SU1701744A1

SU1701744A1 - Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей

Info

Publication number: SU1701744A1
Application number: SU894770553A
Authority: SU
Inventors: Марат Капарович Бегалиев; Муратбек Карабаевич Карабаев; Женис Кадырович Джардемалиев
Original assignee: Институт молекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1989-12-20
Publication date: 1991-12-30

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к биотехнологическим исследовани м растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы , обладающих хоз йственно ценными признаками. Целью изобретени вл етс повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности . Способ предусматривает получение из основани листа каллуса с последующей регенерацией, при этом в процессе культивировани ступенчато измен ют концентрации фитогормонов и освещенность. 8 табл.

Description

&

Ё

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к биологическим исследовани м сельскохоз йственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм пшеницы, обладающих хоз йственно ценными признаками.

Целью изобретени вл етс повышение выхода регенерантов и их жизнеспособности .

Способ предусматривает получение каллуса из экспланта, индукцию образовани морфогенного каллуса, регенерацию растений и укоренение с использованием питательных сред на основе среды Мурасиге- Скуга, в качестве экспланта используют основание листа, а концентрацию фитогормо- нов и интенсивность света измен ют ступенчато: перед высадкой на регенерационную среду каллусы, индуцированные при высоких

(2-4 мг/л) концентраци х 2,4-Д, постепенно адаптируют ко все более низким концентраци м этого гормона (от 2 до 0,1 мг/л) и услови м освещени (темнота - 500-1000 лк), затем в регенерационной среде ступенчато увеличивают содержание зеатина (от 0,1 до 2 мг/л) при посто нной концентрации ИУК (0,01 мг/л) и повышают интенсивность света от 1000 до 2000 лк;дл укоренени и повышени жизнеспособности растений ступенчато измен ют в среде дл укоренени содержание ИУК от 0,1 до 0.5 мг/л, увеличивают освещенность до 4000 лк. Перед высадкой в почву растени выдерживают в среде с половинным содержанием солей по Мурасиге-Скугу (МС) и повышенной по сравнению с регенерационной средой концентрацией ИУК - 0,1-0,5 мг/л. Этим достигаетс стимул ци развити корневой системы, повышение жизнеспособности регенерантов , позвол ющие предотвратить

XI

О

xl

Ь.

4

или уменьшить трансплантационный шок, обусловленный переносом растений из условий In vitro (пробирки) в In vivo (почву). Разработанный способ дает возможность более тонко регулировать морфогенетиче- ские реакции и адаптационные потенции культуры клеток и тем самым регенерировать растени из считающихс низкототи- потентными тканей листа пшеницы.

Способ осуществл етс следующим образом .

Зерновки озимой м гкой пшеницы ( Тг, aestlvum сорт Прогресс) поверхностно стерилизуют последовательно в растворах диацида, этанола, трижды отмывают стерильной дистиллированной водой, и помещают на твердую солевую среду по МС и проращивают на свету 2000hOO лк при температуре 25+1 °С,через 7-8 дней из проростков вычлен ют стерильно базальную часть листа . Сегменты из основани листа длиной 3-5 мм помещают на твердую питательную среду дл каллусогенеза, содержащую соли по МС, 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина , 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 0,7% агара, 2,4-Д при рН 5,7. Экспланты культивируют при 2515,5°С и относительной влажности воздуха 60-70%. Образовавшиес каллусы перенос т на свежую питательную среду того же состава и культивируют 2-3 недели до образовани колоний со средним диаметром 8-10 мм. Далее последовательно осуществл ют следующие этапы:

а)перенос каллусов на среду того же состава, но с содержанием 1 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней в темноте при 25tO,5°C;

б)пересадка каллусов на ту же среду с 0,7 мг/л 2,4-Д, культивирование 12- 14 дней при освещенности 500±100 лк и 25iO,5°C;

в)пересадка каллусов на среду с 0,5 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при освещенности 500+100 лк и 25+0,5°С;

г)пересадка каллусов на среду с 0,3 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при 10001100 лк и 25±0,5°С;

д)пересадка каллусов на среду с 0,1 мг/л 2,4-Д, культивирование 12-14 дней при 1000+100 лк и 25±0.5°С.

