SU1687616A1 - Strain streptococcus lactis - a producer of antibiotic nisyne - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к штаммам микроорганизмов и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской, микробиологической и консервной промышленности Целью изобретени   вл етс  штамм продуцент низина, обеспечивающий высокий выход целевого продукта при сокращении сроков ферментации и расширении спектра сбраживаемых субстратов. Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-4591  вл етс  рекомбинантным, полученным при сли нии протопластов низкоактивных по низину родственных штаммов 729 и 1605, полученных из коллекции культур микроорганизмов ВНИКМИ. Штамм обладает высокой антибиотической активностью низина в культу- ральной жидкости, позвол ет сократить врем  процесса получени  низина и обеспечивает возможность замены глюкозы на другой углеводный субстрат. 2 таблThe invention relates to microorganism strains and can be used in the food, dairy, medical, microbiological and canning industry. The aim of the invention is a nisin producing strain that provides a high yield of the desired product while reducing fermentation time and expanding the spectrum of fermentable substrates. The Streptococcus lactis VKPM B-4591 strain is a recombinant strain obtained by fusing protoplasts of low-active nisinogen related strains 729 and 1605, obtained from the VNMIMI culture collection. The strain possesses high antibiotic activity of nisin in the culture fluid, shortens the time of the process of obtaining nisin, and makes it possible to replace glucose with another carbohydrate substrate. 2 tabl

Description

ЁYo

Изобретение относитс  к штаммам микроорганизмов и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской, микробиологической и консервной промышленности .The invention relates to microbial strains and can be used in the food, dairy, medical, microbiological and canning industries.

Целью изобретени   вл етс  штамм - продуцент низина, обеспечивающий высокий выход целевого продукта при сокращении сроков ферментации и расширении спектра сбраживаемых субстратов.The aim of the invention is a nysin producing strain that provides a high yield of the desired product while reducing fermentation time and expanding the spectrum of fermentable substrates.

Штамм Streptococcus lactls F116 хранитс  в музее чистых культур ВНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В-4591. Штамм  вл етс  рекомбинантным, полученным при сли нии протопластов низкоактивных по низину родственных штаммов 729 и 1605, полученных из коллекции культур микрорганизмов ВНИКМИ Госаг- ропрома СССР.The Streptococcus lactls F116 strain is stored in the Museum of Pure Crops of the Scientific Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms under collection number VKPM B-4591. The strain is recombinant, obtained by fusion of protoplasts of low-active nisinous related strains 729 and 1605, obtained from the collection of microorganism cultures of the All-Union Scientific-Industrial Institute of Metrology and Industry of the USSR State Agrarian Industry.

Морфологические признаки. Грамполо- жительные бактерии, бесспоровые, неподвижные , клетки сферической формы до 2 мкм в диаметре, образующие пары или цепочки до четырех кокков. На агаровых средах образуют белые блест щие колонии с ровными кра ми, мелкие с диаметром до 3 мм (поверхностный рост). Возможен глубинный рост на твердых агаровых средах, при этом вырастают колонии лодочкообразной формы. Характер роста на агаровых средах с добавлением гидролизата молока, капустного отвара, дрожжевого автолизата в сочетании с сол ми или МПА идентичен,Morphological signs. Gram-positive bacteria, uncontrolled, immobile, spherical cells up to 2 microns in diameter, forming pairs or chains up to four cocci. On agar media, white shiny colonies form with smooth edges, small with a diameter of up to 3 mm (surface growth). Deep growth on solid agar media is possible, with boat-shaped colonies growing. The growth pattern on agar media with the addition of milk hydrolyzate, cabbage broth, yeast autolysate in combination with salts or MPA is identical,

Культуральные признаки. При росте в жидких средах, приготовленных на основе гидролизата молока, глюкозодрожжевой с сол ми наблюдаетс  помутнение, в стерильном обезжиренном молоке образуетс  плотный сгусток. В м сопептонном бульоне (МПБ) с 2-4% хлористого натри  наблюдаО 00Cultural features. With growth in liquid media prepared on the basis of milk hydrolyzate, glucose yeast with salts is clouded, and a dense clot forms in sterile skimmed milk. In m of septone broth (MPB) with 2-4% sodium chloride, it is observedO00

