JPS59118097A - Production of herpes simplex virus protein - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 １．発明の分野 本発明は、ヘルペスシンプレックスウィルス（ＨＳＶ）
糖タンパク質類のいずれにも関するタンパク質類の製造
方法に関し、またそのようなタンパク質類を製造する新
規なＤＮＡ配列、プラスミドおよび微生物（真核生物及
び原核生物の両方）を製造し、用いる方法および組成物
に関する。[Detailed description of the invention] 1. FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the herpes simplex virus (HSV).
Methods for producing proteins, including any of the glycoproteins, and methods and compositions for producing and using novel DNA sequences, plasmids and microorganisms (both eukaryotic and prokaryotic) for producing such proteins relating to things.

本発明はウィルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはバク
テリオファージＤＮＡのようなＤＮＡベクトル中に、糖
タンパク質Ｄ（ｇＤ）またはその部分のためのＤＮＡ配
列解読を挿入する組換えＤＮＡ技術を利用し、それによ
りベクトルは、バクテリヤ宿主あるいは他の単一細胞系
中のｇＤ遺伝子の発現を複製し、そして、監督すること
のできるものである。得られる組換えＤＮＡ分子は、宿
主細胞中に導入され、宿主細胞によるｇＤまたはその部
分あるいは分子変異型の製造が可能となる。The present invention utilizes recombinant DNA technology to insert DNA sequencing for glycoprotein D (gD) or a portion thereof into a DNA vector, such as viral DNA, plasmid DNA or bacteriophage DNA, whereby the vector , capable of replicating and directing the expression of the gD gene in a bacterial host or other single cell system. The resulting recombinant DNA molecule is introduced into a host cell, allowing the host cell to produce gD or a portion or molecular variant thereof.

製造されたタンパク質は、次に単離され、精製されそし
てＨＳＶタイプ１（ＨＳＶ−１）およびタイプ２（ＨＳ
Ｖ−２）の両方の感染に対するワクチン中の免疫原とし
て用いるために修飾される。The produced proteins were then isolated, purified and isolated from HSV type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-1).
V-2) for use as an immunogen in vaccines against both infections.

２．発明の背景技術 ２．１．組換えＤＮＡ技術及び遺伝子発現組換えＤＮＡ
技術は、特定ＤＮＡ配列をＤＮＡ乗物（ベクトル）中に
挿入し、宿主細胞中に複製することができる相換えＤＮ
Ａ分子を形成するものである。一般的に、挿入されたＤ
ＮＡ配列は受領ＤＮＡ配列に対して無関係である。すな
わち、挿入ＤＮＡ配列、及びＤＮＡベクトルは、天然中
で遺伝子形成の交換のない生体から誘導される、あるい
は挿入ＤＮＡ配列は、全体的にまたは部分的に合成でき
るものである。近年に、いくつかの一般的方法が、組換
えＤＮＡ分子を構成てぎるように、開発された。例えば
、米国特許第４，２３７，２２４号（コーエンおよびボ
イヤ　ＣｏｈｅｎとＢｏｙｅｒ）は、制限酵素を用いて
、このような組換えプラスミド類を製造することおよび
配位（ｌｉｇａｔｉｏｎ）として知られる方法を記載し
ている。これらの組換えプラスミド類は、次に転写によ
って単細胞生体中に導入され、複製される。米国特許第
４，２３７，２２４号に記載された技術の一般的な適用
のため、それは本明細書中への参照によってここに含有
せしめられる。2. Background of the invention 2.1. Recombinant DNA technology and gene expression recombinant DNA
The technique involves inserting a specific DNA sequence into a DNA vehicle (vector) and creating a compatible DNA sequence that can be replicated into a host cell.
It forms the A molecule. Generally, the inserted D
The NA sequence is unrelated to the received DNA sequence. That is, the inserted DNA sequence and DNA vector can be derived from an organism with no genetic exchange in nature, or the inserted DNA sequence can be wholly or partially synthetic. In recent years, several general methods have been developed for constructing recombinant DNA molecules. For example, U.S. Pat. No. 4,237,224 (Cohen and Boyer) describes the use of restriction enzymes to produce such recombinant plasmids and a method known as ligation. are doing. These recombinant plasmids are then introduced into single-celled organisms by transcription and replicated. Because of the general application of the technology described in US Pat. No. 4,237,224, it is hereby incorporated by reference into this specification.

組換えＤＮＡ分子の単細胞生体への導入の他の方法は、
コリンズ及びホーン（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｈｏｈｎ）によ
って米国特許第４，３０４，８６３号中に記載されてお
り、それも参照によってここに含有される。この方法は
、バクテリオファージベクトルとの充填／形質導入シス
テムを利用づるものである。Other methods of introducing recombinant DNA molecules into single-celled organisms include:
Collins and Hohn in US Pat. No. 4,304,863, which is also incorporated herein by reference. This method utilizes a loading/transduction system with bacteriophage vectors.

構成に用いた方法にかかわらず、組換えＤＮＡ分子は、
宿主細胞と適合すべき、即ち、宿主細胞中の自律複製で
きるものであるべきである。組換えＤＮＡ分子は、マー
カー機能を有すべきで、宿主細胞の選択ができ、それに
より、組換えＤＮＡ分子によって形質転換されるもので
ある。更に、適切な複製、転写および翻訳信号の全てが
プラスミド上に正確に配合される場合、外の遺伝子は、
形質転換細胞およびその子孫中に適切に発現させるもの
である。Regardless of the method used for construction, recombinant DNA molecules
It should be compatible with the host cell, ie, capable of autonomous replication in the host cell. The recombinant DNA molecule should have a marker function, allowing the selection of host cells that will be transformed by the recombinant DNA molecule. Furthermore, if all the appropriate replication, transcription, and translation signals are correctly formulated on the plasmid, the foreign gene
It is appropriately expressed in transformed cells and their progeny.

真核生物の細胞に感染するすべてのウィルスの特色であ
るから、ヘルペスシンプレックスウィルスは、そのゲノ
ムを複製するため、そのウィルス遺伝子が発現し、その
子孫を作る真核生物の宿主細胞系を必要どする。ＤＮＡ
複製のための信号および制御、遺伝子発現および真核生
物中のウィルス組織は、原核生物のものとは異なる。こ
れは、真核生物細胞中にのみ天然で発現される遺伝子を
、原核生物宿主細胞中で発現させる試みを為す場合に臨
界的に重要である。As is characteristic of all viruses that infect eukaryotic cells, the herpes simplex virus requires a eukaryotic host cell system in order to replicate its genome, in which its viral genes are expressed and its progeny produced. do. DNA
The signals and controls for replication, gene expression and viral organization in eukaryotes are different from those in prokaryotes. This is of critical importance when attempting to express genes in prokaryotic host cells that are naturally expressed only in eukaryotic cells.

これらの異なる遺伝子は信号および処理事項は、遺伝子
発現の多くのレベル、例えば、ＤＮＡ転写およびメッセ
ンジャーＲＮＡ翻訳を制御する。ＤＮＡの転写は、ＲＮ
Ａポリメラーゼの結合を指示し、そして、それによって
転写を促進するＤＮＡ配列であるプロモータの存在に依
存している。真核生物のプロモーターのＤＮＡ配列は原
核生物プロモーターのものとは異なる。更に、真核生物
のプロモーターおよびそれに伴なう遺伝子信号は、原核
生物系の中では認識できずあるいは機能できないもので
ある。These different gene signals and processing items control many levels of gene expression, such as DNA transcription and messenger RNA translation. Transcription of DNA is performed by RN
It relies on the presence of a promoter, a DNA sequence that directs the binding of A polymerase and thereby promotes transcription. The DNA sequences of eukaryotic promoters are different from those of prokaryotic promoters. Furthermore, eukaryotic promoters and their associated genetic signals are unrecognizable or unable to function in prokaryotic systems.

同様に、原核生物中のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ
）の翻訳は、真核生物どは異なる適切な原核生物中のｍ
ＲＮＡの効率的な翻訳には、ｍＲＮＡ上のシンダルガル
ノ（Ｓｈｉｎｅ　Ｄａｌｇａｒｎｏ；ＳＤ）配列と称す
るリボゾーム接合を必要とする。Similarly, messenger RNA (mRNA) in prokaryotes
) in the appropriate prokaryotes, which are different from eukaryotes.
Efficient translation of RNA requires ribosome junctions called Shine Dalgarno (SD) sequences on mRNA.

この配列は、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列であり、
それは、プロテインのアミノ−末端メチオニンをエンコ
ード（暗号作成）する短いコドン（ｃｏｄｏｎ　）（Ａ
ＵＧ）の前に位置しでいる。ＳＤ配列は１ｂＳｒＲＮＡ
（リボゾームのＲＮＡ）の３′一端に対して相補的であ
り、そして、多分ｍＲＮＡのリボゾームに対する接合を
、ｒＲＮＡと複式化（二重らせん化〉し、リボゾームの
正しい位置付けを可能にすることによって、促進してい
る。遺伝子発現を最大にする上の考察のために、ロバー
トおよびラウエル（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｌａｕｅｖ）の１
９７９年のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　６８：４７３を参照されたい。This sequence is a short nucleotide sequence of mRNA,
It consists of a short codon (A
It is located in front of UG). SD sequence is 1bSrRNA
complementary to the 3' end of the (ribosomal RNA) and perhaps by duplexing the junction of the mRNA to the ribosome with the rRNA and allowing correct positioning of the ribosome. For considerations on maximizing gene expression, see Roberts and Lauev's 1
979 Methods in Enzymolog
See y 68:473.

多くの因子が、適切な信号が挿入され、そして、適切に
位置つけられた後でさえも、原核生物中の真核生物遺伝
子の発現を複雑にする。これらの因子の性質および操作
か行なわれる機構を明白に理解覆ることが現在欠いてい
るものである。一つのこのような因子はエスケリキアコ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、以下、Ｅ．コ
リという。）および他のバクテリヤ中の活性な原核生物
のシステムの存在である。このタンパク質劣化システム
は、真核生物タンパク質のごとき「異常な」あるいは他
者タンパク質を選択的に破壊するように見える。従つて
、大変な利用性が、原核生物減成からバクテリヤ中に発
現される真核生物タンパク質を保護する手段を開発する
ことによって与えられよう。１つの戦略は、真核生物配
列が、原核生物遺伝子との相に配列された（即ち、正し
い読取フレーム中で）もので、それによって、融合タン
パク質生成物（原核生物のおよび他者、即ち真核アミノ
酸配列の交雑（ハイブリッド）であるタンパク質）が得
られる交雑遺伝子を構成することである。Many factors complicate the expression of eukaryotic genes in prokaryotes even after the appropriate signals have been inserted and properly positioned. What is currently lacking is a clear understanding of the nature of these factors and the mechanisms by which their manipulation takes place. One such factor is the presence of active prokaryotic systems in Escherichia coli (hereinafter referred to as E. coli) and other bacteria. This protein degradation system appears to selectively destroy "abnormal" or foreign proteins, such as eukaryotic proteins. Therefore, great utility would be provided by developing means to protect eukaryotic proteins expressed in bacteria from prokaryotic degradation. One strategy is for the eukaryotic sequence to be aligned in phase with the prokaryotic gene (i.e., in the correct reading frame), so that the fusion protein product (prokaryotic and other, i.e., true) The goal is to construct a hybrid gene that yields a protein that is a hybrid of nuclear amino acid sequences.

交雑遺伝子の構成は、多くの真核生物タンパク質、例え
ば、ソマトスタチン、ねずみプロインシュリン、成長ホ
ルモンおにび卵アルブミン様タンパク質をエンコード（
暗号作成）する遺伝子の分子クローン化において用いた
研究法であった。更に、原核生物プロモータは、卵アル
ブミンおよびβ−グロビンの場合、そのような融合遺伝
子配列と配位していたのである［ギャランテ（Ｇｕａｒ
ｅｎｔｅ）ら、１９８０．Ｃｅｌｌ　２０：５４３］。The hybrid gene composition encodes many eukaryotic proteins, such as somatostatin, murine proinsulin, growth hormone, and ovalbumin-like protein (
This was a research method used in the molecular cloning of genes used to create codes. Furthermore, prokaryotic promoters have been coordinated with such fusion gene sequences in the case of ovalbumin and β-globin [Guarante et al.
et al., 1980. Cell 20:543].

ギャランテのシステムは、ＳＤ配列を含むｌａｃプロモ
ータを、融合遺伝子のＡＴＧの前面で、変えた距離にお
いて挿入することによるものである。幾つかの真核生物
遺伝子分子クローン化および発現は達成されたが、これ
は従来ｇＤ遺伝子については行なわれていない。原核生
物宿主細胞中に他者即ち真核生物遺伝子の発現はルーチ
ンになし得るような技術状態はない。Galante's system relies on inserting the lac promoter containing the SD sequence at varying distances in front of the ATG of the fusion gene. Although molecular cloning and expression of several eukaryotic genes has been accomplished, this has not been previously done for the gD gene. There is no state of the art that would routinely allow expression of other, eukaryotic genes in prokaryotic host cells.

２．２　ワクチン類 ウィルス感染の抑制および治療には次の３つの基本的な
方法がある。（１〉活性な免疫応答を引き出すワクチン
、（２）ウィルス複製を抑制する化学治療法剤および（
３）インターフェロンの合成を導き出す剤。３つの全て
が、感染を防ぐために用いることができるが、感染の初
期に適用すると、より効果的である。ワクチン注射、即
ち免疫化は、感染が始った後では通常効果的でない。2.2 Vaccines There are three basic methods for controlling and treating viral infections: (1) vaccines that elicit an active immune response, (2) chemotherapeutic agents that inhibit viral replication, and (
3) An agent that induces the synthesis of interferon. All three can be used to prevent infection, but are more effective when applied early in the infection. Vaccination, or immunization, is usually not effective after infection has begun.

ワクチンは、通常その免疫学的性質を破壊することなく
、ウイルスを無害化することによって製造される。伝統
的に、これは不活性化ワクチンに使用するために、ウィ
ルスの感染性を不活性化すること（即ち、通常、ホルム
アルデヒドのごとき種々の化学剤による処理によってウ
ィルスを「殺す」こと〉あるいは生のワクチン（弱毒化
ワクチン）用に無毒性あるいは弱毒化された（修飾され
た）ウィルスを選択することによって達成される。Vaccines are produced by rendering the virus harmless, usually without destroying its immunological properties. Traditionally, this has been done by inactivating the infectivity of the virus (i.e. 'killing' the virus, usually by treatment with various chemicals such as formaldehyde) or killing the virus for use in inactivated vaccines. This is achieved by selecting avirulent or attenuated (modified) viruses for use in vaccines (attenuated vaccines).

弱毒化は、ウィルスを通常的でない条件（異なる動物宿
主および細胞培養）に適応せしめることおよび大きなウ
ィルス接種物に数多く通過させ、閉力を失った変異体を
選択し、そして徴候のないものあるいは単に少しの徴候
のものを作ることによって得られる。獣医学の実際にお
いてまだ用いられる少しのワクチンは、ウィルス増殖が
ほとんど続かない場合に注射された完全に閉力のある感
染性ウィルスよりなる。この手順は、ヒトに使用するに
は余りに危険であると考えられてきた。Attenuation involves adapting the virus to unusual conditions (different animal hosts and cell cultures) and passing it through large numbers of large virus inocula, selecting mutants that have lost clot power, and killing those without symptoms or simply Obtained by making things with little indication. The few vaccines still used in veterinary practice consist of fully occlusive infectious viruses injected where little viral replication continues. This procedure has been considered too dangerous for use in humans.

生のワクチン中に用いる弱毒化ウィルスは、一般的に優
れた免疫原である。何故ならば弱毒化ウィルスは、宿主
中において増殖し、従って、長く続く免疫性を引き山号
からである。弱毒化ウイルスは、全てのウィルス抗原、
ヴィリオン（ウィルス粒子）の両の表面および内部抗原
に対して指向の体液性の抗体を誘導する。しかしながら
、多くの問題がウィルスの不充分な弱毒化、ウィルスの
遺伝子的不安定性、ワクチンウィルスの成長に用いた細
胞培養物中での外部ウィルスによる汚染および最後にワ
クチン不安定性（例えば熱不安定性）の如く、生ワクチ
ンの使用に考えられる。Attenuated viruses used in live vaccines are generally good immunogens. This is because the attenuated virus multiplies in the host and thus elicits long-lasting immunity. Attenuated viruses contain all viral antigens,
It induces humoral antibodies directed against both surface and internal antigens of the virion (viral particle). However, many problems arise such as insufficient attenuation of the virus, genetic instability of the virus, contamination by foreign viruses in the cell culture used to grow the vaccine virus and finally vaccine instability (e.g. thermal instability). The use of live vaccines is considered.

不活性ワクチンの使用（増殖しない「殺した」あるいは
不活性化ウィルスを用いて）は、生ワクチンの使用で考
えられる困難点を避けるのだが、殺したウィルスは、免
疫化された動物の中で増殖せず、そして、通常表面成分
のみに対する指向の抗体を作る。しかしながら、不活性
化ワクチンについての主な困難点は、関係抗原の必要量
を供するに充分なウィルスを作ることにある。不活性化
ワクチンの使用で考えられる他の困難点は、達成した免
疫性が短く、そしてよく追加の免疫化を要し、抗原サイ
トが、不活性化化学処理によって変えられる。従って、
免疫原付が小さくなり、あるいはウィルス感染を中和す
るのに効果的でなくし、ぞしてワクチンは、よく充分な
レベルのＩｇＡを導かないことである。The use of inactivated vaccines (using "killed" or inactivated virus that does not multiply) avoids the possible difficulties of using live vaccines, but the killed virus does not survive in the immunized animal. They do not proliferate and usually make antibodies directed only against surface components. However, the main difficulty with inactivated vaccines lies in producing enough virus to provide the required amount of the antigen of interest. Other possible difficulties with the use of inactivated vaccines are that the immunity achieved is short and often requires additional immunizations, and that the antigenic sites are altered by the inactivating chemical treatment. Therefore,
The immunogen becomes smaller or less effective at neutralizing the viral infection, and thus the vaccine often does not elicit sufficient levels of IgA.

サブユニットのワクチンは、非外皮の正二十面体ウイル
スのカプシドタンパク質または外皮のウィルスのペプロ
マー（糖タンパク質スパイク）のごとき必要で、関係す
る免疫原因物質を含む。サブユニットのワクチンは、高
精製のウィルスフラクションから関係サブユニットを単
離すること、あるいは関係ポリペプチドを合成すること
によって作ることができる。サブユニットワクチンの主
な長所は、ウィルス源のおよび宿主−または供与−誘導
の干渉性物質の遺伝物質を排出することである。しかし
ながら坦在、これらの方法を用いてのサブユニットワク
チンの製造は、広く使われる商業用途には高価すぎる。Subunit vaccines contain the necessary and associated immunogenic agents, such as the capsid protein of non-enveloped icosahedral viruses or the peplomer (glycoprotein spike) of enveloped viruses. Subunit vaccines can be made by isolating the relevant subunits from highly purified virus fractions or by synthesizing the relevant polypeptides. The main advantage of subunit vaccines is the elimination of genetic material of viral origin and of host- or donor-induced interfering substances. However, production of subunit vaccines using these methods is often too expensive for widespread commercial use.

絹換えＤＮＡ技術は、サブユニットワクチンの製造に多
くものを供し得、ウィルスの関係免疫原部分またはその
タンパク貿をエンコード（暗号作成）するウィルス遺伝
子の分子クローン化および宿主細胞発規は、サブユニッ
トワクチン中での使用のために関係免疫原を充分量作る
ことができる。Silk recombinant DNA technology has much to offer for the production of subunit vaccines, and molecular cloning and host cell regulation of viral genes that encode the relevant immunogenic portions of the virus or its protein trade is essential for the production of subunit vaccines. Sufficient quantities of the relevant immunogen can be made for use in vaccines.

ワクチンは、種々のアジュバントをもつ懸濁液中でよく
投与される。アジュバントは、免疫原のみを投与した場
合よりも少ない投与量で、少ない量の抗原を用いて、よ
り耐性のよく、より高いレベルの免疫性を与えることを
助りるものである。Vaccines are often administered in suspension with various adjuvants. Adjuvants help provide better tolerance and higher levels of immunity using lower doses and less antigen than if the immunogen alone were administered.

アジュバント作用の機構は、複雑であり、完全には理解
されていない。しかしながら、それは食作用を励起りる
ことおよび細網内皮系の他の活性を励起すること、およ
び抗原の遅らした解放および分解含み得るものである。The mechanism of adjuvant action is complex and not completely understood. However, it may involve stimulating phagocytosis and other activities of the reticuloendothelial system, and delayed release and degradation of antigens.

アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完
全または不完全の）アジュバンド６５（落下生油、マン
ナイドモノオレートおよびアルミニウムモノステアレー
トを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミ
ニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。Examples of adjuvants include Freund's adjuvant (complete or incomplete), Adjuvant 65 (including fallen raw oil, mannide monooleate and aluminum monostearate), and minerals such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate or alum. There is gel.

フリオンドのアジュバントは、ヒトまたは動物のための
ワクチンにはもはや用いられていない。何故ならば、そ
れは非代謝性鉱油を含み、そして潜在的発がん物質であ
るからである。しかしながら鉱物ゲルは、商業的獣医学
上のワクチンに広く用いられている。Friondo's adjuvant is no longer used in vaccines for humans or animals. This is because it contains non-metabolizable mineral oil and is a potential carcinogen. However, mineral gels are widely used in commercial veterinary vaccines.

２．３．ヘルペス　ウィルス類 ヘルペスウィルス類（ヘルペトビリダエ：Ｈｅｒｐｅｒ
ｔｏｖｉｖｉｄａｅ）は、大きなＤＮＡウィルスであり
、宿主の命のため存続できる潜在的感染を確立するので
顕著である。第１次感染後、それは表われ得ず、ウィル
スは、照射あるいは免疫抑制のごとき数個の疑わしい刺
激のどれかによる再活性化がされるまで静止している。2.3. Herpesviruses Herpesviruses (Herpetoviridae: Herper)
tovividae) are large DNA viruses and are notable for establishing latent infections that can persist for the life of the host. After the primary infection, it cannot be expressed and the virus remains quiescent until reactivated by any of several suspected stimuli, such as irradiation or immunosuppression.

活性状態あるいは感染の激しい形態は、増殖のまたは溶
菌感染によって特徴づけられる。即ち、ウィルスが複製
しており、宿主細胞機構を越え、成熟感染ヴィリオンを
作り、そして死亡脂肪をおこすことである。しかしなが
ら、潜在状態において、ウィルスは宿主の結節肺中に確
立される：潜状の間に感染性ウィルスの生成の証拠はな
い。The active state or severe form of infection is characterized by a proliferative or lytic infection. That is, the virus is replicating, overcoming the host cell machinery, producing mature infectious virions, and causing mortality. However, in the latent state, the virus is established in the host's nodular lungs: there is no evidence of production of infectious virus during latency.

最も主な感染は、幼時期に生じ、そして表われていない
。感染は、粘膜のウィルス接種から、あるいはウィルス
が皮ふの中に表皮表面の破れを通して入ることから生じ
得る。従って、感染ウィルスは、密な接触によって移さ
れ得る。いったん獲得されるど、ＨＳＶは、生涯身体中
に保持きれ、そして犠牲者は、無症候性であり得、ある
いは例えば粘膜皮膚病、ヘルペスラビアルス（唇上の病
巣、通常「フィバ−ブリスター」または「コールドソア
ス」唇ヘルペス）と呼ばれる）、歯肉口内炎（口および
歯肉が、小胞でおおわれ、それが破れ、そして潰瘍にな
る）、咽頭炎、扁桃炎、角結膜炎（角膜炎または眼の角
膜の炎症で、樹枝上の潰瘍に進み、究極的には角膜の瘉
痕となり、盲目となる）および性器ヘルペスを含む粘膜
皮ふ病のごとき多くの臨床的発現となる再発発病にかか
る。Most major infections occur during childhood and are unexpressed. Infection can result from viral inoculation of the mucous membranes or from entry of the virus into the skin through breaks in the epidermal surface. Therefore, infectious virus can be transferred by close contact. Once acquired, HSV can remain in the body for life, and the victim may be asymptomatic or suffer from, for example, mucocutaneous disease, herpes labialis (lesions on the lips, usually "fiber blisters") or gingivostomatitis (the mouth and gums become covered with vesicles that rupture and become ulcers), pharyngitis, tonsillitis, keratoconjunctivitis (keratitis or inflammation of the cornea of the eye) The disease progresses to arborural ulceration, which ultimately leads to corneal scarring and blindness) and recurrent attacks that result in many clinical manifestations such as mucocutaneous diseases, including genital herpes.

希には、ＨＳＶか感染は、脳炎、庖疹状湿疹、トラウマ
チシヘルペス、肝炎および新生児ヘルペスを起こし得る
。Rarely, HSV infection can cause encephalitis, eczema, traumatic herpes, hepatitis, and neonatal herpes.

活性な突発の間、感染性ウィルスは、病巣から、または
周囲の液から；例えば、ヘルペス性病感染の場合、唾液
から単離することかできる。これらの病巣は、与えられ
た個所の身体の同じ部分で破れる傾向があり、月経、日
光または冷風のへの過剰の露出、下垂体またはアデナル
ホルモン、アレルギー反応、あるいは古典的には熱少々
のごとき多くの刺激によって引きおこされる。これらの
突発の間、犠牲者は、ウィルスを放っており、そして他
人に接触を通して感染性ウィルスを拡げることができる
。During an active outbreak, infectious virus can be isolated from the lesion or from the surrounding fluid; for example, in the case of a herpes venereal infection, from saliva. These lesions tend to rupture in the same part of the body in a given location and are caused by menstruation, excessive exposure to sunlight or cold wind, pituitary or adenal hormones, allergic reactions, or classically a slight fever. It is triggered by many stimuli such as During these outbreaks, victims are shedding the virus and can spread the infectious virus to others through contact.

感染の潜状期の間、観察者はウィルスが病巣の当然に生
じる場合の他の領域にあることを示してきた。この静由
期の間、ウィルスは感覚結節肝のノイロン中に局在化さ
れ（顔の病巣の場合、三叉神経結節腫が普通になる）そ
して、通常の患される領域から単離できない。During the incubation period of infection, observers have shown that the virus is present in other areas of the lesion as well. During this quiescent phase, the virus is localized in the sensory nodules of the liver (in the case of facial lesions, trigeminal nerve nodules are common) and cannot be isolated from the usual affected areas.

ほとんどの子孫は、第１次感染から急速に回復するが、
時に、肝炎ににって特徴づれられる広がった新生児ヘル
ペス感染がやんだ新生児を圧倒する。最もひどい感染は
、誕生時に感染性付き添いから、より普通には感染母親
から、赤んぼが母の誕生通路中の性器ヘルペスに会うと
きに得取される。女および子供の外陰部肝炎およびペニ
スの感染は、ＨＳＶ−２によって生じると以前考えられ
た。しかしながら最近の結果は、ＨＳＶ−１，ＨＳＶ−
２のどちらも原因となり得ることをし示しており、更に
、女性のヘルペス性病感染は、頚管の癌を伴なったこと
を示している。Most offspring recover quickly from the primary infection, but
At times, a widespread neonatal herpes infection characterized by hepatitis overwhelms the newborn. The most severe infections are acquired from infectious attendants at birth, more commonly from infected mothers, when the baby encounters genital herpes in the mother's birth passage. Vulvar hepatitis and penile infections in women and children were previously thought to be caused by HSV-2. However, recent results indicate that HSV-1, HSV-
It has been shown that both of these two factors can be the cause, and furthermore, it has been shown that herpes venereal disease infection in women was associated with cancer of the cervical canal.

ヘルペス感染は、今日の社会において、表皮割合に達し
ている。現在、ＨＳＶ感染に対しての治療はなく、ＤＮ
Ａ合成を抑制する化合物の使用が現在の処置である。こ
れらの化合物は、もちろん非選択的であり、細胞の分割
並びにウィルスのそれの細胞ＤＮＡ合成を抑制御る。更
に、これらの化合物は、活性感染の間のみ有用であり、
その限り潜伏の間には、はっきりした効果がない。Herpes infections have reached epidermal proportions in today's society. Currently, there is no treatment for HSV infection, and DN
The current treatment is the use of compounds that inhibit A synthesis. These compounds are of course non-selective and inhibit cell division as well as viral and cellular DNA synthesis. Furthermore, these compounds are only useful during active infection;
To that extent, there is no clear effect during incubation.

ヘルペス性病感染は、真核生物のウィルスであり、大き
さ８０×１０６〜１５０×１０６ダルトンの範囲の線状
の二重鎖のＤＮＡゲノムを含んでいる。各ヴィリオンは
、正二十面体ヌクレオカブシドと、成熟期および発芽期
に宿主細胞の脂質二重層から除去されることにより形成
される膜エンベローブ（表面膜）を有する。ウィルスエ
ンベロープは、部分的には膜中に存在するが、膜エンベ
ロープから外側に排除する多くのウィルス特定ブロティ
ンを含む脂質二重層である。第１次感染の間に、膜エン
ベロープは、ウィルス粒子が細胞中に効率的に侵入でる
ために必要である。脂質二重層の外側上にウィルスプロ
ティンと特に結合している抗体は、ウィルス感染を中和
する能力がある。Herpes venereal infection is a eukaryotic virus that contains a linear double-stranded DNA genome ranging in size from 80 x 106 to 150 x 106 daltons. Each virion has an icosahedral nucleocabsid and a membrane envelope (surface membrane) formed by removal from the lipid bilayer of the host cell during maturation and germination. The viral envelope is a lipid bilayer containing many virus-specific proteins that reside partially in the membrane but are excluded outwardly from the membrane envelope. During primary infection, a membrane envelope is required for efficient entry of virus particles into cells. Antibodies that specifically bind to viral proteins on the outside of the lipid bilayer are capable of neutralizing viral infections.

ウィルスタンパク質は、糖タンパク質（そこに糖分分子
を伴なうタンパク質分子）である。ヘルペスシンプレッ
クスウィルスタイプ−１（ＨＳＶ−１）およびタイプ−
２（ＨＳＶ−２）は、各々互いに抗原的区別される少な
くとも４つの異なる糖タンパク質を作る。ＨＳＶ−１お
よびＨＳＶ−２からのこれらのタンパク質のあるものは
、共通のエピトープ（即ち、抗原サイトまたは抗体結合
サイト）を分け持っている。このようなタンパク質の例
は、４９，０００〜５８，０００ダルトンの糖タンパク
質であり、ｇＤと称される。ＨＳＶ−１　ｇＤに対する
多価抗血清は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方の感
染を中和する能力がある。（Ｎｏｒｒｉｌｄ，１９７９
，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ，ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９：６７）。Viral proteins are glycoproteins (protein molecules with sugar molecules attached to them). Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) and type-
2 (HSV-2) makes at least four different glycoproteins, each of which is antigenically distinct from each other. Some of these proteins from HSV-1 and HSV-2 share common epitopes (ie, antigenic or antibody binding sites). An example of such a protein is the 49,000-58,000 dalton glycoprotein, referred to as gD. Multivalent antisera against HSV-1 gD are capable of neutralizing both HSV-1 and HSV-2 infections. (Norrild, 1979
,Current Topics in Microb
iol, and Immunol, 19:67).

３、発明の概略 単一細胞宿主生体中のＨＳＶ糖タンパク質遺伝子のクロ
ーン化（分校系形成）および発現のための方法および組
成物が供される。また、これらの新規な単一細胞生体を
培養し、ＨＳＶ遺伝子生成物を作る方法およびその遺伝
子生成物の精製方法が記される。ここに記された組変え
ＤＮＡ技術によって作られたｇＤ−関連タンパク賀は、
ＨＳＶ−１および、ＨＳＶ−２感染に対して保護するワ
クチンの免疫原として用いるために処方できる。3. Overview of the Invention Methods and compositions are provided for cloning (branch system formation) and expression of HSV glycoprotein genes in a single cell host organism. Also described are methods for culturing these novel single cell organisms and making HSV gene products, and methods for purifying the gene products. The gD-related proteins produced by recombinant DNA technology described here are
It can be formulated for use as an immunogen in vaccines to protect against HSV-1 and HSV-2 infections.

ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子（ＨＳＶ−１パットン株から単離
された）は、タイプ間組換え分析とｍＲＮＡマッピング
によって、ウィルスゲノム中で同定された。ＤＮＡの特
定のセグメント上に局在化されると、遺伝子のヌクレオ
チド配列は決定され、そして、ｇＤタンパク質のアミノ
酸配列が予想された。The HSV-1gD gene (isolated from the HSV-1 Patton strain) was identified in the viral genome by intertype recombination analysis and mRNA mapping. Once localized on a specific segment of DNA, the nucleotide sequence of the gene was determined and the amino acid sequence of the gD protein was predicted.

ＨＳＶ−２ｇＤ遺伝子（ＨＳＶ−２株Ｇから単離〉は、
ウィルスゲノム中でＨＳＶ−１ゲノム中のｇＤの位置に
対する類似性によって、そして、交雑分析によって同定
された。The HSV-2gD gene (isolated from HSV-2 strain G) is
It was identified in the viral genome by similarity to the location of gD in the HSV-1 genome and by hybridization analysis.

単離されたｇＤ遺伝子または遺伝子フラグメント（タイ
プ１または２〉は、ついでプラスミドベクトル中に挿入
され、生物学的に機能的複製単位として働く組換えプラ
スミドを形成した。これらの相換えプラスミドは、適合
できる宿主細胞の形質転換の上でｇＤ遺伝子の複製およ
び発現を容易にするように構成された。更に、プラスミ
ドは、ｇＤ遺伝子を活性に発現する転換された微生物を
一工程で同定するために供する。最後に、発現された遺
伝子生成物を単離するための、またワクチンを処方する
に用いる方法を述べる。The isolated gD gene or gene fragment (type 1 or 2) was then inserted into a plasmid vector to form a recombinant plasmid that served as a biologically functional replication unit. The plasmid was constructed to facilitate replication and expression of the gD gene upon transformation of a host cell capable of producing a plasmid.Furthermore, the plasmid provides for the one-step identification of transformed microorganisms that actively express the gD gene. Finally, we describe the methods used to isolate the expressed gene products and to formulate vaccines.

４、図面の説明 本発明は、次の発明の詳細な説明、特定の具体例および
添付図面を参照することによって、より充分に理解され
得る。4. Description of the Drawings The present invention may be more fully understood by reference to the following detailed description of the invention, specific embodiments, and accompanying drawings.

第１ａ図は、ＨＳＶ−１ゲノムを示し、ＨＳＶ−１のｇ
Ｄ遺伝子のある短い独特な領域（Ｕｓ）の位置を示す（
以下ｇＤ−１遺伝子と称する。）。Figure 1a shows the HSV-1 genome;
The location of the short unique region (Us) of the D gene is shown (
Hereinafter, it will be referred to as gD-1 gene. ).

第１ｂ図は、ラムダｇｔＷＥＳ：：ＥｃｏＲＩ−ＨのＨ
ＳＶ−１ＥｃｏＲＩ−Ｈフラグメントインサートの制限
マツプを示す。議論に関する制限サイトのみが示されて
いる。制限酵素認識配列は、次のように略されている。Figure 1b shows the H of lambda gtWES::EcoRI-H.
A restriction map of the SV-1 EcoRI-H fragment insert is shown. Only restricted sites for discussion are shown. Restriction enzyme recognition sequences are abbreviated as follows.

：ＢａｍＨＩ（Ｂａ４〜Ｂａ８）：ＢｇｆＩＩ（Ｂｇ２
）：ＢｓｔＥＩＩ（Ｂｓ）：ＥｃｏＲＩ（ＲＩ）：Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ（Ｈ３）：ＫｐｎＩ〈Ｋｐ）：ＰｖｕＩＩ（
Ｐｖ）；ＳａｃＩ（Ｓｃ）：ＳａｌＩ（Ｓａ）：および
ＸｈｏＩ（Ｘｈ）。:BamHI(Ba4-Ba8):BgfII(Bg2
):BstEII(Bs):EcoRI(RI):Hi
ndIII(H3):KpnI<Kp):PvuII(
Pv); SacI (Sc): SalI (Sa): and XhoI (Xh).

第１ｃ図は、ラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−ＨのＢａ
ｍＨＩ−８からＢａｍＨＩ−７のフラグメントのｐＢＲ
３２２への挿入物を有するｐＲＷＦ６の構成を示す。Figure 1c shows the Ba of lambda gtWES:EcoRI-H.
pBR of mHI-8 to BamHI-7 fragment
The construction of pRWF6 with an insert into 322 is shown.

第１ｄ図はｐｓＳＣＣ３０−４のＨＳＶ−１ＳａｃｌＤ
ＮＡフラグメントインサートの制限マップを示す。太棒
部（拡大された領域）は、ｇＤ−１ｍＲＮＡ解読配列の
局在および位置を示す。Figure 1d shows HSV-1SaclD of psSCC30-4.
A restriction map of the NA fragment insert is shown. The thick bar (enlarged region) indicates the localization and position of the gD-1 mRNA decoding sequence.

第２図は、ｇＤ−１遺伝子配列の配列戦略と制限マツプ
を示す。解読領域は、太棒部（拡大された領域）によっ
て示され、そして非解読領域は、単線（細線部〉によっ
て示される。フラグメント単離、ラベル化および２次消
化に用いる制限エンドヌクレアーゼ間裂サイトが示され
る。水平の矢印は、配列ＤＮＡ領域を示し、制限マツプ
の上のものは、非解読鎖配列が決定されたことを示し、
制限マツプのＦのものは、鋳型鎖が配列されていたこと
を示す。Figure 2 shows the sequence strategy and restriction map of the gD-1 gene sequence. The coding region is indicated by a thick bar (enlarged region) and the non-coding region is indicated by a single line (thin line). Restriction endonuclease interstitial sites used for fragment isolation, labeling and secondary digestion. The horizontal arrow indicates the sequenced DNA region, and the one above the restriction map indicates that the undeciphered strand sequence has been determined.
F in the restriction map indicates that the template strands were aligned.

第３図は、ｇＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列およびｇ
Ｄ−１プロテインの予想されたアミノ酸配列を示す。適
切な制限サイが示され、そしてｇＤ−１のアミノ解読端
における数が与えられた垂直の矢印は、ｐＪＳ４１３に
対するｇＤ−１アミノ解読端の配位サイトを示し、次の
ごとき組換えプラスミドにある：ｐＥＨ５１，ｐＥＨ６
０，ｐＥＨ６２，ｐＥＨ６６、ｐＥＨ７１，ｐＥＨ７３
およびｐＥＨ７３であり、これらは、その天然のＴＡＧ
に対してｇＤ−１配列の残りを含む；そしてｐＥＨ４−
２，ｐＥＨ８２，ｐＥＨ３−２５およびｐＥＨ９０−Ｎ
シリーズであり、これはＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラク
トシダーゼ融合タンパク賀をエンコードするものである
。ｇＤ−１のカルボキシ解読端にある数の付けられた垂
直な矢印は、ｇＤ−１カルボキシ解読端の以下に対する
配位サイトを示す：（１）組換えプラスミド；ｐＥＨ４
−２，ｐＥＨ８２，ｐＥＨ３−２５中のｐＪＳ４１３の
β−カラクトシダーゼ遺伝子（ｚ−遺伝子）；または（
２）プラスミドのｐＥＨ９０−Ｎシリース中のｐＨＫ４
１４のｚ−遺伝子。Figure 3 shows the nucleotide sequence of the gD-1 gene and the gD-1 gene.
The predicted amino acid sequence of D-1 protein is shown. Appropriate restriction sites are indicated and numbered vertical arrows at the amino-coding end of gD-1 indicate the coordination site of the gD-1 amino-coding end to pJS413 and are present in recombinant plasmids such as :pEH51, pEH6
0, pEH62, pEH66, pEH71, pEH73
and pEH73, which have their natural TAG
contains the remainder of the gD-1 sequence; and pEH4-
2, pEH82, pEH3-25 and pEH90-N
series, which encodes the Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein. The numbered vertical arrows on the carboxy-coding end of gD-1 indicate the coordination sites of the gD-1 carboxy-coding end for: (1) the recombinant plasmid; pEH4;
β-caractosidase gene (z-gene) of pJS413 in -2, pEH82, pEH3-25; or (
2) pHK4 in the pEH90-N series of plasmids
14 z-genes.

第４図（スケールで描かれていない）は、ｐＥＨ２５，
ｇＤ−１遺伝子の一部から導かれた換えプラスミド、お
よびｐＪＳ４１３、Ｅ、コリの発現ベクトルの構成を示
す。組換えプラスミド，ｐＥＨ２５は、発現ベクトルか
ら導かれた「指導者：リーダー」配列（ｃｒｏ）に対し
て配位されたｇＤ−１解読配列の約８７％によってエン
コードされたＨＳＶ−１ｇＤ−関連タンパク質の製造を
監督している。Figure 4 (not drawn to scale) shows pEH25,
The construction of a recombinant plasmid derived from a part of the gD-1 gene and the expression vector of pJS413, E. coli is shown. The recombinant plasmid, pEH25, contains an HSV-1 gD-related protein encoded by approximately 87% of the gD-1 coding sequence, coordinated to a "coachor" sequence (cro) derived from the expression vector. Supervises manufacturing.

第５図は、ｐＥＨ２５中のＣｒｏ／ｇＤ−１結合のＤＮ
Ａ配列と予想アミノ酸配列を示す。Figure 5 shows the DNA of Cro/gD-1 bond in pEH25.
The A sequence and predicted amino acid sequence are shown.

