SU1685944A1 - Способ получени комплексного соединени платины (II) с высокомолекул рной н-ДНК из селезенки крупного рогатого скота марки А, обладающего противоопухолевой активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  платиновых комплексов , в частности получени  комплекса платины (2+) с н-ДН К (высокомолекул рной, выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А), обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в фармакологической промышленности . Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого комплекса. Синтез последнего ведут реакцией цис-дихлордиаминоплатины (2+) с н-дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота марки А при их мол рном соотношении 6:4 и 78 ± 0,5°С (13-30 мин) в среде воды. В этих услови х полученный комплекс в сравнении с исходной цис-дихлордиами- ноплатиной (2+) способен эффективно тормозить рост опухоли и по степени выживаемости и меньшей токсичности превосходит указанное соединение платины (LDso 51,8 мг/кг, LDioo 84 мг/кг против 11,3 мг/кг и 18 мг/кг, а степень выживаемости на 10-е сутки 100% против 80%). 2 табл. Ё О 00 ел Ч Ј

Description

Изобретение относитс  к способу получени  нового комплексного соединени  платины, обладающего противоопухолевой активностью.

Цель изобретени  - получение нового платиноорганического комплексного соединени  с более высокой активностью и более

низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами.

Получают предлагаемое соединение Pt- ДНК следующим образом.

Предварительно нагретые до температуры плавлени  нативной ДНК (н-ДНК) водные растворы цис-дихлородиамминплатины (II) (ДДП) и дезоксирибонуклеиновой кислоты смешивают в мол рном соотношении Pt:P 6:4 и смесь термостатируют при той же температуре до окончани  реакции: 6 п цис-Р:С12(МН3}2 + н-ДНК + + 12п Н20 (МНзХН20)2 б}п-ДНК + + 6n NH4CI(I)

Температуру плавлени  н-ДНК определ ют спектрофотометрическим методом. Дл  приготовлени  раствора ДДП используют воду, нагретую в термостате. Раствор готов т непосредственно перед началом реакции . Препарат н-ДНК раствор ют в воде при комнатной температуре и раствор нагревают в термостате.

Окончание реакции определ ют спектрофотометрически по достижению УФ-спектра соединени  Pt-ДНК, характеризуемого максимумом поглощени  Амакс 268,8 ± 0,1 нм и максимальным мол рным коэффициентом экстинкции Е2б8,е 10000 ± 100л .

Дл  выделени  предлагаемого вещества как индивидуального соединени  в твердом виде образующийс  в ходе реакции (I) аммоний хлористый и избыток воды удал ют лиофильной сушкой,

П р и м е р 1. На спектрофотометре Specord M40 с использованием держател  кюветы с блоком управлени  температурой и программы измерений, обеспечивающей линейное возрастание температуры, определ ют Т.пл. н-ДНК. Регистрируют экстинк- цию как функцию температуры в диапазоне 60-95°С при градиенте температуры 1°С в минуту. Примен ема  дл  получени  предлагаемого соединени  н-ДНК имеет Т.пл. 78°С. По паспортным данным прибора погрешность ± 0,5 С.

Раствор 675 мг цис-Р1С12()2 в 375 мл воды, нагретый до 78 ± 0,5°С (концентраци  раствора 1800 мкг/мл). добавл ют к раствору 500 мг н-ДНК в 375 мл воды (концентраци  раствора 1330 мкг /мл), предварительно нагретому до 78 ± 0,5°С с равномерным повышением температуры со скоростью 1°С в минуту, как при плавлении ДНК. Смесь реагентов с мол рным соотношением Pt:P 6:4 тщательно перемешивают и выдерживают в термостате в течение 15 мин, охлаждают до температуры окружающей среды.

П р и м е р 2. Опыт повтор ют, как в примере 1. только после охлаждени  реакционную смесь подвергают лиофильной сушке по методике, используемой в производстве сухой плазмы крови. Лиофилиза- цию провод т следующим образом. Раствор соединени  Pt-ДНК при посто нном вращении охлаждают до 40°С в течение 40 мин. i затем выдерживают при этой температуре 12 ч. После этого температуру повышают до - 0°С и образец откачивают в течение 40 ч,

нагревают до 40°С и снова откачивают 26 ч. Полученное после лиофильной сушки соединение Pt-ДНК в дальнейшем хранитс  в закрытой стекл нной посуде в холодильнике или на воздухе. Выход продукта Pt-ДНК соответствует теоретическому.

