SU1303033A3 - Способ получени ферментированных спиртовых напитков - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к бродильной промьшшенности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промьшшенности. Целью изобретени   вл етс  снижение содержани  диацетила. Сусло, используемое дл  получени  пива или этанола , или виноградный сок подвергают ферментации дрожжами с последующим его созреванием. В процессе ферментации или после нее, или- в процессе созревани  ввод т фермент, превращающий ацетолактат. В качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу. Фермент и дрожжи используют в иммо- .билизованном виде. Ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде дл  обеспечени  стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5. 3 з.п. ф-лы. i ОТ с со о со о со 02 ы

Description

Изобретение относитс  к бродильной промышленности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческ-ой промышленности.

Цель изобретени  - снижение содер- жани  диацетипа.

Способ осуществл ют следующим образом.

Сусло, содержащее углеводы, подвергают ферментации дрожжами и созре- ванию. Если сусло или виноградный сок ферментиру ют с помощью дрожжей или других микроорганизмов, помимо

Ферментацию ведут в две стадии: основна  ферментаци , котора  длитс  7-10 дн и вторична  фермента1Ц1Я - процесс созревани , который может длитьс  3-12 нед. Во врем  основной

спиртовой ферментации происход т различные процессы, которые выз- 5 ферментации больша  часть углеводов вать образование нежелательных побоч- в сусле превращаетс  в этанол и дву- ных продуктов. Примером  вл етс  об- окись углерода. Созревание провод т разование диацетила, который обладае при низких температурах в присут- сильньм и непри тным запахом даже ствии небольшого остаточного коли- в очень малых концентраци х, при 20 честна дрожжей. Целью созревани   в- этом спиртовые напитки, например л етс  осаждение нежелательных высо- пиво или вино, могут приобрести неприемлемый вкус и аромат, если содержание диацетила превышает допустимую

25

его концентрацию.

Образование диацетила невыгодно также Б промьшшеннных процессах производства этанола, так как путем перегонки очень трудно отделить диаце- тил от этанола. Проблема возникает при получении абсолютированного этанола , если этанол дегидрагируют азе- отропной перегонкой с бензолом. Диа- цетил при этом накапливаетс  в бензольной фазе во врем  азеотропной

НзС-С 0

с-он соон

с -аиешо актат

VH,

НзС-С-ОН

с

(5)

комолекул рных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона, с -ацетолактата и ot-ацето-о -оксибути- рата в такие соединени , как диоды, которые не измен ют запаха и вкуса. Например, бутандиол - конечный продукт превращени  с/ -ацетолактата и диацетила в пиве - не вли ет на вкус 30 и запах в концентраци х ниже 500 .«г/л

Ферментные и химические реакции важные дл  содержани  в пиве днаце- тила можно проршлюстрировать на следующей схеме:

НаС-С 0

1 (даацетил

i(2)

Н

1

н с-с-он

(7)

СООН

(а-кето-|з- окшизо5алерат) СНзCfHs

с-он нзс-с-н

t (3)

НзС-С-ОН НзС-С ОН

н

(auemouH)

(2,3-&1//паноиоЭ

с-он соон

H

(a,ji-9uOKcuu3o5ajiepam)

перегонки, что мс;жет привести к образованию смесей диацетила и которые затрудн ют регенерацию бей- зола, использованного дл  азеотроп- ной перегонки.

Варка пива включает ферментацию сусла прдход щим видом дрожжей, например , Saccharorayces cerevi.siae или Saccharomyces carlsfergensis.

Ферментацию ведут в две стадии: основна  ферментаци , котора  длитс  7-10 дн и вторична  фермента1Ц1Я - процесс созревани , который может длитьс  3-12 нед. Во врем  основной

ферментации больша  часть углеводов в сусле превращаетс  в этанол и дву- окись углерода. Созревание провод т при низких температурах в присут- ствии небольшого остаточного коли- честна дрожжей. Целью созревани   в- л етс  осаждение нежелательных высо-

ферментации больша  часть углеводов в сусле превращаетс  в этанол и дву- окись углерода. Созревание провод т при низких температурах в присут- ствии небольшого остаточного коли- честна дрожжей. Целью созревани   в- л етс  осаждение нежелательных высо-

комолекул рных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона, с -ацетолактата и ot-ацето-о -оксибути- рата в такие соединени , как диоды, которые не измен ют запаха и вкуса. Например, бутандиол - конечный продукт превращени  с/ -ацетолактата и диацетила в пиве - не вли ет на вкус и запах в концентраци х ниже 500 .«г/л,

Ферментные и химические реакции важные дл  содержани  в пиве днаце- тила можно проршлюстрировать на следующей схеме:

НаС-С 0

1 (даацетил

i(2)

Н

1

н с-с-он

t (3)

НзС-С-ОН НзС-С ОН

н

(auemouH)