第６図は、ＨＳＶ感染Ｈｅｌａ細胞のリゼイト（溶菌液
）中に存在する競合抗原を添加することによるｐＥＨ２
５ｇＤ生成物の免疫沈降の抑制率を示す。Figure 6 shows the pEH2
The inhibition rate of immunoprecipitation of 5gD product is shown.

第７図〈スクールの示されていない）は、ｐＥＨ２５か
ら導かれたｇＤ−１発現プラスミド、ｐＥＨ４−２，の
構成を示す、その中では、ｇＤ−１解読配列の３′−末
端の２０５のヌクレオチド（６９のアミノ酸）は除かれ
Ｅ、コリのβ−ガラクトシダーゼタンパク質の代りに、
約３，０００の付化のヌクレオチドで置換される。この
組換えプラスミドは、ｇＤ−１特定タンパク質の各々の
端で融合されたＥ、コリ−関連ポリペプチド（即ち、Ｃ
ｒｏ及びβ−ガラストシダーゼ）による「サンドウィッ
チ」タンパク質（即ち融合プロティン）の製造のための
ものである。Figure 7 (school not shown) shows the construction of a gD-1 expression plasmid, pEH4-2, derived from pEH25, in which the 3'-terminal 205 of the gD-1 coding sequence is The nucleotides (69 amino acids) were removed and replaced with E. coli β-galactosidase protein.
Approximately 3,000 additional nucleotides are substituted. This recombinant plasmid contains the E, coli-related polypeptide (i.e., C
ro and β-galatosidase) for the production of "sandwich" proteins (i.e. fusion proteins).

第８図（スケールで描かれず）は、多くのｇＤ−１発視
プラスミド、ｐＥＨ５０＋ｘ、各々は、ｇＤ遺伝子のア
ミノ解読末端の種々の部分を含んでいる、を製造する方
法を示す。FIG. 8 (not drawn to scale) shows how to produce a number of gD-1 detection plasmids, pEH50+x, each containing a different portion of the amino-decoded end of the gD gene.

第９図（スケールで描かれず）は、ｐＥＨ４−２中のｇ
Ｄ−１遺伝子のアミン解読末端を再構成するための方法
を示し、そこでは、β−ガラクトシダーゼに融合された
ｇＤ−１タンパク質は、ｐＥＨ８２と形質転換された宿
主細胞によって発現される。Figure 9 (not drawn to scale) shows g in pEH4-2.
A method for reconstituting the amine-coding ends of the D-1 gene is presented, in which the gD-1 protein fused to β-galactosidase is expressed by a host cell transformed with pEH82.

、第１０図（スケールで描かれず）は、ｐＥＨ９０−１
０ａｍ，ｐＥＨ３−２５及びｐＨＫ４１４から導かれた
ｇＤ−１発現プラスミドの構成を示す。, Figure 10 (not drawn to scale) shows pEH90-1
The construction of the gD-1 expression plasmid derived from 0am, pEH3-25 and pHK414 is shown.

相換えプラスミド、ｐＥＨ９０−１０ａｍは、アンバ−
サブレッサーｔＲＮＡｓを含むＥ．コリ形質転換体中に
β−ガラクトシターゼと融合した及び非融合の両方のｇ
Ｄ−１を製造するためにある。The replacement plasmid, pEH90-10am, is an amber
E. coli containing subrespressor tRNAs. g both fused and unfused with β-galactosidase in coli transformants.
It is for manufacturing D-1.

第１１ａ図は、ＨＳＶ−２ゲノムを示し、また短い独特
な領域（Ｕｓ）内のＢａｌＩＩフラグメントの位置を示
し、そこには、ＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子（以下ｇＤ−２
遺伝子と称する）がある。Ｌフラグメントを規定りるＢ
ｇｌＩＩＩ制限サイトはＢｇとして示される。Figure 11a shows the HSV-2 genome and shows the location of the BalII fragment within a short unique region (Us), which contains the HSV-2 gD gene (hereinafter gD-2
There are genes (referred to as genes). B that defines the L fragment
The glIII restriction site is designated as Bg.

第１１ｂ図、ｐＨＶ１のＢｇｌＩＩＬフラグメントイン
サートの制限マップを示す。関係制限エンドヌクレアー
ゼ認識サイトのみを示す。制限酵素認識サイトは次よう
に略してある。Figure 11b shows a restriction map of the BglIIL fragment insert of pHV1. Only relevant restriction endonuclease recognition sites are shown. Restriction enzyme recognition sites are abbreviated as follows.

ＢａｍＨＩ（Ｂａ）：ＢｇｉＩＩ（Ｂｇ）：Ｃｌａｌ（
Ｃ）：ＨｉｎｇＩＩＩ（Ｈ３）：ＰｖｕＩＩ（Ｐｖ）：
ＳａｌＩ（Ｓａ）：ＳａｃＩ（Ｓｃ）：ＳｐｈＩ（Ｓｐ
）：ａｎｄ　ＸｈｏＩ（Ｘｈ）。太棒部（拡大された領
域は、ｇＤ−２ｍＲＮＡ解読配列の局在及び位置を示す
。BamHI (Ba): BgiII (Bg): Clal (
C): HingIII (H3): PvuII (Pv):
SalI (Sa): SacI (Sc): SphI (Sp
): and XhoI (Xh). Thick bar (enlarged area indicates localization and position of gD-2 mRNA decoding sequence.

第１１ｃ図はｐＨＶ２のＨＳＶ−２ＸｈｏＩ　ＤＮＡ　
フラグメント　インサートの制限のマツプを示す。Figure 11c shows HSV-2XhoI DNA of pHV2.
A map of fragment insert limitations is shown.

第１２図は、ｇＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列及びｇ
Ｄ−２タンパク質の予想アミノ酸配列を示す。適切な制
限サイトが示され、またｇＤ−２遺伝子のアミン解読末
端にある数のつけられた垂直な矢印は、組換えプラスミ
ドｐＨＶ５（ｇＤ−２の全カルボキシ解読末端を含む）
及びｐＨＶ６中のｐＪＳ４１３に対するｇＤ−２アミノ
解読末端の配位サイトを示す。ＢａｍＨＩサイトは、ｐ
ＨＶ６中のｐＨＫ４１４のＺ−遺伝子に対するｇＤ−２
カルボキシ解読末端の配位サイトである。Figure 12 shows the nucleotide sequence of the gD-2 gene and the gD-2 gene.
The predicted amino acid sequence of D-2 protein is shown. Appropriate restriction sites are indicated and the numbered vertical arrow at the amine-coding end of the gD-2 gene indicates the recombinant plasmid pHV5 (containing the entire carboxy-coding end of gD-2).
and the coordination site of the gD-2 amino-decoded end to pJS413 in pHV6. The BamHI site is p.
gD-2 against the Z-gene of pHK414 in HV6
This is the coordination site for the carboxy decoding terminus.

第１３図は、ｇＤ−１及びｇＤ−２の予想アミノ酸配列
の比較を示す。アミノ酸残分は、単一−文字コードによ
って示される。ｇＤ−１及びｇＤ−２中の同族のアミノ
酸残分は、ｇＤ−２配列中のダッシュにより示される。Figure 13 shows a comparison of the predicted amino acid sequences of gD-1 and gD-2. Amino acid residues are indicated by single-letter codes. Homologous amino acid residues in gD-1 and gD-2 are indicated by dashes in the gD-2 sequence.

ｇＤ−２配列は、ｇＤ−１配列より短い１つのアミノ酸
残分である。The gD-2 sequence is one amino acid residue shorter than the gD-1 sequence.

ｇＤ−２中の「紛失した（ｍｉｓｓｉｎｇ）」アミノ酸
は星印（＊）により示される。"Missing" amino acids in gD-2 are indicated by an asterisk (*).

第１４図（スケールの描かれず）は、ｐＨＶ５、即ちｇ
Ｄ−２遺伝子の一部から導かれる相換えブラスミド及び
ｐＪＳ４１３の構成を示す。組換えブラストｐＨＶ５は
、発現ベクトルから誘かれる。Figure 14 (not drawn to scale) shows pHV5, i.e. g
The construction of a reciprocal plasmid derived from a portion of the D-2 gene and pJS413 is shown. Recombinant blast pHV5 is derived from the expression vector.

「リーダー」配列（Ｃｒｏ）に対して配位されたｇＤ−
２解読配列の約９０％によりエンコードされたＨＳＶ−
２ｇＤ−関連タンパク質の製造を監督する。gD-coordinated to the “leader” sequence (Cro)
HSV- encoded by approximately 90% of the 2 decodable sequences.
Oversees the production of 2gD-related proteins.

第１５図は、ｐＨＶ６、即ちｐＨＶ５から導かれるｇＤ
−２発現プラスミドの構成を示し、そこでは、ｇＤ−２
解読配列の３′−末端の２５９のヌクレオチド（８６の
アミノ酸）が除かれ、Ｅ．コリのβ−ガラクトシダーゼ
プロティンのための発現プラスミドｐＨＫ４１４解読か
ら誘かれる約３．０００の附加ヌクレオチドによって置
換される。組換えプラスミドｐＨＶ６は、ｇＤ−２特定
タンパク質の各々の端に融合したＥ、コリ関連ポリペプ
チド（即ち、、Ｃｒｏ及びβ−ガラクトシダーゼ）を持
つ「サンドウィッチ」タンパク質の製造のためにある。Figure 15 shows pHV6, i.e. gD derived from pHV5.
-2 expression plasmid construction, in which gD-2
The 3'-terminal 259 nucleotides (86 amino acids) of the decoded sequence were removed, resulting in E. approximately 3,000 additional nucleotides derived from the expression plasmid pHK414 for the β-galactosidase protein of E. coli. Recombinant plasmid pHV6 is for the production of a "sandwich" protein with E, coli related polypeptides (ie, Cro and β-galactosidase) fused to each end of the gD-2 specific protein.

５、発明の説明 本発明は、ワクチン処方での免疫原として用いることの
できるＨＳＶタンパク質に関するポリペプチドを作る組
換えＤＮＡ技術に関する。特には、ｇＤ−関連タンパク
質の製造を記載する。ＨＳＶ−１ｇＤに対して関連する
多価抗血清は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方を中和
できるものであるから、純粋なｇＤタンパク質あるいは
その抗原的に重要な部分は、サブユニットワクチン中で
用いることができ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方の
第１次感染から受領体を効率的に保護しよう。5. DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to recombinant DNA technology for producing polypeptides related to HSV proteins that can be used as immunogens in vaccine formulations. In particular, the production of gD-related proteins is described. Since the polyvalent antiserum associated with HSV-1gD is capable of neutralizing both HSV-1 and HSV-2, pure gD protein or antigenically significant portions thereof may be used in subunit vaccines. can be used to effectively protect recipients from primary infection with both HSV-1 and HSV-2.

組換えプラスミドは、ここに記されるように構成されて
おり、ｇＤ−関連のポリペプチドであり、そして、宿主
細胞の減成に対して安定で抵抗性のあるタンパク質の宿
主細胞製造のために供する；このようプラスミドはｇＤ
−関連タンパク質あるいは、ｇＤの免疫学的そして抗原
性の決定因子を含む溶融タンパク質を大量に生成するこ
とを可能にゾる。しかしながら、ここに記したＤＮＡ組
成物は、ｇＤ−関連タンパク質の製造に限定されず、Ｈ
ＳＶタンパク質のいずれかに関連するポリペプチドの製
造に用いることができる。多種の免疫原及びワクチン処
方が製造できることが容易に分る。Recombinant plasmids are constructed as described herein and are gD-related polypeptides and are used for host cell production of proteins that are stable and resistant to host cell degradation. such a plasmid is provided with gD
- Enables the production of large quantities of fused proteins containing related proteins or immunological and antigenic determinants of gD. However, the DNA compositions described herein are not limited to the production of gD-related proteins;
It can be used to produce polypeptides related to any of the SV proteins. It is readily seen that a wide variety of immunogen and vaccine formulations can be produced.

本発明の詳細な説明の目的で次の階段に分けることがで
きる。即ち、（１）ＨＳＶ糖タンパク質遺伝子あるいは
遺伝子フラグメントの同定と単離、（２）クローン化発
現ベクトル中への遺伝子あるいは遺伝子フラグメントを
挿入し、単一細胞生体の形質転換に用いる組換えＤＮＡ
分子を形成すること、（３）遺伝子の複製及び発現ので
きる転換された単一細胞生体の同定と成長、（４）遺伝
子生成物の同定と精製、そして（５）遺伝子生成物免疫
性能を、中和抗体の製造を引き出すその能力を評価する
ことによって決定すること。全方法を明確にする目的で
、ｇＤ遺伝子に関して論じる。しかしながら、同じ技術
が、類似の形で、適用でき、ＨＳＶ糖タンパク質のいず
れかに関連するポリペプチドを同様に製造できる。For the purpose of detailed explanation of the invention, it can be divided into the following steps. (1) identification and isolation of the HSV glycoprotein gene or gene fragment; (2) insertion of the gene or gene fragment into a cloned expression vector and recombinant DNA used for transformation of a single cell organism;
(3) identification and growth of transformed single cell organisms capable of gene replication and expression; (4) identification and purification of the gene product; and (5) gene product immune performance. To be determined by evaluating its ability to elicit the production of neutralizing antibodies. For the purpose of clarifying the entire method, the gD gene will be discussed. However, the same technology can be applied in a similar fashion to similarly produce polypeptides related to any of the HSV glycoproteins.

５．１．ＨＳＶ糖タンパク賀遺伝子の同定と単離ＨＳＶ
糖タンパク質（ｇＤ）は、ＨＳＶタイプ１あるいは２の
株から得ることができる。ｇＤ遺伝子（あるいはその部
分）の単離は、ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを生成し及
び、糖タンパク質遺伝子配列を含むフラグメントを同定
するものである。同定の前に、ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメ
ントは、通常、クローン化ベクトルにくくられ、そのベ
クトルは宿主細胞の形質転換に用いられる：これがＨＳ
Ｖ　ＤＮＡフラグメントの多重複製の生成が可能にされ
、アンプル供給が、分析及び同定の操作のために可能と
なる。5.1. Identification and isolation of HSV glycoprotein gene HSV
Glycoprotein (gD) can be obtained from HSV type 1 or 2 strains. Isolation of the gD gene (or portion thereof) generates HSV DNA fragments and identifies fragments containing glycoprotein gene sequences. Prior to identification, HSV DNA fragments are usually packaged into a cloning vector and the vector is used to transform host cells: this
The generation of multiple copies of V DNA fragments is enabled, and ampoule supply is enabled for analysis and identification operations.

ＨＳＶ　ＤＮＡは、（１）ＤＮＡを直接的に、ウィルス
で感染した真核生物細胞から精製したウィルスから単離
することにより、あるいは（２）ｇＤ遺伝子を含むウィ
ルスゲノムの一部を含むバクテリオファージあるいはプ
ラスミドから得ることができる。HSV DNA can be obtained either (1) by isolating the DNA directly from virus purified from eukaryotic cells infected with the virus, or (2) by isolating the DNA from bacteriophages containing a portion of the viral genome, including the gD gene. It can be obtained from a plasmid.

ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを作るために、ＤＮＡは、
制限酵素を用いて特定の位置で解裂することができ；或
いは、変わりに、マンカンの存在下でＤナーゼ（ＤＮａ
ｓｅ）を用い、ＤＮＡを破片にする。即ち、ＤＮＡは、
例えば音波処理によって物理的に切断できる。線状ＤＮ
Ａフラグメントは、標準的技術によって、大きさに従い
分けることができ、その技術は、これに限定されないが
、アカロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
カラムクロマトグラフィを含む。To create HSV DNA fragments, the DNA is
Restriction enzymes can be used to cleave at specific positions; alternatively, Dnase (DNa
se) to fragment the DNA. That is, DNA is
For example, it can be physically cut by sonication. Linear DN
A fragments can be separated according to size by standard techniques including, but not limited to, acarose and polyacrylamide gel electrophoresis and column chromatography.

制限酵素或いは制限酵素の組合せを用い、ｇＤ配列を含
むＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを生成し、この場合酵素
はｇＤ逍遺伝生成物の免疫性能をこわさないものである
。例えば、タンパク質の抗原性サイトは約７〜１４のア
ミノ酸から成ることができる。従って、ｇＤの大きさの
タンパク質は多くの個別の抗原ナイトを右し得、可能的
には、数４の考えられる重なる配列、２次構造考察及び
処理方法例えば、アセチル化、グリコシル化或いはホス
ホリル化がある。従って、多くの部分的なｇＤ遺伝子配
列が抗原性サイトのため暗号解読をする。従って、多く
の制限酵素組合せをＤＮＡフラグメントを作るために用
い得、適切なベクトル中に挿入されると、単一細胞生体
中で、異なる抗原決定因子を有するｇＤ特定アミノ酸配
列を生成することを制御できるものである。Restriction enzymes or combinations of restriction enzymes are used to generate HSV DNA fragments containing gD sequences, where the enzymes do not disrupt the immunological performance of the gD-translated genetic product. For example, an antigenic site on a protein can consist of about 7 to 14 amino acids. Therefore, a protein of the size of gD may contain many individual antigens, potentially with several possible overlapping sequences, secondary structure considerations, and processing methods, such as acetylation, glycosylation, or phosphorylation. There is. Therefore, many partial gD gene sequences encode antigenic sites. Therefore, many restriction enzyme combinations can be used to create DNA fragments that, when inserted into appropriate vectors, control the generation of gD-specific amino acid sequences with different antigenic determinants in a single cell organism. It is possible.

これらの組換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換は
、ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを伴ない、ウィルスＤＮ
Ａの多重複製の生成を可能にし、それは、ｇＤ遺伝子配
列を含むフラグメントを同定するため分析され得る。ク
ローニングベクトル中へＨＳＶ　ＤＮＡ制限フラグメン
トを挿入することは、クローン化ベクトルが相補的接合
端を有する場合、容易に達成される。しかしながら、Ｈ
ＳＶ　ＤＮＡを切るために用いた相補的制限サイトがク
ローン化ベクトル中に存在しないとき、ＨＳＶＤＮＡの
端部或いはクローン化ベクトルを修飾することができる
。このような修飾は、単一鎖のＤＮＡ終端を逆に消化す
ることにより、また単一鎖の終端を充填していくことに
よる鈍な端を作ることを含み、そねにより、端は鈍な端
に配位され得るようになる。或いは、代替して、望まし
いサイトがヌクレオチド配列（リンカー：結合剤）をＤ
ＮＡ終端上に配位せしめることにより作られ得、これら
の配位されたリンカーは、制限酵素認識配列をエンコー
ドする特定の科学的に合成されたオリゴヌクレオチトを
有し得る。他の方法に従うと、開裂されたベクトル及び
ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントは、ホモポリテックス（均
一重合の）ティリングによって修飾され得る（検討のた
め、Ｍｏｒｒｏｗ、１９７９：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ　６８：３参照〉。Transformation of host cells with these recombinant DNA molecules involves HSV DNA fragments and viral DNA
allows the generation of multiple copies of A, which can be analyzed to identify fragments containing gD gene sequences. Insertion of HSV DNA restriction fragments into a cloning vector is easily accomplished if the cloning vector has complementary junctions. However, H
The ends of the HSV DNA or the cloning vector can be modified when the complementary restriction sites used to cut the SV DNA are not present in the cloning vector. Such modifications include creating blunt ends by back-digesting single-stranded DNA ends and by filling in single-stranded ends; It can now be positioned at the edge. Alternatively, the desired site may link the nucleotide sequence (linker) to
These coordinated linkers can have specific chemically synthesized oligonucleotides encoding restriction enzyme recognition sequences. According to other methods, cleaved vectors and HSV DNA fragments can be modified by homopolytic tilling (for review, see Morrow, 1979: Methods in
See Engymology 68:3>.

ｇＤ遺伝子を含む特定ＤＮＡフラグメントの同定は、多
くの方法によってなされ得る。第１にウィルスＤＮＡフ
ラグメントを配列すること（ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒ
ｔ，１９８０、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｇｙｍｏｌ
ｏｇｙ　６５：４９９）そして、次に、予想されたアミ
ノ酸配列を、ｇＤプロティンのアミノ酸配列と比較する
ことに基づいてｇＤ遺伝子配列を含むフラグメントを同
定することが可能である。第２に、ｇＤ遺伝子を含むフ
ラグメントをｍＲＮＡ選択によって同定できる。ＨＳＶ
　ＤＮＡフラグメントは、交雑化（ハイブリッド化）に
よる相補性ｍＲＮＡを単離するために用いられる。単離
されたｍＲＮＡの試験管内翻訳生成物を免疫沈降分析す
ることにより、ｍＲＮＡを同定し、従ってｇＤ遺伝子配
列を含む補正ＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを同定する。Identification of the specific DNA fragment containing the gD gene can be done in a number of ways. First, sequencing the viral DNA fragments (Maxam and Gilbert
t, 1980, Methods in Engymol
ogy 65:499) and then it is possible to identify fragments containing the gD gene sequence based on comparing the predicted amino acid sequence with the amino acid sequence of gD protein. Second, fragments containing the gD gene can be identified by mRNA selection. HSV
The DNA fragments are used to isolate complementary mRNAs by hybridization. Immunoprecipitation analysis of isolated mRNA in vitro translation products identifies the mRNA and thus the corrected HSV DNA fragment containing the gD gene sequence.

最後にｇＤ−特定ｍＲＮＡは、ＨＳＶ−感染細胞から単
離されたポリソームを、ｇＤに対して指向の免疫化モノ
クローン抗体に吸着せしめることによって選択できる。Finally, gD-specific mRNA can be selected by adsorbing polysomes isolated from HSV-infected cells to immunizing monoclonal antibodies directed against gD.

放射標識された（ラジオラベルされた）ｇＤ−ｍＲＮＡ
或いはｃＤＮＡは、鋳型として、選択されたｍＲＮＡ（
吸着されたポリソームから）を用いて合成することがで
きる。ラジオラベルされたｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡは、
ｇＤ−配列を含むＨＳＶ　ＤＮＡフラグメントを同定す
るプルーブとして用いることができる。（Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ，１９７５；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８．５０３
：Ａｌｗｉｅら，１９７９；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｇｙｍｏｌｏｇｙ、６８：２２０）。Radiolabeled gD-mRNA
Alternatively, the cDNA can be used as a template for the selected mRNA (
(from adsorbed polysomes). Radiolabeled mRNA or cDNA is
It can be used as a probe to identify HSV DNA fragments containing gD-sequences. (South
rn, 1975; J. Mol. Biol. 98.503
: Alwie et al., 1979; Methods in E
ngymology, 68:220).

ｇＤ遺伝子の単離の代替法には、それに限定されないが
、遺伝子配列自体を化学的に合成すること〈配列が分っ
ている場合）或いは、ｇＤ遺伝子をエンコードするｍＲ
ＮＡに対してｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を作ることがある
。Alternatives to isolating the gD gene include, but are not limited to, chemically synthesizing the gene sequence itself (if the sequence is known) or mR encoding the gD gene.
cDNA (complementary DNA) may be made for NA.

これを達成するために、ｇＤに特定のｍＲＮＡをウィル
ス感染細胞から単離する。標準的技術によって単離され
たｍＲＮＡを次に、ｃＤＮＡ複製に変換し、そしてクロ
ーン化ベクトルに直接に挿入する。To accomplish this, gD-specific mRNA is isolated from virus-infected cells. The isolated mRNA by standard techniques is then converted into a cDNA copy and inserted directly into a cloning vector.

単離された遺伝子、ＤＮＡ或いは合成されたＤＮＡを伴
なう組換えＤＮＡ分子により宿主細胞を形質転換するこ
とは、遺伝子の多重複製を可能にする。従って、遺伝子
は、形質転換体を成長せしめ、組換えＤＮＡ分子を、そ
の形質転換体より単離し、そして、単離された組換えＤ
ＮＡから挿入された遺伝子を取り戻りことによってマイ
クログラムの量で得ることができる。或いは代替して、
ｇＤ遺伝子のマイクログラム量は、ｇＤ遺伝子源から、
例えば、感染された動物細胞中のヘルペスシンプレック
スウィルス或いは組換えプラスミド中のウィルス遺伝子
を含むバクテリヤ或いはファージから得ることができる
。ウィルスあるいはプラスミドＤＮＡを単離し、フラグ
メント化し、分割（フラクション）化し、そしてサイズ
（大きさ別に）にするのは、遺伝子の位置決め（局在下
）に用いられると同じ方法で行う。Transformation of host cells with recombinant DNA molecules with isolated genes, DNA or synthesized DNA allows multiple replications of the genes. Therefore, the gene allows the transformant to grow, the recombinant DNA molecule to be isolated from the transformant, and the isolated recombinant D
By retrieving the inserted gene from the NA, it can be obtained in microgram quantities. Or alternatively,
Microgram amounts of the gD gene are obtained from the gD gene source,
For example, it can be obtained from the herpes simplex virus in infected animal cells or from bacteria or phages containing viral genes in recombinant plasmids. Viral or plasmid DNA is isolated, fragmented, fractionated, and sized using the same methods used to localize genes.

５．２．ＨＳＶ等タンバク質遺伝子のクローニング発現
ベクトルへの挿入 単離されると、ｇＤ逍遺伝或いは遺伝子フラグメントは
、適切な発現ベクトル中へ、即ち、挿入された遺伝子の
転写及び翻訳のための必要な要素を含むベクトル中へ、
挿入される。（ロバーツ及びラウエル：Ｒｏｂｅｒｔｓ
、Ｌａｕｅｒ、１９７９、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８：４７３を参照）。5.2. Cloning of protein genes such as HSV Insertion into expression vectors Once isolated, the gD gene or gene fragment contains the necessary elements for transcription and translation of the inserted gene into an appropriate expression vector. into the vector,
inserted. (Roberts and Rawell)
, Lauer, 1979, Methods in En.
Zymology, 68:473).

ｇＤ遺伝子（或いはその遺伝子の一部）の効率的な発現
を得るために、プロモータが発現ベクトル中に存在しな
ければならない。ＲＮＡポリメラーゼは、正常にはプロ
モータに結合し、遺伝予或いは結合された遺伝子の群及
び調節要素、（オペロンと称す）の転写を開始せしめる
。プロモータは、その「強度」即ち、転写を促進する能
力が変わる。In order to obtain efficient expression of the gD gene (or part of the gene), a promoter must be present in the expression vector. RNA polymerase normally binds to promoters and initiates transcription of genetic components or groups of linked genes and regulatory elements (termed operons). Promoters vary in their "strength" or ability to promote transcription.

分子クローン化の目的のために、転写の高レベルを得る
ため、従って、遺伝子発現を得るために、より強いプロ
モータを用いることが望ましい。For purposes of molecular cloning, it is desirable to use stronger promoters in order to obtain high levels of transcription and therefore gene expression.

利用した宿主細胞系に依存して、多くの適当なプロモー
タの一つを用い得る。例えば、Ｅ．コリ宿主細胞系中で
のクローン化の場合、Ｅ、コリ、そのバクテリオファー
ジ或いはプラスミドから単離したプロモータを用いるこ
とができる。（例えはラク（ｌａｃ）プロモータ）。更
に、組換えＤＮＡ或いは他の合成ＤＮＡ技術によって作
られたＥコリ　プロモータは、挿入された遺伝子の転写
のため供するために用い得る。更に特には、コリファー
ジラムダのＰＲ及びＰＬプロモータは、隣接のＤＮＡセ
グメントの転写の高いレベルを指向している。更に、Ｅ
．コリからのｒｅｃＡプロモータは、隣接フラグメント
の遺伝子転写の高いレベルの為に供する。Depending on the host cell system utilized, one of many suitable promoters may be used. For example, E. For cloning in E. coli host cell systems, promoters isolated from E. coli, its bacteriophages or plasmids can be used. (For example, the lac promoter). Additionally, E. coli promoters made by recombinant DNA or other synthetic DNA techniques can be used to provide for the transcription of inserted genes. More specifically, the PR and PL promoters of coliphage lambda direct high levels of transcription of adjacent DNA segments. Furthermore, E
．． The recA promoter from E. coli provides for high levels of gene transcription of flanking fragments.

特定の開始信号もまた、原核生物及び真核生物の細胞中
での効率的な遺伝子転写及び翻訳のために必要である。Specific initiation signals are also required for efficient gene transcription and translation in prokaryotic and eukaryotic cells.

これらの転写及び翻訳開始信号は、各々遺伝子特定メッ
センジャＲＮＡ及び合成されたタンパク質の最によって
測られたものとしての「強度」変えることができる。プ
ロモータを含むＤＮＡ発現ベクトルは、種々の「強い」
転写及び／又は翻訳開始信号のいかなる結合も含み得る
。These transcription and translation initiation signals can vary in "strength" as measured by the amount of gene-specific messenger RNA and synthesized protein, respectively. DNA expression vectors containing promoters are available in a variety of "strong"
It may include any combination of transcription and/or translation initiation signals.

従って、宿主細胞リポソームにより利用できるいかなる
ＳＤ−ＡＴＧ結合用い得る。：このような結合は、制限
されないが、コリファージラムダのｃｒｏ遺伝子或いは
Ｎ−遺伝子から、或いはＥ．コリ　トリプトファンＥ．
Ｄ．Ｃ．Ｂ或いはＡ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧ結合を含
む。更に、組換えＤＮＡ或いは他の合成技術によって作
られるいかなるＳＤ−ＡＴＧ結合も用いうる。Thus, any SD-ATG linkage available to host cell liposomes may be used. : Such linkage may be from, but is not limited to, the cro gene or N-gene of coliphage lambda, or from E. coliphage lambda. coli tryptophan E.
D. C. Contains an SD-ATG bond from the B or A gene. Additionally, any SD-ATG linkage made by recombinant DNA or other synthetic techniques may be used.

ＤＮＡフラグメントをベクトル中に挿入するために上記
の方法のいずれかも、用い得、プロモータ及び他のコン
トロール要素とベクトル内の特定サイト中に配位する。Any of the methods described above may be used to insert the DNA fragment into the vector, coordinating the promoter and other control elements into specific sites within the vector.

従って、ｇＤ−遺伝子（或いはその一部）を、ベクトル
プロモータ及びコントロール要素との関係において特定
のサイトに発現ベクトル中に配位できる、それにより、
ｇＤ遺伝子配列は、ベクトルＡＴＧ配列に関して正しい
翻訳読とりフレーム中（即ち、相中に）にあるようにな
る。或いは、代替して、ｇＤＡＴＧ或いは合成ＡＴＧを
用いうる。得られた組換えＤＮＡ分子を次に、形質転換
、形質導入或いはトランスフェクションにより（ベクト
ル／宿主細胞システムに依存して）適切な宿主細胞中に
導入する。形質転換体は、ｐＢＲ３２２中のアンピシリ
ン耐性或いはトテラサイクリン耐性或いは真核生物宿主
システム中のチミジンキナーゼ活性のごとき、ベクトル
中に通常に存在する適切な遺伝子マーカーの発現に基づ
いて選択される。このようなマーカータンパク質の発現
は、組換えＤＮＡ分子は、無傷であり、また複製するも
のである。通常マーカー機能を含む発現ベクトルには、
限定されないが、次のベクトル或いはその誘導体がある
：ＳＶ４０及びアデノウィルスベクトル、イースト　ベ
クトル、バクテリオファージ　ベクトル、例えば、ラム
ダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、チャロン（Ｃｈａｒｏｎ）
２８，チャロン４Ａ，ラムダｇｔ−１−ラムダＢｃ、ラ
ムダｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ７，Ｍ１３ｍｐ８
，Ｍ１３ｍｐ９或いはプラスミドＤＮＡベクトル、例え
ばｐＢＲ３２２，ｐＡｃ１０５，ｐＶＡ５１，ｐＡＣＹ
１７７，ｐＫＨ４７，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＢ１１０
，ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９，ｐＢＲ３２５，Ｃｏｌ　Ｅ
１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ２１，ＲＳＦ
２１２４．ｐＣＲ１或いはＲＰ４がある。Thus, the gD-gene (or a portion thereof) can be positioned in an expression vector at a specific site in relation to the vector promoter and control elements, thereby
The gD gene sequence will be in the correct translational reading frame (ie, in phase) with respect to the vector ATG sequence. Alternatively, gDATG or synthetic ATG may be used. The resulting recombinant DNA molecule is then introduced into a suitable host cell by transformation, transduction or transfection (depending on the vector/host cell system). Transformants are selected based on the expression of appropriate genetic markers normally present in the vector, such as ampicillin resistance or toteracycline resistance in pBR322 or thymidine kinase activity in eukaryotic host systems. Expression of such marker proteins ensures that the recombinant DNA molecule remains intact and replicates. Expression vectors containing marker functions typically include:
Examples include, but are not limited to, the following vectors or derivatives thereof: SV40 and adenovirus vectors, yeast vectors, bacteriophage vectors, such as lambda gt-WES-lambda B, Charon.
28, Charon 4A, Lambda gt-1-Lambda Bc, Lambda gt-1-Lambda B, M13mp7, M13mp8
, M13mp9 or plasmid DNA vectors such as pBR322, pAc105, pVA51, pACY
177, pKH47, pACYC184, pUB110
, pBR322, pMB9, pBR325, Col E
1, pSC101, pBR313, pML21, RSF
2124. There is pCR1 or RP4.

本発明の実施例に用いた発現ベクトルは、米国特許出願
番号箱４４９．１８７号（１９８２年１２月１３日出願
）により詳細にあり、これはここで参考によって含有さ
れる。The expression vectors used in the examples of the present invention are more fully described in US Patent Application No. Box 449.187, filed Dec. 13, 1982, which is incorporated herein by reference.

更に、宿主細胞株は、特に導入されないプロモータの作
用を抑制しないように選択され得る。この方法において
、９５％以上のベクトルのプロモータの効果性は、非導
入細胞中で抑制され得る。Furthermore, host cell lines can be chosen so as not to suppress the action of promoters that are not specifically introduced. In this way, more than 95% of the promoter efficiency of the vector can be suppressed in non-transfected cells.

あるオベロンにおいて、特定の導入者の添加は、挿入Ｄ
ＮＡの効率的な転写及び翻訳のために必要であり；例え
ばｌａｃオペロンを、ラクトース或いはＩＰＴＧ（即ち
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の添加によ
って導入する。他のオベロン、ｔｒｐ、ｐｒｏなどのの
種々は、異なるコントロール下にある。トリプトファン
が成長媒体中にない時に、ｔｒｐオベロンが導入される
。温度センシフィブ　ラムダ　レプレッサ　プロティン
、例えばＣＩ８５７も含む宿主細胞中で温度の上昇によ
って、ラムダのＰＬプロモータを導入する。従って、遺
伝的に加工されたｇＤタンパク質の発現が制御さね得る
。これは、クローン化された遺伝子のタンパク質生成物
が、宿主細胞に致死である場合に重要である。このよう
な場合において、外部の遺伝子が複製され得るが、形質
転換体の成長の間に発現されない。細胞が成長媒体中で
適当な密度に達した後に、プロモータはタンパク質の生
産のために導入され得る。In one Oberon, the addition of a particular introducer is insertion D
Necessary for efficient transcription and translation of NA; for example, the lac operon is introduced by addition of lactose or IPTG (ie isopropylthio-β-D-galactoside). A variety of other oberons, trp, pro, etc., are under different controls. Trp Oberon is introduced when tryptophan is not in the growth medium. The PL promoter of lambda is introduced by increasing temperature in a host cell that also contains a temperature sensitive lambda repressor protein, such as CI857. Therefore, the expression of genetically engineered gD proteins may be uncontrolled. This is important if the protein product of the cloned gene is lethal to the host cell. In such cases, the foreign gene may be replicated but not expressed during growth of the transformant. After the cells reach a suitable density in the growth medium, the promoter can be introduced for protein production.

上記の如き構成されたプラスミドにより形質転換されて
、細胞中に生成されたｇＤ−関連タンパク質（即ち、天
然ｇＤ翻訳終止信号において終止するｇＤ−関連タンパ
ク質の発現を指向し、そしてベクトル、ｇＤ遺伝子或は
合成配列によって供されてＡＴＧにおいて開始するプラ
スミド）は、以下、非融合ｇＤ−タンパク質域は非融合
ｇＤ関連タンパク質と称する。The vector, the gD gene or The non-fused gD-protein region is hereinafter referred to as non-fused gD-related protein.

５．３．融合タンパク質の製造 特定の形質転換体中の遺伝子発現レベルを最大にするた
めに、問題の遺伝子を、宿主細胞タンパク質の如き遺伝
子エンコーディング（暗号作成）の他のタンパク質に分
けることが望まれ得る。宿主細胞タンパク質は、本来、
検定できる機能を含む場合に、付加的長所が得られる。5.3. Production of Fusion Proteins To maximize the level of gene expression in a particular transformant, it may be desirable to separate the gene of interest into other proteins, such as host cell proteins, that are genetically encoded. Host cell proteins are naturally
Additional advantages are obtained when including functionality that can be tested.

配位された遺伝子の発現により、その大きな分子量及び
検定機能に基づいて同定できる融合タンパク質生成物（
以下、ｇＤ融合タンパク質と称する）が得られる。例え
ば、ｇＤ／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生産
は、Ｅ．コリ宿主中のｇＤのクローン化及び発現のため
にいくつかの長所を供与している。第１に、これにより
、Ｍｉｌｌｅｒの方法に従い（第４７〜５３頁および３
５２〜３５５頁、Ｅｘｐｒｅｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ
ｌｅｃｔａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，
Ｎ．Ｙ．１９７２）β−ガラクトシダーゼ活性のために
特定の比色定量検定を用いて、ベクトルによって指向さ
れたタンパク質生産（従って、発現）のレベル近似が可
能となる。第２に融合タンパク質生産は、タンパク質生
成物の同定及び単離を単純化する。Ｅ．コリ形質生成物
により作られた非融合ｇＤタンパク質は、ｇＤ／β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質よりも小さく、このため
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析さ
れたいくつかの他の宿主タンパク質によって共泳動する
。しかしながら、作られた融合タンパク質は、容易に検
出でき、そしてその独特な大きな分子量に依存して、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
）によって同定できる。Expression of the coordinated genes results in a fusion protein product that can be identified based on its large molecular weight and assay capabilities (
(hereinafter referred to as gD fusion protein) is obtained. For example, production of gD/β-galactosidase fusion proteins can be performed using E. The cloning and expression of gD in the E. coli host offers several advantages. First, this allows us to follow the method of Miller (pages 47-53 and 3).
Pages 52-355, Experiments in Mo
lectar Genetics, Cold Spri
ng Harbor Press, New York,
N. Y. (1972) uses a specific colorimetric assay for β-galactosidase activity, allowing for approximation of the level of vector-directed protein production (and thus expression). Second, fusion protein production simplifies the identification and isolation of protein products. E. The unfused gD protein produced by the E. coli product is smaller than the gD/β-galactosidase fusion protein and therefore co-migrate with several other host proteins analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. However, the created fusion proteins are easily detectable and, depending on their uniquely large molecular weight, S
DS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE
) can be identified.

本発明は、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の生産
に限られなく：真核生物のあるいは原核生物の源のいず
れでの遺伝子も、ｇＤ−遺伝子、（あるいはＨＳＶタン
パク質遺伝子）との相の中に配位でき、β−ガラクトシ
ダーゼ融融合タンパク主生成物同様な長所を供する。限
られないが、実施例は、ガラクキナーゼ：ｔｒｐＤ、Ｅ
あるいはリーダー、ビリ線毛遺伝子、及び真核生物の遺
伝子、例えば、チミジンキナーゼ、β−グロビン、ＳＶ
−４０Ｔ−抗原あるいはロスサルコマ（Ｒｏｕｓ　Ｓａ
ｒｃｏｍａ）ウィルス形質転換遺伝子を含む。The invention is not limited to the production of β-galactosidase fusion proteins: genes of either eukaryotic or prokaryotic origin can be co-ordinated in phase with the gD-gene (or HSV protein gene). and offers similar advantages to β-galactosidase fusion protein-based products. Examples include, but are not limited to, galackinase: trpD, E
or leaders, biliary genes, and eukaryotic genes such as thymidine kinase, β-globin, SV
-40T-antigen or Rous Sa
rcoma) virus transforming gene.

融合タンパク質をエンコードする遺伝子を構成するため
に、２つの遺伝子を、その解読（コード化）配列内に接
合し、それにより、翻訳読取りフレームが保持され、そ
して、終止信号によって妨害されないものでなければな
らない。また、以前に説明したように、宿主細胞が、プ
ロモータの作用を抑制する株である場合、融合タンパク
質は、導入に応答してのみ生産されるものである。To construct a gene encoding a fusion protein, two genes must be joined within their coding sequences so that the translational reading frame is maintained and is not interrupted by a termination signal. No. Also, as previously explained, if the host cell is a strain that suppresses the action of the promoter, the fusion protein will only be produced in response to introduction.