Дл  экспериментальной проверки предлагаемого способа получени  соединени  Pt-ДНК проведено 18 опытов, восемь из -которых показали положительные резульгаты . В положительных опытах получен продукт с параметрами УФ-спектра, характерными дл  предлагаемого соединени . Результаты опытов сведены в табл. 1, где представлены характеристики полученных

продуктов в зависимости от способа их получени , а именно: выбора концентрации исходных растворов ДДП и н-ДНК, мол рных соотношений компонентов, времени и температуры проведени  реакции,

Из табл. 1 следует, что выбор исходных

концентраций ДДП и н-ДНК в пределах ошибки опыта не вли ет на характеристики полученного продукта. Максимальна  концентраци  ДДП ограничена ее растворимостью в . эта величина составл ет 2523 мкг/мл при комнатной температуре. Минимальна  концентраци  ДДП ограничена ми- нимально возможной дл  хорошей спектрофотометрической регистрации концентрацией н-ДНК, котора  составл ет 3,0 мкг/мл.

Отклонение от соотношени  Pt:P - 6:4, как в сторону избытка ДДП, так и в сторону избытка н-ДНК. не позвол ет получить целевое соединение Pt-ДНК с указанными параметрами УФ-спектра.

Врем , необходимое дл  окончани  реакции , определ ют из графика зависимости Амакс УФ-спектра поглощени  реакционной

смеси ДДП с н-ДН К от времени термостати- ровани  при 78 ± 0,5°С. Минимальное врем , которое требуетс  дл  окончани  реакции, равно времени достижени  УФ- спектра смеси ДДП с н-ДНК, характеризуемого максимумом поглощени  Амакс- 268,8 нм и Е268.8 ЮООО л . Это врем  составл ет 12,5 мин. Увеличение времени термостатировани  до 30 мин не вли ет на параметры Ямакс продукта реакции.

Из табл. 1 также следует, что температура проведени  реакции существенно вли ет на такой параметр продукта реакции, как Е2688. Дл  получени  предлагаемого соединени  Pt-ДНК термостатироеание реакционной смеси надо вести при 78,0 ± 0,5°С так как только в указанном интервале температур достигаетс  значение E2G8.8 10000 ± 100 л см .

Приведенные данные позвол ют за- ключить, что смешение предварительно нагретых до температуры плавлени  н-ДНК водных растворов ДДП и н-ДНК при мол рном соотношении Pt:P 6:4 и термостатиро- вании реакционной смеси при этой температуре в течение времени, необходимого дл  окончани  реакции, позвол ет получить соединение, характеризуемое формулой (NH3)(H20) -ДНК с описанными физико-химическими и биологиче- скими свойствами. Отклонение от указанных параметров способа получени : соотношени  реагентов, температуры и времени проведени  реакции, не дает возможности получить предлагаемое соедине- ние с указанными характеристиками.

Вновь синтезированное химическое соединение Pt-ДНК представл ет собой биологически активное вещество, которое способно эффективно тормозить рост опу- холи при меньшей токсичности, чем у ДДП. Оно отличаетс  от ДДП по виду токсичности , лимитирующей дозу препарата, по таким показател м биологической активности , как степень угнетени  роста опухоли, не уступает ДДП, а по выживаемости животных превосходит ДДП.

Предлагаемое соединение Pt-ДНК как индивидуальный препарат представл ет собой мелкокристаллическое порошкообраз- ное вещество желтого цвета. Оно устойчиво в водном растворе и на воздухе, способно в течение года хранитьс  без изменени  свойств при комнатной температуре и в холодильнике. Его состав и строение уста- новлены элементным анализом и физико- химическими исследовани ми в водном растворе и в твердом виде.

Элементный анализ мелкокристаллического образца подтверждает состав синте- зированного целевого соединени  Pt-ДНК.

Найдено, %: Pt38,46; CI 7,38; С 15,61; N 9.36; Н 3,09; Р 4,67.

Вычислено, %: Pt 38,11; CI 6,94; 015,25; N9,58; Н 2,97; Р 4,17.

Рассчитанна  исход  из молекул рной массы соединени  Pt-ДНК и массы мономерной единицы этого полимера, имеющей эмпирическую формулу

PtCI(NH3) (Н20) Сзэ Н49 Оз2 Nis P4, среднестатистическа  величина п составл ет 1900 ± 90. Следовательно, в среднем примерно на 1900 нуклеотидных квартетов ДНК, состо щих из пар аденин-тимин, гуанин-цитозин , приходитс  примерно 11400 платиносодержащих комплексов PtCI (МНз) (Н20)2Г.

УФ-спектр поглощени  водного раство ра Pt-ДНК имеет максимум поглощени  при 268,8 нм, в то врем  как свободна  н-ДНК в том же растворителе максимально поглощает свет при 258,0 нм. В расчете на 1 моль нуклеотида мол рный коэффициент поглощени  соединени  Pt-ДНК Ё2бза 10000 л , а свободной ДНК Е258.0 7000 л см. Смещение максимума поглощени  в длинноволновую область на 10,8 нм у соединени  Pt-ДНК по сравнению с нативной ДНК говорит о том. что ДНК в соединении находитс  в св занном состо нии благодар  образованию ко валентных св зей между атомами платины (II) и донорными атомами азота оснований ДНК. Повышение интенсивности поглощени , т.е. гиперхромный эффект, при этом составл ет около 30%. что свидетельствует о сильных конформационных изменени х двойной спирали ДНК при присоединении металла.