(2,3-&1//панои

Предшественник диацетила of -аце- толактат вырабатываетс  в ферментирующих дрожжах за счет катализируемо ферментом конденсации пирувата и тиа минпирофосфата ацетальдегида и  вл - етс  промежуточным соединением в биосинтезе аминокислоты валина. Л-Ацето- лактат может таже самопроизвольно разлагатьс  через окислительное де- карбЬк силирование до образовани  ди- ацетила, реакци  (1), который затем восстанавливаетс  редуктазами в клетках дрожжей во врем  процесса вызревани  пива. Декарбоксилирование ci-ацетолактата  вл етс  реакцией, котора  зависит от температуры и протекает относительно медленно при низких температурах, тогда как последующее превращение диацетила в ацето- ин и 2,3-бутандиод происходит отно- сительно быстро, вследствие чего стадией, определ ющей скорость удалени  с --ацетолактата и диацетила из пива,  вл етс  декарбоксилирование диацетильиого предшественника. Аналогично стадией, определ ющей скорость удалени  2,3-пентандиола и ог--ацето- - -аксибутирата,  вл етс  спонтанное декарбоксилирование 2,3-пентандионо- вого предшественника.

Дл  достижени  максимального осаждени  высокомолекул рных продуктов и получени  пива хорошего качества вызревание должно происходить при наиболее возможно низких температурах, например 0°С. При этой температуре оно может происходить несколько мес цев, прежде чем полностью удалитс  аце- толактат, и образовавшийс  диацетшт восстановитс  дрожжами. Однако врем  вызревани  можно уменьпшть, если предоставить возможность процессу протекать при более высоких температурах , например, до 1-2 нед при , или 1 -2 нед при 5 с или 1 или 2 нед - при -1°С. Така  процедура ускор ет превращение ацетолактата в диацетил.

Медленного разложени  ацетолактата до диацетипа, реакци  (1) на схеме можно избежать, использу  дл  разло- жени  ацетолактата ферменты. Дл  этой цели можно использовать любые ферменты . Все сводитс  к декарбоксилирова- нию ацетолактата до ацетона, реакци  (4).

Целесообразно осуществл ть превращение ацетолактата в «С-кето- - -оксиизовалерат с помощью изомеразы.

реакци  (6), или превращение ацетолактата в 0 , Э-оксиизовалерат с помощью редукто-изомеразы, реакци  (5) Продукты реакции в обоих случа х  вл ютс  предшественниками аминокислоты валина.

Сусло обрабатывают ферментом, превращающим ацетолактат во врем  или после ферментации. Примером фер- мента  вл етс  ацетолактатдекарбокси лаза, которую можно выделить из микроорганизма Aerobacter aerogenes.

Ауетолактат ферментативно декар- боксршируют до ацетоина, в результат удаетс  избежать образовани  сильно пахнущего нежелательного диацетила из ацетолактата. Разложение Ы -ацетолактата до диацетила удаетс  избежать за счет превращени  предшественника диацетила с помощью ацетолак татных редукто-изомераз или изомераз, реакции (5) и (6).

Ацетолактатдекарбоксилазу можно добавл ть во врем  основной ферментации или во врем  процесса созревани . Применение этого фермента приводит к значительному сокращению времени созревани , так как ацетолактат быстро декарбоксилируетс  до пригодного дл  ферментации ацетоина без какого-либо образовани  диацетила, фермент можно добавл ть перед или во врем  основной ферментации, где рН Bbmie, нежели во врем  процесса созревани .

Вместо использовани  фермента в свободном состо нии его можно использовать в иммобилизованном состо нии, причем иммобилизованный фермент добавл ют к суслу во врем  или при продолжении ферментации. Иммобилизован- ньй фермент можно также хранить в колонке, через которую пропускают ферментируемое сусло или пиво. Фермент можно иммобилизовать отдельно или использовать совместно иммобилизованные дрожжевые клетки и ацетолак- татдекарбоксилазу.

Применение иммобилизованного фермента позвол ет ускор ть продолжительность получени  пива, так как ферментацию пива можно осуществл ть, пропуска  сусло через колонки, содержащие иммобилизованные дрожжи и иммобилизованные ферменты, необ зательна в совместно иммобилизованном состо нии . Ксли процессы основной ферментации и созревани  объедин ют дл 

непрерывного превращени  сусла в готовое пиво, производительность зависит от объема и диаметров колонн. Такой процесс уменьшает затраты труда и снижает себестоимость продукции Предлагаемый способ можно использовать не только дл  приготовлени  пива, но и дл  изготовлени  вина, гд достигаютс  аналогичные преимущества , в частности снижение времени вызревани  и упрощение процесса. Интерес представл ет использование ферментов, превращающих ацетолактат в св зи с так называемой Ма1о- lactic ферментацией. Этот способ, который осуществл ют с помощью таких микроорганизмов, как виды Leuconos- toc, Lactobacillus или Pediococcus, осуществл ют после основной ферментации вина дл  повышени  рН продукта также как и его биологической стабильности и дл  улучшени  аромата вина. Однако такой способ может стат причиной потери аромата за счет диа- цетила, об)азование которого может быть понижено с помощью ацетолакт- превращающего фермента. Способ можно использовать при промышленном производстве этанола так, как продукты ферментации, которые получают и при этом не содержат или практически не содержаФ диацетила, что упрощает процесс дистилл ции в случае азеотроп- ной перегонки дл  получени  абсолютированного этанола, т.е. чистого безводного этанола.