VIVI

ОкOK

сЈcЈ

етс  рост, а с 6,5% хлористого натри  рост отсутствует, а гидролизате молока с рН 9,2 растет, а при рН 9,6 нет. Штамм термоустойчив при 55°С, но прм 45°С не растет, как и при температуре ниже 10°С. Оптимальной температурой инкубировани   вл етс  25°С.growth, and with 6.5% sodium chloride growth is absent, and the hydrolyzate of milk with a pH of 9.2 increases, and at pH 9.6 there is no. The strain is thermally stable at 55 ° C, but prm 45 ° C does not grow, as at temperatures below 10 ° C. The optimum incubation temperature is 25 ° C.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм образует аммиак из аргинина, сбраживает арабинозу, галактозу, маннозу, глюкозу , лактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, сорбит, мэннит, декстрин. Явл етс  типичным представителем гомофер- ментативного молочно-кислого брожени . При росте образует до 4,0% молочной кислоты , следовые количества диацетила и аце- тоина (по креатиновой пробе), за 8-9,5 ч инкубировани  - полипептидный антибиотик низин с активностью его в культураль- ной жидкости до 4000-4200 ME/мл. Штамм устойчив к низину, фузидину, рифампицину, неомицину, пенициллину, фагоустойчив, не патогенен. Высока  активность штамма стабильна в течение 22 генераций и при длительном хранении в пиофильном состо нии в ампулах с защитной средой, содержащей, %: желатоза 11; сахароза 22, глютамат натри  4,4; цитрат натри  трехзамещенного 50,0, при 4-6°С; в течение мес ца штамм можно хранить а услови х холодильника в виде молочного сгустка. Перевивку производ т посредством внесени  сгустка с одной микробиологической петли в стерильное обезжиренное молоко (8-10 мл). Засе нный инокул т выращивают при 22-25°С в течение 10-12 ч.Physiological and biochemical signs. The strain forms ammonia from arginine, it ferments arabinose, galactose, mannose, glucose, lactose, sucrose, maltose, raffinose, sorbitol, mannitol, dextrin. It is a typical representative of homofermentative lactic fermentation. With growth, it forms up to 4.0% lactic acid, trace amounts of diacetyl and acetoin (in the creatine test), for 8-9.5 hours of incubation - nipin polypeptide antibiotic with its activity in the culture fluid up to 4000-4200 ME / ml. The strain is resistant to nisin, fusidin, rifampicin, neomycin, penicillin, phage-resistant, not pathogenic. High activity of the strain is stable for 22 generations and during long-term storage in a pyophilic state in ampoules with a protective medium containing,%: gelatose 11; sucrose 22, monosodium glutamate 4.4; sodium citrate trisubstituted 50.0, at 4-6 ° C; The strain can be stored for a month under the conditions of the refrigerator as a milk clot. Rewashing is done by depositing a clot with one microbiological loop into sterile skimmed milk (8-10 ml). The planted inoculum is grown at 22-25 ° C for 10-12 hours.

П р и м е р 1. Использование штамма Streptococcus lactis F 116.PRI me R 1. The use of the strain Streptococcus lactis F 116.

Штамм восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 25°С до образовани  сгустка. Микробиологической петлей сброженный культурой молочный сгусток внос т в 10 мл стерильного обезжиренного молока и инкубируют 8 ч. Затем тем же способом сгусток внос т в посевную промежуточную среду состава: глюкоза 1%; дрожжевой автолизат 25 мг% по азоту аммони . После 8-9 ч инкубировани  3% инокул та перенос т из посевной среды в солевую среду, содержащую, %: глюкоза 1; К2НР04 2,0; NaCI 20,2; MgSCU 0,02 и дрожжевой автолизат в том количестве , что и в посевной среде. Процесс ферментации ведут 8-9,5 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4000 МЕ/мл.The strain is reconstituted in sterile skimmed milk and incubated at 25 ° C until a clot forms. A microbiological loop of a cultured fermented milk clot is introduced into 10 ml of sterile skimmed milk and incubated for 8 hours. Then the clot is introduced into the inoculated intermediate medium of the composition: glucose 1%; yeast autolysate 25 mg% ammonium nitrogen. After 8-9 hours of incubation, 3% inoculum is transferred from the inoculum to a saline medium containing,%: glucose 1; K2HP04 2.0; NaCl 20.2; MgSCU 0.02 and yeast autolysate in the same amount as in the sowing medium. The fermentation process is carried out for 8-9.5 hours at room temperature, which ensures the antibiotic activity of the culture fluid at the level of 4000 IU / ml.