Идентичность УФ-спектров поглощени  соединени  Pt-ДНК, полученного в растворе , и выделенного в индивидуальном состо нии, указывает нз одинаковый химический состав вещества в растворе и в твердом виде. Об этом же свидетельствуют одинаковые результаты биологических испытаний вещества, приготовленного в растворе или выделенного в чистом виде. Однако после выделени  препарата как индивидуального соединени  его водораство- римость понижаетс . Так растворимость мелкокристаллического порошка Pt-ДНК при 20°С в воде составл ет всего 0,002%, что в 125 раз меньше максимально достижимой концентрации соединени  в водном растворе. Поэтому при биологических испытани х индивидуального соединени  Pt- ДНК оно вводилось животным в виде водной суспензии.

Водный раствор индивидуального соединени  практически не проводит электрический ток, что говорит о неэлектролитной природе Pt-ДНК.

Изменение в ИК-спектрах соединени  Pt-ДНК по сравнению со свободной ДНК указывают, что металл в соединении Pt-ДНК св зываетс  не только с азотистыми основани ми ДНК, но и с атомами кислорода фосфатных групп. Полосы при 1090 и 1240 соответствуют валентным колебани м фос- фодиэфирных мостиков ДНК, полосы в области 1500-1700 - валентным колебани м групп , , азотистых

оснований, полосы в области 3100-3700см 1 - валентным колебани м групп С-Н, N-H, 0-Н, вход щих в состав ДНК и молекул воды. Кроме того, при 340 наблюдаетс  валентное колебание Pt-CI, а при 1320 - деформационное колебание N-H координированной молекулы МНз.

По данным термического анализа твердый образец соединени  Pt-ДНК при нагревании до 200°С тер ет две молекулы воды на один атом платины. Высока  температура , необходима  дл  удалени  молекул воды , свидетельствует о вхождении молекул воды во внутреннюю координационную сферу платины.

Спектры отражени  твердого соединени  Pt-ДН К имеют значени  коэффициентов спектрального отражени  R(%) в экстремальных точках отличающиес  от значений R дл  4HC-PtCl2(NH3)2. Дл  Pt-ДН К R248.3 4,60; Рззз,з 12,3; R400,6 22,4; Rsi4,4 60,1, а дл  цис-РЮ2(МНз)2 ,2 9,7; R269.7 13,6; R333.3 10,4; R340 17,10: R414.6 14,80; Rsi4,4 50,57. Спектры отражени  подтверждают, что взаимодействие цис- PtCl2(NH3J2 с н-ДНК сопровождаетс  изменением состава координационной сферы платины за счет замещени  одного иона хлора и одной молекулы аммиака фрагментами ДНК.

Данные элементного анализа, вискозиметрии , кондуктометрии, УФ- и ИК-спект- ров поглощени  и спектров отражени  свидетельствуют о том, что синтезированное соединение действительно в ысокомолекул рное вещество - хлоро- амминодиакваплатина (II), св занна  с дезоксирибунуклеиновой кислотой в соотношении Pt:P 6:4, формулы (МНз) (Н2ОШп ДНК, где п 1900 ± 90,

Предлагаемое новое химическое соединение представл ет собой высокомолекул рное платиносодержащее вещество, которое не менее эффективно, чем ДДП, тормозит рост опухоли, не менее токсично и повышает процент выживаемости животных .

В табл. 2 представлены результаты исследований токсичности и противоопухолевой активности н-ДНК, ДДП и предлагаемого соединени , полученного в растворе и индивидуально.

Опыты проводили на мышах и крысах обоих полов. Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышей весом 30,0 ± 2,0 г, прошедших карантин 20 дн. (в каждой группе было по 10 животных). Препараты вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 2 ч по 0,5

мл. Инъекции ДДП и н-ДНК детали в водном растворе, соединени  Pt-ДНК - в виде водного раствора и водной суспензии. Суммарные дозы составл ли дл  ДДП 8; 16 и 18

мг/кг, дл  ДНК 20; 40 и 60 мг/кг, а дл  соединени  Pt-ДНК 34; 68 и 84 мг/кг. Через 24-48 ч после введени  препаратов отмечали количество погибших и выживших животных в каждой группе. Расчет токсической

дозы (ЛДво) проводили по известной методике . Летальную дозу, ЛДюо. определ ли экспериментально.