５．４．遺伝子生成物の同定 正しいＤＮＡ構成を含む形質転換体が同定されると、組
換えＤＮＡ　ｇＤ遺伝子生成物の免疫活性及び抗原性の
分析か必要である。宿主細胞は、天然にあるＨＳＶ−ｇ
Ｄと同じパターンでｇＤ遺伝子成物のグリコシル化が可
能でないと、ｇＤ遺伝子生成物は天然ｇＤ糖タンパク質
と異なる。従って、免疫学約分析は、ｇＤ遭遺転子成物
のために特に重要である。何故ならば、究極のゴールは
、ワクチン処方中で生成されたｇＤ関連タンパク質を用
いることである。免疫活性の分析は、ＨＳＶ感染細胞の
ｇＤ糖タンパク質に対して関連する抗血清を用いて最も
容易に行われ、抗原性はｇＤ遺伝子生成物への免疫性に
応答して展間する。5.4. Identification of the Gene Product Once transformants containing the correct DNA composition have been identified, analysis of the immunoreactivity and antigenicity of the recombinant DNA gD gene product is necessary. The host cell is a naturally occurring HSV-g
The inability to glycosylate the gD gene product in the same pattern as D differs from the native gD glycoprotein. Therefore, immunological analysis is particularly important for gD trochanteric products. Because the ultimate goal is to use gD-related proteins produced in vaccine formulations. Analysis of immune activity is most easily performed using relevant antisera against the gD glycoprotein of HSV-infected cells, and antigenicity develops in response to immunity to the gD gene product.

種々の抗血清が、全ウィルスあるいは、特別のｇＤに対
して指向の多価抗体製造を含む免疫活性を分析するため
に入手できる。ｇＤタンパク質分子上の１つの抗原サイ
トのみを認識するモノクローン化抗体を用いることによ
り、大きな特定性を得る。ｇＤに対して指向の種々のモ
ノクローン抗体が存在し、そのいくつかは、ＨＳＶ−１
及びＨＳＶ−２のｇＤ遺伝子生成物を特定的に免疫沈降
せしめないが、どれらのウィルスの感染性も中和する。A variety of antisera are available for analysis of immune activity, including production of multivalent antibodies directed against whole viruses or against specific gDs. Great specificity is obtained by using monocloned antibodies that recognize only one antigenic site on the gD protein molecule. There are various monoclonal antibodies directed against gD, some of which are directed against HSV-1
and does not specifically immunoprecipitate the gD gene product of HSV-2, but neutralizes the infectivity of either virus.

したがって、本発明に述べたタンパク質の同定は、２の
要件に基づく。第１に、ｇＤ−関連タンパク質は、プロ
モータの導入に応答してのみ作られるべきである。第２
にｇＤ−関連タンパク質は、ＨＳＶに対して指向の種々
のポリクローン抗体あるいはｇＤに対して指向のモノク
ローン抗体を用いて免疫反応性であるべきである。タン
パク質は、全遺伝子配列の発現、遺伝子配列の一部ある
いは、融合タンパク質の生産に指向するために配位され
る２以上の遺伝子配列からのいずれから得る場合でも、
免疫反応性であるべきである。この反応性は、標準的免
疫学的技術により、例えば免疫沈降、免疫拡散、放射−
免疫競合、免疫電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離され、次にニトロセルロース上に
移されたタンパク質の免疫学的検出により示され得る。Therefore, the identification of the proteins mentioned in the present invention is based on two requirements. First, gD-related proteins should only be made in response to the introduction of a promoter. Second
gD-related proteins should be immunoreactive using various polyclonal antibodies directed against HSV or monoclonal antibodies directed against gD. The protein may be obtained either from expression of the entire gene sequence, from a portion of the gene sequence, or from two or more gene sequences coordinated to direct the production of a fusion protein.
Should be immunoreactive. This reactivity can be determined by standard immunological techniques, e.g. immunoprecipitation, immunodiffusion, radio-
It can be demonstrated by immunological detection of proteins separated by immunocompetition, immunoelectrophoresis or polyacrylamide gel electrophoresis and then transferred onto nitrocellulose.

５．５．遺伝子生成物の精製 ｇＤ遺伝子（或はいかなるＨＳＶ糖タンパク質遺伝子も
）を含む細胞は、大容量で生長され、そしてプロモータ
導入後作られたプロティンは、そのような細胞から、或
はタンパク質が***されるとき、その媒体から単離され
る。タンパク質は、イオン交換、親和力或ザイシング樹
脂を含む標準的クロマトグラフィにより、遠心力により
、或いはタンパク質の精製のための他の標準的技術によ
って単離され、そして精製され得る。5.5. Purification of the Gene Product Cells containing the gD gene (or any HSV glycoprotein gene) are grown in large quantities and the protein produced after introduction of the promoter is removed from such cells or the protein is excreted. When it is isolated from the medium. Proteins can be isolated and purified by standard chromatography, including ion exchange, affinity or Zysing resins, by centrifugation, or other standard techniques for protein purification.

ある融合タンパク質が、細胞中に過剰に作られた時及び
溶液中に作られたときに、アグリゲートを作るので、タ
ンパク質を作るアグリゲートを単離する方法は、本発明
で作られた融合プロティンの単離に特に有用である。こ
れらの融合タンパク質を次に、ワクチン処方に用いるこ
とができる。When a certain fusion protein is produced in excess in cells or in solution, it forms aggregates, so the method for isolating protein-forming aggregates is based on the fusion protein produced in the present invention. It is particularly useful for the isolation of These fusion proteins can then be used in vaccine formulations.

融合タンパク質の精製（以下、アグリゲート精製と称す
る）は、細胞の***と、次いでのアゲリグ−ト物質の洗
滌による、アグリゲート形成タンパク貿の抽出、分離及
び／或は精製を含むものである。更に、アグリゲート物
質は、強い水素アクレプターと強い水素ドナーの両方の
溶媒（これらの性質の１つを各々含む溶媒の組合せ〉を
添加することによって溶解化でき、アグリゲート形成タ
ンパク質を次に、適合バッファーによる希釈によって沈
降化する。適合なタンパク質溶媒には、限られないが、
尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約
８０％容量／容量比基準）及びグアニジン塩化水素塩（
約４Ｍ〜約８Ｍ）がある。Purification of fusion proteins (hereinafter referred to as aggregate purification) involves the extraction, separation and/or purification of the aggregate-forming protein material by cell division and subsequent washing of the aggregation material. Additionally, the aggregate material can be solubilized by adding both a strong hydrogen acceptor and a strong hydrogen donor solvent (a combination of solvents each containing one of these properties), and the aggregate-forming proteins are then Precipitate by dilution with buffer. Compatible protein solvents include, but are not limited to:
Urea (about 4M to about 8M), formamide (on a volume/volume basis of at least about 80%) and guanidine hydrochloride (
There are approximately 4M to approximately 8M).

アクリゲート（凝集物）形成タンパク質を溶解化できる
いくつかの溶媒、例えば、ＳＤＳ（ナトリウムドテシル
サルフェート）、７０％蟻酸は、この処理法用には不適
である。何故ならば、溶解されたアグレゲート形成タン
パク質と次に沈降せしめるときに、効率的でないことが
示されたからである。グアニジン塩化水素塩及び他の同
様な試薬は、変性剤であるが、研究により、この変性は
、不可逆でないこと及び再生は除去しても（例えば、透
析により）或は変性剤を希釈しても生じ得ることが示さ
れ、免疫学的に及び／或は生物学的に活性なタンパク質
の再形成ができる。Some solvents that can solubilize acrylate-forming proteins, such as SDS (sodium dotecyl sulfate), 70% formic acid, are unsuitable for this treatment method. This is because it has been shown to be inefficient when subsequently precipitated with dissolved aggregating proteins. Guanidine hydrochloride and other similar reagents are denaturing agents, but studies have shown that this denaturation is not irreversible and that regeneration is possible even after removal (e.g., by dialysis) or dilution of the denaturant. It has been shown that immunologically and/or biologically active proteins can be reformed.

融合タンパク質単離技術の１つの具体例は、次の如く概
略される（以下において、非変性のアグレゲート精製処
理と称される）。One specific example of a fusion protein isolation technique is outlined as follows (hereinafter referred to as a non-denaturing aggregate purification process).

細胞ベレット（沈降物）を、ドライアス／メタノールを
用いてすばやく凍結し、重量を測り、そして３〜４ｇの
細胞を少なくとも２５ｍｌのバッファ溶液（例えば、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン塩化水索塩）、ｐＨＢ、０、２ｍＭ　ＥＤＴＡ〈
エチレンジアミンテトラ酢酸）及び２００ｍＭＮａＣｌ
）中に再懸濁する。即ち、細胞は、バッファ溶液中に約
１００〜２００ｇの細胞／ｌの近似濃度で懸濁されてい
る。約１６０ｇ／１以下の濃度が好適である。この懸濁
物に、リソチームを、約１３０μｇ／ｍｌの最終濃度に
添加し、そして、選られた混合物を、４℃に２０分間、
時々振とうしながら保持する。ノニデト（Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ）Ｐ４０（ＮＰ−４０，Ｓｈｅｌｌ社商標，ポリオキ
シエチレン（９〉ｐ−ｔｅｒｔ　オクチルフェール）、
膜を溶解化するために用いる非イオン性洗滌剤を、約０
．１％の最終濃度にまで添加し、そして溶液を混合する
。The cell pellet (sediment) is quickly frozen using Dryas/methanol, weighed, and 3-4 g of cells are added to at least 25 ml of buffer solution (e.g.
0mM Tris-HCl (Trishydroxymethylaminomethane chloride salt), pHB, 0, 2mM EDTA
ethylenediaminetetraacetic acid) and 200mM NaCl
). That is, the cells are suspended in a buffer solution at an approximate concentration of about 100-200 g cells/l. Concentrations of about 160 g/1 or less are preferred. To this suspension, lysozyme was added to a final concentration of approximately 130 μg/ml and the selected mixture was incubated at 4° C. for 20 min.
Hold while shaking occasionally. Nonide
t) P40 (NP-40, Shell Company trademark, polyoxyethylene (9>p-tert octyl phere),
The nonionic detergent used to solubilize the membrane was
．． Add to a final concentration of 1% and mix the solution.

次に、懸濁物を約１分間、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏ
ｎ）粉砕器（Ｂｒｉｎｋｍｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ，　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）或は等何物を用い
て粉砕する。The suspension was then heated in a Polytron for approximately 1 minute.
n) Brinkmon Instrument
s, Westbury, N.S. Y. ) or the like.

懸濁物を、８．０００×ｇ、３０分間延伸分離し、そし
てベレット〈沈降物）を洗滌バッファ、例えば２ｍＭト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５
０ｍＭＮａＣｌ及び２％ト リトン−Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ
−Ｘ）１００（ポリオキシエチレン（９−１０’）ｐ−
ｔｅｒｔ−オクチルフェノール、非イオン性洗浄剤）、
中に再懸濁し、そして、ポリトロン粉砕器によって粉砕
する。遠心分離、洗滌及び粉砕のこの工程は、更にベレ
ットを洗浄するために、そして出来るだけ細胞残層を除
くために繰り返すことができる。The suspension was stretched at 8.000 x g for 30 min and the pellet was washed with a washing buffer, e.g. 2mM Tris-HCl (pH 7.2), 1mM EDTA, 15
0mM NaCl and 2% Triton-X (Triton-X)
-X) 100 (polyoxyethylene (9-10') p-
tert-octylphenol, nonionic detergent),
and grind with a Polytron grinder. This step of centrifugation, washing and trituration can be repeated to further wash the pellet and to remove as much cell debris as possible.

あるいは、代替して、アクリゲートのベレツトは、更に
変性剤の添加によって、以下の如く処理することができ
る。（以下において、変性アグレゲート精製処理と称す
る。）。懸濁物を遠心分離し、上澄みを完全に除き、そ
してべレットを６Ｍグアニジン塩化水素塩（然溜水中）
の約１／５量の中再慰濁する。例えは、２５ｍｌのバッ
ファに洗浄した３ｇの細胞は、この工程において５ｍｌ
の６Ｍグアニジン塩化水素塩溶液中に再懸濁すべきであ
る。この段において、ベレットを再懸濁することは困難
であり、そして音波処理あるいは均質化か、均質溶液を
得るために必要であろう。溶液は、２２℃に２０分間放
置され、次に８０００ｘｇで３０分間遠心分離され、汚
物を除き、この点で融合タンハク質を含む上澄みを取る
。Alternatively, the acrylate beret can be further treated as follows with the addition of a modifier. (Hereinafter, referred to as modified aggregate purification treatment.) The suspension was centrifuged, the supernatant was completely removed, and the pellet was washed with 6M guanidine hydrochloride (in distilled water).
Reconcile in about 1/5 of the amount. For example, 3g of cells washed in 25ml of buffer will require 5ml in this step.
should be resuspended in 6M guanidine hydrochloride salt solution. At this stage, it is difficult to resuspend the pellet and sonication or homogenization may be necessary to obtain a homogeneous solution. The solution is left at 22° C. for 20 minutes and then centrifuged at 8000×g for 30 minutes to remove dirt, at which point the supernatant containing the fused protein is taken.

融合タンパク質は、約４容量の水性バッファの添加によ
ってグアニジン塩化水素塩上澄みから沈降せしめる。ほ
とんど水性バッファは、この段で使うことができるが、
少量の非イオン性洗浄剤、たとえば、０．５％ＮＰ−４
０あるいはトリトンＸ１００を添加することは、助けと
なろう。この懸濁物を４℃に３０分間放置し、次に８，
０００×ｇで１０分間遠心分離をする。上澄みを捨て、
ベレット（融合タンパク質沈降物）を、適切なパッファ
中に、例えば、適切な容量のりん酸バッファ生理食水（
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｌｅｒｃｄ　Ｓａｌｉｎｃ
：ＰＢＳ）中に再懸澗する。短い音波処理あるいはスラ
リー（アグレゲート形成タンパク賀は水に不溶性である
から）を得る上で助けとなりうる。The fusion protein is precipitated from the guanidine hydrochloride supernatant by addition of approximately 4 volumes of aqueous buffer. Most aqueous buffers can be used at this stage, but
A small amount of non-ionic detergent, e.g. 0.5% NP-4
Adding 0 or Triton X100 may help. This suspension was left at 4°C for 30 minutes, then 8.
Centrifuge at 000 xg for 10 minutes. Discard the supernatant,
The pellet (fusion protein precipitate) is placed in a suitable puffer, e.g., in an appropriate volume of phosphate buffered saline (
Phosphate Buflercd Salinc
:PBS). A short sonication or a slurry (as aggregate-forming proteins are insoluble in water) can be helpful.

５．６．非融合ｇＤタンパク買の製法 ワクチン処方で非融合タンパク質を用いることが望まし
いたろう。しかしながら、前に説明したように、非融合
ｇＤタンパク質を作る形質転換体は、ｇＤ融合タンパク
質を作る形質転換体よりも少ない量のものであり、これ
は、非融合タンパク質のための遺伝子配列が、導入でき
るプロモータの制御下のときでも本当である。更に、バ
クテリヤ形質転換体によって作られた非融合ｇＤタンパ
ク質は、ｇＤ融合タンパク質よりも不安定であろう。5.6. Methods for Preparing Non-Fusion gD Proteins It would be desirable to use non-fusion proteins in vaccine formulations. However, as explained previously, the transformants that make the non-fused gD protein are of lower abundance than the transformants that make the gD fusion protein, which is because the gene sequence for the non-fused protein is This is true even when under the control of an introducible promoter. Furthermore, unfused gD proteins produced by bacterial transformants may be more unstable than gD fusion proteins.

本発明の代替的具体例において、宿主細胞形質転換体は
、共アンバ−変異し容易に精製され得る融合及び非融合
の両方のｇＤ関連タンパク質を大量に作るように加工さ
れ得る。この具体例に従い、ｇＤ融合タンパク質をエン
コードする組換えプラスミドが、ｇＤ遺伝子配列と宿主
タンパク質遺伝子配列（例えば、β−ガラクトシダーゼ
　ｚ遺伝子配列）との接合において、変えられ、それに
より、非感覚コドン配列、即ち、アンバー（ａｍｂｅｒ
）（ＴＡＧ）、オーカー（ｏｃｈｒｅ）（ＴＡＡ）ある
いはオパール（ｏｐａｌ）（ＴＧＡ）のことき鎖終端配
列は、２つの遺伝子配列の間に位置され：鎖終止剤（タ
ーミネイタｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）は、両方のｇＤ配列
と宿主細胞配列の翻訳読取フレームと相を一致されなけ
ればならない。このような変化は、２つの遺伝子配列の
間に位置する制限サイトにおいてプラスミドを開裂し、
そして、アンバー、オーカー、或いはオパールのごとき
鎖ターミネイタをエンコードするＤＮＡリンカ−配列を
、プラスミド上の開裂されたサイトの中に配列すること
によって達成でき、鎖ターミネイタは、両方の遺伝子配
列の翻訳読取りフレームと相を一致させている。In an alternative embodiment of the invention, host cell transformants can be engineered to produce large amounts of both fused and non-fused gD-related proteins that can be co-amber mutated and easily purified. In accordance with this embodiment, a recombinant plasmid encoding a gD fusion protein is altered at the junction of the gD gene sequence and the host protein gene sequence (e.g., the β-galactosidase z gene sequence), thereby altering the nonsensory codon sequence, That is, amber
) (TAG), ochre (TAA) or opal (TGA) are located between the two gene sequences: the chain terminator is located between both gD The sequence must be aligned with the translated reading frame of the host cell sequence. Such a change cleaves the plasmid at a restriction site located between the two gene sequences,
This can then be accomplished by placing a DNA linker sequence encoding a strand terminator, such as amber, ocher, or opal, into the cleaved site on the plasmid, the strand terminator being in the translational reading frame of both gene sequences. It matches the phase.

これらのアンバー、オーカー或いはオパール修飾プラス
ミドを、適切なｔＲＮＡサプレッサーを含む宿主細胞中
に導入すると、非融合ｇＤ関連タンパク質並びにｇＤ融
合タンパク貿の両方の合成が得られる。アンバー、オー
カー或いはオパール修飾プラスミドが、非サプレッサー
細胞系統を形質転換するため用いられる場合、非融合ｇ
Ｄ−関連タンパク質が優勢的に作られるしのである。Introduction of these amber, ocher, or opal modified plasmids into host cells containing the appropriate tRNA suppressor results in the synthesis of both unfused gD-related proteins as well as gD fusion proteins. When an amber, ocher or opal modified plasmid is used to transform a non-suppressor cell line, the unfused g
D-related proteins are predominantly produced.

アンバー、オーカー或いはオパール修飾プラスミドをサ
プレッサー細胞規定中に導入するために少なくとも２つ
の方法がある。（１）形質転換体（即ち、アンバー、オ
ーカー或いはオパール装飾プラスミドにより形質転換さ
れた宿主細胞）が、適切なサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子
をもつ溶原生形質導入ファージ（例えば、φ８０ｐＳＵ
３は、アンバー変異のｓｕｐＦサプレッサーをもつ）に
よって感染せしめることができる。或いは（２）アンバ
ー、オーカー或いはオパール修飾ブラスミドは、各々ア
ンバー、オーカー、或いはオパールのサプレッサーｔＲ
ＮＡを含む細胞系統を形質転換するために用いることが
できる。このような菌株の例には、限定がないが、ＬＦ
３９２（アンバー変異のｓｕｐ及びｓｕｐＦサプレッサ
ーを含む）、ＹＭＣ（ｓｕｐＦを含む）及びＣ６００（
ｓｕｐＥ）がある。Ｅ，コリ中の種々のアンバー、サプ
レッサーｔＲＮＡ遺伝子には、限定はないが、ｓｕｐＢ
、ｓｕｐ　Ｃ，ｓｕｐ　Ｄ，ｓｕｐＦ、ｓｕｐ　Ｆ、ｓ
ｕｐ　Ｇ、ｓｕｐＬ、ｓｕｐ　Ｍ、ｓｕｐ　Ｎ、ｓｕｐ
　Ｏ，ｓｕｐ　Ｐ、ｓｕｐ　Ｕ、ｓｕｐＶがある。Ｅ、
コリ中の種々のオーカー、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子
には限定はないが、ｓｕｐＢ、ＳｕｐＣ、ＳｕｐＧ、ｓ
ｕｐＬ、ｓｕｐＭ，ｓｕｐ　Ｎ、ｓｕｐＯ、ｓｕｐＶが
ある。Ｅ、コリ中の種々のオパールサプレッサーｔＲＮ
Ａ遺伝子には限定はないが、ｓｕｐＫがある（Ｂａｃｋ
ｍａｎｎおよびＬｏｗ、１９８０、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　４４（１）：１〜５６
参照）。There are at least two methods for introducing amber, ocher or opal modified plasmids into suppressor cell populations. (1) Transformants (i.e., host cells transformed with amber, ocher, or opal-decorated plasmids) are transformed with lysogenically transducing phage (e.g., φ80pSU) carrying the appropriate suppressor tRNA gene.
3 has an amber mutant supF suppressor). or (2) the amber-, ocher-, or opal-modified plasmid is an amber-, ocher-, or opal-modified plasmid, respectively.
It can be used to transform cell lines containing NA. Examples of such strains include, but are not limited to, LF
392 (contains the amber mutant sup and supF suppressor), YMC (contains supF) and C600 (
supE). Various amber suppressor tRNA genes in E. coli include, but are not limited to, supB
, sup C, sup D, sup F, sup F, s
up G, sup L, sup M, sup N, sup
There are O, sup P, sup U, and sup V. E,
Various ocher and suppressor tRNA genes in coli include, but are not limited to, supB, SupC, SupG, s
There are upL, supM, supN, supO, and supV. E, various opal suppressor tRN in coli
There are no restrictions on the A gene, but there is supK (Back
Mann and Low, 1980, Microbiol
ogical Reviews 44(1):1-56
reference).

アンバー、オーカー或いはオパール修飾プラスミドによ
って形質転換された適切なサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子
を含む宿主細胞は、融合タンパク質及び非融合タンパク
質としてｇＤ関連タンパク質を作ることができる。（作
られた融合ｇＤと非融合タンパク質の割合は、宿主細胞
中の抑制（サプレッション）の大きさに依存する〉：両
タンパク質は、ＨＳＶに対する抗血清と免疫反応する。Host cells containing the appropriate suppressor tRNA genes transformed with amber, ocher or opal modified plasmids can produce gD-related proteins as fusion and non-fusion proteins. (The proportion of fused gD and non-fused protein produced depends on the amount of suppression in the host cell): both proteins are immunoreactive with antiserum against HSV.

第５．５項でのべた非変性アグレゲート精製処理を用い
るとき、非融合ｇＤとｇＤ融合タンパク質の両方は、共
精製する（この場合、処理は、非変性共アグレゲート精
製処理である。）溶解化後、非融合ｇＤは、大きさ或い
は電荷に基づいて、ｇＤ融合タンパク質から分離できる
。結果として、宿主細胞形質転換体により作られた非融
合ｇＤ−関連タンパク質が大量に、容易に精製でき、そ
して、ワクチンとして使用するために処方され得る。When using the non-denatured aggregate purification process described in Section 5.5, both the non-fused gD and gD fusion proteins are co-purified (in this case the process is a non-denatured co-aggregate purification process). Thereafter, unfused gD can be separated from gD fusion proteins based on size or charge. As a result, large amounts of unfused gD-related protein produced by host cell transformants can be easily purified and formulated for use as a vaccine.

５．７．ワクチンの処方 本発明の目的は、組替えＤＮＡ技術によって、ワクチン
中でＨＳＶ−１及び或いはＨＳＶ−２感染に対しで保護
する免疫原としで用いることのできるｇＤ−関連タンパ
ク質のようなＨＳＶ糖タンパク質−関連ポリペプチドを
作ることである。作られたｇＤ−関連タンパク質が特定
のＨＳＶ−１及び或いはＨＳＶ−２中和抗原体に対して
免疫活性である場合、ｇＤ−関連タンパク質は、生体内
の関係ウィルスを中和することが可能である免疫応答を
引き出すことが期待されるだろう。一般的に加工された
免疫原から作られたワクチンは、弱毒化されたウィルス
から作られた通常のワクチンよりも安全であるべきであ
る、何故ならば、受領体の感染の危険がないからである
。或いは、代替して、一般的に加工されたｇＤ生成物は
、受働的免疫治療に有用である抗体を作るために用い得
る。5.7. Vaccine formulation It is an object of the present invention to develop HSV glycoproteins, such as gD-related proteins, which can be used as immunogens to protect against HSV-1 and/or HSV-2 infections in vaccines by recombinant DNA technology. The next step is to make related polypeptides. If the produced gD-related protein is immunoactive against specific HSV-1 and/or HSV-2 neutralizing antigens, the gD-related protein is capable of neutralizing the related virus in vivo. It would be expected to elicit a certain immune response. Vaccines made from engineered immunogens should generally be safer than conventional vaccines made from attenuated viruses because there is no risk of infection of the recipient. be. Alternatively, commonly processed gD products can be used to make antibodies that are useful in passive immunotherapy.

（ＩＤ／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質生成物自
体は、ワクチン処方に有用であろうが、最初にβ−ガラ
クトシダーゼ部分を除く必要があろう。或いはｇＤ遺遺
転子アミン解読終端を再構成することは、アミン終端は
、更に顕著な抗原サイトを含み得るので、タンパク賀の
免疫原性のためには重要であろう。ｇＤ遺伝子のアミン
解読終端は、ｇＤのアミノ終端をエンコードするＤＮＡ
配列を、相換えＤＮＡ分子のｇＤ解読領域内の適切なサ
イトの中に配位することによって再構成することができ
る。組替えＤＮＡ分子は、全ての必要な発現コントロー
ル要素を保留するので、全長の（或いは全長に近い）ｇ
Ｄ−関連タンパク質は、再構成された遺伝子を含むＤＮ
Ａ分子により形質転換された細胞によって作られる。(The ID/β-galactosidase fusion protein product itself would be useful in vaccine formulation, but it would be necessary to first remove the β-galactosidase moiety. , the amine terminus may be important for the immunogenicity of the protein, as it may contain a more prominent antigenic site.
The sequence can be reconstructed by coordinating into the appropriate site within the gD coding region of a reciprocal DNA molecule. The recombinant DNA molecule retains all necessary expression control elements so that full-length (or near-full-length) g
D-related proteins are DN containing rearranged genes.
Produced by cells transformed with the A molecule.

最初に、一般的に加工されたｇＤ−関連タンパク質は、
標準的タンパク質単離技術を用いて、或いは、ここにの
べたアグリゲート精製方法によって宿主細胞から単離さ
れ、そして、精製され得る。Initially, commonly processed gD-related proteins were
It can be isolated and purified from host cells using standard protein isolation techniques or by the aggregate purification methods described herein.

最後の精製された生成物は次に、適切な濃度に希釈され
得、そして、適切なワクチンアジュバントと共に処方さ
れ、そして用途のために包装され得る。適切なアジュバ
ンドには、限定はないが、表面活性物質、例えば、ヘキ
サデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、
ジメチルジオクタテシルアンモニウムブロマイド、Ｎ、
Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグ
リセロールおよひ及びプルロニックポリオール類；ポリ
アニリン類、例えば、ピラン、デキストラン、ナルフェ
ート、ポリＩＣ，ポリアクリル酸、カルボボール：ペプ
チド類、例えば、ムルアミルジペプチド、ジメチルグリ
ジン、タフトシン；油懸濁物；及び明ばんがある。最後
に、タンパク質生成物は、ワクチン処方用のためにリポ
ソーム中に含有され得、或いは、ポリサツカリド類或い
は他のポリマーと複合できる。The final purified product can then be diluted to the appropriate concentration and formulated with a suitable vaccine adjuvant and packaged for use. Suitable adjuvants include, but are not limited to, surfactants such as hexadecylamine, octadecylamine, lysolecithin,
dimethyldioctatecylammonium bromide, N,
N-diotadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethyl-propanediamine), methoxyhexadecylglycerol and pluronic polyols; polyanilines such as pyran, dextran, nalphate, polyIC, polyacrylic acid , carbobol: peptides such as muramyl dipeptide, dimethylglycine, tuftsin; oil suspension; and alum. Finally, protein products can be contained in liposomes or conjugated with polysaccharides or other polymers for use in vaccine formulations.

ここにのべた一般的に加工されたＤＮＡ分子は、ワクチ
ン製造に、大きな柔軟性を可能にする。例えば、ワクチ
ンは、ｇＤ遺伝子配列の一部（或いはその一部）の多重
複製を含む組替えＤＮＡ分子により作られたｇＤ−関連
タンパク質を用いて処方することができた。ｇＤ遺伝子
配列（或いはその一部）は、他の免疫原をエンコードす
る遺伝子と配位でき、それにより、融合タンパク質生成
物は、多価ワクチンの製造に使用できるようになる。The commonly engineered DNA molecules described herein allow great flexibility in vaccine production. For example, vaccines could be formulated using gD-related proteins made by recombinant DNA molecules containing multiple copies of a portion (or portions) of the gD gene sequence. The gD gene sequence (or a portion thereof) can be coordinated with genes encoding other immunogens, allowing the fusion protein product to be used in the production of multivalent vaccines.

更に、ｇＤ配列は、ワクチンの免疫原性を増すものど、
認識でさる。例えば、遺伝子配列は、変えられ得、それ
によりタンパク質生成物が特定のエビトーブを免疫シス
テムに対して呈し、（例えば、通常、露出されないｇＤ
の抗原サイトが、免疫システムに対して呈示されている
。）；あるいはプロティンの免疫抑制部分をエンコード
するｇＤ遭遺転子列の領域を削除することができる。Furthermore, although the gD sequence increases the immunogenicity of the vaccine,
A monkey with recognition. For example, the gene sequence can be altered so that the protein product presents a particular epitope to the immune system (e.g., normally exposed gD
antigenic sites are presented to the immune system. ); or the region of the gD trochanteric column encoding the immunosuppressive portion of the protein can be deleted.

６、実施例：ＨＳＶ−１ｇＤ 本発明の方法により、ｇＤ−１遺伝子は、ＨＳＶ−１ゲ
ノムのＵｓ部分のＤＮＡフラグメンク（第１ａ図参照）
を、ベクトルｐＢＲ３２２中に挿入し、ＨＳＶ−１ゲノ
ムの異なるフラグメントを各々含んだ組替えプラグミド
を作ることによって局在化され、そして、同定された。6. Example: HSV-1gD According to the method of the present invention, the gD-1 gene is isolated from a DNA fragment of the Us portion of the HSV-1 genome (see Figure 1a).
were inserted into the vector pBR322, localized and identified by creating recombinant pragmids each containing a different fragment of the HSV-1 genome.

ｇＤ−１遺伝子を含むプラスミドは、次の３つの技術（
順に揚げる必要はない）によって同定された。（１）Ｄ
ＮＡ配列化、（２）ｇＤ−１特定ｍＲＮＡ交雑（雑種形
成）研究及び（３）組換えプラスミドに交雑化するｍＲ
ＮＡの生体内翻訳。Plasmids containing the gD-1 gene can be obtained using the following three techniques (
It is not necessary to fry them in order). (1)D
NA sequencing, (2) gD-1 specific mRNA hybridization studies, and (3) mR hybridization to recombinant plasmids.
In vivo translation of NA.

ｇＤ−１遺伝子を含むプラスミドが同定された時、遺伝
子はＤＮＡ配列化により、そして組換えプラスミド内に
ｇＤ−１遺伝子末端に位置せしめることによって特徴づ
けられた。解読配列の第１の１５６のヌクレオチドを欠
くｇＤ−１遺伝子を含んだＤＮＡフラグメントを、同定
されたプラスミドから単離した。このＤＮＡフラグメン
は、ＤＮＡベクトル、ｐＪＳ４１３にくくられ、Ｅ．コ
リ中の遺伝子のクローン化及び発現のために用いられた
ｐＥＨ２５を作った。導入された形質転換体から単離さ
れた遺伝子生成物を、ｇＤ−１に対して関係するモノク
ローナル抗体による及び、ＨＳＶ−１に関係する多価抗
体による免疫沈澱化によってｇＤ−１特定タンパク質と
して同定された。When a plasmid containing the gD-1 gene was identified, the gene was characterized by DNA sequencing and by placing it at the end of the gD-1 gene within the recombinant plasmid. A DNA fragment containing the gD-1 gene lacking the first 156 nucleotides of the coding sequence was isolated from the identified plasmid. This DNA fragment was packaged into a DNA vector, pJS413, and E. pEH25 was created which was used for cloning and expression of the gene in E. coli. Gene products isolated from introduced transformants are identified as gD-1 specific proteins by immunoprecipitation with monoclonal antibodies directed against gD-1 and with multivalent antibodies directed against HSV-1. It was done.

第１に、ｇＤ−１道伝子フラグメントは、特定サイトで
制限エンドヌクレアーゼ開裂をすることによって、ｐＥ
Ｈ２５から単離した。それによりｇＤ−１解読配列の終
止配列（ＴＡＧ）を削除した。ｇＤ−１遺伝子の一部及
びプラスミドプロモータ及びコントロール要素（例えば
、ＳＤ−ＡＴＧ）を含んだこのＤＮＡフラグメントを、
β−ガラクトシダーゼ解読配列を含むベクトル中に配位
した。ｃｒｏＳＤ−ＡＴＧをもつプラグミドのｌａｃプ
ロモータと、β−ガラクターゼ遺伝子との間にサンドウ
ィッチされてｇＤ−１解読配列を含んだ得られた組換え
プラスミド、ｐＥＨ４−２は、導入されたＥ．コリ形質
転換体中の融合タンパク質の発現を指向していた。次に
、この融合タンパク質を、宿主細胞リゼイトから単離し
た。そして、免疫原として用いるために処方した。或い
は、代替的に、ｇＤ−１遺伝子のアミノ解読末端を再編
成し、そして得られたｇＤ−１タンパク質を、動物法則
及び、予治療試験のために処方された。構成づけの各工
程の詳細は、以下の章に提示される。First, the gD-1 gene fragment is isolated from pE by restriction endonuclease cleavage at specific sites.
Isolated from H25. As a result, the termination sequence (TAG) of the gD-1 decoding sequence was deleted. This DNA fragment containing part of the gD-1 gene and the plasmid promoter and control elements (e.g. SD-ATG) was
Coordinated into a vector containing the β-galactosidase coding sequence. The resulting recombinant plasmid, pEH4-2, contained the gD-1 coding sequence sandwiched between the pragmid lac promoter with croSD-ATG and the β-galactase gene, which contained the introduced E. was directed to the expression of the fusion protein in E. coli transformants. This fusion protein was then isolated from host cell lysates. It was then formulated for use as an immunogen. Alternatively, the amino-coding ends of the gD-1 gene were rearranged and the resulting gD-1 protein was formulated for animal testing and pre-therapeutic testing. Details of each step of composition are presented in the following chapters.

ここで作られたｇＤ−１関連タンパク質及び融合タンパ
ク質は、非グリコシレート化のものであり、従って、天
然にあるＨＳＶ−１ｇＤ糖タンパク質とは異なるもので
ある。しかしながら、ｇＤ−１関連タンパク質は、ＨＳ
Ｖ−１およびＨＳＶ−２ｇＤに対して指向の抗体と免疫
反応性を有する。The gD-1 related proteins and fusion proteins produced herein are non-glycosylated and therefore different from the naturally occurring HSV-1 gD glycoprotein. However, gD-1 related proteins are
Immunoreactive with antibodies directed against V-1 and HSV-2gD.

６．１．プラスミド製造に用いられる一般的手順次の記
述は、ＤＮＡ単離、酵素反応及び配位反応に用いる一般
的手順及び物質を説明する。6.1. General Procedures Used in Plasmid Production The following description describes the general procedures and materials used in DNA isolation, enzymatic reactions, and coordination reactions.

６．１．１．プラスミドＤＮＡ単離 宿主細胞バクテリア　エスケリキア　コリ（Ｅｓｃｈａ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：Ｅ．コリ）は、形質転換され
た（Ｑａｕｔｉｅｒ及びＢｏｍｅｗａｌｄ，１９８０、
Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｃｎｅｔ．１７８：３７５）。6.1.1. Plasmid DNA Isolation Host Cell Bacterium Escherichia coli (Escha
richia coli:E. coli) was transformed (Qautier and Bonewald, 1980,
Molec. Gen. Gcnet. 178:375).

そしてプラスミドＤＮＡの大量（ミクログラム）が、Ｍ
−９ブロス中に生長されＥ．コリ形質転換体の培養物か
ら単離された。（Ｍｉｌｌｅｒ、ｐ、４３１：Ｅｘｐｃ
ｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓの中、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、１９７２）。プ
ラスミドは、グリ−（Ｇｕｅｒｒｙ）らの方法（１７８
３．Ｊ．Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、１１６：１０６３）の変
更法を用いて、生長物の遅い対数段で、細胞より単離さ
れた。And large amounts (micrograms) of plasmid DNA are
E. -9 grown in broth. It was isolated from a culture of E. coli transformants. (Miller, p. 431: Expc.
riments in Molecular Gene
Cold Spring Harbor in tics
Press, New York, N.Y., 1972). Plasmids were prepared using the method of Guerry et al. (178
3. J. Bactcriol, 116:1063) was isolated from cells in slow logarithmic stages of growth.

６．１２制限酵素消化のための条件 本発明で用いた制限酵素は、他に示さない限り、マサチ
ューセッツ州ベバリーのニュー、イングランド．バイオ
ラブス．インコーポレーテッド（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｄｓ，　Ｉｎｃ、、Ｂｅｒｅｒｌｙ、Ｍ
ａ、）から得られた。酵素単位は、１．０μｇのラムダ
ＤＮＡを、１５分間に、３７℃で５０μｌの全反応混合
物中で消化するに要する最として定義されでいる。6.12 Conditions for Restriction Enzyme Digestion Restriction enzymes used in the present invention, unless otherwise indicated, were purchased from New England, Beverly, Massachusetts. Biolabs. Incorporated (New English)
d Biolads, Inc., Berery, M.
Obtained from a.). An enzyme unit is defined as the maximum amount required to digest 1.0 μg of lambda DNA in 15 minutes at 37° C. in 50 μl of the total reaction mixture.

全ての制限酵素全消化は、次のような条件下で達成され
た。：各々１μｇのＤＮＡを、酵素０．５単位に３７℃
で６０分間、２０μｌのバッファ中に培養した。部分的
消化が、次のような全消化に用いた条件を変更すること
によって達成された。All restriction enzyme total digestions were accomplished under the following conditions. : 1 μg of each DNA to 0.5 unit of enzyme at 37℃
The cells were incubated in 20 μl of buffer for 60 minutes. Partial digestion was achieved by modifying the conditions used for total digestion as follows.

各々１μｇのＤＮＡを０．１単位の酵素で、３７℃で１
５分間培養した。反応は、０．１％ナトリウムドデシル
サルフェート（ＳＤＳ）のの添加によって終止された。1 μg of each DNA was mixed with 0.1 unit of enzyme at 37°C.
It was incubated for 5 minutes. The reaction was terminated by the addition of 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS).

従って、反応条件は、ＤＮＡ分子当り１つの開裂の平均
が得られるように調節された。Therefore, reaction conditions were adjusted to obtain an average of one cleavage per DNA molecule.

６．１，３．制限酵素バッファ ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ或いはＳｍａＩ消化に用いたバッ
ファは、６．６ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）６．
６ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び６．６ｍＭ　β−ＭＥ（β−メ
ルカブトエタノール）より成る。6.1, 3. Restriction enzyme buffer SacI, SacII or SmaI The buffer used for digestion was 6.6mM Tris-HCl (pH 7.4)6.
Consists of 6mM MgCl2 and 6.6mM β-ME (β-mercabutoethanol).

ＢｇｌＩＩ，ＢｓｔＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ
，ＮｒｕＩ，ＰｓｔＩ或いはＰｒｕＩＩに用いたバッフ
ァ、消化は：６０ｍＭ　ＮａＣｌ、６．６ｍＭ　トリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び
６．６ｍＭ　β−メルカブトエタノール〈β−ＭＥ）よ
り成る。BglII, BstII, EcoRI, HindIII
, NruI, PstI or PruII, the digestion buffer consisted of: 60mM NaCl, 6.6mM Tris-HCl (pH 7.4), 6.6mM MgCl2 and 6.6mM β-mercabutethanol (β-ME).

ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩ或いはＸｂａＩ消化に用いたバッ
ファは、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，６．６ｍＭトリス　Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び６．
６ｍＭ　β−ＭＥより成る。The buffer used for BamHI, SalI or XbaI digestion was 150mM NaCl, 6.6mM TrisH.
Cl (pH 7.4), 6.6mM MgCl2 and 6.
Consists of 6mM β-ME.

２以上の制限エンドヌクレアーゼ反応がＤＮＡ上になさ
れた場合には、低い塩バッファ中の反応が、高い塩バッ
ファ中での反応の前に達成された。If more than one restriction endonuclease reaction was performed on the DNA, the reaction in low salt buffer was accomplished before the reaction in high salt buffer.

２つの酵素が同じバッファを要する時、反応は同時にな
され得る。When two enzymes require the same buffer, reactions can be done simultaneously.