П р и м е р 2. Штамм, восстановленный в стерильном обезжиренном молоке, после инкубировани  в промежуточной посевной среде состава по примеру 1, высевают вEXAMPLE 2 A strain, reconstituted in sterile skimmed milk, after incubation in an intermediate inoculum of the composition of Example 1, is seeded in

солевую среду, содержащую, %: мальтоза 1,0; остальные компоненты - в том же количестве. Уровень антибиотической активности при тех же режимах составл ет 4200 МЕ/мл.salt medium containing,%: maltose 1.0; the remaining components are in the same quantity. The level of antibiotic activity under the same regimens is 4200 IU / ml.

Антибиотическую активность определ ют микробиологическим методом с тест- культурой Вас. coagulans. Среду дл  культиЁировани  теста готов т на бульоне Хоттингера с добавлением, %: глюкоза 1,0;Antibiotic activity is determined by a microbiological method with a test culture of you. coagulans. The cultivation medium of the dough is prepared in Hottinger broth with the addition,%: glucose 1.0;

NaCI 0,2; агар-агар 2,0. Дл  титровани  антибиотика низина служит среда, приготовленна  на фосфатном буфере с рН 5,0 с добавлением, %: пептон 2,0; глюкоза 1,0; агар 2,0.NaCl 0.2; agar-agar 2.0. For titration of nisin antibiotic, a medium prepared in phosphate buffer with a pH of 5.0 with the addition,%, is used: peptone 2.0; glucose 1.0; agar 2.0.

Ход определени . Культуральную жидкость вместе с биомассой стрептококков экстрагируют ацетоуксусной смесью в соотношении ацетон:кислота:вода 4:1:5 при 55°С в течение 1 ч. Дл  этого 0,5 мл культуральной жидкости развод т в 4,5 мл смеси, став т на экстракцию, полученный экстракт развод т фосфатным буфером в соотношении 1:10 и 0,12 мкл, внос т в лунки на агаровой среде, засе нной тест-культурой. ПоThe course of determination. The culture fluid together with the streptococcal biomass is extracted with an acetoacetic mixture in a ratio acetone: acid: water 4: 1: 5 at 55 ° C for 1 hour. For this, 0.5 ml of the culture fluid is diluted into 4.5 ml of the mixture, put on the extraction, the obtained extract was diluted with phosphate buffer in a ratio of 1:10 and 0.12 µl, were added to the wells on an agar medium, seeded with the test culture. By

зонам ингибировани  роста теста за 14 ч роста определ ют антибиотическую активность экстрактов в пересчете по калибровочной кривой, полученной при титровании растворов стандартного препарата NlsapllnThe zones of growth inhibition of the test for 14 hours of growth are determined by the antibiotic activity of the extracts in terms of the calibration curve obtained by titration of solutions of the standard preparation Nlsaplln

фирмы Aplln and Barret (Англи ), содержащего 5, 10, 15, 20 мкг/мл чистого низина.firm Aplln and Barret (England), containing 5, 10, 15, 20 µg / ml of pure nisin.

В табл.1 приведены сравнительные данные антибиотической активности и процесса ферментации предлагаемого и известного штаммов.Table 1 shows the comparative data of antibiotic activity and the fermentation process of the proposed and known strains.

В табл. 2 приведены генетические особенности предлагаемого и известного штаммов.In tab. 2 shows the genetic features of the proposed and known strains.

Использование предлагаемого штаммаThe use of the proposed strain

по сравнению с известным имеет следующие преимущества:compared with the known has the following advantages:

высока  антибиотическа  активность низина в культуральной жидкости;high antibiotic activity of nisin in the culture fluid;

сокращение времени процесса получени  целевого продукта:reduction of the process of obtaining the target product:

возможность замены основного углеводного субстрата (глюкозы на мальтозу или другой утилизируемый углеводный субстрат ).the possibility of replacing the main carbohydrate substrate (glucose for maltose or other utilizable carbohydrate substrate).

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-4591 - продуцент антибиотика низина.The strain Streptococcus lactis VKPM B-4591 - producing antibiotic nisin. Таблица 1Table 1 Таблица 2table 2