Этап культивировани каллусов при концентрации 0,1 мг/л 2,4-Д существенного вли ни на морфогенетическую активность ткани не оказывает и в цел х ускорени регенерации его можно не проводить.

Указанна выше процедура последовательного переноса каллуса на среды со все более понижающимис концентраци ми 2,4-Д позвол ет избежать некроза каллусу,

наблюдаемого при пр мом его переносе со среды дл каллусогенеза на регенерацион- ную, а также существенно увеличить выход эмбриогенного каллуса (примеры).

Далее эмбриогенные каллусы, характеризующиес плотной зарнистой консистенцией , желтовато-зеленого цвета с четко выдел емыми участками из слабовакуоли- зированных клеток меристемоидного типа

0 перенос т на регегерационную среду. Последовательно провод т следующие операции:

а)перенос эмбриогенных каллусов на среду, содержащую соли по МС, 100 мг/л

5 мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,5 мг/л пиридоксина, 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 0,7% агара. Концентраци фитогормонов - 0,5 мг/л зеа- тина, 0,01 мг/л ИУК, Культивируют 7-8 дней

0 при 1000 лк, 27i1°C;

б)пересадка на среду гого же состава, но концентрацию зеатина увеличивают до 1 мг/л. Интенсивность света повышают до 2000 лк, культивируют 7-8 дней;

5в) пересадка на ту же среду и культивирование при тех же услови х, но концентрацию зеатина повышают до 2 мг/л.

Использование этапов культивировани с концентраци ми зеатина ниже 0.5

0 мг/л существенного вли ни нэ регенера- ционную активность не оказывает, и эти этапы можно не осуществл ть.

Образовавшиес на регенерационной среде побеги перенос т на среду дл

5 укоренени , содержащую половинную концентрацию солей по МС и различные концентрации ИУК. В этих услови х регене- ранты переход т постепенно на фотротроф- ный способ питани (так как среда не

0 содержит органических добавок). Последовательно осуществл ют следующие этапы:

а)перенос побегов на половинную минеральную среду МС с содержанием 0,3 мг/л ИУК, освещенность 2000 лк при 16-ча5 совом фотопериоде, температура 27± 1°С, культивирование 5-6 дней;

б)культивирование побегов в тех же услови х , но концентрацию ИУК увеличивают до 0,5 мг/л;

0в) перенос растений на ту же минеральную среду, увеличивают концентрацию ИУК до 1 мг/л и интенсивность света до 4000 лк.

Культивирование побегов на средах с концентраци ми ИУК ниже 0,3 мг/л суще- 5 ственного вли ни на жизнеспособнсоть регенерантов не оказывает, а при концентраци х выше 1,0 мг/л процент укоренившихс растений снижаетс .

Растени -регенеранты с хорошо развитой корневой системой высаживают в почву

и осуществл ют полный этап вегетации до получени сем н.

Полученные из листовой ткани расте- ний-регенеранты. проход т селекционно-генетические испытани в полевых услови х. Среди них вы влены i сомаклональные варианты с хоз йственно-ценными признаками .

П р и м е р 1. Изучают вли ние различных концентраций 2,4-Д на морфогенетиче- скую активность каллусной ткани. Каллусы индуцируют на среде с 2-4 мг/л 2,4-Д. Выход морфогенных каллусов на этой среде 1-2 %. Данные приведены в табл.1,

41 р и м е р 2. Изучают вли ние различ- ных этапов субкультивировани при последовательно понижающихс концентраци х 2,4-Д. Данные приведены в табл.2.

Как видно из сравнительного анализа данных табл.1 и 2, при ступенчатом пониже- нии концентрации 2,4-Д в среде культивировани процент морфогенных каллусов существенно возрастает (до 64%). При концентраци х 2,4-Д ниже 0,3 мг/л дальнейшего усилени эффекта ступенчатого изменени градиента воздействи не наблюдаетс .

ПримерЗ Изучают вли ние условий предварительного субкультивировани каллусов при различных концентраци х 2,4-Д на по вление некротических участков в кал- лусах при их пересадке на регенерацион- ную среду. В этом же опыте оценивают частоту регенерации. Данные приведены в табл.3.