６．１．４．ＤＮＡの装飾 Ｂａ１　３１ヌクレアーゼは、多機能酵素であり、それ
は、高い特定の単一鎖のものを含み、二重鎖のＤＮＡ（
ｄｓＤＮＡ）の３′−及び５′−末端の両方を同時に劣
化するものであり、エンドデオキシリボヌクリアーゼ活
性及び前進型エンドソヌクレアーゼ活性を有する。ヌク
レアーゼ　Ｂａｌ　３１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ，　Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａ．）
１単位を、１．０μｇの酸溶解性ヌクレオチドを、１分
間、３０℃で変性化カーフ胸腺ＤＮΔ（６５０μｇ／ｍ
ｌ）から解放するに要する量として定義する。Ｂａｌ３
１のために用いた反応バッファは：２ｏｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ８０），６００ｍＭ　ＮａＣｌ，１２ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２，１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１．０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ及びＤＮＡよりなる。培養（インキュベート）は、３
０℃で：Ｂａｌ３１消化は、０．５単位のＢａｌ３１を
有する３０μｇのＤＮＡを、１，２，４．６，８．及び
１０分間培養することによってなされた。反応は、ＥＤ
ＴＡを、５０ｍＭ添加すること、或いはＢａｌ３１の熱
不活性化（例えば、６５℃１０分間）によって終止され
た。6.1.4. DNA decoration Ba1 31 nuclease is a multifunctional enzyme, it is highly specific for both single-stranded and double-stranded DNA (
It simultaneously degrades both the 3'- and 5'-ends of dsDNA) and has endodeoxyribonuclease activity and processive endosonuclease activity. Nuclease Bal 31 (New England B
iolabs, Inc., Beverly, Ma. )
One unit was added to denatured calf thymus DNAΔ (650 μg/m
It is defined as the amount required to release from l). Bal3
Reaction buffer used for 1: 2omM Tris HC
l (pH 80), 600mM NaCl, 12mM C
aCl2, 12mM MgCl2, 1.0mM EDT
Consists of A and DNA. Culture (incubation) is 3
At 0°C: Bal31 digestion is performed by injecting 30 μg of DNA with 0.5 units of Bal31 into 1, 2, 4.6, 8. and incubation for 10 minutes. The reaction is ED
TA was terminated by adding 50 mM or by heat inactivation of Bal31 (eg, 65° C. for 10 min).

Ｓｌヌクレアーゼは、ＲＮＡ或いは変性ＤＮＡ（即ち、
単一鎖のＤＮＡ）をモノヌクレオチドに分解するが、二
重鎖のＤＮＡ或いはＤＮＡ／ＲＮＡ交雑物〈ハイブリッ
ド〉を、（適当な条件下で）分解することはない。Ｓｌ
ヌクレアーゼの（単位（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ．Ｉｎｄ，）は
、３０分間３７℃で変性カーフ胸腺ＤＮＡ１１μｇを酸
安定化するに要する酵素の量として定義されている。Ｓ
ｌヌクレアーゼのための用いた反応バッファは、３０ｍ
Ｍ醋酸ナトリウム（ｐＨ４．６），２５０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ，１ｍＭＺｎＳｏ４及び５％グリセロールよりなって
いた。Sl nuclease can be used to synthesize RNA or denatured DNA (i.e.
It degrades single-stranded DNA (single-stranded DNA) into mononucleotides, but does not (under appropriate conditions) degrade double-stranded DNA or DNA/RNA hybrids. Sl
Units of nuclease (Bochringer Man
nheim, Indianapolis. Ind,) is defined as the amount of enzyme required to acid stabilize 11 μg of denatured calf thymus DNA at 37° C. for 30 minutes. S
The reaction buffer used for l nuclease was 30 m
M Sodium acetate (pH 4.6), 250mM NaC
1, 1mM ZnSo4 and 5% glycerol.

Ｓｌ消化は、４５℃３０分間、０．１μｇＤＮＡ及び２
０μｇＲＮＡを有する２０００単位の酵素を培養するこ
とによって達成された。Sl digestion was carried out using 0.1 μg DNA and 2
This was achieved by incubating 2000 units of enzyme with 0 μg RNA.

エキソヌクレーゼ■（Ｅｘｏ■）は、単一鎖のＤＮＡ（
ｓｓＤＮＡ）を分解する。Ｅｘｏ■の作用の機構は、前
進型エキソヌクレアーゼのもののようである。Ｅｘｏ■
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）の１単位
は、３０分間、３７℃で、基体として線状の、変性され
た［３Ｈ］−ＳＶ４０ＤＮＡを用いて、１ｎモルのヌク
レオチドモノマーを作る酵素の量として定れされている
。Ｅｘｏ■のために用いた反応バッファは、１０ｍＭ　
トリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）。Exonuclease (Exo) is a single-stranded DNA (
ssDNA). The mechanism of action of Exo■ appears to be that of a processive exonuclease. Exo■
(Bethesda Research Labora
tories, Rockville, Md. ) is determined as the amount of enzyme that makes 1 nmol of nucleotide monomers at 37° C. for 30 minutes using linear, denatured [3H]-SV40 DNA as the substrate. The reaction buffer used for Exo■ was 10mM
Tris HCl (pH 7.9).

１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　β−ＭＥ及び８ｍＭ
　ＥＤＴＡよりなっていた。Ｅｘｏ■消化は、２５０μ
ｌ反応量中で、１時間４５℃で、０．１μｇＤＮＡ当り
４単位のＥｘｏ■を用いてなされた。100mM NaCl, 10mM β-ME and 8mM
It was made of EDTA. Exo ■ digestion is 250μ
1 reaction volume for 1 hour at 45° C. using 4 units of Exo■ per 0.1 μg DNA.

６．１．５．ＤＮＡポリメラーゼ反応 ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖の段階伸長を触媒する
。鎖生長は、５’−３′の方向であり（即ち、ヌクレオ
チドの添加が３′−末端で生じる）、そして、ポリマー
の配列を、鋳型のものによって決まる。何故ならば、入
るヌクレオチドは、その鋳型に対して相補するものでな
ければならないであり、即ち鋳型鎖と正しい塩基対を形
成しなければならないからである。既知のＤＮＡポリメ
ラーゼは、鎖合成を開始することができない。従って、
ＤＮＡ合成は　鋳型鎖とアンニールされた遊離の３′−
ヒドロキシ末端をもつプライマー（始動物質）を要する
。鎖伸長は、入るヌクレオチドの５′−フォスフェート
（燐酸）上にプライマーの３’−ヒドロキシ末端が求核
的に攻撃することによってなされる。新しい鎖は、塩基
対になり、そして、鋳型鎖の対して逆平行である。ＤＮ
Ａポリメラ−ゼ反応の結果として、単一鎖の鋳型鎖は「
充填されて」、即ち二重鎖のＤＮＡ分子に変換される。6.1.5. DNA Polymerase Reaction DNA polymerase catalyzes the stepwise elongation of DNA strands. Chain growth is in the 5'-3' direction (ie, nucleotide addition occurs at the 3'-end) and the sequence of the polymer is determined by that of the template. This is because the incoming nucleotides must be complementary to the template, ie, form correct base pairs with the template strand. Known DNA polymerases are unable to initiate strand synthesis. Therefore,
DNA synthesis consists of a template strand and an annealed free 3'-
Requires a hydroxy-terminated primer (starting material). Chain extension is accomplished by nucleophilic attack of the 3'-hydroxy terminus of the primer onto the 5'-phosphate of the incoming nucleotide. The new strand is base-paired and antiparallel to the template strand. D.N.
As a result of the A polymerase reaction, the single-stranded template strand is
"packed," ie, converted into a double-stranded DNA molecule.

ＤＮＡポリメラーゼの第２の重要な特色は「プルーフ−
リーディング（保証読取り）」機能である。ＤＮＡポリ
メラーゼＩに伴なう３′−５’のエキソヌクレアーゼ活
性は、非塩基対の末端に働く、そして、単一および二重
鎖のＤＮＡの両方を３′−５′の方向で減成でき、モノ
ヌクレオチドを与える。従って、正しくなく加えられた
ヌクレオチドは、重合化の続く前に除去され、そして、
酵素の忠実性が更に高められる。ＤＮＡポリメラーゼＩ
はまた、二重鎖のＤＮＡについて特定の５′対３′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有しており（５′モノヌクレオチ
ド及びＡリボヌクレオチドを与える）、それはＤＮＡ中
の不一致の領域を切除できる。The second important feature of DNA polymerases is their “proofing”.
This is the "Reading (Guaranteed Reading)" function. The 3'-5' exonuclease activity associated with DNA polymerase I acts on unbase-paired ends and can degrade both single- and double-stranded DNA in the 3'-5' direction. , giving a mononucleotide. Thus, incorrectly added nucleotides are removed before polymerization continues, and
Enzyme fidelity is further enhanced. DNA polymerase I
It also has specific 5' to 3' exonuclease activity on double-stranded DNA (giving 5' mononucleotides and A ribonucleotides), which allows it to excise regions of mismatch in the DNA.

クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）の方法（Ｋｌｅｎｏｗら、１
９７１、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２：３７１）
によるＤＮＡポリメラーゼＩの原核生物処理は、２つの
フラグメント、大いものと小さいものを与える。大きな
フラグメント、即ちフクレナウ（Ｋｉｅｎｏｗ）フラグ
メント（７６，０００ダルトン）は、ポリメラーゼ及び
３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を保持し、一方、小
さいフラグメントは５′−３′エキソヌクレアーゼ活性
を保持する。ＤＮＡポリメラーゼ■或いはＤＮＡポリメ
ラーゼ■−大のフラグメントの１単位（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉんｃ，，Ｂｅｖｅｒｌｙ
、Ｍａ）は、デオキシリボヌクレアチド１０ｎモルを、
３０分間３７℃で酸不溶性形に変換する量として定義さ
れる。両方の酵素のための検定条件は同じであり、ＤＮ
Ａポリメラーゼ■に対する反応混合物が６７ｍＭＫＰＯ
４（ｐＨ７．５）を含み、一方クレナウ・フラグメント
のための反応混合物は４０ｍＭ　ＫＰＯ４（ｐＨ７．５
）を含み、次のバッファである：６．５ｍＭ　ＭｇＣｌ
２，１．０ｍＭ　β−ＭＥ、２ｍＭ　ｄＡＴコポリマー
、３３μＭｄＡＴＰ、３３μＭ　３Ｈ−ｄＴＴＰ及び酵
素。Klenow's method (Klenow et al., 1
971, Eur, J. Biochem, 22:371)
Prokaryotic treatment of DNA polymerase I with DNA polymerase I yields two fragments, a large one and a small one. The large fragment, the Kienow fragment (76,000 Daltons), retains polymerase and 3'-5' exonuclease activity, while the small fragment retains 5'-3' exonuclease activity. DNA polymerase ■ or DNA polymerase ■ - 1 unit of large fragment (New Eng
land Biolabs, Inc., Beverly
, Ma) is 10 nmol of deoxyribonucleatide,
Defined as the amount converted to the acid-insoluble form at 37° C. for 30 minutes. Assay conditions for both enzymes are the same, DN
The reaction mixture for A polymerase ■ was 67mM KPO.
4 (pH 7.5), while the reaction mixture for the Klenow fragment contained 40 mM KPO4 (pH 7.5).
) in the following buffer: 6.5mM MgCl
2, 1.0mM β-ME, 2mM dAT copolymer, 33μM dATP, 33μM 3H-dTTP and enzyme.

本出願において、ＤＮＡポリメラーゼ大きな（クレナウ
〉フラグメントが、制限酵素開裂から得る単一鎖のＤＮ
Ａ、即ち付着末端を充填するために用いられる時、次の
手順を用いた。制限酵素反応は、６８℃に１０分間加熱
することによって終止された。同じ反応混合物に対して
、各々デオキシヌクレオチド三リン酸塩５０μＭの最終
濃度が添加された。そして、反応混合物中のＤＮＡの１
マイクログラム当り、ＤＮＡポリメラーゼフレナラフラ
グメント１０〜１００単位が添加された。In this application, DNA polymerase large (Klenow) fragments are used to synthesize single-stranded DNA obtained from restriction enzyme cleavage.
When used to fill A, ie cohesive ends, the following procedure was used. Restriction enzyme reactions were terminated by heating to 68°C for 10 minutes. To the same reaction mixtures, a final concentration of 50 μM of each deoxynucleotide triphosphate was added. and 1 of the DNA in the reaction mixture.
10-100 units of DNA polymerase Frenara fragment were added per microgram.

換言すると、過剰のＤＮＡポリメラーゼクレナウフラグ
メントが、単一鎖端を完全に充填せしめられたことを確
保覆るために用いられた。In other words, excess DNA polymerase Klenow fragment was used to ensure that the single stranded ends were completely filled.

６．１，６．　ＤＮＡフラグメントのゲル精製制限酸素
酸ヌクレアーピ処理の後に、種々の大ささのＤＮＡフラ
グメントは、アガローセ或いはポリアクリルアミドスラ
ブグルの内で、低電圧での（アガロ−ゼグルにおいては
約２ボルト／ｃｍ及びポリアクリルアミドゲルにおいて
は１０ボルト／ｃｍで）、ゲル電気泳動によって分離さ
れ、エチジウムブロマイドで着色され、そして、紫外線
下で可視化された。（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７９、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｄｏｇｙ６８：１５２
）。6.1,6. Gel Purification of DNA Fragments After limited oxygen acid nucleation, DNA fragments of various sizes are purified in agarose or polyacrylamide slabs at low voltage (approximately 2 volts/cm in agarose or polyacrylamide slabs). (at 10 volts/cm in gels), separated by gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and visualized under ultraviolet light. (Southern, 1979, M
methods in Enzymdogy68:152
).

ゲルから特殊なＤＮＡフラグメントを回収するために、
適切なバンドをゲルから切り出した。そしてＤＮＡは、
透析管へ電気溶離された。次に、ＤＮＡはＤＥＡＥセル
ロース上に単離されたか、或いはエタノール沈澱された
。そして適当なバッファ中に際懸濁された。（Ｓｍｉｔ
ｈ，１９８０Ｍｅｔｂｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　６５：３７１）。To recover special DNA fragments from the gel,
Appropriate bands were excised from the gel. And the DNA is
Electroeluted into dialysis tubing. DNA was then isolated on DEAE cellulose or ethanol precipitated. and suspended in an appropriate buffer. (Smit
h, 1980 Metbods in Enzymolo
gy 65:371).

６．１，７．ＤＮＡ配置 全ての配位は、ＴＡ　ＤＮＡリガーゼを用いて達成され
た（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ
、、Ｂｏｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１
単位は、バクテリオファージ　ラムダＤＮＡのＨｉｎｄ
■フラグメントの５０％配位が３０分間で、１６℃、リ
ガーゼバッファの２０μｌの中で、そして０．１２μＭ
の５′−ＤＮＡ末端淵度（３００Ｍｇ／ｍｌ）で得られ
るに要する量として定義される。6.1, 7. Coordination of all DNA arrangements was achieved using TA DNA ligase (New England Biolabs, Inc.
, Boverly, MA). T4 DNA ligase 1
The unit is Hind of bacteriophage lambda DNA.
■ 50% coordination of the fragments for 30 minutes at 16°C in 20 μl of ligase buffer and 0.12 μM
It is defined as the amount required to obtain 5'-DNA terminal depth (300 Mg/ml).

ＤＮＡ配位は、６０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）
、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭジチオツレイドール
（ＤＴＴ）、１．０ｍＭ　ＡＴＰ及び１５〜５０μｇ／
ｍｌの範囲のＤＮＡ濃度からなるリガーゼバッファ中で
行なわれた。配位反応は、４〜２４時間、室温で約３０
０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ／１０μｌ反応容積を用い
て培養された。DNA coordination was performed using 60mM Tris-HCl (pH 7.8)
, 10mM MgCl2, 20mM dithiothreidol (DTT), 1.0mM ATP and 15-50μg/
It was carried out in ligase buffer consisting of a range of DNA concentrations in ml. The coordination reaction is carried out for 4 to 24 hours at room temperature for approximately 30 minutes.
Incubation was performed using 0 units of T4 DNA ligase/10 μl reaction volume.

６．２．ｇＤ−１遺伝子の局在化と単離ＨＳＶ−１×Ｈ
ＳＶ−２組替え体により特定されたタンパク質を分析す
ると、それはｇＤ−１遺伝子は、ＤＮＡのＵｓ領域内で
０．９〜０．９４５のゲノムマップ単位の間にマップし
たことを示している（Ｒｕｙｅｃｈａｎら．．１９７９
．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、２９：６６７）、第１ａ及び１ｂ図
参照。ＵＳ領域は、制限酵素によってフラグメント化さ
れ、そして、このようなフラグメントはクローン化ベク
トル中に挿入され、種々の組替えプラスミドを作成した
。各プラスミドは、ＵＳ領域の規定部分を含んでいる。6.2. Localization and isolation of gD-1 gene HSV-1xH
Analysis of the proteins identified by the SV-2 recombinant shows that the gD-1 gene maps between 0.9 and 0.945 genome map units within the Us region of the DNA (Ruyechan et al. 1979
．． J. Virol, 29:667), see Figures 1a and 1b. The US region was fragmented with restriction enzymes and such fragments were inserted into cloning vectors to create various recombinant plasmids. Each plasmid contains a defined portion of the US region.

次にこれらの組換えプラスミドを、ＵＳ領域内にｇＤ−
１遺伝子を局圧化せしめるために分析した。ＨＳＶ−１
中のｇＤ−１のマップ位置は、最近、Ｌｅｅらによって
１９８２．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ．４３：４１に報告されてい
る。Next, these recombinant plasmids were inserted into the US region with gD-
One gene was analyzed to localize it. HSV-1
The map location of gD-1 in 1982. J, Virol. Reported at 43:41.

６．２．１．ＨＳＶー１のＵｓ領域の規定部分を含む組
換えＤＮＡプラスミド 数個の組替えプラスミドが、ベクトル、ｐＢＲ３２２及
びＨＳＶ−１（パットン株）のＵＳ領域の種々のフラグ
メントを用いて構成された。これらのプラスミドのうち
の１つ、ｐＲＷＦ６と称するものは、全ｇＤ−１遺伝子
を含むことが見い出された。ｐＲＷＦ６の説明は、以下
の如くである。6.2.1. Recombinant DNA Plasmids Containing Defined Portions of the Us Region of HSV-1 Several recombinant plasmids were constructed using the vector pBR322 and various fragments of the US region of HSV-1 (Patton strain). One of these plasmids, designated pRWF6, was found to contain the entire gD-1 gene. The description of pRWF6 is as follows.

組換えプラスミドｐＲＷＦ６のＨＳＶ−１挿入（第１Ｃ
図）Ｆ、ラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−Ｈクローンの
Ｕｓ領領域ら得られた（ＵｍｅｎｅおよびＥｎｇｕｉｓ
ｔ，１９８１、Ｇｅｎｅ１３；２５１）。HSV-1 insertion of recombinant plasmid pRWF6 (1C
Figure) F, Lambda gtWES: Obtained from the Us region of the EcoRI-H clone (Umene and Enguis
t, 1981, Gene 13; 251).

ラムダｇｔＷＥＳ：Ｅｃｏ　ＲＩ−Ｈクローンは消化さ
れ、ＥｃｏＲＩとの補体になった（全消化）。Lambda gtWES: Eco RI-H clone was digested and complemented with Eco RI (total digestion).

ラムダｇｔＷＥＳ：ＥｃｏＲＩ−ＨクローンはのＥｃｏ
ＲＩ−Ｈフラグメント、約１５〜１６ｋｂ［キロ塩基（
ｋｉｏｂａｓｅ）］は、ＨＳＶ−１の全Ｕｓ領域を含ん
でいる。Lambda gtWES:EcoRI-H clone is Eco
RI-H fragment, approximately 15-16 kb [kilobases (
kiobase] contains the entire Us region of HSV-1.

プラスミド、ｐＢＲ３２２及びＨＳＶ−１のＥｃｏＲ−
Ｈフラグメン（上記で単離された）は、各々ＢａｍＨＩ
によって全体的に消化された。Plasmids, pBR322 and HSV-1 EcoR-
H fragments (isolated above) were each BamHI
digested in its entirety.

ｐＢＲ３２２の得られた４．４ｋｂのフラグメント及び
ＨＳＶ−１の６：４ｋｂのフラグメントをアンニールし
、そして１：１の比率で配位し、ｐＲＷＦ６を得た。The resulting 4.4 kb fragment of pBR322 and the 6:4 kb fragment of HSV-1 were annealed and coordinated in a 1:1 ratio to yield pRWF6.

６．２．２．ｇＤ−１特定ｍＲＮＡ解読配列の位置付け ｐＲＷＦ６内でｇＤ−１のため特定の解読配列を位置付
けし、そして、選択するために、ウィルスＤＮＡインサ
ートを、再びｐＢＲ３２２中ヘリプクローン化した。サ
ブクローンｐＳＣ３０−４の変性のおこったウィルスＤ
ＮＡ制限フラグメント（第１Ｄ図及び以下説明する。）
は、ニトロセルロ−ス上に固定化され、そして、ＨＳＶ
−１感染細胞の胞胞質ＲＮＡ抽出分からｍＲＮＡ（相補
的塩基ペアの交雑を通して）単離するために用いられた
。２つのｍＲＮＡ種（３．０ｋｂ及び１．７ｋｂ）は、
ｐＳＣ３０−４と交雑化（ハイブリッド化）した。試験
管内のこれらのｍＲＮＡの翻訳では３．０ｋｂの或いは
１．７ｋｂのｍＲＮＡがｇＤ−１タンパク質をエンコー
ドしたことを示していた。6.2.2. Locating the gD-1 specific mRNA coding sequence To locate and select the specific coding sequence for gD-1 within pRWF6, the viral DNA insert was again helip-cloned into pBR322. Virus D with degeneration of subclone pSC30-4
NA restriction fragment (Figure 1D and explained below)
was immobilized on nitrocellulose and HSV
Cytoplasmic RNA extracts of -1 infected cells were used to isolate mRNA (through complementary base pair hybridization). The two mRNA species (3.0 kb and 1.7 kb) are
It was hybridized with pSC30-4. Translation of these mRNAs in vitro showed that 3.0 kb or 1.7 kb mRNA encoded gD-1 protein.

処理の詳細は、以下に述べられ、第１図に示される。Details of the process are described below and illustrated in FIG.

プラスミド、ｐＲＷＦ６を、Ｅ．コリ形質転換体より単
離した。そして、制限酵素、Ｓａｃｌによって消化され
た。これにより３つのフラグメントを作った。即ち、全
ｐＢＲ３２２ベクトルと、ＨＳＶ−１ＤＮＡ配列の一部
を含む６．２ｋｂのフラグメント、２．９ｋｂのＨＳＶ
ＤＮＡフラグメント及び１．７ｋｂのＨＳＶ−１ＤＮＡ
フラグメントである。The plasmid, pRWF6, was derived from E. It was isolated from a coli transformant. It was then digested with the restriction enzyme Sacl. This created three fragments. That is, the entire pBR322 vector, a 6.2 kb fragment containing part of the HSV-1 DNA sequence, and a 2.9 kb HSV
DNA fragment and 1.7kb HSV-1 DNA
It is a fragment.

２．９ｋｂのＨＳＶ−１ＤＮＡフラグメント（第１Ｄ図
参照）をサブクローン化するために、ｐＢＲ３２２をＰ
ｖｕＩＩ（ｐＢＲ３２２を線状化する）によって開裂し
、そしてＳａｃＩリンカ−（結合剤）の存在化にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて配位せしめた。（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｒｅｒｌｙ
、Ｍａ）。従って、ｐＢＲ３２２の独特ＰｖｕＩサイト
が独特Ｓａｃｌサイト（ＳａｃＩ（ＰｖｕＩＩ（−）〉
と称す）に変換された。ＳａｃＩ酵素ににつて修飾ｐＢ
Ｒ３２２ベクトルを開裂した後に、このベクトルを、２
，９ｋｂのＨＳＶ−１ＳａｃＩＤＮＡフラグメントによ
り配位し、そしてｐＳＣ３０−４得た。この組替えプラ
スミドをＥ．コリの形質転換に用いた。形質転換体をス
クリーンし、ミニリゼイト技術（Ｃｌｅｗｅｌｌおよび
Ｈｅｌｉｎｓｋｉ、１９７０、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９：４
４２８）を用いて制限マッピングにより選択した。To subclone the 2.9 kb HSV-1 DNA fragment (see Figure 1D), pBR322 was
cleaved by VuII (linearizes pBR322) and in the presence of a SacI linker (binding agent) T4D
Coordination was performed using NA ligase. (New Eng.
land Biolabs, Inc., Berery
, Ma). Therefore, the unique PvuI site of pBR322 is the unique Sacl site (SacI(PvuII(-)〉
) was converted into Modified pB for SacI enzyme
After cleavage of the R322 vector, this vector was
, 9 kb HSV-1 Sacl DNA fragment and yielded pSC30-4. This recombinant plasmid was transferred to E. It was used for transformation of coli. Transformants were screened using the minilysate technique (Clewell and Helinski, 1970, Biochem, 9:4).
428) by restriction mapping.

サブクローンｐＳＣ３０−４を、ｍＲＮＡ交雑化選択の
ために次の如く用いた：（Ｒｉｃｃｉａｒｄｏら，１９
７９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．，Ｕ．
Ｓ．Ａ．７６：４９２７）。プラスミドｐｓＣ３０４を
Ｅ、コリ形質転換体より単離した。Subclone pSC30-4 was used for mRNA hybridization selection as follows: (Ricciardo et al., 19
79. Proc, Natl, Acad, Sci. , U.
S. A. 76:4927). Plasmid psC304 was isolated from an E. coli transformant.

そして、２００μｇのｐｓＣ３０−４ＤＮＡをＳａｃｌ
によって消化し、ＨＳＶ−１ＤＮＡインサートを切除し
た。開裂されたプラスミドを、クロロホルム／フェノー
ル（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈澱せしめた
。沈澱物を２ｍｌの０．３Ｍ　ＮａＯＨ中に再懸濁し、
室温で１０分間培養し、ＤＮＡを変性した。この懸濁物
を次に、４，４ｍｌ蒸溜水、０．２ｍｌ３Ｍ　ＨＣｌ，
０．２ｍｌ１Ｍ　トリスＨＣｌ　（ｐＨ７．５）及び３
ｍｌ２０×ＳＳＣ（ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）の添加によっ
て中和した。指示紙ににって測ったｐＨは、６〜８の間
であった。変性され、中和されたＤＮＡを、２５ｍｍニ
トロセルロースフィルター（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒとＳ
ｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ．Ｎ．Ｈ．）を通して真空濾
過し、それを蒸留水中に予備浸をし、次に６×ＳＳＣで
行った。真空濾過後ニトロセルローズフイルターを６×
ＳＳＣで洗浄し、乾燥し、そして８０℃２時間焼成した
。半分のニトロセルロースフィルターを、次に概略する
如く、交雑化処理に用いた。Then, 200 μg of psC30-4 DNA was added to Sacl
The HSV-1 DNA insert was excised. The cleaved plasmids were extracted with chloroform/phenol (1:1) and ethanol precipitated. The precipitate was resuspended in 2 ml of 0.3 M NaOH,
The DNA was denatured by culturing at room temperature for 10 minutes. This suspension was then mixed with 4.4 ml distilled water, 0.2 ml 3M HCl,
0.2ml 1M Tris HCl (pH 7.5) and 3
ml20×SSC (SSC is 0.15M NaCl,
Neutralized by addition of 0.015M sodium citrate). The pH measured on indicator paper was between 6 and 8. The denatured and neutralized DNA was filtered through a 25 mm nitrocellulose filter (Schleicher and S
chuell, Keene. N. H. ), which was presoaked in distilled water and then run on 6x SSC. After vacuum filtration, pass through a nitrocellulose filter 6x.
Washed with SSC, dried and calcined at 80° C. for 2 hours. Half of the nitrocellulose filters were used for hybridization as outlined below.

ウィルスＤＮＡを含むニトロセルロースを小さな片に切
って、全細胞質ＲＮＡにより培養し、そのＲＮＡは、次
の如く作ったＨＳＶ感染ベロ細胞のリゼイトから単離し
たものである。ベロ細胞を、１０プラーク形成単位（ρ
ｆｕ）／細胞により感染せしめ、そして、７時間３７℃
でデュルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の媒体中で培養し
た。それは１０μｇ／ｍｌのシタラビン（ｃｙｔａｒａ
ｂｉｎｅ）（β−チトシン　アラビノシ■）をＤＮＡ複
製を防止するために添加したしのである。細胞を０．６
５％ＮＰ−４０により、０．１５ＭＮａＣｌ．１．５ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２及び０．０１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
９）中で溶菌した。核を、３０００ｘｑ，２分間の遠心
分前により沈降せしめた。そしてその上澄みを、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）及び０．５％ＳＤＳの最終濃度
に調製した。溶液を、２度クロロホルム／フェノール（
１：１）により抽出し、更に１度クロロホルムにより抽
出した。Nitrocellulose containing viral DNA was cut into small pieces and cultured with total cytoplasmic RNA, which was isolated from lysates of HSV-infected Vero cells made as follows. Vero cells were divided into 10 plaque-forming units (ρ
fu)/cells and incubated at 37°C for 7 hours.
The cells were cultured in Dulbecco's medium. It contains 10 μg/ml cytarabine (cytara
Bine) (β-cytosine arabinosine) was added to prevent DNA replication. 0.6 cells
With 5% NP-40, 0.15M NaCl. 1.5m
M MgCl2 and 0.01 M Tris HCl (pH 7.
9) The bacteria were lysed in the medium. Nuclei were sedimented by centrifugation for 2 minutes at 3000xq. Then, the supernatant was mixed with 1mM
A final concentration of EDTA (pH 7.9) and 0.5% SDS was prepared. The solution was diluted twice with chloroform/phenol (
1:1) and further extracted once with chloroform.

細胞質ＲＮＡをエタノール沈降せしめ（ベロ細胞の１つ
の前面ローラーボトルで約１．５ｍｇＲＮＡを得た）、
そして部分的に乾燥した。ＲＮＡ沈降物（約０．４〜０
．８ｍｇＲＮＡ）を、４００μｌの交雑化バッファ（５
０％ホルムアミド、Ｏ．４Ｍ　ＮａＣｌ，４０ｍＭ　Ｐ
ＩＰＥＳ、ｐＨ６．４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１％ＳＤ
Ｓ）中に溶解せしめ、そして細断ニトロセルロースフィ
ルターに添加した。突筒化は、５５℃３時間で振とうし
、水槽中で行なわれた。Cytoplasmic RNA was ethanol precipitated (approximately 1.5 mg RNA was obtained in one front roller bottle of Vero cells);
and partially dried. RNA precipitate (approximately 0.4-0
．． 8 mg RNA) in 400 μl of hybridization buffer (5
0% formamide, O. 4M NaCl, 40mM P
IPES, pH 6.4, 1mM EDTA and 1% SD
S) and added to a shredded nitrocellulose filter. The tube formation was performed in a water bath with shaking at 55° C. for 3 hours.

フィルター片を次に１０回、０．５％ＳＤＳを含むＳＤ
Ｓにより６０℃で洗浄し、次に、ＳＳＣ中の１ｍｌ　２
ｍＭ　ＥＤＴＡで６０℃で２回洗浄した。最後に、フィ
ルター片を、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０，６０℃で
５分間洗浄した。溶液を除去し、フィルター片をよく、
綿棒（コットンスワブ）で乾燥した。The filter pieces were then washed 10 times with SD containing 0.5% SDS.
Wash at 60 °C with SSC, then 1 ml 2 in SSC
Washed twice with mM EDTA at 60°C. Finally, the filter pieces were washed with 2mM EDTA, pH 8.0, 60°C for 5 minutes. Remove the solution and clean the filter pieces well.
Dry with a cotton swab.

交雑化ｍＲＮＡを、ホルムアミド及びヒートを用いて、
次の如くニトロセルロース片から溶離した。１２０μｌ
９５％ホルムアミド／１０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５
）をフィルターに添加し、５分間６５℃で培養した。溶
離液をマイクロ遠心分離管に移し、そして、水中に保持
した。第２の１２０μｌの溶液バッファをニトロセルロ
ース片に添加し、再び６５℃で５分間培養した。この溶
離液を、第２のマイクロ遠心分離管に移し、氷上に保持
した。滅菌蒸留水の７２０μｌアリコットをフィルター
に添加し、次に攪拌した。約３６０μｌを、次に、溶離
液を含む各マイクロ遠心弁分離管に移した、マイクロ遠
心分離管の溶離ＲＮＡに、２０μｌ５Ｍ　ＮａＣｌ，５
μｇ適当な担体（例えば、うさぎ肝ｔＲＮＡ）及び１ｍ
ｌ無水エタノールを添加した。ＲＮＡをその混合物の１
時間−７０℃のインキュベートすることにより、或いは
管をドライアイス／ＥｔｏＨスラリーに２０分間浸すこ
とにより沈降せしめた。沈降ＲＮＡを、マイクロ遠心分
離でべレット化した（１０分間、１２．０００×ｇで）
、そして１つの管の沈降物を１ｍｌバッファ（０．５Ｍ
　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）及
び０．５％ＳＤＳ）中に再懸濁し、ＲＮＡを溶解した。The hybridized mRNA was purified using formamide and heat.
It was eluted from the nitrocellulose piece as follows. 120μl
95% formamide/10mM PIPES (pH 6.5
) was added to the filter and incubated at 65°C for 5 minutes. The eluate was transferred to a microcentrifuge tube and kept in water. A second 120 μl of solution buffer was added to the nitrocellulose pieces and incubated again at 65° C. for 5 minutes. This eluate was transferred to a second microcentrifuge tube and kept on ice. A 720 μl aliquot of sterile distilled water was added to the filter and then vortexed. Approximately 360 μl was then transferred to each microcentrifuge tube containing the eluent, 20 μl 5M NaCl, 5
μg suitable carrier (e.g. rabbit liver tRNA) and 1 m
1 of absolute ethanol was added. RNA to one part of the mixture
Sedimentation was achieved by incubation at -70°C for an hour or by immersing the tubes in a dry ice/EtoH slurry for 20 minutes. Precipitated RNA was pelleted by microcentrifugation (10 min at 12,000 x g).
, and the sediment from one tube was added to 1 ml buffer (0.5 M
RNA was dissolved by resuspending in NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) and 0.5% SDS).

溶解ＲＮ△を、複管に加え、アリコットを合わせて、全
ての沈降ＲＮＡを溶解した。ポリアデニル化ＲＮＡ［ポ
リ（Ａ）ＲＮＡ］を、オリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉ
ｅｓ　，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）を用
いるクロマトグラフにより溶解ＲＮＡより単離した。ポ
リ（Ａ）ＲＮＡを、溶離バッファとして１０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ７，９）及び０．１％ＳＤＳを用いてオリ
ゴ（ｄＴ）セルロースより溶離した、ポリ（Ａ）ＲＮＡ
を次に、上記の如く、エタノール沈降せしめた。Lysed RNAΔ was added to multiple tubes and aliquots were combined to dissolve all precipitated RNA. Polyadenylated RNA [poly(A) RNA] was added to oligo(dT) cellulose (Be
thesda Research Laboratovi
es, Inc. , Rockville, Md. ) was isolated from dissolved RNA by chromatography. Poly(A) RNA was eluted from oligo(dT) cellulose using 10 mM Tris HCl (pH 7,9) and 0.1% SDS as elution buffer.
was then ethanol precipitated as described above.

ｐＳＣ３０−４ＤＮＡと交雑化したｍＲＮＡの２つの種
を単離した。３．Ｏｋｂの及び１．７ｋｂのｍＲＮＡ、
これらの２つの種類を、試験管内で、３５Ｓ−メチオニ
ンを含むうさぎ網状赤血球細胞フリーのシステムを用い
て翻訳せしめた。（Ｐｅｌｈａｍ及びＪａｃｋｓｏｎ，
１９７６．Ｅｕｒ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７：２４７
）。Two species of mRNA that hybridized with pSC30-4 DNA were isolated. 3. Okb and 1.7 kb mRNA,
These two types were translated in vitro using a rabbit reticulocyte cell-free system containing 35S-methionine. (Pelham and Jackson,
1976. Eur, J. Biochem, 67:247
).

試験管内翻訳抽出弁を、ｇＤ−１に対して関するモノク
ローン抗原４Ｓ（Ｍ．Ｚｗｅｉｇ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈによって供さ
れた）によって免疫沈降せしめ、そして上記の如＜、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥのために作られた。細胞−フリーの翻訳
シスツムの免疫沈降プロティン生成物を電気泳動分析や
ると、これらの選択されたｍＲＮＡは、５０，０００ダ
ルトンのｇＤ−１特定タンパク賀（データ提示せず）を
特定していたことを示した。In vitro translation extraction valves were prepared using the monoclonal antigen 4S (M. Zweig, National
provided by the Institute of Health) and immunoprecipitated as described above.
Created for DS-PAGE. Electrophoretic analysis of the immunoprecipitated protein products of the cell-free translation system revealed that these selected mRNAs identified the 50,000 Dalton gD-1 specific protein (data not shown). showed that.

ｇＤ−１タンパク質の大きさ大きさに従い、最小のｍＲ
ＮＡ解読配列は、約１．６ｋｂであろう。従って、ｍＲ
ＮＡ指導（リーダー）配列及びポリ（Ａ）テイルを数え
、大きなく３．０ｋｂ）ｍＲＮＡが、ｇＤ　１ポリペブ
チドをエンコードしていると思われた。According to the size of gD-1 protein, the minimum mR
The NA decoding sequence will be approximately 1.6 kb. Therefore, mR
A large (3.0 kb) mRNA appeared to encode the gD1 polypeptide, counting the NA leader sequence and poly(A) tail.

６．２．３．ｇＤ−１　ｍＲＮＡの特色ｐｓｃ３０−４
内の３．０ｋｂのｍＲＮＡ配列の位置をマッピングする
こと及びｍＲＮＡの特色づけることは、Ｓｌマッピング
により、即ち、単一鎖の特定ヌクレアーゼＳ１、及びエ
キソヌクレアーゼ■を用いて、ＤＮＡプルーブの領域を
マップし、それは、相補的ｍＲＮＡ配列と交雑すること
によって達成された［バークとシャープ（Ｂｅｒｋａｎ
ｄ　Ｓｈａｒｐ）１９７８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、７５：１２７４）。6.2.3. Features of gD-1 mRNA psc30-4
Mapping the location of the 3.0 kb mRNA sequence within and characterizing the mRNA was done by Sl mapping, i.e. using the single-stranded specific nuclease S1 and the exonuclease ■, to map the region of the DNA probe. , which was achieved by hybridizing with complementary mRNA sequences [Berkan and Sharpe
d Sharp) 1978. Proc, Natl, Ac
ad, Sci, U,S,A, 75:1274).

そして、ｇＤ−１遺伝子解読領域のＤＮＡを配列するこ
と（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８０．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｌｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４９
９）によってなされた。and sequencing the DNA of the gD-1 gene coding region (Maxam and Gilbert, 1980.
thods in Enzymology, 65:49
9).

ＳＩマツピング技術は、３．０ｋｂ及び１．７ｋｂのｍ
ＲＮＡ種の両方が重ね継がれていないこと（即ち、介在
する配列或いはイントロン（介在配列）を含んでないこ
と）及び、それらは、異なる５′−末端で、しかし共通
の３′−末端を持つことを示していた。３．０ｋｂのｍ
ＲＮＡの５′−末端の解読領域を含む１０６８のヌクレ
オチドＤＮＡ配列が決定された。そして、翻訳の読み取
りフレームが、５′−末端に最も近い開始コドン（Ａ丁
Ｇ〉を位置ぎめ（局在化）することによって演綾（推論
）された。SI mapping technology supports 3.0 kb and 1.7 kb m
Both RNA species are not spliced (i.e., do not contain intervening sequences or introns) and they have different 5'-ends but a common 3'-end. It was showing. 3.0kb m
A 1068 nucleotide DNA sequence containing the 5'-terminal coding region of the RNA was determined. The reading frame for translation was then deduced by locating the initiation codon (AG) closest to the 5'-end.

Ｓ１マツピング技術の原理は、ＲＮＡと放射標識の単一
鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）プルーブ（例えば、ｐＳＣ３
０−４から得た）の間の二重鎖形成を行なうことである
。ＲＮＡが成熟スプライスのｍＲＮＡである場合、イン
トロンが、ｓｓＤＮＡループを形成するものである。酵
素ヌクレアーゼＳ１は、ＲＮＡとの二重鎖形成で保護さ
れていない放射標識ＤＮＡのｓｓＤＮＡ領域を全て消化
する。The principle of the S1 mapping technique is to combine RNA with a radiolabeled single-stranded DNA (ssDNA) probe (e.g., pSC3).
0-4)). When the RNA is mature spliced mRNA, the intron is what forms the ssDNA loop. The enzyme nuclease S1 digests all ssDNA regions of the radiolabeled DNA that are not protected by duplex formation with RNA.

一方、エキソヌクレアーピ■は、末端のみのｓｓＤＮＡ
を消化し、従って、ｓｓＤＮＡループを消化しない。こ
れらのヌクレアーゼに対して受け入れやすくないＤＮＡ
の大きさを（ＲＮＡに対する交雑化によって）比較する
ことにより、スプライスのｍＲＮＡ転写体の検出を可能
にする。On the other hand, exonucleapi■ is a terminal-only ssDNA.
, and therefore does not digest the ssDNA loop. DNA that is not receptive to these nucleases
Comparing the size of (by hybridization to RNA) allows detection of spliced mRNA transcripts.