В результате проведенных опытов установлено , что дл  ДДП ЛДбо равно 11,3 мг/кг,

ЛДюо равно 18 мг/кг, а дл  соединени  Pt- ДНК ЛДбО равно 51,8 мг/кг, ЛДюо равно 84,0 мг/кг независимо от формы введени . ДНК оказалась нетоксичной даже в дозе 60 мг/кг. Из сравнени  приведенных величин

следует, что токсичность соединени  Pt- ДНК в 4,6 раза ниже, чем токсичность ДДП. Согласно гистологическим исследовани м гибель животных, получавших токсические дозы препаратов, обусловлена

различными причинами. При введении ДДП наблюдаетс  нефроз разной степени выраженности и дистрофи  внутренних органов. При введении соединени  Pt-ДНК в почках отмечен1., незначительные изменени : небольшой отек стромы, зерниста  дистрофи  канальцев, единичные мелкоочаговые кровоизли ни , но имеет место выраженна  дисплази  клеток эпители  кишечника, нарушение его регенераторной функции, сокрэщение количества митозов. Однако энтеротоксичность поддаетс  коррекции в большей степени, чем нефротоксичность.

Противоопухолевую активность каждого из препаратов оценивали из экспериментов , проведенных на п ти группах животных (в каждой группе по 10 животных). Белым беспородным крысам весом 150-200 г под кожу бедра трансплантировали 2 108- -2 1010 клеток перевивного штамма лейкоза Швеца. Животные первой группы служили дл  контрол , втора  группа получала н-ДНК, а треть , четверта  и п та  группы - соответственно ДДП, и соединение Pt-ДНК, полученное в растворе и в чистом виде. Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно: первый раз - на 4-6 сут после трансплантации опухоли, т.е. в период логарифмической фазы ее роста; второй и третий раз - с интервалами 24-28 ч соответственно . Суммарна  доза ДНК составила 18 мг/кг, ДДП 8,1 мг/кг, соединени  Pt-ДНК 17 мг/кг.

Противоопухолевую активность оценивали по следующим показател м физиологической активности: по обьему опухоли (V), степени угнетени  роста опухоли (Т/С) и выживаемости животных на 10-е сутки (В Ж). Необходимые расчеты производили по следующим формулам:

VfcM3)- m1 +™2+ тз .

где mi, и тз - три взаимно перпендикул рных измерени  опухолевого узла;

VKOH - Von

Т/С(%)100 ,

VKOH

гдеУкон и V0n - объем опухоли в контрольной группе и у опытных животных, соответственно;

А 100

ВЖ(%)

N

где А - число живых животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли;

N - число животных в данной группе.

Экспериментально найденные значени  величин V, Т/С и ВЖ приведены в табл, 2.

Анализ данных, представленных в табл, 2, показывает, что свободна  ДНК, хот  и не токсична, но и не тормозит рост опухолей. Препарат ДДП тормозит рост опухоли на 78% по сравнению с контролем. В то же врем  при его введении выживаемость животных на 10-е сутки падает на 20%. Соединение Pt-ДНК независимо от формы введени  тормозит рост опухоли по сравнению с нелечеными животными на 84%, а по такому показателю, как выживаемость животных , превосходит ДДП на 20%,

Сравнительный анализ данных, приве денных в табл. 2, позвол ет заключить, что предлагаемое соединение по уровню противоопухолевой активности, определ емому такими показател ми, как объем опухоли и

-

10

15

20

25

30

35

40

степень угнетени  роста опухоли, не уступает ДДП. По такому показателю, как процент выживаемости животных превосходит ДДП. Кроме того, предлагаемое соединение менее токсично, чем ДДП.

Таким образом, создание высокомолекул рного соединени  на основе комплекса платины (II) и н-ДНК привело к получению вещества с ценными свойства: противоопухолевой активностью при низкой токсичности . По этим свойствам предлагаемое соединение выгодно отличаетс  от используемого в клинике лекарственного препарата ДДП, превосход  или будучи сопоставимо с ним по показател м физиологической активности.

Такие свойства делают предлагаемое соединение перспективным в качестве основы дл  создани  препаратов, эффективных дл  лечени  злокачественных опухолей.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  комплексного соединени  платины (II) с высокомолекул рной н-ДНК из селезенки крупного рогатого скота марки А, обладающего противоопухолевой активностью, взаимодействием соединени  платины с органическим лиган- дом в водной среде при нагревании, отличающийс  тем. что, с целью получени  соединени  с более высокой активностью и более низкой токсичностью, в качестве соединени  платины используют цис-дихлоро- диаминоплатину (II), а в качестве органического лиганда - н-дезоксирибонук- леиновую кислоту, выделенную из селезенки крупного рогатого скота, марки А при их мол рном соотношении 6:4 и процесс ведут при (78,0 ± 0,5)°С в течение 13-30 мин.

   Таблица 1

   Продолжение табл 1

   Таблица 2