П р и м е р 4, Изучают вли ние различ- ных концентраций фитогормонов в регене- рационной среде на частоту по влени побегов. Морфогенные каллусы получают путем ступенчатого снижени концентрации 2,4-Д от 4 до 0,3 мг/л. Данные приведе- ны в табл.4.

Как видно из приведенных данных, оп- тимальныне дл регенерации растений концентрации при пр мой пересадке составл ют 1,0-2,0 мг/л. Дальнейшее повы- шение концентации снижает эффект.

П р и м е р 5, Изучают вли ние ступенчатого изменени концентрации зеатина на регенерационную способность каллусов. Морфогенные каллусы получают, как в при- мере 4. Концентраци ИУК посто нна и равна 0,01 мг/л. Данные приведены в табл.5.

Из сравнительного анализа данных табл.4 и 5 следует следующее: при ступен- чатом повышении концентрации зеа/ина частота регенерации возрастает по сравнению с пр мой пересадкой. Кроме того, возрастает также в 1,5 раза количество побегов с одного каллуса.

Примерб, Изучают вли ние различных концентраций ИУК в среде дл укоренени на жизнеспособность растений-регенерантов, оцениваемую по количеству укоренившихс в почве растений. Данные приведены в табл.6.

Как видно из приведенных данных, оптимальные дл укоренени растений концентрации ИУК наход тс в пределах 0,3-1,0 мг/л. Ступенчатое изменение концентрации ИУК дает 100%-ную приживаемость , при этом корнева система растений более мощна , чем при пр мой пересадке на среду с 0,5 мг/л ИУК.

Пример. Изучают вли ние освещенности на частоту образовани морфогенных каллусов. Услови индукции каллусогенеза, как в примере 1. Данные приведены в табл,7.

Из данных следует, что освещение каллусов в 1,5 раза увеличивает частоту по влени морфогенных каллусов.

Перечень компонентов среды, использовавшихс в осуществлении предлагаемого способа,

Состав питательной среды, мг/л МН4МОз1650

КМОз1900

CaCl2 2Н20440

MgS04 7H20370

КНаР04170

N32EDTA 2Н2037,3

FeS04 7Н2027,8

НзВОз6,2

MnSCM 4H2022,3

ZnS04 7H208,6

KI0,83

Na2Mob4 2H200,25

CuSCM 5Н2О0,025

CoCI2 6Н200,025

Сахароза30000

Глицин2,0

Мезоинозит100,0

Никотинова кислота0,5

Пиридоксин HCI1,0

Тиамин HCI1,0

Агар7000

РН5,7

Claims

Гормоны (табл.8) Формула изобретени Способ регенерации растений пшеницы в культуре тканей, включающий получение первичного каллуса из экспланта, индукцию образовани и культивирование эмбриогенного каллуса, получение регене- рантов и их укоренение с использованием питательных сред на основе Мурасиге-Ску- га в присутствии фитогормонов.о т л и ч а ю- щ и и с тем,что с целью повышени выхода регенерантов и их жизнеспособности, в качестве экспланта используют основание листа , при культивировании эмбриогенного каллуса в питательной среде измен ют ступенчато концентрацию 2,4-Д от 2 до 0,1 мг/л и освещенность от 500 до 1000 лк, при получении регенёрэнтов в среде ступенчато измен ют концентрацию зеатина от 0,1 до

Вли ние различных концентраций 2,4 - Д на морфогенез

Исследование различных ступенчатых изменений содержани 2.4 - Д

Вли ние изменени содержани фитогормонов на регенерацию

2 мг/л, устанавливают концентрацию индо- лил-3-уксусной кислоты, равную 0,01 мг/л, и освещенность увеличивают от 1000 до 2000 лк, при укоренении регенерантов в среде ступенчато измен ют концентрацию индо- лил-3-уксусной кислоты от 0,1 до 0,5 мг/л и освещенность от 2000 до 4000 лк.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Вли ние содержани фитогормонов на побегообразование

Вли ние изменени содержани зеатина на регенерационную способность

Вли ние содержани ПУК на укоренение

Таблица 4

Таблица 5

Таблица б

Вли ние освещенности на морфогенез

Содержание фитогормонов в различных средах

Таблица 7

Таблица 8