本発明において、３．０ｋｂｍＲＮＡの５′−末端を位
置きめめするために用いた成用標識ＤＮＡは、３２Ｐｄ
ｅ（上記のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法によ
り、酵素、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて）そのＢ
ｓｔＥＩＩ５’−末端で，ＢａｎＨＩの開裂の前にラベ
ルされた。３．０ｋｂのｍＲＮＡの３′−末端を局在化
するに用いた放射標識のＤＮＡは、３２ｐで、（Ｍａｘ
ａｍとＧｉｌｂｅｒｔ、上記の方法により、ＤＮＡポリ
メラーゼのクレナウフラグメントを用いて）、そのＨｉ
ｎｄＩＩＩ３’−末端を、ＳａｌＩの開裂の前にラベル
した。細胞質ｍＲＮＡを、上記の如くシタラビンの存在
化７時間成長させたＨＳＶ−１感染ベロ細胞から単離し
た。用いたＳ１マッピング技術は、ＢｅｒｋとＳｈａｒ
ｐの処理法（Ｗｓｔｓｏｎら、１９８１．Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ、３７；４３１）の変更法であった。ｇＤ−１ｍＲＮ
Ａの５′−末端は、ｐＳＣ３０−４のＨｉｎｄＩＩＩさ
いどのそばにマップした、一方、３′−末端は、約２．
８ｋｂ下にマツプした。（第１ｄ図）。In the present invention, the labeled DNA used to locate the 5'-end of 3.0 kb mRNA was 32Pd
e (using the enzyme polynucleotide kinase according to the method of Maxam and Gilbert above) that B
The stEII 5'-end was labeled prior to BanHI cleavage. The radiolabeled DNA used to localize the 3'-end of the 3.0 kb mRNA was 32p, (Max
am and Gilbert, using the Klenow fragment of DNA polymerase), the Hi
The ndIII 3'-end was labeled prior to SalI cleavage. Cytoplasmic mRNA was isolated from HSV-1 infected Vero cells grown for 7 hours in the presence of cytarabine as described above. The S1 mapping technique used is Berk and Shar
(Wstson et al., 1981. J. Viro
1, 37; 431). gD-1mRN
The 5'-end of A mapped next to the HindIII end of pSC30-4, while the 3'-end was approximately 2.
I mapped it down 8kb. (Figure 1d).

最後に、ｐＳＣ３０−４のＨＳＶ−１ＤＮＡを、Ｍａｘ
ａｍとＧｉｌｂｅｒｔの方法を用いて配列した。第２図
はＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子解読領域のための配列づけ戦略
を示す。解読及び非解読鎖の両方が配列された。第３図
は、ＨＳＶ−１ｇＤ遺伝子のために得られたＤＮＡ配列
を示す。ＤＮＡ配列は、位置２４１のＡＴＧから伸びて
いる３９４のコドンの開いた読とりフレームを含んでい
たことは明らかであった。このサイトは、ｇＤ−１遺伝
子の開始剤（イニシエイター）であると思われた、そし
て、それはこの推定ｇＤ−１遺伝子を、発現ベクトルｐ
ＪＳ４１３中にクローン化することによって、それであ
ることが示された（第６，３項参照）６．３．ｇＤ−１
遺伝子のクローニングと発現ｇＤ−１解読配列は、ｌａ
ｃプロモータの制御下に置かれた。この目的に対して、
推定上のｇＤ１遺伝子の一部（以下（ｇＤ−１遺伝子と
称する）は、始めの配列、ＡＴＧ及びアミノ解読末端（
遺伝子の５’一端）の第１の１５６のヌクレオチドを欠
いているが、ＤＮＡクローン化発現ベクトル、ｐＪＳ４
１３中へ配位され、ｐＥＨ２５を形成する（第４図参照
）。部分的ｇＤ−１遺伝子は挿入され、タンパク質解読
配列は、正しい読みとりフレーム中に、ベクトルの始め
のＡＴＧに関して、あるようにされた。その結果、転化
ｍＲＮＡ次の翻訳は、ベクトルの始めの配列（ＡＴＧ）
で開始され、ｇＤ−１遺伝子（それ自体の初めのＡＴＧ
及びｇＤ−１解読配列の第１の１５６のヌクレオチドを
欠く）を通して、ｇＤ−１天然の終止信号まで行く。Finally, HSV-1 DNA of pSC30-4 was
The sequence was performed using the method of Am and Gilbert. Figure 2 shows the sequencing strategy for the HSV-1gD gene coding region. Both the decoding and non-decoding strands were sequenced. Figure 3 shows the DNA sequence obtained for the HSV-1gD gene. It was clear that the DNA sequence contained an open reading frame of 394 codons extending from ATG at position 241. This site appeared to be the initiator of the gD-1 gene, and it was possible to direct this putative gD-1 gene into the expression vector p
This was shown to be the case by cloning into JS413 (see Section 6.3) 6.3. gD-1
Gene Cloning and Expression The gD-1 decoding sequence is la
It was placed under the control of the c promoter. For this purpose,
A part of the putative gD1 gene (hereinafter referred to as gD-1 gene) consists of the initial sequence, ATG and the amino-decoded end (
The DNA cloned expression vector, pJS4, lacks the first 156 nucleotides of the 5' end of the gene).
13 to form pEH25 (see Figure 4). A partial gD-1 gene was inserted so that the protein coding sequence was in the correct reading frame with respect to the ATG at the beginning of the vector. As a result, the inverted mRNA subsequent translation is directed to the starting sequence (ATG) of the vector.
gD-1 gene (its own initial ATG
and missing the first 156 nucleotides of the gD-1 coding sequence) to the gD-1 natural stop signal.

ｇＤ−１遺伝子を含むｐＥＨ２５プラスミドは、Ｅ．コ
リ宿主株を形質変換するために用いられ、そこでは、ｌ
ａｃオペロンからのＤＮＡの転化がプロモータが特別に
導かれない限り阻害される。第１義的形質転換体は、薬
耐性のためにアッセイ（検定）された（アンピシリン耐
性遺伝子をベクトル中に運ぶ）。得られる組換えプラス
ミド、ｐＥＨ２５の構造は、制限分析及びＤＮＡ配列づ
けによって確められる。ｐＥＨ２５形質転換体の導入に
よって、４６，０００ダルトンのポリペプチドが生成さ
れ、それはＨＳＶに対して関係する抗血清あるいはｇＤ
に対して関係するモノクローンの抗体のいずれについて
も免疫沈澱性である。The pEH25 plasmid containing the gD-1 gene was derived from E. coli host strain, where l
Conversion of DNA from the ac operon is inhibited unless the promoter is specifically directed. The primary transformants were assayed for drug resistance (carrying the ampicillin resistance gene in the vector). The structure of the resulting recombinant plasmid, pEH25, is confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. Introduction of the pEH25 transformant produced a 46,000 Dalton polypeptide, which could be compared with the relevant antiserum against HSV or gD
It is immunoprecipitable with any of the monoclonal antibodies related to it.

６．３，１．発現ベクトルｐＪＳ４１３発現ベクトル、
ｐＪＳ４１３（第４図）は、ａｍｐｒ（β−ラクタマー
ゼ）遺伝子、ｌａｃプロモータ（Ｐｌａｃ）、ｌａｃ及
びｃｒｏリボソム結合サイト（ＳＤｌａｃ及びＳＤｃｒ
ｏは、全ての図で各々ＳＤ８及びＳＤＣＹＯＺとして表
わされる。）ｃｒｏ（ｃｒｏ）の６９のヌクレオチドを
もつ鎖初期ＡＴＧ及び修飾β−ガラクトシダーゼ遺伝子
（ｌａｃｉ−ｚ遺伝子は、以下、Ｚ−遺伝子とて称する
）を含むｐＢＲ３２２誘導体である。遺伝子を、ｐＪＳ
４１３のｃｒｏ開始ＡＴＧと、Ｚ−遺伝子の１回（即ち
、ｐＪＳ４１３のＢｇｌＩＩＩ、ＳｍａＩあるいはＢａ
ｍＨ■クローン化サイト内）の正しい読取りフレーム内
に挿入すると、形質転換細胞中の融合タンパク質の発現
ができる。しかしながら、この実施例において、Ｚ−遺
伝子を削除し、そして部分的ｇＤ−１遺伝子を、ｐＪＳ
４１３ｃｒｏ開始ＡＴＧ及びｃｒｏヌクレオチドとの和
の中に配位された。6.3,1. expression vector pJS413 expression vector,
pJS413 (Figure 4) contains the ampr (β-lactamase) gene, the lac promoter (Plac), the lac and cro ribosomal binding sites (SDlac and SDcr
o are represented in all figures as SD8 and SDCYOZ, respectively. ) is a pBR322 derivative containing a chain initial ATG with 69 nucleotides of cro (cro) and a modified β-galactosidase gene (laci-z gene is hereinafter referred to as Z-gene). Gene, pJS
413's cro-start ATG and once in the Z-gene (i.e., BglIII, SmaI or Ba of pJS413).
mH (within the cloning site) in the correct reading frame allows expression of the fusion protein in transformed cells. However, in this example, the Z-gene was deleted and the partial gD-1 gene was transformed into pJS
413 was coordinated into the sum of the cro-initiating ATG and the cro nucleotide.

ｇＤ−１遺伝子の挿入用のｐＪｓ４１３の製造するため
（第４図参照）、ｐＪＳ４１３をＳｍａＩにより（鈍い
端になる）、またＳａｃＩ（ＳａｃＩ３’−付着末端に
なる）により消化した。プロモータ、ＳＤ配列、開始Ａ
ＴＧ及び部分的ｃｒｏ配列を含む４．７ｋｂのフラグメ
ントを、ゲル電気泳動によって単離した。Ｚ−遺伝子の
５′−末端を含む１．８ｋｂのフラグメントを削除した
。To produce pJs413 for insertion of the gD-1 gene (see Figure 4), pJS413 was digested with SmaI (resulting in blunt ends) and SacI (resulting in SacI 3'-cohesive ends). promoter, SD sequence, start A
A 4.7 kb fragment containing TG and partial cro sequences was isolated by gel electrophoresis. A 1.8 kb fragment containing the 5'-end of the Z-gene was deleted.

６．３．２．ｇＤ−１遺伝子のｐＪｓ４１３への挿入ｇ
Ｄ−１遺伝子をｐＳＣ３０−４にマッピングした（６，
２．３）後に、ｇＤ−１遺伝子のカルボキシ−解読末端
の最後の１０２６ｂｐの（塩基ベア）を含む２，２ｋｂ
のＤＮＡフラグメントを、ＰＶＵＩＩ（鈍な端になる）
及びＳａｃｌ（Ｓａｃｌ３’−付着末端になる）との消
化によってｐＳＣ３０’−４から単離された（第４図）
。6.3.2. gD-1 gene insertion into pJs413g
The D-1 gene was mapped to pSC30-4 (6,
2.3) After 2.2 kb containing the last 1026 bp (base bare) of the carboxy-coding end of the gD-1 gene
DNA fragment of PVUII (blunt end)
and Sacl (resulting in a Sacl3'-sticky end) from pSC30'-4 (Figure 4).
.

２．２ｋｂのＰｖｕＩＩ／Ｓａｃｌ　ｐＳＣ３０−４フ
ラグメント及び４．７ｋｂのＳｍａＩ／ＳａｃＩ　ｐＪ
Ｓ４１３フラグメントは、１：１の比率ｒ、Ｔ４ＤＮＡ
リカーゼを用いて、配位された（第４図）。2.2 kb PvuII/Sacl pSC30-4 fragment and 4.7 kb SmaI/SacI pJ
The S413 fragment is in a 1:1 ratio r, T4 DNA
Coordination was performed using licase (Figure 4).

得られた組替えプラスミドは、Ｅ、コリ株ＮＦ１８２９
を形質転換するために用いられた。Ｅ、コリ株ＮＦ１８
２９は、ｌａｃレプレッサー過剰製造のためのｌａｃＩ
Ｑ変異を伴なうＦ’−ｌａｃエピソムを有するＫ−１２
Ｍ１０００誘導体である。Ｆ′−ｌａｃエピソム上に存
在するβ−ガクトシダーゼをエンコードするＩａｃ　Ｚ
−遺伝子は、Ｔｎｓ（トランスポゾン）挿入によって不
活性化される。従って、株ＮＦ１８２９中にｌａｃプロ
モータは、ｐＪＳ４１３プラスミド中に挿入された遺伝
子の発現を得るために導かれなければならない。The obtained recombinant plasmid was used for E. coli strain NF1829.
was used to transform. E. coli strain NF18
29 is lacI for overproduction of lac repressor
K-12 with F'-lac episome with Q mutation
It is an M1000 derivative. Iac Z encoding β-gactosidase present on the F′-lac episome
- The gene is inactivated by Tns (transposon) insertion. Therefore, the lac promoter in strain NF1829 must be introduced in order to obtain expression of the genes inserted in the pJS413 plasmid.

６．３．３．（ｇＤ−１遺伝子を発現する形質転換体の
同定 アンピシリン耐性Ｅ、コリ形質転換体から単離されたプ
ラスミドは、制限酵素マッピングにより、そしてｐＪＳ
４１３ベクトルとｇＤ−１遺伝子インサートの間の結合
のＤＮＡ配列つけによって分析された。プラスミドｐＥ
Ｈ２５（第４図〉は、ｃｒｏ−ｇＤ−１結合と交差して
正しいヌクレチド配列を持ち〈第５図に示される〉。そ
してｇＤ−１関連ポリペプチドの発現を監督するでの能
力を審査したｌａｃプロモータは、ＮＦ１８２９中で転
写上不活性であった（ｌａｃレプレサー（抑制剤）の過
剰生産により）ので、ｇＤ−１プロテインは、１ｍＭＩ
ＰＴＧあるいは１〜１０ｍＭラクトーゼのいずれかによ
るプロモータの導入によって検出のみができる。6.3.3. (Identification of transformants expressing the gD-1 gene. Plasmids isolated from ampicillin-resistant E. coli transformants were determined by restriction enzyme mapping and pJS
The linkage between the 413 vector and the gD-1 gene insert was analyzed by DNA sequencing. Plasmid pE
H25 (Figure 4), which has the correct nucleotide sequence across the cro-gD-1 binding (shown in Figure 5), was tested for its ability to direct the expression of gD-1 related polypeptides. Since the lac promoter was transcriptionally inactive in NF1829 (due to overproduction of the lac repressor), gD-1 protein was
Detection is only possible by introduction of the promoter with either PTG or 1-10 mM lactose.

ｐＥＨ２５による形質転換されたクローンは、ｇＤ−１
関連タンパク質のＩＰＴＧ特定導入のために審査され、
そしてｃｒｏタンパク質のアミノ酸（ｐＪＳ４１３内に
コードされた）及びｇＤ−１タンパク質の３４２のアミ
ノ酸（即ち、ｇＤ−１の最初の５２のアミノ酸はなくし
ている）よりなる４６，０００ダルトンのタンパク質を
製造すると見い出された。このタンパク質は、ＨＳＶ−
１に対する全うさぎ抗血清（ＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．）に
より、そして、ＨＳＶ−１のｇＤに対する特定関連のモ
ノクローン抗体（ＩＳ、４５，５５Ｓ及び５７Ｓ）（Ｓ
ｈｏｗａｌｔｅｒら、１９８１、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａ
ｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３４：６８４）により免疫沈
降されることがでる。The clone transformed with pEH25 was gD-1
screened for IPTG specific introduction of related proteins;
and produced a 46,000 Dalton protein consisting of the amino acids of the cro protein (encoded in pJS413) and the 342 amino acids of the gD-1 protein (i.e., the first 52 amino acids of gD-1 are missing). Found out. This protein is HSV-
Total rabbit antiserum against 1 (DAKO Chemica
ls, Inc. , Hicksville, N. Y. ) and specific related monoclonal antibodies against gD of HSV-1 (IS, 45,55S and 57S) (S
howalter et al., 1981, Infectiona
nd Immunity, 34:684).

モノクローン抗体１Ｓ．４Ｓ．５５Ｓ及び５７Ｓは、ｇ
Ｄ−１分子上の多くの明確なサイトを認識している（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４１
；４７８）。顕著なことには、モノクロ−ン４Ｓは、Ｈ
ＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染性を中和する能力があり、
そして両方のウィルスによって作られたｇＤタンパク質
を免疫沈降せしめる能力がある。ｐＥＨ２５によって作
られたタンパク質を、４Ｓ抗体によって免疫沈下せしめ
、それによって、ｐＥＨ２５　ｇＤ−１関連タンパク質
は、両ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ｇＤタンパク質によっ
て持たれた抗原決定因子を発現したことを示していた。Monoclonal antibody 1S. 4S. 55S and 57S are g
recognizes many distinct sites on the D-1 molecule (E
isenberg et al., 1982. J. Virol, 41
;478). Notably, Monoclone 4S is
Capable of neutralizing SV-1 and HSV-2 infectivity;
and is capable of immunoprecipitating the gD protein produced by both viruses. Proteins produced by pEH25 were immunoprecipitated with the 4S antibody, demonstrating that pEH25 gD-1-related proteins expressed antigenic determinants carried by both HSV-1 and HSV-2 gD proteins. .

更に、ｐＥＨ２５ｇＤ−１関連タンパク質を、ＨＳＶ−
１のみを中和する１Ｓモノクローン抗体によって免疫沈
降せしめた。ｐＥＨ２５ｇＤ−１関連タンパク貿もまた
、ＨＳＶ−１あるいはＨＳＶ−２感染性も中和しない５
５Ｓ及び５７Ｓモノクロ一ン抗体によって沈降せしめた
。Furthermore, pEH25gD-1 related protein was isolated from HSV-
Immunoprecipitation was performed using a 1S monoclonal antibody that neutralizes only 1. pEH25gD-1-related protein trade also does not neutralize HSV-1 or HSV-2 infectivity.
Precipitated with 5S and 57S monoclonal antibodies.

各免疫沈降体をＳＰＳ−ＰＡＧＥによって分析した。全
処理法の詳細は以下に説明する。Each immunoprecipitate was analyzed by SPS-PAGE. Details of the entire treatment method are explained below.

Ｌプロス中で３７℃で、終液培養のアリコット（静止相
）を除去し、Ｍ−９プロス中で２０倍に希釈し、３７℃
で、９０分間振動しながら成長せしめることによって全
ｐＥＨ２５形質転換体を成長せしめた（Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｕ　Ｈａｒ
ｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９
７２）。At 37°C in L Pros, an aliquot of the final culture (stationary phase) was removed, diluted 20-fold in M-9 Pros, and incubated at 37°C.
All pEH25 transformants were grown by growing with shaking for 90 minutes (Miller,
Experiments in Molecular
Genetics, Cold Spring Har
borPress, New York, N. Y. ,19
72).

ｇＤ−１タンパク質の発現のためのこれらの培養物の検
定において、１ｍＭのＩＰＩＧ及び２５μＣｉ／ｍｌ　
３５Ｓ−メチオニンを、培養物に添加した。（コントロ
ールは、３５Ｓ−メチオニンによってラベルされたが、
導入されなかった。）３７℃６０分後、培養物を遠心分
離によってペレット化〈沈降）した。細胞を容筒化し、
そして細胞内容物を解放するために、細胞の各ペレット
を、等量の容菌（リセス〉バッファ、ＩＤ−３（２０ｍ
Ｍトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＮＤ−４０，１％デオキシ
レコード及び０．１％ＳＰＳ）中に再懸濁した。直速く
液体窒素中に凍結し、そして、音波処理した。細胞リゼ
イトを、５，０００×ｇで５分間４℃で遠心分離した。In assaying these cultures for gD-1 protein expression, 1 mM IPIG and 25 μCi/ml
35S-methionine was added to the culture. (The control was labeled with 35S-methionine, but
Not introduced. ) After 60 minutes at 37°C, the culture was pelleted (sedimented) by centrifugation. Convert cells into containers,
Then, to release cell contents, each pellet of cells was washed with an equal volume of recess buffer, ID-3 (20 m
M Tris-HCL (pH 8.1), 100mM NaC
1, 1mM EDTA, 1% ND-40, 1% Deoxyrecord and 0.1% SPS). Immediately quickly frozen in liquid nitrogen and sonicated. Cell lysates were centrifuged at 5,000 xg for 5 minutes at 4°C.

そして、上澄みをアリコットに分けた。コントロール血
清（非免疫あるいは予免疫血清）あるいはテスト抵抗血
清（ＨＳＶ−１に対する多価抗血清あるいは、ｇＤ−に
対するモノクローン抗血清）を、各アリコットに添加し
た。次に、４℃６０分間培養した。（添加された抗血清
の量は、既知酊の抗原を用いた。抗血清の連結希釈物を
テストすることによる抗血清滴定を較正することによっ
て決定される。）免疫コンプレックスを、洗浄されたパ
ンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）（スタフィロコッカ
ス・オウレウス（Ｓｔａｐｈｙｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕ
ｒｅｕｓ）プロティンＡ，Ｃａｆｂｉｏｃｈｍ−Ｂｅｈ
ｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌ．）
を添加し、そして遠心分離（この処理中で全ての遠心分
離は５，０００ｘｇ５分間４℃で行った。特に述べてな
い限り）することにより採集した。ペレット化免疫沈下
物を再懸濁し、そして、ＩＰ−２（ＩＰ−３と同じだが
、２０ｍｇ／ｍｌボビン（ｂｏｖｉｎｅ）血清アルブミ
ン、ＢＳＡを非特定吸着をなくすために添加してある）
により洗浄し、そして、ＩＰ−１（２０ｍＭ　トリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ及び１％ＮＰ−４０）中に再懸濁した。この懸濁
物を新しい管に移し、その中で遠心分離をし、そしてペ
レットを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル　サンプ
ル　バッファ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０．Ｎａｔｕｒ
ｅ　２２７：６８０）中に再懸濁した。９５℃に３分間
加熱した後、サンプルを２分間１２，ＯＯＯｘｇでマイ
クロの遠心分離器中で遠心分離し、不溶性成分を除いた
。上澄みを除き、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル
（１０％）上にのせた。電気泳動後、タンパク買をコオ
マシ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）青色塗料で染色した。The supernatant was then divided into aliquots. Control serum (nonimmune or preimmune serum) or test resistance serum (polyvalent antiserum to HSV-1 or monoclonal antiserum to gD-) was added to each aliquot. Next, the cells were incubated at 4°C for 60 minutes. (The amount of antiserum added is determined by calibrating the antiserum titration by testing conjugate dilutions of the antiserum using a known intoxicant antigen.) Pansorbin (Staphylococcus aureus)
reus) Protein A, Cafbiochem-Beh
ring corp. , La Jolla, Cal. )
was added and harvested by centrifugation (all centrifugations during this procedure were performed at 5,000 x g for 5 minutes at 4°C, unless otherwise stated). The pelleted immunoprecipitate was resuspended and IP-2 (same as IP-3 but with 20 mg/ml bovine serum albumin, BSA added to eliminate non-specific adsorption)
and IP-1 (20mM Tris H
Cl (pH 8.1), 100mM NaCl, 1mMME
DTA and 1% NP-40). The suspension was transferred to a new tube, centrifuged therein, and the pellet was washed with SDS-polyacrylamide gel sample buffer (Laemmli, 1970.Natural
e 227:680). After heating to 95° C. for 3 minutes, the samples were centrifuged for 2 minutes at 12,000×g in a microcentrifuge to remove insoluble components. The supernatant was removed and loaded onto an SDS polyacrylamide gel (10%). After electrophoresis, the protein samples were stained with Coomassie blue paint.

サルチル酸ナトリウムで処理し、フルオログラフのため
に乾燥した。（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、１９７９，Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、９８：１３２）。ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結
果は、導入口より作られたｐＥＨ２５−指向４６，００
０ダルトンのｇＤ−１関連タンパク質は、ＨＳＶ−１に
対して指向の全うさぎ抗血清により、そしてモノクロー
ン抗体１Ｓ、４Ｓ、５５Ｓ及び５７Ｓにより免疫沈下せ
しめられたことを明らかに示していた。Treated with sodium salicylate and dried for fluorography. (Chamberlain, 1979, A
nal. Biochem, 98:132). The results of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) show that pEH25-oriented 46,00
It was clearly shown that 0 daltons of gD-1 related protein was immunoprecipitated by whole rabbit antiserum directed against HSV-1 and by monoclonal antibodies 1S, 4S, 55S and 57S.

最後に、競合実験を、ｐＥＨ２５によって形質転換され
たＥ、コリＮＦ１８２９中で発現された導入ｇＤ−１関
連タンパク質を免疫沈降せしめることによるＨＳＶ−１
感染ヘラ細胞のリゼイトの効果を決めるために行った（
第６図参照）。連続希釈物を、コントロール（非感染）
のリゼイト及びＨＳＶ−１感染ヘラ細胞（感染は、ベロ
細胞について上記した如く行った）から作った。モノク
ローン５５Ｓ腹水症液（ｇＤ−１特定モノクロ一ン抗体
）の１００倍希釈物の５μｌアルコツトを、ヘラ細胞リ
ゼイトの希釈物の各アリコツトに加えた。４℃３０分間
の培養の後、導入ｐＥＨ２５形質転換体のリゼイトから
の３５Ｓ−メチオニンラベルタンパク質を、ヘラ細胞リ
ピイトに添加し、そして更に６０分間４℃で培養した。Finally, competition experiments were performed on HSV-1 by immunoprecipitating introduced gD-1 related proteins expressed in E. coli NF1829 transformed with pEH25.
was carried out to determine the effect of lysate of infected Hela cells (
(See Figure 6). Serial dilutions, control (uninfected)
lysate and HSV-1-infected Hera cells (infection was performed as described above for Vero cells). A 5 μl aliquot of a 100-fold dilution of monoclonal 55S ascites fluid (gD-1 specific monoclonal antibody) was added to each aliquot of a dilution of Hela cell lysate. After incubation for 30 minutes at 4°C, 35S-methionine labeled proteins from lysates of introduced pEH25 transformants were added to the Hela cell repeats and incubated for an additional 60 minutes at 4°C.

免疫コンプレックスを、免疫沈降によって採取し、そし
て上記のごときＳＰＳ−ＰＡＧＥ及びフルオログラフに
よって分析した。特定的に免疫沈降せしめられたタンパ
ク質バンドを、ゲルからスライスし、そして放射活性を
、シンチレーション計数によって測った。第６図は、こ
れらの実験の結果を示す。Immune complexes were collected by immunoprecipitation and analyzed by SPS-PAGE and fluorography as described above. Specific immunoprecipitated protein bands were sliced from the gel and radioactivity was measured by scintillation counting. Figure 6 shows the results of these experiments.

各サンプルの放射活性は、ｐＥＨ２５の免疫沈降されラ
ベルされたタンパク質生成物をましており、コントロー
ルの％としてプロットされた。丸は、希釈されたコント
ロール（非感染）ヘラ細胞リゼイトを示している。四角
は、希釈されたＨＳＶ−ぬ感染ヘラ細胞リゼイトを示す
。これは、ＨＳＶ−１タンパク質は、５５Ｓモノクロ一
ン抗体による免疫コンプレックスの形成について、放射
線標識されたｐＥＨ２５−指向タンパク質と充分成功裏
に競合することを示している。The radioactivity of each sample was relative to the immunoprecipitated labeled protein product of pEH25 and was plotted as % of control. Circles indicate diluted control (uninfected) Hela cell lysates. Squares indicate diluted HSV-nu infected Hela cell lysate. This indicates that HSV-1 protein successfully competes with radiolabeled pEH25-directed protein for the formation of immune complexes with the 55S monoclonal antibody.

６．４．Ｃｒｏ／ｇＤ−１β−ガラクトシダーゼ融合プ
ロティンの製造を監督するｐＥＨ４−２の製造。6.4. Production of pEH4-2 to direct production of Cro/gD-1β-galactosidase fusion protein.

ｇＤ−１遺伝子をｐＥＨ２５から単離し、その末端信号
を削除した。この目的に対して、ｇＤ−１遺伝子配列を
含むＤＮＡフラグメントを、制限サイトで、ｇＤ−１終
端配列、ＴＡＧを越えて間裂せしめた。ＴＡＧはＢａｌ
３１，ＤＮＡヌクレアーゼを伴なう末端の的進型潤化に
につて次に除去された。つぎに、このｇＤ−１遺伝子フ
ラグメントは、融合タンパク質：Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β
−ガラクトシダーゼをエンコードするためにｐＪＳ４１
３中に押入された。処理法は、以下の説明及び第７図に
示される。The gD-1 gene was isolated from pEH25 and its terminal signals were deleted. For this purpose, a DNA fragment containing the gD-1 gene sequence was cleaved at restriction sites beyond the gD-1 terminal sequence, TAG. TAG is Bal
31, which was then removed by targeted lubrication of the ends with DNA nuclease. Next, this gD-1 gene fragment is converted into a fusion protein: Cro/gD-1/β
- pJS41 to encode galactosidase
3 was broken into. The processing method is illustrated below and in FIG.

プラスミドｐＥＨ２５は、消化され、ＮｒｕＩと仕上げ
、そして、前進的にＢａｌヌクレアーゼで消化された。Plasmid pEH25 was digested, finalized with NruI, and progressively digested with Bal nuclease.

得られた種々の長さのＤＮＡを次に制限酵素Ｐｓｔ■で
開裂し、フラグメントのスペクトルを得、その多くはｇ
Ｄ−末端コドンを欠き、しかし、ほどんどのｇＤ−１遺
伝子配列を保持していた。適切なＤＮＡフラグメント（
１，５〜１．９ｋｂ）を、ゲル電気泳動によって単離し
、かつ前記で説明した如く溶離せしめた。ベクトルｐＪ
Ｓ４１３は、消化され、ＰｓｔＩ及びＳｍａＩと共に仕
上げ、そして適切な５．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを
単離した（第７図）。ｐＥＨ２５フラグメントト及びｐ
ＪＳ４１３フラグメントは、１：１の比立で配意され、
Ｅ．コリＮＦ１８２９を形質転換するために用いられた
。アンピシリン耐性コロニーは、指示物アガー板上のβ
−ガラクトシターゼ活性に対して検定することによって
融合タンパク質製造について審査された。（ミラー：Ｍ
ｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｕｕ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，
Ｎ．Ｙ．，１９７２）。正のコロニーは、ＩＰＴＧで導
入された形質転換体の全リゼイトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
析によってＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼの
存在についてテストされた。１６０，０００ダルトンの
融合タンパク質の１つの高レベル生産物は、Ｃｒｏ／ｇ
Ｄ−１／β−ガクトシダーゼ融合プロティンを発現する
そのクローンから単離された。このクローンに含まれる
プラスミドはｐＥＨ４−２と称されたく第７図）。ｐＥ
Ｈ４−２により形質転換されたＥ．コリ　クローンによ
り作られた融合タンパク質は、ＩＰＴＧにより導かかれ
うるものと示され、モしてＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の
両方と交差免疫活性であると示された。ｐＥＨ４−２プ
ラスミドは単離され、そして制限マッピングとＤＮＡ−
配列づけによって分析された。ｐＥＨ４−２は、ｐＪＳ
４１３のＢａｍＨＩサイトを含まない（第８図参照）。The obtained DNAs of various lengths were then cleaved with the restriction enzyme Pst■ to obtain a spectrum of fragments, most of which were
It lacked the D-terminal codon but retained most of the gD-1 gene sequence. appropriate DNA fragment (
1.5-1.9 kb) was isolated by gel electrophoresis and eluted as described above. Vector pJ
S413 was digested, worked up with PstI and SmaI, and the appropriate 5.5 kb DNA fragment was isolated (Figure 7). pEH25 fragment and pEH25 fragment
JS413 fragments were arranged in a 1:1 ratio,
E. was used to transform E. coli NF1829. Ampicillin-resistant colonies are β on indicator agar plates.
- Fusion protein production was examined by assaying for galactosidase activity. (Mirror: M
iller,Experiments in Mole
cular Genetics, Cold Sprin
g Harbor Presuu, New York,
N. Y. , 1972). Positive colonies were tested for the presence of Cro/gD-1/β-galactosidase by SDS-PAGE analysis of total lysates of transformants introduced with IPTG. One high level product of the 160,000 Dalton fusion protein is Cro/g
was isolated from that clone expressing the D-1/β-gactosidase fusion protein. The plasmid contained in this clone is designated pEH4-2 (Fig. 7). pE
E. H4-2 transformed A fusion protein produced by the E. coli clone was shown to be driven by IPTG and was shown to be cross-immunoactive with both HSV-1 and HSV-2. The pEH4-2 plasmid was isolated and subjected to restriction mapping and DNA-
Analyzed by sequencing. pEH4-2 is pJS
413 BamHI sites are not included (see Figure 8).

ｐＥＨ３−２５と称されたプラスミドで形質転換された
他のＥ、コリ単離体は、ｐＥＩ４−２形質転換体が作っ
たよりも、少ない量のＣｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクト
シダーゼ融合タンパク質を製造した。Other E. coli isolates transformed with the plasmid designated pEH3-25 produced lower amounts of the Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein than the pEI4-2 transformant made. did.

６．４．１．ｐＥＨ４−２融合タンパク質は抗ＨＳＶ−
１血清と免疫反応する。6.4.1. pEH4-2 fusion protein is anti-HSV-
1. Reacts immunologically with serum.

ｐＥＨ４−２で形質転換されたＥ．コリによって作られ
た融合タンパク質はＨＳＶ−１に対して関係する「うさ
ぎ」抗血清と干渉した（データは示さず）。ｐＥＨ４−
２及びｐＥＨ２５のＩＰＴＧ−導入タンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって分離され、そして、ニトロセルロ
ース上に移送された（即ら、タンパク質「プロット」が
なされた）。非導入のｐＥＨ４−２及びｐＥＨ２５形質
転換体のリゼイトは、基準として、同じ手順にかけられ
た。次に、ニトロセルロースを、ＨＳＶ−１に対して関
係する「うさぎ」抗血清で処理され、そしてプロープと
して、うさぎ免疫グロブリンに対する１２５Ｉでラベル
されたゴート抗血清で処理された。（Ｔｏｗｂｉｎら、
１９７９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０）。E. coli transformed with pEH4-2. The fusion protein made by E. coli interfered with the related "rabbit" antiserum against HSV-1 (data not shown). pEH4-
IPTG-transduced proteins of 2 and pEH25 were SD
Separated by S-PAGE and transferred onto nitrocellulose (ie, protein "plots" were made). Lysates of untransfected pEH4-2 and pEH25 transformants were subjected to the same procedure as a reference. The nitrocellulose was then treated with the relevant "rabbit" antiserum against HSV-1 and, as a probe, with 125I-labeled goat antiserum against rabbit immunoglobulin. (Towbin et al.
1979, Proc. Natl. Acad. Sci. ，
U. S. A. 76:4350).

タンパク質プロットのオートラジオグラムでは、１６０
．０００ダルトンのｐＥＨ４−２特定の融合タンパク質
がＨＳＶ−１に対しての「うさぎ」抗血清で免疫反応し
たこと、及び４６，０００ダルトンのｐＥＨ２５特定ｇ
Ｄ−１関連タンパク質がＨＳＶ−１に対する「うさぎ」
抗血清で免疫反応したことを示していた。In the autoradiogram of the protein plot, 160
．． pEH4-2 specific fusion proteins of 46,000 daltons immunoreacted with the "rabbit" antiserum to HSV-1, and pEH25 specific g of 46,000 daltons.
D-1 related protein is a “rabbit” against HSV-1
This showed that there was an immune reaction with the antiserum.

６．４．２．ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血
清は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２タンパク質を免疫沈降
する。6.4.2. Antiserum against pEH4-2 fusion protein immunoprecipitates HSV-1 and HSV-2 proteins.

ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血清は、ＨＳＶ
−１ｇＤ及びＨＳＶ−２ｇＤと免疫活性であることを示
した。従って、ｐＥＨ４−２融合タンパク質は、ｇＤ特
定の抗原性決定因子を含むことを示している。これは、
ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する抗血清により免疫
沈降されたＨＳＶ−１タンパク質及びＨＳＶ−タンパク
質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを分析によって示された。以下の
議論を参照。Antiserum against pEH4-2 fusion protein
-1gD and HSV-2gD. Therefore, the pEH4-2 fusion protein is shown to contain gD specific antigenic determinants. this is,
SDS-PAGE analysis of HSV-1 and HSV-proteins immunoprecipitated by antiserum against pEH4-2 fusion protein was shown. See discussion below.

ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対でる「うさぎ」抗血清
は、次のように作られた： ｐＥＨ４−２で形質転換されたＥ．コリ　クローンは、
ミドーログ相に成長せしめられ、そして１ｍＭのＩＰＴ
Ｇによって導入された。導入後４時間して、バクテリヤ
は、遠心分離ににり沈澱せしめられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料バッファにより溶菌せしめられ、そして調整用ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上にのぼられた。電気泳動
後、タンパク質をその外側縁をコオマシー青色塗料によ
って染色づることによって可視化した。次に、１６０，
０００ダルトンの融合タンパク質バンドをゲルからスラ
イスした。ゲルスライスを液体窒素に浸け、粉末に粉砕
し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。フロインド完全アジ
ュバンドの等量を次に添加した。よく混合した後に、溶
液を、２羽のニュージーランドうさぎ（０１８及び０１
９）に皮下注射した。各うさぎに２５．５０μｇのタン
パク質を注射した。２８日後、うさぎを不完全フロイン
トのアジュバンド中に懸濁した融合タンパク質同量で促
進した。最初の注射より５５日後、耳から採血すること
によって採取した血清を、免疫沈降分析に用いた。免疫
沈降は次の如く行なった。A "rabbit" antiserum against the pEH4-2 fusion protein was made as follows: E. Cori clone is
grown to mid-log phase and 1mM IPT
Introduced by G. Four hours after introduction, bacteria were precipitated by centrifugation and subjected to SDS-PAGE.
Bacteria are lysed with sample buffer, and SD for adjustment
It was loaded onto an S-polyacrylamide gel. After electrophoresis, proteins were visualized by staining their outer edges with Coomassie blue paint. Next, 160,
000 Dalton fusion protein band was sliced from the gel. Gel slices were soaked in liquid nitrogen, ground to powder, and resuspended in PBS. An equal volume of Freund's complete adjuvant was then added. After mixing well, the solution was added to two New Zealand rabbits (018 and 01).
9) was injected subcutaneously. Each rabbit was injected with 25.50 μg of protein. After 28 days, rabbits were boosted with the same amount of fusion protein suspended in incomplete Freund's adjuvant. Serum collected by ear bleed 55 days after the first injection was used for immunoprecipitation analysis. Immunoprecipitation was performed as follows.

全面培養細胞を、ＨＳＶで、１０ｐｆμ／細胞（１０プ
ラーク形成単位／細胞）で感染せしめた。そして、感染
後１６時間３５Ｓ−メチオニンでラベルした。（ＧＢＫ
（ジョーシア　ボビン腎（Ｇｅｏｒｇｉａ　Ｂｏｖｉｎ
ｅ　Ｋｉｄｎｅｙ））細胞を、ＨＳＶ−１で感染せしめ
た。一方、ヘラ細胞を、ＨＳＶ−２で感染。ベロ細胞を
、ＨＳＶ−１あるいはＨＳＶ−２のいずれかにより感染
せしめた。）。３５Ｓ−メチオニンでラベルされたＨＳ
Ｖ−感染細胞のリゼイトを、１０μｌの予定免疫うさぎ
血清、ｐＥＨ４−２融合タンパク質に対する指向のうさ
ぎ抗血清（例えば０１８あるいは０１９抗血清）により
、あるいは、１μｌのモノクローン抗体４Ｓによって培
養した。免疫コンプレックスを、第６，３．３項に述べ
た如く、パンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）を用いて
採取し、得られた放射ラベルの免疫沈降したタンパク質
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、そしてフルオログ
ラフにかけた。ＳＰＳＰＡＧＥの結果は、 （１）ＨＳＶ−１感染ＧＢＫ細胞あるいはベロ細胞によ
り作られた５２，０００ダルトンのｇＤタンパク貿は、
ｐＥＨ４−２形質転換体により作られた融合タンパク質
に対して指向の抗血清と、免疫反応性であること、（２
）ＨＳＶ−２感染ヘラ細胞あるいは、ベロ細胞により作
られた５０，０００ダルトンのｇＤタンパク質は、ｐＥ
Ｈ４−２融合タンパク質に対する指向の抗血清及び４Ｓ
モノクローン抗体と免疫活性であることを示していた。Whole culture cells were infected with HSV at 10 pfμ/cell (10 plaque forming units/cell). The cells were then labeled with 35S-methionine for 16 hours after infection. (GBK
(Georgia Bovin Kidney)
e Kidney) cells were infected with HSV-1. Meanwhile, Hera cells were infected with HSV-2. Vero cells were infected with either HSV-1 or HSV-2. ). HS labeled with 35S-methionine
Lysates of V-infected cells were incubated with 10 μl of preimmune rabbit serum, rabbit antiserum directed against the pEH4-2 fusion protein (eg, 018 or 019 antiserum), or with 1 μl of monoclonal antibody 4S. Immune complexes were harvested using Pansorbin as described in Section 6, 3.3, and the resulting radiolabeled immunoprecipitated proteins were resolved by SDS-PAGE and fluorographed. . The results of SPSPAGE are as follows: (1) The 52,000 dalton gD protein trade produced by HSV-1 infected GBK cells or Vero cells is
being immunoreactive with an antiserum directed against the fusion protein made by the pEH4-2 transformant (2
) The 50,000 dalton gD protein produced by HSV-2-infected Hera or Vero cells is pE
Antiserum directed against H4-2 fusion protein and 4S
It was shown to be a monoclonal antibody and immunoreactive.

ＨＳＶ−１から誘導のｇＤと比べた、ＨＳＶ−２から誘
導のｇＤの見かけ上の低い分子量は、刊行された観察（
Ｒｕｙｅｃｈａｎら、１９７９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、２９
；６７７）と一致している。フルオログラフの結果は、
ＨＳＶ−１或はＨＳＶ−２感染細胞により作られたｇＤ
タンパク質がｐＥＨ４−２形質転換体により作られた融
合タンパク質に対して指向の抗血清と免疫反応性がある
ことを示していた。The apparent lower molecular weight of gD derived from HSV-2 compared to gD derived from HSV-1 is consistent with published observations (
Ruyechan et al., 1979, J. Virol, 29
;677). The fluorograph results are
gD produced by HSV-1 or HSV-2 infected cells
The protein was shown to be immunoreactive with antiserum directed against the fusion protein made by the pEH4-2 transformant.

