
| WO2014171486A1 (en) | Medium composition and method for producing red blood cells using same | |
| EP3853339A1 (en) | Mesh rolled scaffold and advanced bioreactor | |
| JP5725394B2 (en) | Hematopoietic stem cell culture method | |
| JP6954266B2 (en) | Medium composition for suspension culture and cell recovery method for easy cell recovery | |
| JP7256818B2 (en) | Sheeting method of cardiomyocytes | |
| WO2017104558A1 (en) | Hollow-fiber membrane and hollow-fiber module for cell culture | |
| CN111925984A (en) | Cell co-culture system and construction method and application thereof | |
| WO2020262354A1 (en) | Cell culturing vessel and cell culturing apparatus | |
| KR20210143133A (en) | Composition of Bio-ink Comprising Human Derived Collagen and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same | |
| JP4310433B2 (en) | Biomaterial pretreatment method and application | |
| CN113015784A (en) | Low macrophage adhesion and activation culture device and method for culturing bone marrow by using same | |
| Bukharova et al. | Tissue engineering construct on the basis of multipotent stromal adipose tissue cells and osteomatrix for regeneration of the bone tissue | |
| JP2019154277A (en) | Cell culture vessel | |
| WO2024033385A1 (en) | Methods for hematopoietic stem and progenitor cell expansion and differentiation in three-dimensional silk scaffolds and uses thereof | |
| KR101128262B1 (en) | Process for preparing red blood cells using positively charged surface | |
| JP4186043B2 (en) | Cell differentiation inducing method and cell culture | |
| JP2018014947A (en) | Cell culture method using hollow fiber membrane module | |
| NGIAP | Bio-functionalization of Electrospun Nanofibre Scaffolds for Cell Culture Applications |