６．４，３．ｐＥＨ４−２に対する抗血清は、試験管内
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染を中和する。6.4,3. Antiserum against pEH4-2 neutralizes in vitro HSV-1 and HSV-2 infections.

ｐＥＨ４−２融合タンパク質対づる「うさぎ」抗血清は
、ウィルス感染を中和するその能力について分析された
。ウィルス中和能力は、組織培養中の感染細胞中のプラ
ーク数の減少ににって検定した。この目的に対して、５
０〜１００ｐｆｕのＨＳＶ−１或いはＨＳＶ−２を、予
−免疫血清の希釈物に（基準：コントロール）、免疫抗
血清（０１８或いは０１９〉或いはモノクローン抗体４
Ｓに、活性血清補体（Ｃ′〉の存在下或いは不存在下で
予、め培養した。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞は、ＨＳＶ−１
或いはＨＳＶ−２の製造物によって感染された。３〜４
日後、ＨＳＶプラークを数えて、プラーク数の減少で抗
血清の効果を測定した。表１に示す結果は、各々のうさ
ぎからの抗血清は、試験管中のＨＳＶ−１及びＨＳＶ−
２を中和することができることを示している。中和は、
活性補体のないとき明らかであった。一方、補体は、顕
著に中和油性を増加した。中和は、ＨＳＶ−２に対して
よりも、ＨＳＶ−１に対する方が、より効果的であった
。A "rabbit" antiserum against the pEH4-2 fusion protein was analyzed for its ability to neutralize viral infection. Virus neutralization ability was assayed by the reduction in the number of plaques in infected cells in tissue culture. For this purpose, 5
0 to 100 pfu of HSV-1 or HSV-2 was added to a dilution of pre-immune serum (standard: control), immune antiserum (018 or 019) or monoclonal antibody 4.
Vero cells were pre-cultured in the presence or absence of active serum complement (C').
or infected with HSV-2 products. 3-4
Days later, HSV plaques were counted and the effectiveness of the antiserum was determined by the reduction in plaque number. The results shown in Table 1 show that the antisera from each rabbit were isolated from HSV-1 and HSV-1 in test tubes.
This shows that it is possible to neutralize 2. Neutralization is
was evident in the absence of active complement. On the other hand, complement markedly increased neutralizing oiliness. Neutralization was more effective against HSV-1 than against HSV-2.

示した結果ハ、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対してサブ
ユニットワクチン中のｐＥＨ４−２融合タンパク賀の有
用性を示している。The results presented demonstrate the utility of the pEH4-2 fusion protein in a subunit vaccine against HSV-1 and HSV-2.

６．４．４．ｐＥＨ４−２中のｇＤ−１遺伝子の再構成 プラスミドｐＪＳ４１３及びｐＲＷＦ６を、ｇＤ−１遺
伝子の再構成に用いた（第８図）。6.4.4. Reconstruction of the gD-1 gene in pEH4-2 Plasmids pJS413 and pRWF6 were used for the reconstruction of the gD-1 gene (Figure 8).

従って、ｐＲＷＦ６は、ＨｉｎｄＩＩＩ及び、Ｂａｌ３
１により消化され、ランダムに大きさの鈍い端のフラグ
メントのスペクトラルを生成した。これらのフラグメン
トをＳａＣｌで消化した後、２．２〜２．４ｋｂの範囲
で鈍端／ＳａｃＩフラグメントを単離した。これらのフ
ラグメントは、ｇＤ−１遺伝子のアミノ解読末端の種々
の長さを含んでいた（第８図参照）。Therefore, pRWF6 contains HindIII and Bal3
1, producing a spectrum of randomly sized blunt-end fragments. After digesting these fragments with SaCl, blunt end/SacI fragments ranging from 2.2 to 2.4 kb were isolated. These fragments contained various lengths of the amino-decoded ends of the gD-1 gene (see Figure 8).

ｇＤ−１フラグメントを、ｐＪＳ４１３にサブクローン
した。この目的に対して、ｐＪｓ４１３をＳｍａｌ■（
鈍い端となる）及びＳａｃＩ（ＳａｃＩ３′−付着末端
となる）によって消化した。４．７ｋｂのＳｍａＩ／Ｓ
ａｃＩ　ｐＪＳ４１３フラグメントは、１：１の比率の
鈍い端／Ｓａｃｌ　ｐＲＷＦ６フラグメント（２．２〜
２．４ｋｂ）によって配位され、Ｅコリ株ＮＦ１８２９
を形質転換するために用いた。これにより、プラスミッ
ドで形質転換されたクローンの数が得られ、それはその
アミン解読末端でランダムに「除去された」ｇＤ−遺伝
子を含んでいた（第８図）。全てにおいて、２４のプラ
スミド、標識されたｐＥＨ５０＋ｘ（ここでＸは１〜２
４である）は、各々約７ｋｂであり、制限酵素認識サイ
トのマッピングによって分析された。これらは、ｇＤ−
１遺伝子内にＰｖｕＩＩサイトを含んで（２４の形質転
換体のうち１９）、そして、更に、ｇＤ−１のアミノ解
読末端の最も大きな部分を含んだクローンを同定するた
めに、分析された。The gD-1 fragment was subcloned into pJS413. For this purpose, pJs413 was converted into Small (
(resulting in a blunt end) and SacI (resulting in a SacI 3'-sticky end). 4.7kb SmaI/S
The acI pJS413 fragment is a 1:1 ratio of blunt end/Sacl pRWF6 fragments (2.2~
2.4 kb) and E coli strain NF1829
was used for transformation. This resulted in a number of clones transformed with the plasmid, which contained the gD-gene randomly "deleted" at its amine-reading end (FIG. 8). In all, 24 plasmids, labeled pEH50+x (where X is 1-2
4) are each approximately 7 kb and were analyzed by restriction enzyme recognition site mapping. These are gD-
The clones containing the PvuII site within one gene (19 of 24 transformants) and also containing the largest portion of the amino-decoded ends of gD-1 were analyzed.

完全なｇＤ−１遺伝子配列において、ｇＤ開始ＡＴＧと
内部ＰｖｕＩＩサイドの間の距離は１５６の塩基ペアで
ある。従って、各々、１９のｐＥＨ５０＋×プラスミド
がＢｇｌＩＩ及びＰｖｕＩＩによって消化された。得ら
れたフラグメントは、ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩフラグメ
ントの大きさを測定するために電気泳動によって分解さ
れた。１６０のベースより小さいＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩ
Ｉフラグメントを持っ１５コのｐＥＨ５０＋ｘプラスミ
ドが同定された、即ち、第８図に示されるＢａｌ３１消
化の終点は、ｇＤ−１、開始ＡＴＧとＰｖｕＩＩサイト
の間のどこがである。これらの１５個は、ｐＪＳ４１３
プラスミドに対する配位のサイトを正確に決めるために
配列せしめられた。７つのプラスミド、ｐＥＨ５１、１
、ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６２、ｐＥＨ６６、ｐＥＨ７１、
ｐＥＨ７３及びｐＥＨ７４は、ｐＪＳ４１３のｃｒｏＡ
ＴＧの翻訳読取りフレームと相を一致して配位されたｇ
Ｄ−１配列を含んだ（第３図参照、そこでは、これらの
配位サイトは、相当するｐＥＨ数と垂直な矢印によって
示されている）。事実、ｐＥＨ５１は、すべてをエンコ
ードしているが、ｇＤ−１アミノ末端の最初の６つのア
ミノ酸である。In the complete gD-1 gene sequence, the distance between the gD initiation ATG and the internal PvuII side is 156 base pairs. Therefore, 19 pEH50+x plasmids were each digested with BglII and PvuII. The resulting fragments were resolved electrophoretically to determine the size of the BglII/PvuII fragments. BglII/PvuI smaller than the base of 160
Fifteen pEH50 + These 15 are pJS413
sequenced to precisely determine the site of coordination for the plasmid. 7 plasmids, pEH51, 1
, pEH60, pEH62, pEH66, pEH71,
pEH73 and pEH74 are croA of pJS413
g coordinated in phase with the translated reading frame of TG
D-1 sequence (see Figure 3, where these coordination sites are indicated by the corresponding pEH numbers and vertical arrows). In fact, pEH51 encodes all but the first six amino acids of the amino terminus of gD-1.

ｐＥＨ５１，ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６２及び　ｐＥＨ７１
の形質転換体は、ＩＰＩＧ誘導をもつ或いはもたない３
５Ｓ−メチオニンで標識された、そして、細胞リゼイト
をモノクローン抗体５５８で処理した。免疫沈降物は、
前記の如く、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。形
質転換体は、各々、ｐＥＨ５１，ｐＥＨ６０、ｐＥＨ６
２或いはｐＥＨ７１を含み、モノクローン５５Ｓにより
沈降する導入できるタンパク質４６，０００ダルトンを
作った（データは示さず）。pEH51, pEH60, pEH62 and pEH71
Transformants of 3 with or without IPIG induction
Cell lysates were labeled with 5S-methionine and treated with monoclonal antibody 558. The immunoprecipitate is
Analyzed by SDS-PAGE as described above. The transformants were pEH51, pEH60, and pEH6, respectively.
2 or pEH71 and produced a 46,000 Dalton introducible protein precipitated by monoclonal 55S (data not shown).

最後に、融合タンパク質をエンコードする粗替えプラス
ミドを、ｐＥＨ５１のアミノ解読末端を用いて作り、ｐ
ＥＨ４−２中に存在するｇＤ−１遺伝子配列のアミノ解
読末端を再構成した（第９図参照）。プラスミドｐＥＨ
４−２を、ＰｓｔＩ及びＳａｃ■によって消化した。そ
して、部分的にｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ遺伝子
を含む６．２ｋｂのフラグメントを単離した。プラスミ
ドｐＥＨ５１を、全体的に、ＰｓｔＩによって消化した
。Finally, a crude plasmid encoding the fusion protein was created using the amino-decoded ends of pEH51 and
The amino-decoded terminus of the gD-1 gene sequence present in EH4-2 was reconstructed (see Figure 9). Plasmid pEH
4-2 was digested with PstI and Sac■. Then, a 6.2 kb fragment partially containing the gD-1/β-galactosidase gene was isolated. Plasmid pEH51 was digested in its entirety with PstI.

しかし、ＳａｃＩＩによって部分的に消化した。ｐＥＨ
５１の１．２５ｋｂのＰｓｔＩ／Ｓａｃ■フラグメント
を、１：１の比率で、ｐＥＨ４−２の６．２ｋｂＰｓｔ
Ｉ／ＳａｃＩＩフラグメントににり配位し、ｐＥＨ８２
を形成した。形質転換体を、前記の如く、β−ガラクト
シダーゼ活性についてスクリーニングによって同定した
。ｐＥＨ５１を含有するＥ．コリ形質転換体を、Ｅ．コ
リ菌株Ｗ．Ｗ５１と称する。ｐＥＨ８２プラスミドを含
有する形質転換体は、Ｅ．コリ菌株ＷＷ８２と称する。However, it was partially digested by SacII. pEH
The 1.25 kb PstI/Sac■ fragment of pEH4-2 was added to the 6.2 kb PstI/Sac fragment of pEH4-2 in a 1:1 ratio.
I/SacII fragment and pEH82
was formed. Transformants were identified by screening for β-galactosidase activity as described above. E. containing pEH51. E. coli transformants were transformed into E. coli transformants. coli strain W. It is called W51. Transformants containing the pEH82 plasmid are E. coli strain WW82.

ＨＳＶｇＤ−１融合タンパク質は、Ｅ．コリ中に定量的
に作ることができると示す。融合タンパク質は、非常に
安定であり、多分、融合タンパク質構成自体に、あるい
は、密で、不溶性の含有体中の融合タンパク質の配列づ
けに依存している。The HSVgD-1 fusion protein is derived from E. It is shown that it can be produced quantitatively during coli. Fusion proteins are very stable, perhaps depending on the fusion protein composition itself or on the arrangement of the fusion protein in dense, insoluble inclusions.

融合タンパク質は、Ｅ、コリから抽出でき、そして、動
物を免疫化するために用いることができることを示した
。作られた抗血清は、試薬管内のＨＳＶ−１及びＨＳＶ
−２の両方のプラーク形成を中和することができる。It has been shown that the fusion protein can be extracted from E. coli and used to immunize animals. The antiserum made is HSV-1 and HSV in the reagent tube.
-2 can neutralize both plaque formation.

６．５．Ｃｒｏ／ｇＤ−１及びＣｒｏ／ｇＤ−１／β−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質を作るｐＥＨ９０−１
０ａｍＬＥ３９２の製造組換えプラスミド、ｐＥＨ９０
−１０ａｍは、適当な宿主細胞中の融合あるいは非融合
のｇＤ−１関連のタンパク質の製造を制御できるように
、構成された（第１０図参照）。6.5. Cro/gD-1 and Cro/gD-1/β-
pEH90-1 to create galactosidase fusion protein
Production of 0amLE392 Recombinant plasmid, pEH90
-10am was constructed to control the production of fused or unfused gD-1 related proteins in appropriate host cells (see Figure 10).

ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミドは、組替えプラスミド
、ｐＥＨ−９０−Ｎのシリーズから導かれた、それは、
逆に、ｐＥＨ３−２５（第６，４項で単離された）から
導かれた、そして、それは、Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質をエンコードするもので
ある。（第３図及び第１０図参照）、しかしながら、ｐ
ＥＨ−９０−Ｎシリーズは、ｐＥＨ４−２（６．４章）
と同様であり、Ｃｒｏ、ｇＤ−１及びＺ−遺伝子の翻訳
読取りフレームは、相を一致しており、ｐＥＨ−９０−
Ｎシリーズは、附加的な独特な制限エンドヌクレアーゼ
認識配列を含み、それは、ｇＤ−１運伝子及びＺ−遺伝
子の接合に位置している。The pEH90-10am plasmid was derived from a series of recombinant plasmids, pEH-90-N, which
Conversely, it was derived from pEH3-25 (isolated in section 6.4), which encodes a Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein. (see Figures 3 and 10), however, p
The EH-90-N series is pEH4-2 (Chapter 6.4)
The translation reading frames of the Cro, gD-1 and Z-genes are in phase, pEH-90-
The N series contains an additional unique restriction endonuclease recognition sequence, which is located at the junction of the gD-1 gene and the Z-gene.

ｐＥＨ−９０−Ｎシリーズの１つの形質転換体から単離
された組換えプラスミドは、ｐＥＨ−９０−１０と称さ
れ、更に、次にように修飾された。A recombinant plasmid isolated from one transformant of the pEH-90-N series was designated pEH-90-10 and was further modified as follows.

（１）ｐＥＨ−９０−１０は、ｇＤ−遺伝子配列及びＺ
−遺伝子配列の接合において、開裂された。(1) pEH-90-10 contains gD-gene sequence and Z
- Cleaved at the junction of gene sequences.

（２）次に、ｐＥＨ−９０−１０は、アンバー鎖終止配
列、ＴＡＧを含むＤＮＡ結合配列の存在下で配位された
。得られた組換えプラスミド、ｐＥＨ−９０−１０ａｍ
は、ｇＤ−１遺伝子とＺ−遺伝子の両方の翻訳配列を含
んでいる。(2) pEH-90-10 was then coordinated in the presence of a DNA binding sequence containing an amber strand termination sequence, TAG. The obtained recombinant plasmid, pEH-90-10am
contains the translated sequences of both the gD-1 gene and the Z-gene.

ｐＥＨ９０−１０ａｍを、Ｅ、コリＮＦ１８２９を形質
転換するために用いた場合は、アンピシリン耐性形質転
換体は、検出できる融合プロティンを合１戊しなかった
。しかしながら、ｐＥＨ−９０−１０ａｍ形質転換体が
、アンバー・サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含む溶加性
導入ファージφ８０ＳｕＩＩＩにより感染されたとき、
誘導された形質転換体は、Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク貿生成した。溶層性は、ｐＥ
Ｈ９０−１０ａｍ　ＳｕＩＩＩと称される。When pEH90-10am was used to transform E. coli NF1829, ampicillin-resistant transformants did not synthesize any detectable fusion protein. However, when pEH-90-10am transformants were infected with soluble transducer phage φ80SuIII containing the amber suppressor tRNA gene,
The induced transformants produced Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein. The solubility is pE
It is called H90-10am SuIII.

代替的に、ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミドは、２つの
アンバーサプレッサー変異（ＳｕｐＥ及びＳｕｐＦ）を
もつＥ、コリＬＥ３９２を形質転換するために用いた。Alternatively, the pEH90-10am plasmid was used to transform E. coli LE392, which carries two amber suppressor mutations (SupE and SupF).

ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形質転換体は、誘導あ
るいは非誘導の両方の条件下で、Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β
−ガラクトシダーゼを作った。（ＬＥ３９２細胞は、ｌ
ａｃリプレッサーの過剰製造になるＮＦ１８２９のｌａ
ｃＩａ変異をもたない。）ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３
９２形質転換体によって作られたタンパク質のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により、融合タンパク質（約１６０．００
０ダルトン）及び非融合ｇＤ−１関連タンパク質〈約３
８，０００ダルトン）の両方が製造されたこと、両方の
タンパク質は、うざぎ抗−ＨＳＶ−１血清と免疫反応す
ることが明らかになった。The pEH90-10amLE392 transformant was able to express Cro/gD-1/β under both induced and non-induced conditions.
-Made galactosidase. (LE392 cells are l
la of NF1829 resulting in overproduction of ac repressor
Does not have cIa mutation. )pEH90-10amLE3
SDS of proteins produced by 92 transformants
PAGE analysis revealed that the fusion protein (approximately 160.00
0 daltons) and unfused gD-1 related protein (approximately 3
8,000 daltons) and both proteins were found to be immunoreactive with rabbit anti-HSV-1 serum.

ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形質転換体は、ほとん
ど等モル量で両方のタンパク質を作るらしく、そして、
２つのタンパク質は、第５，５項に説明した非変性共ア
グリゲート生成処理を通して単離されるとき、共精製す
る。処理の詳細は、以下の章で説明される。pEH90-10amLE392 transformants appear to make both proteins in nearly equimolar amounts and
The two proteins co-purify when isolated through the non-denaturing co-aggregate generation process described in Section 5.5. Processing details are explained in the following sections.

６．５．１．ｐＥＨ９０−Ｎシリーズの製造第６，４項
で前に説明したように、ｐＥＨ３−２５形質転換体は、
Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質ｐＥＨ４−２形質転換体より少ない■にもかかわらず
製造スる。6.5.1. Preparation of the pEH90-N series As explained previously in Section 6.4, the pEH3-25 transformants were
The Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein was produced even though it was less than the pEH4-2 transformant.

ｐＥＨ３−２５組換えプラスミドは、ｇＤ−１のトラン
スメンブレン配列をもつ以外は、ｐＥＨ４−２と同様で
ある。（第３図参照）。トランスメンブレン配列は、宿
主細胞形質転換体中に融合タンパク質が効率的に発現し
ないことに責任があろう。The pEH3-25 recombinant plasmid is similar to pEH4-2 except that it has the transmembrane sequence of gD-1. (See Figure 3). The transmembrane sequence may be responsible for the inefficient expression of the fusion protein in host cell transformants.

発現ベクトルｐＨＫ４１４（第１０図）は、ｐＪＳ４１
３誘導体である。事実、ｐＨＫ４１４は、ｐＪＳ４１３
の要素全てを含むが、ｃｒｏ−２結合を交差して、その
独特クローン化サイトがある点で異なる。ｐＨＫ４１５
のクローン化サイトは、ＢｇｌＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩである。Ｚ−遺伝子は、ｃｒｏＡ
ＴＧとの層を一致させてなく、従って、そこなわれてい
ないプラスミドは、β−ガラクトシダーゼの製造に向け
られている。しかしながら、適切な長さ（３ｎ＋２）の
ＤＮＡフラグメントが、プラスミド上のこれらのクロー
ン化サイトのいずれかに挿入される場合、ｚ−遺伝子の
読取りフレームは、ｃｒｏＡＴＧに関して再調節され、
その場合、挿入されたＤＮＡ配列は、ｃｒｏＡＴＧある
いはＺ−遺伝子との層の中にある終止信号（例えば、Ｔ
ＧＡ、ＴＡＡあるいはＴＡＧ）を含まないという条件に
あり、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、宿主細
胞形質転換体により作られるものである。Expression vector pHK414 (Figure 10) is pJS41
3 derivative. In fact, pHK414 is pJS413
, but differs in its unique cloning site across the cro-2 junction. pHK415
The cloning sites are BglII, HindIII,
They are SmaI and BamHI. Z-gene is croA
The plasmid, which is not layer matched with TG and therefore intact, is directed to the production of β-galactosidase. However, if a DNA fragment of the appropriate length (3n+2) is inserted into any of these cloning sites on the plasmid, the reading frame of the z-gene is readjusted with respect to croATG,
In that case, the inserted DNA sequence has a termination signal (e.g. T
GA, TAA or TAG), and the β-galactosidase fusion protein is produced by the host cell transformant.

ｐＥＨ９０−Ｎシリーズは、次のように構成された（第
１０図参照）。ｐＥＨ３−２５は、第１に、ＢａｍＨＩ
によって消化された。次に、開裂されたプラスミドは、
カルボキシ−解読末端のｇＤ−１トランスメンブレン配
列を除去するためにＢａ１３１によって処理された。Ｂ
ａｌ３１消化の後に、ｐＥＨ３−２５はＰｓｔＩにより
開裂された。ＤＮＡフラグメントの数は、１．７〜１．
９ｋｂの範囲であり、ＰｓｔＩ付着末端、ａｍｐｒ遺伝
子のアミノ解読末端、ｌａｃプロモータ及び翻訳コント
ロール要素によって特色づけられており、ｇＤ−１遺伝
子は、トランスメンブレン配列の全て或は一部を削除さ
れ、そして、純な末端（ＢａｍＨＩ−）は、アガローゼ
ゲル電気泳動によって単離された。The pEH90-N series was constructed as follows (see Figure 10). pEH3-25 was first treated with BamHI
digested by. Next, the cleaved plasmid is
Treated with Bal31 to remove gD-1 transmembrane sequences at the carboxy-coding ends. B
After al31 digestion, pEH3-25 was cleaved with PstI. The number of DNA fragments ranges from 1.7 to 1.
9 kb in length and is characterized by a PstI cohesive end, an amino-coding end of the ampr gene, a lac promoter, and translational control elements, the gD-1 gene has all or part of the transmembrane sequence deleted, and , pure ends (BamHI-) were isolated by agarose gel electrophoresis.

発現プラスミド、ｐＥＫ４１４は、第１に、ＢｇｌＩＩ
によって開裂された、そして、ＢｇｌＩＩ付着末端は、
ＤＮＡポリメラーゼのクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグ
メントを用いて、充填されｑ。線状の鈍な末端ｐＨＫ４
１４を、次に、ＰｓｔＩによって消化した、そして、５
，５ｋｂのＤＮＡフラグメントは、鈍な末端（ＢＯｌＩ
Ｉ−）、Ｚ−遺伝子、ａｍｐｒ遺伝子のカルボキシ−解
読末端及びＰｓｔＩ付着末端によって特徴づけられてお
り、アガローゼセゲル電気泳動によって単離された。The expression plasmid, pEK414, first contains BglII
and the BglII cohesive end was cleaved by
Filled in using the Klenow fragment of DNA polymerase. Linear blunt end pHK4
14 was then digested with PstI and 5
, 5kb DNA fragment with blunt ends (BOII
I-), Z-gene, ampr gene, characterized by a carboxy-coding end and a PstI cohesive end, and were isolated by agarose Segel electrophoresis.

ｐＥＨ３−２５の１．７対１．９ｋｂのＰｓｔＩ／Ｂａ
ｍＩ−ＤＮＡフラグメント及びｐＨＫ４１４の５．５ｋ
ｂのＢｇｌＩＩ−／ＰｓｔＤＮＡフラグメントは、１：
１のモル比率で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、配位さ
れた。得られたｐＥＨ９０−Ｎと称したプラスミド数は
、インジクータアガー板に成表されたＥ、コリＮＦ１８
２９を形質転換するために用いた。1.7 vs. 1.9 kb of PstI/Ba in pEH3-25
5.5k of mI-DNA fragment and pHK414
The BglII-/Pst DNA fragment of b is 1:
Coordination was performed using T4 DNA ligase at a molar ratio of 1. The resulting plasmid number, designated pEH90-N, was expressed on an indicator agar plate as E. coli NF18.
29 was used for transformation.

融合タンパク質を作った２４の形質転換体の１０個から
誘導された次の組換えプラスミドを、ｇＤ−１／ｚ−遺
伝子結合を交差ＤＮＡ配列づけることによって分析した
。The subsequent recombinant plasmids derived from 10 of the 24 transformants that made the fusion protein were analyzed for gD-1/z-gene junctions by cross-DNA sequencing.

ｐＥＨ９０−２，ｐＥＨ９０−３，ｐＥＨ９０−４．ｐ
ＥＨ９０−５，ｐＥＨ９０−６，ｐＥＨ９０−７，ｐＥ
Ｈ９０−８，ｐＥＨ９０−９，ｐＥＨ９０−１０，ｐＥ
Ｈ９０−１１６よびｐＥＨ９０−１２、ｐＥＨ９０−１
２を除く全ては、トランスメンブレン配列の全て或は一
部の削除を含んでいる。ｐＥＨ９０−４及びｐＥＨ９０
−５は、トランスメンブレン配列の約半分を含む。ｐＥ
Ｈ９０−１２を除いて、これらのプラスミドは、夫々ｐ
ＥＨ４−２により作られた高いレベルにおいて、Ｃｒｏ
／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の製
造に向けられる。プラスミドｐＥＨ９０−１０は、処理
中の次の段のために選択された。（ｐＥＨ９０−１０形
質転換体によって作られたｇＤ−１融合タンパク質は、
ｐＥＨ４−２形質転換体で作られたものと同じであり、
但し、ｐＥＨ４−２形質転換体で作られたｇＤ−１の最
後の４つのアミノ酸は、ｐＥＨ９０−１０形質転換体で
作られた融合タンパク質よりなくなっている。） ６．５．２．ｐＥＨ９０−１０の製造 ｇＤ−１配列とｐＥＨ９０−１０プラスミドのｚ−遺伝
子の間に、アンバー鎖終止配列を導入するために、次の
手順を用いた（第１０図参照）。pEH90-2, pEH90-3, pEH90-4. p
EH90-5, pEH90-6, pEH90-7, pE
H90-8, pEH90-9, pEH90-10, pE
H90-116 and pEH90-12, pEH90-1
All but 2 contain deletions of all or part of the transmembrane sequence. pEH90-4 and pEH90
-5 contains approximately half of the transmembrane sequence. pE
With the exception of H90-12, these plasmids each
At the high levels produced by EH4-2, Cro
/gD-1/β-galactosidase fusion proteins. Plasmid pEH90-10 was selected for the next step in the process. (The gD-1 fusion protein produced by the pEH90-10 transformant is
It is the same as that produced by the pEH4-2 transformant,
However, the last four amino acids of gD-1 produced by the pEH4-2 transformant are missing from the fusion protein produced by the pEH90-10 transformant. ) 6.5.2. Preparation of pEH90-10 The following procedure was used to introduce an amber strand termination sequence between the gD-1 sequence and the z-gene of the pEH90-10 plasmid (see Figure 10).

ｐＥＨ９０−１０を、ＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、次に、
ＢａｍＨＩは、ｇＤ−１遺伝子とＺ−遺伝子の間の結合
に局在するその独特な制限エンドヌクレアーゼサイトに
おいて、プラスミドの開裂を行った。pEH90-10 was cleaved with HindIII and then
BamHI performed plasmid cleavage at its unique restriction endonuclease site located at the junction between the gD-1 and Z-genes.

（以下参照）。(See below).

７．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ開裂プラスミ
ドは、アガローゼ　ゲル電気泳動によって単離され、そ
して、（Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを開いて）ＤＮＡリンカ
−と配位され、それはＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＩＩＩ付
着末端及び内部ＸｂａＩサイト及びアンバー配列（ＴＡ
Ｇ）によって特徴づけられる。The 7.3 kb HindIII/BamHI cleaved plasmid was isolated by agarose gel electrophoresis and ligated (opened with T4 DNA ligase) with a DNA linker, which contained a HindIII/BamIII cohesive end and an internal XbaI site and an amber Array (TA
G).

ＤＮＡリンカ−の各々の相補鎖は、チオ−（ＣｈｏＷ）
らの１９８１、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ９（
１９）：２８０７−２８１７９の報告の同相法によって
合成された。Each complementary strand of the DNA linker is a thio-(ChoW)
1981, Nucleic Acid Res9 (
19): 2807-28179.

リンカ−を開裂プラスミドに配位した後、得られた相換
えプラスミドをＸｂａＩによって開裂した、線状の７．
３ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガローゼ　グル電気泳
動によりて単離し、そして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとの配
位によって再環化した。After ligating the linker to the cleaved plasmid, the resulting replacement plasmid was cleaved with XbaI to create a linear 7.
A 3 kb DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis and recircularized by coordination with T4 DNA ligase.

（これは、ｐＥＨ９０−１０プラスミドのために選択さ
れており、事実、それは、プラスミド上の単一のＸｂａ
Ｉサイドの存在によって示されたｇＤ−１／ｚ接合にお
いて、ＨｉｎｄＩＩＩＩとＢａｍＨＩサイトの間に配位
されたリンカ−配列を含んでいた。）配位の結果として
、ＤＮＡリンカ−のアンバー配列は、ｇＤ−１及びｚ−
遺伝子の翻訳読取りフレームと相を一致さけた（以下参
照）。(This was chosen for the pEH90-10 plasmid, and in fact it is a single Xba
The gD-1/z junction, indicated by the presence of the I side, contained a linker sequence located between the HindIII and BamHI sites. ) As a result of the coordination, the amber sequence of the DNA linker is linked to gD-1 and z-
The phase was matched to the translational reading frame of the gene (see below).

得られたプラスミドは、ｐＥＨ９０−１０ａｍと称した
。The resulting plasmid was designated pEH90-10am.

６．５．３．ｐＥＨ９０−１０ａｍ形質転換体ｐＥＨ９
０−１０ａｍをＥ．コリＮＦ１８２９を形質転換づるた
めに用いた。ＩＰＴＧで導くと、アンピシリン耐性形質
転換体は、融合プロティンを検出できるレベルに合成し
ていなかった。（ＭａｃＣｏｕｋｅｙのインジケーター
　アガー板上で赤色コロニーがない。〉形質転換体を次
にアンバーサプレッサーｔ　ＲＮＡ遺伝子を有する溶原
化導入ファージ、０８０ＳｕＩＩＩによって感染せしめ
た。ＩＰＴＧで導かれた溶原化形質転換体は、ＭａｃＣ
ｏｎｋｅｙアガー扱上に赤色コロニーを作った。これは
、融合プロティンの製造を示している。これらの溶原体
は、ｐＥＨ９０−１０ａｍＳｕＩＩＩと称した。6.5.3. pEH90-10am transformant pEH9
0-10am on E. E. coli NF1829 was used for transformation. When induced with IPTG, ampicillin-resistant transformants did not synthesize detectable levels of the fusion protein. (MacCoukey's indicator No red colonies on agar plate.) The transformants were then infected with 080SuIII, a lysogenized transducer phage carrying the amber suppressor t RNA gene. Lysogenized transformants guided with IPTG is MacC
Red colonies were created on onkey agar. This indicates the production of fusion proteins. These lysogens were designated pEH90-10amSuIII.

ｐＥＨ９０−１０ａｍプラスミドはまた、２つのアンバ
ーサプレッサー（ｓｕｐＥとｓｕｐＦ）を有するＥ、コ
リＬＥ３９２を形質転換するために用いられたが、ＮＦ
１８２９のｌａｃＩＱ変異はなかった、従って、ｌａｃ
レプレッサーを過剰に合成してはいない。これらの形質
転換体は、ｐＥＨ９０−１０ａｍ　ＬＥ３９２と称され
、ＩＰＴＧによって誘導されても或いは誘導なくても、
融合タンパク質を作った。The pEH90-10am plasmid was also used to transform E. coli LE392, which has two amber suppressors (supE and supF), but not NF.
There was no lacIQ mutation in 1829, therefore lac
It does not oversynthesize repressors. These transformants were designated pEH90-10am LE392 and were induced with or without IPTG.
A fusion protein was created.

６．５．４．ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２形質転換
体によって作ったタンパク質の分析融合タンパク質（約
１６０，０００ダルトン）及び３８．０００ダルトンの
タンパク質を、約等モル量のｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ
３９２形質転換体によって作った。各々のタンパク質は
、ＨＳＶ−１に対してのうさぎ抗血清に関して免疫反応
することが示された。この目的に対して、細胞タンパク
質は、ミニアグレゲート（小凝集）手順〈以下に説明）
によって単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され
、そしてニトロセルローズ上に移送され、次にＨＳＶ−
１に対するうざぎ抗血清によって処理され、さらにプル
ープとして、うさぎ免疫グロブリンに対す１２５Ｉ−標
識されたゴート（やぎ）抗血清によって処理された（Ｔ
ｏｗｂｉｎら、１９７９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ．，Ｕ、Ｓ、Ａ、７６：４３５０）。6.5.4. Analysis of proteins produced by pEH90-10amLE392 transformants The fusion protein (approximately 160,000 Daltons) and the 38,000 Dalton protein were transformed into approximately equimolar amounts of pEH90-10amLE.
392 transformant. Each protein was shown to be immunoreactive with rabbit antiserum against HSV-1. To this end, cellular proteins can be synthesized using a mini-aggregation procedure (described below).
isolated by SDS-PAGE, and transferred onto nitrocellulose, followed by HSV-
(T
owbin et al., 1979. Proc, Natl, Aca
d, Sci. , U, S, A, 76:4350).

次のミニアグリゲート手順を、宿主細胞アグリゲートを
スクリーニング分析のために用いた。The following mini-aggregate procedure was used to screen host cell aggregates for analysis.

（１）１００μｑ／ｍｌアンピシリンを含む新鮮なルリ
ア（Ｌｕｒｉａ）ブロス　５ｍｌを含む複製培養管を、
終液培養から得た細胞２００μａで接種し、そして、９
０分間３７℃で成長せしめた。各々複製物の１つを、１
ｍＭＩＰＴＧ（最終濃度）の添加により誘導した。接種
物を次に、攪拌しながら、更に５時間、３７℃で成長せ
しめた。(1) Replicate culture tubes containing 5 ml of fresh Luria broth containing 100 μq/ml ampicillin.
Cells obtained from final culture were inoculated with 200 μa and 9
Growth was performed at 37° C. for 0 min. one of each copy, 1
Induced by addition of mMIPTG (final concentration). The inoculum was then grown for an additional 5 hours at 37° C. with agitation.

〈２）培養物の３ｍｌアリコート中に含まれる細胞は、
２分間マイクロセントリファージ（微速１５分離器）中
で（１２，０ＯＯ×ｇ）遠心分離され沈澱物化（ペレッ
ト化）された。(2) The cells contained in a 3 ml aliquot of the culture are
The pellets were pelleted by centrifugation (12,000 x g) in a microcentriphage (15 minute separator) for 2 minutes.

（注意：マイクロセントリファージ管の全容量は、１．
５ｍｌである。従って、１．５ｍｌアリコートが第１に
ペレット化、そして、上澄みがすてられ、また１．５ｍ
ｌアリコートが加えられ、同じマイクロセントリファー
ジ管に加えられ、同じ管でペレット化された。） （３）細胞ペレットは、５０ｍＭトリスＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌを含み、ｐＨ８　２５％スクロース５０μｌ中に再懸
濁された、そして、乳化液はドライアイス／エタノール
浴中に管を入れることによって凍結された。(Note: The total volume of the microcentriphage tube is 1.
It is 5 ml. Therefore, a 1.5 ml aliquot is first pelleted and the supernatant is discarded, and a 1.5 ml aliquot is first pelleted and the supernatant is discarded.
1 aliquot was added to the same microcentriphage tube and pelleted in the same tube. ) (3) Cell pellets were prepared using 50mM Tris-HC.
The emulsion was frozen by placing the tube in a dry ice/ethanol bath.

（４）凍結懸濁液を解かし、０．２５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、ｐＨ８中の１０ｍｇ／ｍｌのリソチーム５０μ
ｌを添加し、そして懸濁液を、１０〜１５時間氷上でイ
ンキュベートした。(4) Thaw the frozen suspension and add 0.25M Tris-
10mg/ml lysozyme 50μ in HCI, pH 8
1 was added and the suspension was incubated on ice for 10-15 hours.

（５）１０〜１５分間のインキュベートの後、４００μ
ｌのＴＥＴバッファ（１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　ｐ
Ｈ８、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００：トリトンＸ−１００は、非イオン性洗
浄剤であり：ポリオキシエチレン（９，１０）ｐ−ｔｅ
ｒｔ−オクチル　フェノール）を添加した。懸濁液をや
さしく混合し、氷上で５分間インキュベートした。次に
５００μｌの２ＸＲＩＰＡ（２ＸＰＩＲＡは、２０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，４、３００ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、２％ナトリウム　デオキシコレート、２％ＮＰ−４
０，０．２％ＳＰＳである）を添加し、そして、懸濁液
をやさしく混合し、氷上で５分間インキュべートした。(5) After incubation for 10-15 minutes, 400μ
l of TET buffer (100mM Tris-HCl p
H8, 50mM EDTA, 2% Trito
n) X-100: Triton X-100 is a non-ionic detergent: polyoxyethylene (9,10) p-te
rt-octyl phenol) was added. The suspension was mixed gently and incubated on ice for 5 minutes. Next, 500μl of 2XRIPA (2XPIRA is 20mM
Tris-HCl, pH 7.4, 300mM NaC
l, 2% sodium deoxycholate, 2% NP-4
0.2% SPS) was added and the suspension was mixed gently and incubated on ice for 5 minutes.

（６）次に、懸濁液中の細胞を１０秒間、マイクロプル
ープを用いて音波処理した。そして、懸濁液をＳｏｒｖ
ａｌｌ　ＳＳ３４　ローターの中で、３０分間、２０，
００Ｏｒ．ｐ．ｍ．（４７，８００ｘｇ）で遠心分離を
行うことにより、清浄化した。(6) Next, the cells in suspension were sonicated for 10 seconds using a microprobe. Then, sorb the suspension
all SS34 in the rotor for 30 minutes, 20,
00Or. p. m. The cells were clarified by centrifugation at (47,800xg).

〈７）上澄みをデカントした。そして共アグレゲート（
凝集）タンパク質を含むペレットを５０ｍｌの蒸溜水中
で再乳化した、それに対して、５０μｌの２×サンプル
バッファ（２Ｘサンプルバツファは、１０％ＳＤＳ、４
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８，２％β−ＭＥ
及びプロモフェノール　ブルーの０．０２容積飽和溶液
よりなる）を添加し、そしてよく混合した。混合物を、
５分間沸騰し、２５μ℃アリコートを、１０％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド　ゲルについて、電気泳動のために
適用した。(7) The supernatant was decanted. and co-aggregate (
The pellet containing proteins (aggregated) was re-emulsified in 50 ml of distilled water, compared to 50 μl of 2X sample buffer (2X sample buffer is 10% SDS, 4
0mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% β-ME
and 0.02 volume saturated solution of promophenol blue) and mixed well. the mixture,
Boil for 5 min and aliquot at 25 μC in 10% SDS-
A polyacrylamide gel was applied for electrophoresis.

タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後に、
ニトロセルロース上に移送した。（即ち、タンパク質「
プロット」を行った。）。次に、ニトロセルロースを、
ＨＳＶ−１に対するうさぎ抗血清によって処理した。次
にうさぎ免疫グロブリンに対する１２５Ｉ−標識やぎ抗
血清によってプルーブ（ｐｒｏｂｅ）として行った。（
Ｔｏｗｂｉｎ，１９７９等）。After separating the proteins by SDS-PAGE,
Transferred onto nitrocellulose. (i.e. protein “
Plot" was performed. ). Next, nitrocellulose
Treated with rabbit antiserum against HSV-1. This was then probed with 125I-labeled goat antiserum against rabbit immunoglobulin. (
Towbin, 1979, etc.).

タンパク質プロットのオートラジオグラムは、２つのバ
ンドが抗ＨＳＶ−１抗体と免疫反応したことをはっきり
と示した。即ち、１６０，０００ダルトンの融合タンパ
ク質（Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ及び３
８，０００ダルトンのｇＤ−１関連タンパク貿（Ｃｒｏ
／ｇＤ−１）或いは非融合ｇＤタンパク質（β−ガラク
トシダーゼと融合しない）である。従って、単離の共ア
ゲレゲート法を、タンパク質の単離のめたに用いる時、
そして非融合ｇＤ（Ｃｒｏ／ｇＤ−１）及びｇＤ−融合
タンパク質（Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーげ
）の両方が、抗ＨＳＶ血清と免疫反応したときに、非融
合タンパク質は、融合タンパク質と一緒に精製する。The autoradiogram of the protein plot clearly showed that two bands immunoreacted with the anti-HSV-1 antibody. That is, a 160,000 Dalton fusion protein (Cro/gD-1/β-galactosidase and
8,000 Dalton gD-1 related protein trade (Cro
/gD-1) or unfused gD protein (not fused to β-galactosidase). Therefore, when using the coagelegation method of isolation for protein isolation,
And when both unfused gD (Cro/gD-1) and gD-fusion protein (Cro/gD-1/β-galactosidase) immunoreacted with anti-HSV serum, the unfused protein Refined together with.

７．実施例：ＨＳＶ−２ｇＤ ＨＳＶ−１のゲノムマップを、ＨＳＶ−２のものと比較
した。ＨＳＶ−２ゲノム内のｇＤ解読配列の位置は、Ｈ
ＳＶ−１ゲノム内のｇＤの位置と大きさと類似のものに
よって決定された。ＨＳＶ−２のＵｓ領領域ＢｇｌＩＩ
Ｌフラグメントを、ｐＢＲ３２２中に挿入し、組換えプ
ラスミドｐＨＶ１を形成した。ｐＨＶ１中に含まれるｇ
Ｄ−２読解配列は、交雑プローブとして、ｐＳＣ３０−
４から得られたｇＤ−１ＤＮＡの一部を用いる交雑化に
よって局在化した。ｇＤ−２解読配列を含むｐＨＶ１の
部分は、次に、ｐＢＲ３２中にサブクローン化されて、
組換えプラスミドｐＨＶ２を形成した。ｐＨＶ２内のｇ
Ｄ−２遺伝子のＤＮＡ配列が決定された、そして、ｇＤ
−２の配列が、ｇＤ−１のものと比較された。ｇＤ−２
のＤＮＡ配列は、ｇＤ−１のものよりも短い１つのコド
ン（暗号単位）であるが、しかし、その２の配列の間に
は、相当の相同物がある。7. Example: HSV-2gD The genomic map of HSV-1 was compared to that of HSV-2. The location of the gD sequence within the HSV-2 genome is H
The location and size of gD within the SV-1 genome were determined by similarity. Us territory BglII of HSV-2
The L fragment was inserted into pBR322 to form recombinant plasmid pHV1. g contained in pHV1
The D-2 reading sequence was used as a hybridization probe with pSC30-
Localization was achieved by hybridization using a portion of the gD-1 DNA obtained from 4. The portion of pHV1 containing the gD-2 coding sequence was then subcloned into pBR32 and
A recombinant plasmid pHV2 was formed. g in pHV2
The DNA sequence of the D-2 gene has been determined, and gD
The sequence of -2 was compared to that of gD-1. gD-2
The DNA sequence of gD-1 is one codon (coding unit) shorter than that of gD-1, but there is considerable homology between the two sequences.

ｌａｃブロモ−タコトロール下にｇＤ−２遺伝子をおく
ために、タンパク質解読配列の最初の１２０のヌクレオ
チドを欠くｇＤ−２遺伝子の一部を、ｐＨＶ２より単離
した。このＤＮＡフラグメントをｌａｃプロモータ及び
翻訳コントロール要素を解読する小さなＤＮＡフラグメ
ントに配位せしめた。To place the gD-2 gene under lac bromo-tacotrol, a portion of the gD-2 gene lacking the first 120 nucleotides of the protein coding sequence was isolated from pHV2. This DNA fragment was linked to a small DNA fragment that encodes the lac promoter and translational control elements.

得られた粗換えプラスミド、ｐＨＶ５は、宿主細胞形質
転換体中のｇＤ−２関連タンパク質を製造するために向
けられた。The resulting crude plasmid, pHV5, was directed to produce gD-2 related proteins in host cell transformants.

最後に、ｇＤ−２遺伝子フラグメントは、特別のサイト
における制限エンドヌクレアーゼ開裂によってｐＨＶ５
より単離され、それによって、ｇＤ−２解読配列の終止
配列（ＴＡＧ）が削除された。このＤＮＡフラグメント
は、ｇＤ−２遺伝子の一部と、発現プラスミドプロモー
タ及びコントロール要素を含み、ｐＨＫ４１４、β−ガ
ラクトシダーゼ解読配列を含むベクトルの中に配位され
た。得られた組換えプラスミドｐＨＶ６は、ｃｒｏＳＤ
−ＡＴＧをもつプラスミドｌａｃプロモータとβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子との間にサンドウィッチにされたｇ
Ｄ−２解読配列を含んでおり、誘導されたＥ．コリ形質
転換体中での融合プロティンの発現に向けられていた。Finally, the gD-2 gene fragment is isolated from pHV5 by restriction endonuclease cleavage at special sites.
was isolated, thereby deleting the termination sequence (TAG) of the gD-2 coding sequence. This DNA fragment contained part of the gD-2 gene, expression plasmid promoter and control elements, and was arranged into a vector containing the pHK414, β-galactosidase coding sequence. The obtained recombinant plasmid pHV6 was croSD
- plasmid lac promoter with ATG sandwiched between the β-galactosidase gene
D-2 coding sequence and derived E. expression of the fusion protein in coli transformants.

ｐＨＶ６融合タンパク質は、宿主細胞より単離され、そ
して、免疫原として使用されるために処方された。構成
中の各工程についての詳細な説明は、以下の次の順に提
示されている。pHV6 fusion protein was isolated from host cells and formulated for use as an immunogen. A detailed description of each step in the construction is presented in the following order.

７．１．プラスミドの製造に用いた一般的手段他に述べ
ない限り、ＤＮＡ単離、酵素反応及び配位反応について
６項及びその項目の中で説明した一般的方法が、ｇＤ−
２のクローン化についても用いられた。7.1. General Procedures Used to Manufacture Plasmids Unless otherwise stated, the general methods described in Section 6 and subsections for DNA isolation, enzymatic reactions, and coordination reactions are used for gD-
It was also used for cloning of 2.

７．１．１．制限酵素バッファ ＳｍａＩ消化に用いたバッファは、６．６ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び６
．６ｍＭβ−ｍＥよりなる。7.1.1. Restriction enzyme buffer The buffer used for SmaI digestion was 6.6mM Tris-
HCl (pH 7.4), 6.6mM MgCl2 and 6
．． Consists of 6mM β-mE.

ＢｇｌＩＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＩあるいはＰｓｔＩ消
化に用いたバッファは、６０ｍＭ　ＮａＣｌ，６．６ｍ
Ｍトリス−ＭＣｌ（ｐＨ７．４）、６６．６ｍＭｇＣｌ
２及び６．６ｍＭβ−ｍＥよりなる。The buffer used for BglII, ClaI, EcoRI or PstI digestion was 60mM NaCl, 6.6mM
M Tris-MCI (pH 7.4), 66.6mMgCl
2 and 6.6mM β-mE.

ＢａｍＨｉ、ＳａｌあるいはＸｈｏＩ消化に用いたバッ
ファは、１５０ｍＭＮａＣｌ，６．６ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、６．６ｍＭＭｇＣｌ及び６．６ｍＭ
β−ＭＥよりなる。The buffer used for BamHi, Sal or XhoI digestion was 150mM NaCl, 6.6mM Tris-HC.
l (pH 7.4), 6.6mM MgCl and 6.6mM
Consists of β-ME.

２以上の制限エンドヌクレアーゼ反応がＤＮＡ上になさ
れる時はいつでも、低い塩バッファ中での反応前に達成
されることに留意すべきである。It should be noted that whenever more than one restriction endonuclease reaction is performed on DNA, it is accomplished prior to the reaction in a low salt buffer.

２つの酵素が同じバッファに要する場合、反応は同時に
行なわれ得る。If the two enzymes require the same buffer, the reactions can be performed simultaneously.

７．２．ｇＤ−２遺伝子の局在化と単離前に述べたよう
に、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２のゲノムマップが、ＨＳ
Ｖ−２ゲノム内のｐＤの近似の位置及び人ききを決める
ために比較された。7.2. Localization and Isolation of the gD-2 Gene As mentioned previously, the genomic maps of HSV-1 and HSV-2
A comparison was made to determine the approximate location and distribution of pD within the V-2 genome.

ｇＤ−２遺伝子は、Ｕｓ領域内の０．９〜０．９４５ゲ
ノムマップ単位の間にマップしており、その領域は、８
．５ｋｂのＢｇｌＩＩＬフラグメント内に含まれる。Ｂ
ｇｌＩＩＬフラグメントは、ＨＳＶ−２ＤＮＡから切除
され、更に、分析のためにｐＢＲ３２２中に挿入された
。The gD-2 gene maps between 0.9 and 0.945 genome map units within the Us region;
．． Contained within a 5 kb BglIIL fragment. B
The glIIL fragment was excised from HSV-2 DNA and inserted into pBR322 for further analysis.

７．２．１．ｇＤ−２遺伝子を含むｐＨＶ１の構成ＨＳ
Ｖ−２（株Ｇ）ゲノム性ＤＮＡが、ＢｇｌＩＩによって
消化され、かつｇＤ−２遺伝子を含んだＤＮＡフラグメ
ント約８．５ｋｂが、アガローゼゲル電気泳動によって
単離された。プラスミドｐＢＲ３２２は、全体的に、Ｂ
ａｍＨＩによって消化された。ＨＳＶ−２の得られた４
．４ｋｂのｐＢ　３２２ＤＮＡ及び８．５ｋｂＢｇｌＩ
ＩＬ　ＤＮＡフラグメントは、アニールされた（Ｂａｍ
ＨＩ付着端及びＢｇｌＩＩ付着端は、相補的である。）
そして１１比率で配位されて、ｐＨＶ１となった（第１
１ｂ図）。7.2.1. Constituent HS of pHV1 containing gD-2 gene
V-2 (strain G) genomic DNA was digested with BglII, and a DNA fragment of approximately 8.5 kb containing the gD-2 gene was isolated by agarose gel electrophoresis. Plasmid pBR322 consists entirely of B
Digested by amHI. Obtained 4 of HSV-2
．． 4 kb pB 322 DNA and 8.5 kb BglI
IL DNA fragments were annealed (Bam
The HI sticky end and the BglII sticky end are complementary. )
Then, it was coordinated in a ratio of 11 to become pHV1 (the first
Figure 1b).

７．２．２．ｇＤ−２特定ｍＲＮＡ解読配列の局在化ｇ
Ｄ−２　ｍＲＮＡ解読配列は、交雑によって（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ、１９７５．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、９８：５
０３）交雑化プルーブとしてｐＳＣ−３０−４から得た
ｇＤ−１ＤＮＡの一部を用いて（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ移送
のため用いたプロトコールのため、Ｍａｎｉａｔｉｓら
の、１９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ
．ｐ．３８２〜３８９参照）局在化された。7.2.2. gLocalization of D-2 specific mRNA decoding sequenceg
The D-2 mRNA decoding sequence was obtained by hybridization (Sout
Hern, 1975. J. Mol. Biol, 98:5
03) Using a portion of gD-1 DNA obtained from pSC-30-4 as a hybridization probe (for the protocol used for Southern transfer, see Maniatis et al., 1982. Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, ColdS
pring Harbor Laboratory,p
．． p. 382-389) localized.

従って、ｐＨＶ１は、ＸｈｏＩによって開裂された。そ
して、得られたＤＮＡフラグメントは、アガローゼグル
電気泳動によって分離された。ゲル中のＤＮＡフラグメ
ントを、次に、アルカリ中に変性し、中和し、そして、
ニトロセルロースフィルター上に移送した。フィルター
には着したＤＮＡフラグメントを、次に、３２ｐ−標識
されたｇＤ−１プルーブと交雑化した。Therefore, pHV1 was cleaved by XhoI. The obtained DNA fragments were then separated by agarose gel electrophoresis. The DNA fragments in the gel are then denatured in alkali, neutralized, and
Transferred onto a nitrocellulose filter. The DNA fragments that landed on the filter were then hybridized with a 32p-labeled gD-1 probe.

３２ｐ−標識ｇＤ−１プルーブは、次の如く作られた。The 32p-labeled gD-1 probe was made as follows.

ｐｓｃ３０−４（第１ｄ図及び第４図）を、ＰｖｕＩＩ
によって開裂した、そして、ｇＤ−１の最初の５２のコ
ドン（１５６のヌクレオチド）を含む５００ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって単離した。ｇＤ−１ＤＮＡのをニック翻訳によっ
て放射線標識した（ＢＲＬ　Ｋｉｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。psc30-4 (Fig. 1d and Fig. 4), PvuII
A 500 bp DN cleaved by and containing the first 52 codons (156 nucleotides) of gD-1
The A fragment was isolated by polyacrylamide gel electrophoresis. gD-1 DNA was radiolabeled by nick translation (BRL Kit, Bethesda
Research Laboratories,In
c. , Gaithersburg, MD).

ニック翻訳は、二本鎖ＤＮＡを、高い放射線特定活性に
試験管内標識するための選択方法である。Nick translation is the method of choice for in vitro labeling of double-stranded DNA with high radiospecific activity.

この方法は、Ｅ、コリＤＮＡポリメラーゼＩの数個の活
性のうらの２つの長所を有する。即ち、５′−３’のエ
キソヌクレアーゼ活性と、５’−３’ポリメラーゼ活性
である。ニック翻訳において、酵素は、二本鎖ＤＮＡの
１つの鎖中のニックにおいて結合する。５′−３’エキ
ソヌクレアーゼ活性は、次にニックされた（切り込みさ
れた）鎖のヌクレオチドを、進行するポリメラーゼに先
じて、加水分離する。従って、ニックを鎖にそって動か
す（翻訳する）加水分解の速度は、手合の速度と等しい
ので、組織（ネット）合成はない。しかしながら、この
交換反応の過程において、反応混合物中に存在する放射
活性のデオキシヌクレシド三リン酸塩は、ＤＮＡ中に包
含される。（Ｋｅｌｌｙら、１９７０，Ｊ．Ｂｉｏｌ，
Ｃｈｅｍ，２４５：３９）。次に、３２ｐ−標識ｇＤ−
１二重鎖ＤＮＡを、単一鎖プルーブとして使用のために
変性した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎ
ａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｐｐ、１０９〜１１２参照）。This method has two advantages over several activities of E. coli DNA polymerase I. That is, 5'-3' exonuclease activity and 5'-3' polymerase activity. In nick translation, an enzyme binds at a nick in one strand of double-stranded DNA. The 5'-3' exonuclease activity then hydrolyzes the nucleotides of the nicked (incised) strand prior to the proceeding polymerase. Therefore, the rate of hydrolysis that moves (translates) the nick along the chain is equal to the rate of hand movement, so there is no net synthesis. However, in the course of this exchange reaction, the radioactive deoxynucleside triphosphates present in the reaction mixture are incorporated into the DNA. (Kelly et al., 1970, J. Biol.
Chem, 245:39). Next, 32p-labeled gD-
Single-stranded DNA was denatured for use as a single-stranded probe (Maniatis et al., Molecular
Cloning A Laboratory Mann
al, Cold Spring Harbor Lab
oratories, pp. 109-112).

オートラジオグラフでは、Ｘｈｏｌ／ｐＨＶ１のＸｈｏ
ＩＤＮＡフラグメント約２，３ｋｂは、放射活性ｇＤ−
１プルーブと相補的であったことを示した。従って、そ
れはｇＤ−１解読配列を含んでいた。In the autoradiograph, Xho of Xhol/pHV1
The approximately 2,3 kb I DNA fragment contains radioactive gD-
1 probe was shown to be complementary. Therefore, it contained the gD-1 coding sequence.

次に、ＸｈｏＩ／ｐＨＶ１のＸｈｏＩＤＮＡフラグメン
トを、ｐＢＲ３２２中にサブクローン化した。The XhoI DNA fragment of XhoI/pHV1 was then subcloned into pBR322.

それは、ｇＤ−２解読配列を更に特徴づけるためである
。この目的に対して、ｐＨＶ１をＸｈｏＩによって消化
し、かつｇＤ−２解読配列を含む２．３ｋｂのＤＮＡフ
ラグメントをアンニールし、そして、１：１比率で、Ｓ
ａｌ　Ｉで予め開裂した線状ｐＢＲ３２２に配位し（Ｓ
ａｌＩ）生成付着端は、ＸｈｏＩ生成付着端と相補的で
ある。）ｐＨＶ２を形成した（第１１ｃ図）。This is to further characterize the gD-2 decoded sequence. For this purpose, pHV1 was digested with XhoI and the 2.3 kb DNA fragment containing the gD-2 coding sequence was annealed and S
Coordinates to linear pBR322 previously cleaved with alI (S
The alI) generated sticky end is complementary to the XhoI generated sticky end. ) pHV2 was formed (Figure 11c).

７．２．３．ｇＤ−２ｍＲＮＡ解読配列の特徴づけｐＨ
Ｖ２のＨＳＵ−ＤＮＡ、ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔの
方法を用いた配列づけした（１９８０．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｌｏｇｙ，６５：４９９）。第１２図
は、ＨＳＶ−２ｇＤ遺伝子のために得たＤＮＡ配列を示
す。7.2.3. Characterization of gD-2 mRNA decoding sequence pH
V2 HSU-DNA was sequenced using the method of Maxam and Gilbert (1980. Methods
in Enzymology, 65:499). Figure 12 shows the DNA sequence obtained for the HSV-2gD gene.

ＤＮＡ配列は、３９３コドン（１コドンは、ｇＤ−１の
ＤＮＡ解読配列よりも小さい）の開いた読取りフレーム
を含んでおり、それは、２６７の位置のＡＴＧからのび
ている。このサイトは、ｇＤ−２遺伝子のイニシェイタ
ーであると疑われていた。The DNA sequence contains an open reading frame of 393 codons (one codon smaller than the DNA coding sequence of gD-1), which extends from the ATG at position 267. This site was suspected to be the initiator of the gD-2 gene.

そして、発現ベクトルｐＪＳ４１３及びｐＨＫ４１３（
下記）中のこの推定ｇＤ−２遺伝子配列をクローン化す
ることによってそうであることが示された。Then, the expression vectors pJS413 and pHK413 (
This was shown to be the case by cloning this putative gD-2 gene sequence in (below).

ｇＤ−２タンパク質の予想されたアミノ酸配列を、ｇＤ
−１プロテインの予想されたアミノ酸配列と比較した（
第１３図）。２つの配列は、約８２％相同であり、非相
同の領域は、次の３つの領域に生じるようである。指導
（リーダー）配列、トランスメンブラン領域及び推定ア
ンカー（固定）領域。ｇＤ−２タンパク質は、ｇＤ−１
タンパク質よりも短い１つのアミノ酸残分である。The predicted amino acid sequence of gD-2 protein was
-1 protein compared with the predicted amino acid sequence (
Figure 13). The two sequences are approximately 82% homologous, and regions of non-homology appear to occur in three regions: Leader sequence, transmembrane region and putative anchor region. gD-2 protein is gD-1
It is one amino acid residue shorter than a protein.

７．３．ｇＤ−２遺伝子のクローン化と発現ｇＤ−遺伝
子をｌａｃプロモータコントロール下におくために、ア
ミン解読末端（遺伝子の５′−端）において最初の１２
０のヌクレチドを欠いた推定遺伝子配列の一部をｐＨＶ
２より単離した。7.3. Cloning and Expression of the gD-2 Gene To place the gD-gene under the control of the lac promoter, the first 12
A part of the deduced gene sequence lacking the 0 nucleotide was converted into pHV
It was isolated from 2.

ｐＨＶ２ＤＮＡフラグメントをｌａｃプロモータ、翻訳
コントロール要素、ｃｒｏＡＴＧ及び、ｃｒｏの６９の
ヌクレオチドを含む小さなｐＪＳ４１３ＤＮＡフラグメ
ント（約２００ｂｐ）と配位せしめた。得られた組換え
プラスミドｐＨＶ５（第１４図）は、ｇＤ−２配列の全
てのしかし最初の４０のコドンを含む。事実、ｐＨＶ−
５は実際、成熟。The pHV2 DNA fragment was coordinated with a small pJS413 DNA fragment (approximately 200 bp) containing the lac promoter, translational control elements, croATG, and 69 nucleotides of cro. The resulting recombinant plasmid pHV5 (Figure 14) contains all but the first 40 codons of the gD-2 sequence. In fact, pHV-
5 is actually mature.

ｇＤ−２タンパク質の全てで１５のアミノ酸を読取る（
エンコード）。通常、ｐＤ−２の最初の２５のアミノ酸
残分（信号配列）は、天然ｇＤ−２タンパク質が処理さ
れるときに、開裂される。ｐＨＶ５の構成は以下説明さ
れる。Read 15 amino acids in all gD-2 proteins (
encoding). Normally, the first 25 amino acid residues of pD-2 (signal sequence) are cleaved when the native gD-2 protein is processed. The construction of pHV5 is explained below.

７．３．１．ｐＨＶ５の構成 組換えプラスミド、ｐＨＶ２をＣｌａＩで消化した（第
１４図参照）。また得られた付着末端は、ＤＮＡボリメ
ラーぜのＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて充填された
。純な末端の線状ｐＨＶ２を次に、ＥｃｏＲＩによって
間製した。ａｍｐｒ遺伝子及び全てで１２０のｇＤ−２
解読配列ヌクレオチドを含む５．４ｋｂのＣｌａｌ−／
ＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気
泳動によって単離した。7.3.1. Construction of pHV5 The recombinant plasmid, pHV2, was digested with ClaI (see Figure 14). The resulting cohesive ends were also filled in using the Klenow fragment of DNA polymerase. Pure terminal linear pHV2 was then synthesized with EcoRI. ampr gene and a total of 120 gD-2
5.4kb Claal-/ containing decoding sequence nucleotides
EcoRI DNA fragments were isolated by agarose gel electrophoresis.

発現ベクトルｐＪＳ４１３（第６．３．１項で述べた）
を、ＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩによって開製した。２００
ｂ．ｐ．（０，２ｋｂ）のフラグメントは、ｌａｃプロ
モータ、ＳＰＺ、ＳＤｃｒｏＡＴＧおよびｃｒｏの６９
のヌクレオチドを暗号作成（エンコード）するものであ
り、それは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
単離された。Expression vector pJS413 (described in Section 6.3.1)
was opened with SmaI and EcoRI. 200
b. p. (0,2 kb) fragment contains the lac promoter, SPZ, SDcroATG and cro69
nucleotides, which were isolated by polyacrylamide gel electrophoresis.

５．４ｋｂのＣｌａＩ−／ＥｃｏＲ１ｐＨＶ２ＤＮＡフ
ラグメント及び０．２ｋｂのＥＣ０ＲＩ／ＳｍａＩ　ｐ
Ｊｓ４１３　ＤＮＡフラグメントを１：１モル比で、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて配位した。得られた組換えプ
ラスミド、ｐＨ５を、Ｅ．コリ菌株ＮＦ１８２９の形質
転換のために用いた。5.4 kb ClaI-/EcoR1pHV2 DNA fragment and 0.2 kb ECORI/SmaI p
Js413 DNA fragment in a 1:1 molar ratio, T
Coordination was performed using 4 DNA ligase. The obtained recombinant plasmid, pH5, was transformed into E. It was used for transformation of coli strain NF1829.

７．３，２．ｇＤ−２遺伝子を発現する形質転換体の同
定 アンピシリン耐性Ｅ．コリ形質転換体から単離したプラ
スミドを、制限エンドヌクレアーゼマツピングによって
分析した、そして、ｇＤ−２関連ポリペプヂドの発現に
向けるその能力について分析した。ニブロモータは、Ｎ
Ｆ１８２９中において転写の上では不活性である。（ｌ
ａｃレプレセ−（抑制体）の過剰製造によって）ので、
ｇＤ−２タンパク質は、１ｍＭ　ＩＰＴＧあるいは１−
１０ｍＭラクトーゼのいずれかによりプロモータの誘導
によって検出のみできる。7.3,2. Identification of transformants expressing the gD-2 gene Ampicillin-resistant E. Plasmids isolated from E. coli transformants were analyzed by restriction endonuclease mapping and analyzed for their ability to direct expression of gD-2 related polypeptides. Nibro motor is N
It is transcriptionally inactive in F1829. (l
(by overproduction of ac repressor),
gD-2 protein was mixed with 1mM IPTG or 1-
Detection is only possible by induction of the promoter with either 10mM lactose.

ｐＨＶ５と称する組換えプラスミドによって形質転換さ
れたクローンは、誘導性ｇＤ−２関連タンパク質作るこ
とが発見された。誘導性タンパク質は、ＨＳＶ−２に対
するうさぎ抗血清により免疫沈降されることが見い出さ
れた。Clones transformed with a recombinant plasmid designated pHV5 were found to produce inducible gD-2 related proteins. The inducible protein was found to be immunoprecipitated by rabbit antiserum against HSV-2.

７．４．Ｃｒｏ／ｇＤ−２／β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質の製造を監督するｐＨＶ６の製造 融合タンパク質を作るために、ｇＤ−２配列をバクテリ
ヤ宿主遺伝子配列に配位せしめた。それによって、翻訳
読取りフレームは、終止信号によって妨害されないもの
となった。この目的に対して、ｐＨＶ５のｂＤ−２解読
配列を開製した、それにより、ｇＤ−２終止信号（ＴＡ
Ｇ）は削除された。ｌａｃプロモータ、翻訳コントロー
ルＣｒｏ／ｇＤ−２配列を含むｐＨＶ５ＤＮＡフラグメ
ントを、ｚ−遺伝子を含むｐＨＫ４１４　ＤＮＡフラグ
メントに配位せしめた。得られた組換えプラスミド、ｐ
ＨＶ６（第１５図）は、Ｃｒｏ／ｇＤ−２／β−ガラク
トシダーゼ融合タンパク質をエンコードする。7.4. Production of pHV6 to Direct Production of Cro/gD-2/β-Galactosidase Fusion Protein To make the fusion protein, gD-2 sequences were coordinated to bacterial host gene sequences. Thereby, the translation reading frame was not disturbed by termination signals. To this end, we have opened the bD-2 coding sequence of pHV5, thereby detecting the gD-2 termination signal (TA
G) has been deleted. A pHV5 DNA fragment containing the lac promoter and translational control Cro/gD-2 sequences was coordinated to a pHK414 DNA fragment containing the z-gene. The obtained recombinant plasmid, p
HV6 (Figure 15) encodes a Cro/gD-2/β-galactosidase fusion protein.

７．４．１．ｐＨＶ６の構成 プラスミドｐＨＶ５をＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩによって
消化した（第１５図参照）。ａｍｐｒ遺伝子のアミノ暗
号解読〈コード）終端の一部、ｌａｃプロモータ、ＳＤ
２．ＳＤｃｒｏ，ｃｒｏＡＴＧ及びｃｒｏ／ｇＤ−２を
エンコード（暗号作成）する１．７５ｋｂのＰｓｔＩ／
ＢａｍＨＩ　ｐＨＶ５　ＤＮＡフラグメントを、アガロ
ースゲル電気泳動によって単離した。7.4.1. Constituent pHV6 plasmid pHV5 was digested with PstI and BamHI (see Figure 15). Deciphering the amino code of the ampr gene (code) part of the end, lac promoter, SD
2. 1.75kb PstI/ which encodes (ciphers) SDcro, croATG and cro/gD-2
BamHI pHV5 DNA fragments were isolated by agarose gel electrophoresis.

発現ベクトル、ｐＨＫ４１４を、ＰｓｔＩ及びＢａｍＨ
Ｉによって消化した。Ｚ遺伝子及びａｍｐｒ遺伝子のカ
ルボキシ解読終端の一部をエンコードする５．５４ｋｂ
のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ　ｐＨＫ４１４　ＤＮＡフラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動によって単離した。Expression vector, pHK414, PstI and BamH
Digested by I. 5.54 kb encoding part of the carboxy-decoded terminus of the Z gene and the ampr gene
The BamHI/PstI pHK414 DNA fragment was isolated by agarose gel electrophoresis.

１．７５ｋｂＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ　ｐＨＶ５　ＤＮＡ
フラグメント及び５．５４ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩｐＨＫ
４１４　ＤＮＡフラグメントをアンニールし、そして、
１：１のモル比で配位せしめた、そして、Ｅ．コリＮＦ
１８２９の形質転換のために用いた。アンピシリン体制
コロニーを、融合プロテイン製造について、指示アガー
板上のβ−ガラクトシダーゼ活性についての検定によっ
て審査した。正のコロニーを、Ｃｒｏ／ｇＤ−２／βガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質の存在について、ＩＰＴ
Ｇにより誘導された形質転換体の全すゼイトをＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析することによってテストした。１６０，０
００クルトンの融合タンパク質の高レベル製造物が、単
離された、そして、この形質転換体から誘導されたプラ
スミドを、ｐＨＶ６と称した。1.75kbPstI/BamHI pHV5 DNA
Fragment and 5.54BamHI/PstIpHK
414 annealing the DNA fragment and
coordinated in a molar ratio of 1:1, and E. Cori NF
1829 was used for transformation. Ampicillin regime colonies were screened for fusion protein production by assaying for β-galactosidase activity on indicated agar plates. Positive colonies were IPT tested for the presence of Cro/gD-2/β-galactosidase fusion protein.
All zeites of transformants induced by G.
Tested by PAGE analysis. 160,0
A high level product of the 00 crouton fusion protein was isolated and the plasmid derived from this transformant was designated pHV6.

ｐＨＶ６によって形質転換されたＥ．コリ　クローンに
よって作られた融合タンパク質は、ＩＰＴＧにより導入
され得るものであり、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方
と交差免疫活性であることが示された。作られた融合タ
ンパク質は、ｇＤ−２プロテインの２６５のアミノ酸残
分を含んでいる。E. coli transformed with pHV6. The fusion protein produced by the E. coli clone was able to be introduced by IPTG and was shown to be cross-immunoactive with both HSV-1 and HSV-2. The fusion protein created contains the 265 amino acid residue of gD-2 protein.

７．４．２．ｐＨＶ６融合タンパク質に対する抗血清の
免疫沈降分析 ｐＨＶ６融合タンパク質を、第６．４．２項で述べた変
性プロトコールを用いて精製した、そして、以下の如く
、３つのうさぎ（Ｒ１５９，Ｒ１６０、Ｒ１６１）中に
抗血清を作るために用いた。7.4.2. Immunoprecipitation analysis of antiserum against pHV6 fusion protein The pHV6 fusion protein was purified using the denaturing protocol described in Section 6.4.2 and was tested in three rabbits (R159, R160, R161) as follows: was used to make antiserum.

ｐＨＶ６によって形質転換されたＥ、コリ　クローンを
中間指数増殖期（ｍｉｄ−ｌｏｇ　ｐｈａｓｅ）に成長
せしめた、そして、１ｍＭ　ＩＰＴＧによって誘導され
た。誘導後４時間で、バクテリヤは、遠心分離によって
ペレット（沈澱物）化せしめられ、ＳＤＳ−ＴＡＧＥ試
料バッファによってリゼイド（溶菌）化され、そして、
調整ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に乗せられた。E. coli clones transformed with pHV6 were grown to mid-log phase and induced with 1 mM IPTG. Four hours after induction, bacteria were pelleted by centrifugation, lysed with SDS-TAGE sample buffer, and
Loaded onto a prepared SDS-polyacrylamide gel.

電気泳動後、タンパク質をコオマシ−（ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅ）青色染料で、外側を染めることによって可視化し
た。次に、１６０，０００ダルトンの融合タンパク質バ
ンドを、ゲルからスライス（切断）した。ゲルスライス
を液体窒素中に付け、粉末に粉砕し、そして、次に、Ｐ
ＢＳ中に懸濁した。フロイント完全アジュバントの等容
量を、３羽のニューシーラントうさぎに皮下往側した（
Ｒ１５９，Ｒ１６０，Ｒ１６１）。各うさぎに、１００
〜２００μｇのタンパク質を注射した。２８日後、うさ
ぎを不完全なフロイントアジュバンド中に懸濁した融合
タンパク質の同量により追加刺激した。動物は、５回（
全部で）１０日間間隔で追加刺激された。最初の注射後
５５日で採取した血清（即ち、２羽の追加後）を、免疫
沈降分析に用いた。After electrophoresis, the proteins were separated by coomassie.
ie) Visualized by staining the outside with blue dye. The 160,000 Dalton fusion protein band was then sliced from the gel. The gel slices are placed in liquid nitrogen, ground into powder, and then P
Suspended in BS. Equal volumes of complete Freund's adjuvant were administered subcutaneously to three New Sealant rabbits (
R159, R160, R161). 100 for each rabbit
~200 μg of protein was injected. After 28 days, rabbits were boosted with the same amount of fusion protein suspended in incomplete Freund's adjuvant. Animals were tested 5 times (
(in total) were boosted at 10-day intervals. Serum collected 55 days after the first injection (ie, after two additional birds) was used for immunoprecipitation analysis.

免疫沈降は、次の如く行った。全面細胞に、ＨＳＶによ
り１０ｐｆｕ／細胞で感染せしめた）ベロ細胞をＨＳＶ
−１で感染させ、一方ヘラ（Ｈｅｒａ）細胞をＨＳＶ−
２で感染させた〉。細胞を３５Ｓ−メチオニンで、注射
後１６時間標識した。３５Ｓ−メチオニン−標識ＨＳＶ
−１感染ベロ細胞あるいはＨＳＶ−２感染ヘラ細胞のリ
ゼイト（溶菌液）を、予免疫うさぎ血清あるいは、ｐＨ
Ｖ６融合タンパク質に対するうさぎ抗血清のいずれかの
１０μｌによりインキュベートした（即ち、Ｒ１５９、
Ｒ１６０，あるいはＲ１６１抗血清）。免疫錯体を、第
６．３．３項に述べたようにバンソルビン（Ｐａｂｓｏ
ｒｂｉｎ）を用いて採取した、そして、ｈり割標識した
免疫沈降タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解
せして、フルオログラフにかけた。ＳＰＳ−ＰＡＧＥの
結果によれば、ＨＳＶ−２感染ヘラ細胞によって作られ
た５０．０００ダルトンのｇＤタンパク質は、形質転換
体によって作られた融合タンパク質に対しての抗血清に
ついて免疫反応性を示した。Ｒ１５９及びＲ１６１抗血
清は、ｇＤ−２について特定しており、一方Ｒ１６０抗
血清は、ｇＤ−１（ＨＳＶ−１感染ベロ細胞により作ら
れた５２，０００ダルトンのｇＤタンパク質）及びｇＤ
−２の両方を免疫沈降する；従って、Ｒ１６０は、「タ
イプ−コモン（共通タイプ）」である。ｐＥＨ４−２に
よってエンコードされたｇＤ−１融合タンパク質に対し
て向けられる０１８（６．４．２．項）も亦タイプコモ
ンである事を留意すべきである。Immunoprecipitation was performed as follows. Vero cells (whose surface was infected with HSV at 10 pfu/cell) were infected with HSV.
-1, while Hera cells were infected with HSV-1.
2). Cells were labeled with 35S-methionine for 16 hours post-injection. 35S-methionine-labeled HSV
-1 infected Vero cells or HSV-2 infected Hera cells lysate (lysate) was added to pre-immunized rabbit serum or pH
Incubated with 10 μl of either rabbit antiserum against the V6 fusion protein (i.e. R159,
R160 or R161 antiserum). The immune complex was treated with vansorbin (Pabso) as described in Section 6.3.3.
Immunoprecipitated proteins harvested using h-bin) and h-labeled were resolved by SDS-PAGE and fluorographed. According to SPS-PAGE results, the 50,000 Dalton gD protein produced by HSV-2 infected Hela cells was immunoreactive with antisera directed against the fusion protein produced by the transformants. . The R159 and R161 antisera are specific for gD-2, while the R160 antiserum is specific for gD-1 (the 52,000 dalton gD protein made by HSV-1 infected Vero cells) and gD
-2; therefore, R160 is "type-common." It should be noted that 018 (Section 6.4.2.) directed against the gD-1 fusion protein encoded by pEH4-2 is also type common.

７．４，３．試験管中のヘルペスシンプレックスウィル
ス中和 ｐＨＶ６融合タンパク質に対する上記のうさぎ抗血清も
亦、試験管中のＨＳＶ感染を中和する能力を測定するた
めに用いた。この目的に対して、プラークアッセイを用
いるウィルス中和研究を前記の如く行なった。全面細胞
の台皿（３５ｍｍ）に、ＨＳＶの５０ｐｆｕを感染せし
めた（ベロ細胞は、ＨＳＶ−１によって感染され、一方
ヘラ細胞はＨＳＶ−２によって感染された）、それは、
コントロール（予免疫血清）あるいはテスト抗血清希釈
物によって予めインキュベートされたものであった。（
次の抗血清がテストされた：０１８：Ｒ１５９、Ｒ１６
０，Ｒ１６１）。３日後、細胞を固定し、染色し、そし
て、プラークを数えた。表２は、このような２つの実験
の結果を示す。中和性は、プラーク数が５０％減少する
に必要な血清希釈度として示される。表２には、ｐＨＶ
６融合タンパク質（Ｒ１５９，Ｒ１６０及びＲ１６１）
に対する抗血清は、試験管内のＨＳＶ−２感染の中和の
能力があること、一方ｐＥＨ４−２融合タンパク質（０
１８）に対する抗血清は、試験管内のＨＳＶ−１感染の
中和に能力があることが明らかに示されている。０１８
とＲ１６０はタイプ・コモン（第７．４．２．項に免疫
沈降データに基づいて）であるが、０１８（抗ｇＤ−１
融合タンパク質）は、試験管内ＨＳＶ−１の中和につい
てより効果的であり、Ｒ１６０（抗ｇＤ−２融合タンパ
ク質）は、試験管内のＨＳＶ−２感染の中和により効果
的である。7.4,3. Herpes simplex virus neutralization in vitro The rabbit antiserum described above against the pHV6 fusion protein was also used to determine its ability to neutralize HSV infection in vitro. To this end, virus neutralization studies using plaque assays were performed as described above. A full cell plate (35 mm) was infected with 50 pfu of HSV (Vero cells were infected with HSV-1, while Hera cells were infected with HSV-2), which
They were preincubated with control (preimmune serum) or test antiserum dilutions. (
The following antisera were tested: 018:R159, R16
0, R161). After 3 days, cells were fixed, stained, and plaques were counted. Table 2 shows the results of two such experiments. Neutralization is expressed as the serum dilution required to achieve a 50% reduction in plaque number. Table 2 shows pHV
6 fusion proteins (R159, R160 and R161)
The antiserum against pEH4-2 fusion protein (0
Antiserum against 18) has been clearly shown to be capable of neutralizing HSV-1 infection in vitro. 018
and R160 are type common (based on immunoprecipitation data in Section 7.4.2.), whereas 018 (anti-gD-1
fusion protein) is more effective at neutralizing HSV-1 in vitro, and R160 (anti-gD-2 fusion protein) is more effective at neutralizing HSV-2 infection in vitro.

７．４，４．ｐＨＶ６融合タンパク質に対する抗血清の
免疫蛍光分析 免疫蛍光検定が次のように行われた。全面細胞が、ヘル
ペスウィルスによって０．１ｐｆｕ／細胞で２０時間３
７℃で感染された。（ベロ細胞は、ＨＳＶ−１によって
感染され、一方ヘラ細胞はＨＳＶ−２によって感染され
た。）細胞を、ＰＢＳで洗脩した、そして次に９０秒間
室温でアセトン：メタノール（１：１）により固定され
た。固定液を除去し、細胞を空気乾燥した。次に、ＰＢ
Ｓ中に１：２０で希釈された各うさぎ抗血清（０１８，
Ｒ１５９，Ｒ１６０及びＲ１６１）の２０μｌアリコー
トを、根土の細胞に、標識のされた位置に藺別の滴とし
て施こした。３７℃・３０分間のインキュベートの後、
細胞をＰＢＳで洗滌し、空気乾燥した。次に、蛍光−接
合スウィン抗うさぎ血清を、標識された位置に施した。7.4,4. Immunofluorescence analysis of antiserum against pHV6 fusion protein Immunofluorescence assay was performed as follows. All cells were infected with herpesvirus at 0.1 pfu/cell for 20 hours3.
infected at 7°C. (Vero cells were infected with HSV-1, while Hera cells were infected with HSV-2.) Cells were washed with PBS and then with acetone:methanol (1:1) at room temperature for 90 seconds. fixed. The fixative was removed and the cells were air dried. Next, P.B.
Each rabbit antiserum (018,
20 μl aliquots of R159, R160 and R161) were applied as separate drops to the cells of the root soil at the labeled locations. After incubation at 37°C for 30 minutes,
Cells were washed with PBS and air dried. Fluorescent-conjugated Swin anti-rabbit serum was then applied to the labeled locations.

３７℃３０分間インキュベートの後に細胞を洗修し、空
気乾燥し、グリセロールの上にのせ、紫外顕微鏡を用い
て紫外線下で観察した。蛍光の存在は、うさぎ抗血清が
、ＨＳＶ感染細胞と免疫反応性であることを示している
。結果は表３に示される。After incubation for 30 minutes at 37°C, cells were washed, air dried, mounted on glycerol, and observed under UV light using an ultraviolet microscope. The presence of fluorescence indicates that the rabbit antiserum is immunoreactive with HSV infected cells. The results are shown in Table 3.

８、実施例：ワクチン投与 ８．１．ワクチン処方中にｇＤ−１融合タンパク質を用
いた生体内でのＨＳＶ−２感染に対する保護性 各々１０匹のバルブ（Ｂａｌｂ）Ｃマウスの３つのグル
ープに、次の調製物を腹腔内的に注射した。8. Example: Vaccine Administration 8.1. Protection against HSV-2 infection in vivo using gD-1 fusion proteins during vaccine formulation Three groups of 10 Balb C mice each were injected intraperitoneally with the following preparations: .

グル−プ１（ワクチンのない標準：コントロール）は、
生理食塩水を受り；グループ２は、完全フロイント（Ｆ
ｒｅｕｎｄ）アジコバノド中のもとの（ネイティブ）Ｈ
ＳＶ−１ｇＤタンパク質３μｇを受け、そしてクループ
３は、生理食塩水中のｐＥＨ４−２融合タンパク質（５
，５，項で説明した変性アグレグート（凝集物）精製法
によって単離した）３０μｇを受けた。全てのグループ
は、４回注射ＩＰを得け；各々の注射は、２週間の間隔
て投与され、そして増強では、１μ　ｇＤ（グループ２
）あるいは１０μｇの融合タンパク質を含んだ。Group 1 (standard without vaccine: control)
Group 2 received saline; Group 2 received complete Freund's (F
(reund) original (native) H in ajicobanod
SV-1 gD protein received 3 μg, and croup 3 received pEH4-2 fusion protein (5 μg) in saline.
, 30 μg (isolated by the denatured aggreguate purification method described in Section 5). All groups received 4 injections IP; each injection was administered 2 weeks apart and in boost, 1 μgD (group 2
) or 10 μg of fusion protein.

マウスは、４回目の注射後、眼窩後方的（ｒｅｔｒｏ−
ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）に出血した、そして、この血清は
、６．４．３項及び７．４．２項で以前説明したプラー
クアッセイを用いて、試験管内で（補体なしで）ヘルペ
スウィルスの中和についてテストした。After the fourth injection, the mice underwent retro-orbital (retro-
orbitally) and this serum was assayed for herpesvirus neutralization in vitro (without complement) using the plaque assay previously described in Sections 6.4.3 and 7.4.2. Tested.

４回目の接種後、１週間目に、マウスは、１０ＬＤ５０
のＨＳＶ−２株１８６により挑戦を受けた。One week after the fourth inoculation, mice were given 10LD50
HSV-2 strain 186.

ＨＳＶ−２は、０．５ｍｌ中に乳化され、腹腔内に注射
された。挑戦されたマウスの生存者は、その保護性を示
している。結果は表４に示す。HSV-2 was emulsified in 0.5 ml and injected intraperitoneally. Survivors of challenged mice demonstrate their protection. The results are shown in Table 4.

８．２．ワクチン処方中にｇＤ−２融合タンパク質を用
いた、生体内のＨＳＶ−２感染に対する保護性 各々１０匹のマウスの４つのグループに、次の調製物で
ワクヂン注射を行った。グループ１（標準：コントロー
ル）は、ｐＮ８９−１生成長ホルモン／β−カラクトシ
ダーゼ融合タンパク質を受けた。グループ２は、ｐＥＨ
４−２Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ融合タ
ンパク質（６．４項参照）を受け、グループ３は、ｐＥ
Ｈ８２再構成Ｃｒｏ／ｇＤ−１／β−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質（６．５項参照）を受け、グループ４は
、ｐＨＶ６Ｃｒｏ／ｇＤ−２／β−ガラクトシダーゼ融
合タンパク質（７，４，項参照）を受けた。8.2. Protection against HSV-2 infection in vivo using gD-2 fusion protein in vaccine formulation Four groups of 10 mice each were vaccinated with the following preparation. Group 1 (standard: control) received pN89-1 live growth hormone/β-caractosidase fusion protein. Group 2 is pEH
4-2Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein (see section 6.4); group 3 received pE
H82 reconstituted Cro/gD-1/β-galactosidase fusion protein (see section 6.5) and group 4 received pHV6Cro/gD-2/β-galactosidase fusion protein (see section 7,4). .

融合タンパク質は、種々のＥ、コリ形質転換体より、誘
導された形質転換体をリゾチーム／デタージエント（清
浄剤）崩壊すること、次に、アグリゲート（凝集物）を
ペレット化する（非変性のアグリゲート精製手順は、５
．５．項に説明される如く）ことによって単離された。The fusion protein is derived from various E. coli transformants by disrupting the derived transformants with lysozyme/detergent and then pelleting the aggregates (undenatured aggregates). The gate purification procedure consists of 5
．． 5. (as described in Section 1).

免疫化スケジュールは次の如くである。ＢａｌｂＣマウ
ス（６〜７週令）に、０．２ｍｌ生理食塩水の非変性融
合タンパク質１５０〜２００μｇを腹腔内に各々接種し
た。マウスを３回以上、２週間間隔て（全部で４回の接
種）、７５〜１００μｇ融合タンパク質で腹腔内に（増
強されて）再接種された。マウスは、４回目の注射の後
、眼窩後方的（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｌｙ）に出
血した、そしてこの血清は、試験管内で（補体なしで）
ヘルペスについて、第６．４．３．及び７．４．２．項
で前に説明したプラークアッセイを用いてテストされた
。The immunization schedule was as follows. BalbC mice (6-7 weeks old) were each inoculated intraperitoneally with 150-200 μg of non-denatured fusion protein in 0.2 ml physiological saline. Mice were re-inoculated intraperitoneally (boosted) with 75-100 μg fusion protein three more times at two-week intervals (four total inoculations). Mice bled retro-orbitally after the fourth injection, and this serum was purified in vitro (without complement).
About herpes, Section 6.4.3. and 7.4.2. was tested using the plaque assay described earlier in section.

４回の接種の後１週間で、マウスは、ＨＳＶ−２株１８
６の１７ＬＤ５０により挑戦された。ＨＳＶ−２は、０
．５ｍｌ中に乳化され、腹腔内に注射された。挑戦され
たマウスの生き残りは、保護性を示した。結果は表５に
示す。One week after the fourth inoculation, mice were infected with HSV-2 strain 18.
Challenged by 17LD50 of 6. HSV-2 is 0
．． It was emulsified in 5 ml and injected intraperitoneally. Surviving challenged mice showed protection. The results are shown in Table 5.

８．８．ワクチン処方の比較 マウスを、以下の説明の異なるアジュバントとの混合物
にした、ｐＥＨ４−２及びｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３
９２形質転換体から作られた融合タンパク質調整物によ
って免疫化した。得られた抗血清を、培養物中のＨＳＶ
−１感染細胞から導かれたタンパク質を免疫沈降するそ
の能力によって評価した。8.8. Comparison of vaccine formulations mice were given pEH4-2 and pEH90-10amLE3 in mixtures with different adjuvants as described below.
Immunizations were made with fusion protein preparations made from 92 transformants. The obtained antiserum was used to detect HSV in culture.
Proteins derived from -1 infected cells were evaluated by their ability to immunoprecipitate.

融合タンパク質を、８．２．項で説明した非変性技術に
よって、ｐＥＨ４−２及びｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３
９２形貿転換体より単離した。アグレゲート（凝集物）
は、音波処理により再懸濁化し（スラリーを形成）、次
の如き熱アルカリ中の処理により溶解した。０．５ＭＮ
ａ０Ｈを、アゲレゲートのペレットに、５０ｍＭの最終
濃度まで添加した。アグレグートは、６５℃１５分間の
加熱によって溶解した。次に溶液を、冷却し、そして、
トリスＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７，５を添加した（最終
濃度：１００ｍＭトリス−ＨＣｌ）。8.2. pEH4-2 and pEH90-10amLE3 by the non-denaturing technique described in section
It was isolated from a form 92 trade transformant. Aggregate
was resuspended (forming a slurry) by sonication and dissolved by treatment in hot alkali as follows. 0.5MN
a0H was added to the Ageregate pellet to a final concentration of 50mM. Aggreguto was dissolved by heating at 65° C. for 15 minutes. The solution is then cooled and
Tris-HCl pH 7.5 was added (final concentration: 100mM Tris-HCl).

融合タンパク質調整物（スラリーあるいは熱調整物）を
、接種の前に次のアジュバントと混合した。（１）Ｌ１
２１（ハンターＨｕｎｔｅｒら、１９８１、Ｊ、ｏｆ　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２７（３）：１２４４−１２５０：
ＢＡＳＦ　Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ、Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ、Ｍｉｃｈ、）プルロニック（
ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール（動物当り２．５ｍｇを
投与した）、あるいは（２）水酸化アルミニウムゲル（
Ｒｅｈｅｉｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂ
ｅｒｋｅｌｅｙＨｅｉｇｈｔｓ．Ｎ、Ｊ、）０．２％の
最終濃度。The fusion protein preparation (slurry or heat preparation) was mixed with the following adjuvants prior to inoculation. (1)L1
21 (Hunter et al., 1981, J. of
Immunol, 127(3):1244-1250:
BASF Wyandotte Corporation
n, Wyandotte, Mich.) Pluronic (
(2) aluminum hydroxide gel (2.5 mg per animal);
Reheis Chemical Company, B
erkeleyHeights. N, J,) final concentration of 0.2%.

これらの調整物を、次のスケジュールに従い、マウス（
ＣＤ−１株）の免疫化のために用いた。These preparations were added to mice (
CD-1 strain) was used for immunization.

各マウスは、１００μ９の融合タンパク質を１次注射で
与えられ、そし、２２日後、５０μｇの融合タンパク質
で再注射された。融合タンパク質は、０．２ｍｌの全容
量に乳され、それは、各腿に筋肉内注射された。マウス
は、最後の注射後、眼窩後方的に（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂ
ｉｔａｌｌｙ）７日間出血した。Each mouse received a primary injection of 100 μg of fusion protein and was reinjected 22 days later with 50 μg of fusion protein. The fusion protein was concentrated to a total volume of 0.2 ml, which was injected intramuscularly into each thigh. After the last injection, mice were placed retro-orbitally (retro-orb).
itally) Bleeding for 7 days.

採取血清を、次の如く、免疫沈降によって分析した。３
５Ｓ−メチオニン標識のＨＳＶ−１感染ベロ（ｖｅｒｏ
）細胞のリゼイト（溶菌液）と、５μｌのマウス血清く
抗ｐＥＨ４−２あるいは抗ｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３
９２）、予免疫血清（負の標準、ネガティブコントロー
ル）あるいはモノコロナル（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ）
４Ｓ（正の標準。ポジティブコントロール）により、２
時間４℃でインキュベートし、５μｌのうざぎ抗マウス
血清（Ｄａｋｏ、３０分間４℃で）でインキュベートし
た。The collected serum was analyzed by immunoprecipitation as follows. 3
5S-methionine-labeled HSV-1 infected vero
) Cell lysate (lysate) and 5 μl of mouse serum anti-pEH4-2 or anti-pEH90-10 amLE3
92), pre-immune serum (negative standard, negative control) or monocolonal
2 by 4S (positive standard. positive control)
Incubated at 4°C for an hour and with 5 μl of rabbit anti-mouse serum (Dako, 30 minutes at 4°C).

免疫錯体を、６．３．３．項で説明した如きバンソルビ
ン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）を用いて回収した、そして、
放射標識された免疫沈降タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって溶解し、フルオログラフィ（蛍光写真法）を
した。フルオログラフィの結果により、Ｌ１２１アジュ
バンドをもつアルカリ溶解化融合タンパク質（ｐＥＨ４
−２及びｐＥＨ９０−１０ａｍＬＥ３９２の両方とも）
で免疫化したマウスは、強い免役応答性があることを示
した。6.3.3. was recovered using Pansorbin as described in Section 3.
Radiolabeled immunoprecipitated proteins were collected using SDS-PAG.
E and fluorography. Fluorography results showed that alkaline-solubilized fusion protein (pEH4) with L121 adjuvant
-2 and pEH90-10amLE392)
Mice immunized with H.

水酸化アルミニウムで投与したアルカリ溶解化ｐＥＨ４
−２融合タンパク貿では弱い応答性が見られた。他のマ
ウスでは、このテストで判断するのでは応答性が見られ
なかった。Alkaline solubilized pEH4 dosed with aluminum hydroxide
-2 fusion protein trade showed weak responsiveness. Other mice showed no responsiveness as determined by this test.

９、微生物の寄託 ヌクレオチドに与えられた全ての基本の対の大ぎさは、
近似であり、説明のために用いられるものであるごとを
理解すべきである。更に、以上に示された、本発明の、
多くの修飾例及び変更例は、その精神及び観点を離れる
ことなく、作ることができることは明らかである。説明
された特定の具体例は、例のためにのみ与えられ、そし
て、発明は、請求の範囲によってのみ限定される。9. The magnitudes of all basic pairs given to the deposited nucleotides of microorganisms are:
It should be understood that these are approximations and are used for illustrative purposes only. Furthermore, the present invention shown above,
Obviously, many modifications and variations may be made without departing from the spirit and perspective thereof. The specific embodiments described are given by way of example only and the invention is limited only by the scope of the claims.

掲げられたプラスミドを持つ次のようなＥ．コリ菌株は
、アメリカン・タイプ・カルチャ・コレクション（Ａ　
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ
．）に寄託され、そして、掲示された継承番号が命名さ
れた。The following E. coli with the listed plasmids: coli strains were collected from the American Type Culture Collection (A
merican Type Culture Coll
ction: ATCC) (Rockville, Md.
．． ), and the posted succession number was named.

掲げられたプラスミドを持つ次のＥ、コリ株は、アグリ
カルチュラル・リサーチ・カルチャ・コレクション（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＮＲＲＬ）（Ｐｅｏｒ
ｉａ、Ｉｌｌ．）に寄託され、次の継承番号になった。The following E. coli strains carrying the listed plasmids are available from the Agricultural Research Culture Collection (A.
gricultural Research Cult
ure Collection: NRRL) (Peor
ia, Ill. ) and became the next successor number.

本発明は、範囲において、寄託された微生物によって制
限されない、何故ならば、寄託された具体例は本発明の
数個の局面の例示として意図されているからである。全
くここに示され、また説明されたものに加えて、本発明
の変更例は、以上の説明と図面から当業者に明らかにさ
れるものである。このような変更例は、請求の範囲内に
入ると意図されているものである。The invention is not limited in scope by the deposited microorganisms, as the deposited examples are intended as illustrations of several aspects of the invention. Modifications of the invention, in addition to those fully shown and described herein, will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description and drawings. Such modifications are intended to be within the scope of the claims.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図はＨＳＶ−１遺伝子の構成を承り。第２図は、ｇ
Ｄ−１遺伝子配列の配列戦略の制限マツプを示す。第３
３図はｇＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列及びｇＤ−１
プロテインの予想アミノ酸配列を示す。第４図は、ｐＥ
Ｈ２５、即ちｇＤ−１遺伝子の一部から導かれた粗換え
プラスミド及びｐＪｓ４１３、Ｅ、コリの発現ベクトル
の構成を示す。第５図は、ｐＥＨ２５中のＣｒｏ／ｇＤ
−１結合のＤＮＡ配列と予想アミノ酸配列を示す。第６
図は、ＨＳＶ感染ヘラ細胞のリゼイト中に存在する競合
抗原を添加することによるｐＥＨ２５ｇＤ生成物の免疫
沈降の抑制率を示す。第７図は、ｐＥＨ２５から導かれ
たｇＤ−１発現プラスミド、ｐＥＨ４−２の構成を示す
。第８図は、多くのｇＤ−１発現プラスミド、ｐＥＨ５
０＋ｘを製造する方法を示覆。第９図は、ｐＥＨ４−２
中のｇＤ−遺伝子のアミノ解読末端を再構成するための
方法を示す。第１０図は、ｐＥＨ９０−１０ａｍ、即ち
ｐＥＨ３−２５及びｐＨＫ４１４がら導かれたｇＤ−１
発現プラスミドの構成を示す。第１１図はＨｓＶ−２遺
伝子配列の構成を示す。第１２図は、ｇＤ−２遺伝子の
ヌクレオチド配列及びｇＤ−２タンパク質の予想アミノ
酸配列を示す。第１３図は、ｇＤ−１及びｇＤ−２の予
想アミノ酸配列の比較を示す。第１４図は、ｐＨＶ５、
即ちｇＤ−２遺伝子の一部から導かれる組換えプラスミ
ド及びｐＪＳ４１３の構成を示す。第１５図は、ｐＨＶ
６、即ち、ｐＨＶ５から導かれるｇＤ−２発現プラスミ
ドの構成を示す。 特許出願人　　　　モレキュラー、ジェネティックス、
インコーボレーテッド 代理人弁理士　八田幹雄 手続補正書　（方氏） 昭和５９年１月２０日 特許庁長官　若杉　和夫殿 １．事件の表示 昭和５８年　特許願　１３１，１５１号２．発明の名称 シンプレックスウィルスタンパク質類の製法３．補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国５５３４３　　ミネソタ州　ミ
ネトンカプレン　ロード　イースト　１０３２０名　称
　モレキュラー、ジェネティックス、インコーホレーテ
ッド 代表者　チャールス、シー、マスコプラット国　籍　ア
メリカ合衆国 ４、代理人 住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス
二番町氏　名　（７２３４）弁理士　八田幹雄　　　　
電　話　０３−２３０−４７６６番５．補正命令の日付 昭和５８年１０月１日（発送日：昭和５８年１０月２５
日）６、補正の対象 （１）明細用の浄書（内容に変更なし）（２）図面の浄
書（内容に変更なし） （３）願書の「特許出願人の代表者氏名」の欄（４）委
任状 （５）法人国籍証明書 ７、補正の内容 （１）別紙添付浄書した明細書のとおり。 （２）別紙添付浄書した図面のとおり。 （３）別紙添付訂正願書のとおり。 〈４）別紙添付委任状およびその訳文のとおり。 （５）別紙添付法人国籍証明書およびその訳文のとおり
。Figure 1 shows the structure of the HSV-1 gene. Figure 2 shows g
A restriction map of the sequence strategy for the D-1 gene sequence is shown. Third
Figure 3 shows the nucleotide sequence of gD-1 gene and gD-1
The predicted amino acid sequence of the protein is shown. Figure 4 shows pE
The construction of a crude plasmid derived from a portion of the H25, ie, gD-1 gene, and the expression vector of pJs413, E. coli, is shown. Figure 5 shows Cro/gD in pEH25.
-1 binding DNA sequence and predicted amino acid sequence are shown. 6th
The figure shows the percentage inhibition of immunoprecipitation of pEH25gD products by addition of competing antigens present in lysates of HSV-infected Hela cells. Figure 7 shows the construction of pEH4-2, a gD-1 expression plasmid derived from pEH25. Figure 8 shows a number of gD-1 expression plasmids, pEH5
Revealing the method of manufacturing 0+x. Figure 9 shows pEH4-2
2 shows a method for reconstructing the amino-decoded ends of the gD-gene in FIG. Figure 10 shows gD-1 derived from pEH90-10am, pEH3-25 and pHK414.
The construction of the expression plasmid is shown. FIG. 11 shows the structure of the HsV-2 gene sequence. Figure 12 shows the nucleotide sequence of the gD-2 gene and the predicted amino acid sequence of the gD-2 protein. Figure 13 shows a comparison of the predicted amino acid sequences of gD-1 and gD-2. Figure 14 shows pHV5,
That is, the structure of a recombinant plasmid derived from a part of the gD-2 gene and pJS413 is shown. Figure 15 shows pHV
6, that is, the construction of the gD-2 expression plasmid derived from pHV5. Patent applicant: Molecular, Genetics,
Incorporated Representative Patent Attorney Mikio Hatta Procedural Amendment (Mr. Kata) January 20, 1980 Commissioner of the Japan Patent Office Kazuo Wakasugi 1. Indication of the incident 1981 Patent Application No. 131,151 2. Name of the invention Method for producing simplex virus proteins 3. Relationship to the amendr case Patent applicant address 10320 Kaplen Road East, Minneton, Minnesota, United States 55343 Name Molecular, Genetics, Incorporated Representative Charles, C., Muscoprat Nationality United States 4, Agent address 11-9 Nibancho, Chiyoda-ku, Tokyo Dia Palace Nibancho Name (7234) Patent attorney Mikio Hatta
Telephone: 03-230-4766 5. Date of amendment order: October 1, 1982 (Shipping date: October 25, 1988)
6, Subject of amendment (1) Engraving of the specification (no change in content) (2) Engraving of drawings (no change in content) (3) Column for "Name of representative of patent applicant" in application (4) ) Power of attorney (5) Certificate of corporate nationality 7, contents of amendments (1) As per the detailed attached attached copy. (2) As shown in the attached attached drawing. (3) As per the attached amendment application form. (4) As per the attached power of attorney and its translation. (5) As per the attached corporate citizenship certificate and its translation.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）（ａ）ヘルペスシンプレッスクウィルス糖タンパ
ク質の免疫活性及び抗原性の決定因子を有し、単細胞生
体中に複製、転写及び翻訳されることのできるポリペプ
チドのため解読するＤＮＡ配列を有する引換えベクトル
を含む単細胞生体を培養し、かつ（ｂ）該ポリペブチド
を培養物から単離することを特徴とするヘルペスシンプ
レックスウィルス糖タンパク賀の免疫反応性で抗原性の
決定因子を有するポリペブチドの製造方法。 （２）該ポリペプチドは免疫原性である特許請求の範囲
第１項に記載の製造方法。 （３）該組換えベクトルは、単細胞生体中に形質転換に
よって導入されたことを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の製造方法。 （４）該組換えベクトルは、単細胞生体中に、形質導入
によって導入されたことを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の製造方法。 （５）該組換えベクトルは、単細胞生体中に、トランス
フェクションによって導入されたことを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の製造方法。 （６）ＤＮＡ配列に含まれる情報は、ヘルペスシンプレ
ックスウィルスゲノムから得られたことを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 （７）ＤＮＡ配列に含まれる情報は、ヘルペスシンプレ
ックスウィルスタイプ１から得られたことを特徴とする
特許請求の範囲第６項に記載の製造方法。 （８）ＤＮＡ配列から得られる情報は、ヘルペスシンプ
レックスウィルスタイプ２から得られたことを特徴とす
る特許請求の範囲第６項に記載の製造方法。 （９）ＤＮＡ配列から得られる情報は、ヘルペスシンプ
レックスウィルス糖タンパク質について解読するｍＲＮ
Ａを単離し、かつ単離されたｍＲＮＡに対して相補の１
つの鎖を有する該ＤＮＡ配列と対比づる逆転写酵素を用
いることによって得られたことを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の製造方法。 （１０）ＤＮＡ配列は、ヘルペスシンプレックスウィル
スＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクトルから得られたことを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造方法。 （１１）ＤＮＡ配列は、ヘルペスシンプレックスウィル
スタイプ１のｇＤ糖タンパク質についで暗号解読するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造方法
。 （１２）ＤＮＡ配列は、ヘルペスシンプレックスウィル
スタイプ２のｇＤ糖タンパク質について暗号解読するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造方法
。 （１３）単細胞生体は真核生物の生体である特許請求の
範囲第１項に記載の製造方法。 （１４）単細胞生体は、原核生物の生体である特許請求
の範囲第１項記載の製造方法。 （１５）原核生物の生体はエスケリキア・コリ（Ｅｘｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第
１４項に記載の製造方法。 （１６）エスケリキア・コリはＡＴＣＣ継承第３９．１
５９号を有し、またはその変異株、組換えまたは一般的
に加工された等価誘導株である特許請求の範囲第１５項
に記載の製造方法。 （１７）エスクリキア・コリはＡＴＣＣ継承第３９．１
６０号を有し、またはその変異株、組換えあるいは一般
的に加工された等価誘導株である特許請求の範囲第１５
項に記載の製造方法。 （１８）エスケリキア・コリはＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５
４４９号を有し、またはその変異株、組換えあるいはそ
の一般的に加工された等価誘導株である特許請求の範囲
第１５項に記載の製造方法。 （１９）エスケリキア・コリはＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５
４５０号を有し、またはその変異株、組換えあるいは一
般的に加工された等価誘導株である特許請求の範囲第１
５項に記載の製造方法。 （２０）エスケリキア・コリはＮＲＬ継承第Ｂ−１５４
５１号を有し、またはその変異株、組換えあるいは一般
的に加工された等価誘導株である特許請求の範囲第１５
項に記載の製造方法。 （２１）エスケリキア・コリはＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５
４７１号を有し、またはその変異株、組換えあるいは一
般式に加工された等価誘導株である特許請求の範囲第１
５項に記載の製造方法。 〈２２）ヘルペスシンプレックスウィルス糖タンパク質
の免疫活性で抗原性の決定因子を有するポリペプチドの
ためのＤＮＡ配列暗号解読を有する単細胞生体の製造方
法において、組換えベクトルを単細胞生体の中に導入し
、ここで該組換えベクトルはヘルペスシンプレックスウ
ィルス糖タンパク質の免疫活性で抗原性の決定因子を持
ち、そして、単細胞生体中で複製され、転写されかつ翻
訳されることのできるポリペブチドのためのＤＮＡ配列
暗号解読を含んでいることを特徴とする単細胞生体の製
造方法。 （２３）第３図に示されるごときヘルペスシンプレック
スウィルスタイプ１ｇＤ糖タンパク質のための解読の精
製ＤＮＡ配列またはヘルペスシンプレックスウィルス糖
タンパク質の免疫活性で抗原性の決定因子を持つポリペ
プチドのためのその部分。 （２４）特許請求の範囲第２３項のＤＮＡ配列を有する
組換えベクトル。 （２５）該ＤＮＡ配列は、発現制御部材の制御下にある
ことを特徴とする特許請求の範囲第２４項に記載の組換
えベクトル。 （２６〉該ベクトルは、ｐＥＨ５１またはその変異物、
組換えまたは一般的に加工された等価誘導対であること
を特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の組換えベ
クトル。 （２７）更に、ｐＢＲ３２２レプリコンの本質的部分を
有する特許請求の範囲第２４項に記載の組換えベクトル
。 （２８）該ＤＮＡ配列が正確な翻訳読みとりフレームの
中で、タンパク質のための解読する第２のＤＮＡ配列と
結合していることを特徴とする特許請求の範囲第２４項
に記載の組換えベクトル。 （２９）該ベクトルは、ｐＥＨ４２またはその変異物、
組換えまたは一般的に加工された等価誘導体であること
を特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の組換えベ
クトル。 （３０）該ベクトルは、ｐＥＨ８２またはその変異物、
相換えまたは一般的に加工された秀価誘導体であること
を特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の組換えベ
クトル。 （３１）鎖末端信号は、正確な翻訳読みとりフレーム中
に該第１及び第２のＤＮＡ配列の間に位置していること
を特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載の相換えベ
クトル。 （３２）該ベクトルｐＥＨ９０−１０ａｍまたはその変
異物、絹換えまたは一般的に加工された等価誘導体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載の組
換えベクトル。 （３３〉特許請求の範囲第２３項のＤＮＡ配列を含む単
細胞生体。 （３４）特許請求の範囲第２４項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （３５〉特許請求の範囲第２５項の相変換えベクトルを
含む単細胞生体。 （３６）特許請求の範囲第２７項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （３７）特許請求の範囲第２８項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （３８）特許請求の範囲第３１項の組換えベクトルおよ
び相当する鎖端末ザプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含む単
細胞生体。 （３９）特許請求の範囲第２３項のＤＮＡ配列を含むエ
スケリキャ・コリ・バクテリヤ。 （４０）特許請求の範囲第２８項のＤＮＡ配列を含むエ
スケリキア・コリ・バクテリア。 （４１）特許請求の範囲第３１項のＤＮＡ配列及び相当
する鎖末端体サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含むエスケ
リキア・コリ・バクテリア。 （４２）ＡＴＣＣに寄託され、継承第３９．１５９号と
命名された特許請求の範囲第３９項のエスケリキア・コ
リまたはその変異物、組換えまたは一般的に加工された
等価誘導体。 （４３）ＡＴＣＣに寄託され、継承第３９，１６０号と
命名された特約請求の範囲第４０項のエスケリキア・コ
リ・バクテリアまたはその変異体、組換えまたは一般的
に加工された等価誘導体。 （４４）ＮＲＲＬに奇託され、継承第Ｂ−１５４７１号
と命名された特許請求の範囲第４０項にエスクリキア・
コリ・バクテリアまたはその変異体、組換えまたは一般
的に加工された等価誘導体。 （４５）ＮＲＲＬに寄託され、継承第Ｂ−１５４５１号
と命名された特許請求の範囲第４１項のエスクリキア・
コリ・バクテリアまたはその変異体、組換えまたは一般
的に加工された等価講導体。 （４６）第１２図に示す如き、ヘルペスシンプレツクス
ウイルスタイプ２ｇＤ糖タンパク質の免疫活性で、抗原
性決定因子を有するポリペプチドのための解読のその部
分。 （４７）特許請求の範囲第４６項のＤＮＡ配列を有する
組換えベクトル。 （４８）該ＤＮＡ配列は、発現制御要素の制御下にある
ことを特徴とする特許請求の範囲第４７項の組換えベク
トル。 （４９）該ベクトルはｐＨＶ５またはその変異体、相換
えまたは一般的に加工された等価誘導体であることを特
徴とする特許請求の範囲第４８項の組換えベクトル。 （５０）更に、ｐＢＲ３２２レプリコンの本質的部分を
有する特許請求の範囲第４７項の組換えベクトル。 （５１）該ＤＮＡ配列は、正しい翻訳リーディングフレ
ームにおいて、タンパク質のための解読の第２のＤＮＡ
配列に結合していることを特徴とする特許請求の範囲第
４７項の組換えベクトル。 （５２）該ベクトルは、ｐＨＶ６またはその変異体、相
換えまたは一般的に加圧された等価誘導体であることを
特徴とする特許請求の範囲第５１項の相換えベクトル。 （５３）鎖末端信号は、正しい翻訳リーディングフレー
ムにおいて、該第１と第２のＤＮＡ配列の間に位置され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第５１項の組換
えベクトル。 （５４）特許請求の範囲第４６項のＤＮＡ配列を含む、
単細胞生体。 （５５）特許請求の範囲第４７項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （５６）特許請求の範囲第４８項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （５７）特許請求の範囲第５０項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （５８）特許請求の範囲第５１項の組換えベクトルを含
む単細胞生体。 （５９）特許請求の範囲第５３項の組換えベクトル及び
相当する鎖末端体サブレッサーｔＲＮＡを含む単細胞生
体。 （６０）特許請求の範囲第４６項のＤＮＡ配列を含むエ
スケリキア・コリ・バクテリヤ。 （６１）特許請求の範囲第５１項のＤＮＡ配列を含むエ
スクリキア・コリ・バクテリヤ。 （６２）ＮＲＲＬに寄託され、継承筒Ｂ−１５４４９号
と命名された特許請求の範囲第６０号のエスケリキア・
コリ・バクテリヤまたはその変異体、組換えまたは一般
的に加工された等価誘導体。 （６３）ＮＲＲＬに寄託され、継承第Ｂ−１５４５０号
と命名された特許請求の範囲第６１号のエスケリキア・
コリ・バクテリヤまたはその変異体、組換えまたは一般
的に加工された等価誘導体。 （６４）特許請求の範囲第１項の方法により作られたポ
リペプチド。 （６５）エスケリキア・コリ　ＡＴＣＣ継承第３９，１
５９号またはその変異体、組換えまたは一般的に加工さ
れた等価誘導体によって作られた、ヘルペスシンプレッ
クスウィルス糖タンパク質の免疫活性及び抗原性決定因
子を右するポリペプチド。 （６６〉エスケリキア・コリ　ＡＴＣＣ継承第３９，１
６０号またはその変異体、組換えまたは一般的に加工さ
れた等価誘導体によって作られた、ヘルペスシンプレッ
クスウィルス糖タンパク賀の免疫活性及び抗原性決定因
子を有するポリペプチド。 （６７）エスケリキア・コリ　ＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５
４７１号またはその変異体、組換えまたは一般的に加工
された等価誘導体によって作られた、ヘルペスシンプレ
ツクスウイルス糖タンパク質の免疫活性及び抗原性の決
定因子を有するポリペプチド。 （６８）エスケリキア・コリ　ＮＲＲＬ継承箱Ｂ−１５
４５１号またはその変異体、組換えまたは一般的に加工
された等価誘導体によって作られた、ヘルペスシンプレ
ックスウィルス糖タンパク賀の免疫活性及び抗原性の決
定因子を有するポリペプチド。 （６９）エスクリキア・コリＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５４
４９号またはその変異体、組換えまたは一般的に加工さ
れた等価誘導体により作られたヘルペスシンプレックス
ウィルス糖タンパク質の免疫活性及び抗原性の決定因子
を有するポリペプチド。 （７０〉エスケリキア・コリＮＲＲＬ継承第Ｂ−１５４
５０号あるいはその変異体、組換えあるいは一般的に加
工された等価誘導体により作られた、ヘルペスシンプレ
ックスウイルス糖タンパク質の免疫活性及び抗原性の決
定因子を有するポリペプチド。 （７１）特許請求の範囲第６４項のポリペプチド及びそ
のための適合する製薬的担体を有するワクチン処方。[Scope of Claims] (1) (a) For a polypeptide having determinants of immunoactivity and antigenicity of the herpes simplex virus glycoprotein and capable of being replicated, transcribed and translated in a single cell organism. an immunoreactive and antigenic determinant of a herpes simplex virus glycoprotein, comprising culturing a unicellular organism containing an exchange vector having a DNA sequence to be decoded, and (b) isolating said polypeptide from the culture. A method for producing a polypeptide having (2) The production method according to claim 1, wherein the polypeptide is immunogenic. (3) Claim 1, characterized in that the recombinant vector is introduced into a unicellular organism by transformation.
The manufacturing method described in section. (4) The production method according to claim 1, wherein the recombinant vector is introduced into a single-celled organism by transduction. (5) The production method according to claim 1, wherein the recombinant vector is introduced into a single-celled organism by transfection. (6) The manufacturing method according to claim 1, wherein the information contained in the DNA sequence is obtained from the herpes simplex virus genome. (7) The manufacturing method according to claim 6, wherein the information contained in the DNA sequence is obtained from herpes simplex virus type 1. (8) The manufacturing method according to claim 6, wherein the information obtained from the DNA sequence is obtained from herpes simplex virus type 2. (9) Information obtained from DNA sequences can be used to decode mRNAs about herpes simplex virus glycoproteins.
A and complementary to the isolated mRNA.
2. The production method according to claim 1, wherein the method is obtained by using a reverse transcriptase to contrast the DNA sequence having two strands. (10) The manufacturing method according to claim 1, wherein the DNA sequence is obtained from a DNA vector containing a herpes simplex virus DNA sequence. (11) The production method according to claim 1, wherein the DNA sequence is decoded after gD glycoprotein of herpes simplex virus type 1. (12) The production method according to claim 1, wherein the DNA sequence is decoded for gD glycoprotein of herpes simplex virus type 2. (13) The manufacturing method according to claim 1, wherein the unicellular organism is a eukaryotic organism. (14) The production method according to claim 1, wherein the unicellular organism is a prokaryotic organism. (15) The prokaryotic organism is Escherichia coli (Exc
15. The manufacturing method according to claim 14, wherein the method is Herichia coli. (16) Escherichia coli is ATCC succession number 39.1
59, or a mutant, recombinant or generally processed equivalent derivative strain thereof. (17) Escrichia coli is ATCC succession number 39.1
No. 60, or a mutant, recombinant or generally processed equivalent derivative strain thereof, Claim 15
The manufacturing method described in section. (18) Escherichia coli is NRRL inheritance No. B-15
449, or a mutant, recombinant, or commonly processed equivalent derivative thereof. (19) Escherichia coli is NRRL inheritance No. B-15
450, or its mutant, recombinant or generally processed equivalent derivative strain
The manufacturing method according to item 5. (20) Escherichia Cori is NRL Succession No. B-154
Claim No. 51, or a mutant, recombinant or generally processed equivalent derivative strain thereof
The manufacturing method described in section. (21) Escherichia coli is NRRL inheritance No. B-15
471, or its mutant strain, recombinant strain, or equivalent derivative strain processed into the general formula.Claim 1
The manufacturing method according to item 5. <22) In a method for producing a unicellular organism having DNA sequence coding for a polypeptide having an immunologically active and antigenic determinant of herpes simplex virus glycoprotein, a recombinant vector is introduced into the unicellular organism; The recombinant vector carries the immunoreactive and antigenic determinants of the herpes simplex virus glycoprotein and has the DNA sequence coding for a polypeptide that can be replicated, transcribed and translated in a single cell organism. A method for producing a single-celled organism, comprising: (23) A purified DNA sequence of the decoding for the herpes simplex virus type 1 gD glycoprotein as shown in FIG. 3 or a portion thereof for a polypeptide having immunoreactive and antigenic determinants of the herpes simplex virus glycoprotein. (24) A recombinant vector having the DNA sequence according to claim 23. (25) The recombinant vector according to claim 24, wherein the DNA sequence is under the control of an expression control member. (26> The vector is pEH51 or a mutant thereof,
26. The recombinant vector according to claim 25, which is a recombinant or generally processed equivalent derivative pair. (27) The recombinant vector according to claim 24, further comprising an essential part of the pBR322 replicon. (28) The recombinant vector according to claim 24, characterized in that the DNA sequence is joined in a correct translational reading frame to a second DNA sequence decoding for the protein. . (29) The vector is pEH42 or a mutant thereof,
26. The recombinant vector according to claim 25, which is a recombinant or commonly processed equivalent derivative. (30) The vector is pEH82 or a mutant thereof,
26. The recombinant vector according to claim 25, which is a recombinant or commonly processed derivative. (31) The reciprocity vector of claim 28, wherein a chain end signal is located between the first and second DNA sequences in the correct translational reading frame. (32) The recombinant vector according to claim 31, which is the vector pEH90-10am or a mutant, recombined or generally processed equivalent derivative thereof. (33> A unicellular organism comprising the DNA sequence of claim 23. (34) A unicellular organism comprising the recombinant vector of claim 24. (35> Phase conversion of claim 25) (36) A single-celled organism comprising the recombinant vector of Claim 27. (37) A single-celled organism comprising the recombinant vector of Claim 28. (38) Claims A unicellular organism comprising the recombinant vector of Claim 31 and the corresponding chain-terminal Zapressor tRNA gene. (39) Escherichia coli bacterium comprising the DNA sequence of Claim 23. (40) Claims Escherichia coli bacteria comprising the DNA sequence of Claim 28. (41) Escherichia coli bacteria comprising the DNA sequence of Claim 31 and the corresponding chain end suppressor tRNA gene. (42) ATCC Escherichia coli or a mutant, recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof of claim 39, deposited with the ATCC and designated Assumption No. 39.159. Escherichia coli bacterium or its mutant, recombinant or commonly processed equivalent derivative thereof as claimed in Claim 40, designated as No. 39,160. Claim 40 entitled B-15471 claims Escrichia.
coli bacteria or its mutants, recombinant or commonly engineered equivalent derivatives. (45) The escrichia of claim 41 deposited with NRRL and named Inheritance No. B-15451.
coli bacteria or its mutants, recombinant or commonly engineered equivalents. (46) That part of the deciphering for the immunoreactive, antigenic determinant-bearing polypeptide of the herpes simplex virus type 2gD glycoprotein as shown in FIG. (47) A recombinant vector having the DNA sequence according to claim 46. (48) The recombinant vector according to claim 47, wherein the DNA sequence is under the control of an expression control element. (49) The recombinant vector according to claim 48, characterized in that the vector is pHV5 or a mutant, recombinant, or commonly processed equivalent derivative thereof. (50) The recombinant vector according to claim 47, further comprising an essential part of the pBR322 replicon. (51) The DNA sequence is the second DNA decoding for the protein in the correct translation reading frame.
48. A recombinant vector according to claim 47, characterized in that it is linked to a sequence. (52) The reciprocal vector of claim 51, wherein the vector is pHV6 or a mutant, reciprocal or generally pressurized equivalent derivative thereof. (53) The recombinant vector of claim 51, wherein a chain end signal is located between the first and second DNA sequences in the correct translation reading frame. (54) Contains the DNA sequence according to claim 46,
Single-celled organism. (55) A unicellular organism comprising the recombinant vector according to claim 47. (56) A unicellular organism comprising the recombinant vector according to claim 48. (57) A unicellular organism comprising the recombinant vector according to claim 50. (58) A unicellular organism comprising the recombinant vector according to claim 51. (59) A unicellular organism comprising the recombinant vector of claim 53 and the corresponding chain end subresor tRNA. (60) Escherichia coli bacterium comprising the DNA sequence of claim 46. (61) A Escrichia coli bacterium comprising the DNA sequence of claim 51. (62) Escherichia of Claim No. 60, deposited with NRRL and named Succession Tube B-15449.
E. coli or a mutant, recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof. (63) Escherichia of Claim No. 61, deposited with NRRL and named Inheritance No. B-15450.
E. coli or a mutant, recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof. (64) A polypeptide produced by the method of claim 1. (65) Escherichia coli ATCC Succession No. 39, 1
59 or its mutants, recombinant or commonly engineered equivalent derivatives, which determine the immunological activity and antigenicity of herpes simplex virus glycoproteins. (66〉Escherichia coli ATCC Succession No. 39, 1
60 or a variant thereof, or a recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof, having the immunological activity and antigenicity determinants of the herpes simplex virus glycoprotein. (67) Escherichia coli NRRL Succession No. B-15
471 or a variant, recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof, having immunological activity and antigenicity determinants of a herpes simplex virus glycoprotein. (68) Escherichia coli NRRL inheritance box B-15
451 or a variant, recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof, having immunological activity and antigenicity determinants of the herpes simplex virus glycoprotein. (69) Escrichia coli NRRL Succession No. B-154
49 or a variant thereof, or a recombinant or commonly engineered equivalent derivative thereof, a polypeptide having the immunological activity and antigenicity determinants of the herpes simplex virus glycoprotein. (70> Escherichia coli NRRL inheritance No. B-154
50 or its mutants, recombinant or commonly processed equivalent derivatives, and having immunological activity and antigenicity determinants of herpes simplex virus glycoprotein. (71) A vaccine formulation comprising the polypeptide of claim 64 and a compatible pharmaceutical carrier therefor.