Ацетолактаткарбоксилазу можно выделить , например, из Aerobacter aerogenes. Однако можно также использовать и ацетолактат-превращаю-. щие ферменты, полученные из других источников, например, видов Bacillus Enterobacter, Klebsiella, Leuconos- toc, Serratia u Streptococcus и неко Торых В1ЗДОВ Actinomycetes и грибков.

Подход щие ацетолактактные редук- то-изомеразы и изомеразы можно вьще- лить из бактерий, таких видов, как Е. Coli или Aerobacter aerogenes или из Neurospora crassa, дрожжей Salmonella или растений. Так как рассматриваютс  ферменты в аминокислотном метаболизме, еле дует ожидать их наличи  почти во всех живых клетках.

Если процесс спиртовой ферментации 55лонку диаметром 10 см и высотой 5 см.

происходит при рН в интервале 4-5, аЧерез этот реактор прокачивают стемногие легко доступные ацетолактат-рнльное сусло при 10°С со скоростью

декарбоксилазы, выделенные из микро-0,15 л/ч, причем крепость сусла сосорганизмов , обладают оптимальной .тавл ет 10,7°. Ослабление элюата на

стабильностью и активностью при рН вьш1е 5, целесообразно использовать ацетолактатдекарбоксилазу в химически кодифицированном состо нии дл  получени  высокой стабильности и/или оптимальной активности в интервале рН 4-5.

Пример 1. Порционна  ферментаци  и быстрое созревание пива

|С использованием ацетолактатдекарбок- силазы..

1 л стерильного сусла из сусла крепостью 10,7 инокулируют пивными дрожжами Saccharomyces carlstergensis

в количестве 20x10 клеток 1 л. Спуст  6 дн при 10 С процесс основной ферментации заканчиваетс , причем ослабление пива определ етс  как 2,0°Р. Содержание свободного и св занного диацетила (т.е. диацетила, полученного из ct-ацетолактата) в пиве определ ют как 0,12 и 0,71 ч./млн. Затем пиво декантируют от выпавших в осадок дрожжей и смешивают со 100 мл

Kreusen , т.е. интенсивно ферментированного пива, полученного из сусла, инокулированного дрожжами за 48 ч до этого. Более того, добавл ют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы, выделенной из Aerobacter aerogenes. После 24 ч выстаивани  при дл  вторичного ферментировани  и созревани  определ ют содержание свободного и св занного диацетила как 0,05 и

0,10 ч./млн соответственно. Затем пиво охлаждают до -1°С и оставл ют выстаиватьс  в течение двух дней при этой температуре, а затем готовое пиво фильтруют.

Пример 2. Непрерывна  ферментаци  и быстрое созревание пива.

250 г пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis, вьщеленных центрифугированием , суспендируют в 350 мл

3%-ного стерильного раствора натрий- ал ьгината. Эту смесь по капл м добавл ют к 10 л стерильного 0,1 М СаС дл  желатинизации альгината кальци  с образованием сферических, содержащих дрожжи частиц диаметром около 3 мм.

Их оставл ют выстаиватьс  в раст-. воре хлористого кальци  в течение 12 ч при 4°С, а затем набивают в ко7

выходе из реактора 2,1°Р, а по данн газовой хроматографии, содержание свободного и св занного диацет1гла 0,15 и 2,21 ч./млн соответственно. К 1 л пива из реактора добавл ют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы. Пи оставл ют выстаиватьс  при 10°С в течение 24 ч, а затем прокачивают через другой реактор с иммобилизоваными дрожжами, так что врем  пребы- вани  составл ет 5 ч. Содержание свбодного и св занного диацетила в эл ате определ ют как 0,05 и О, 10 ч./мл соответственно. Затем температуру понижают до -1°С и после выстаивани в течение двух дней при этой темпертуре готовое пиво декантируют от осадка и окончательно фильтруют.

Пример 3. Порционна  ферметаци  и быстрое созревание пива с применением ацетолактатной редукто- изомеразы.

1 л стерильного сусла ферментиру Saccharomyces carlsbergensis, как описано в примере 1. После 6 дн основной ферментации содержание в пив свободного и св занного диацетила по определению составл ет 0,10 и 0,61 ч./млн соответственно. Пиво декантируют от остаточных дрожжей и добавл ют 100 мп Kreusen, как описано в примере 1, вместе со 100 мг с --ацетолактат-редукто-изомеразы, по луч,енной из Е. coli. Затем пиво оставл ют выстаиватьс  в течение еще 24 ч при 10°С, после чего определ ю содержание в нем свободного и св заного диацетила, которое составл ет 0,03 и 0,09 Ч./1-ШН соответственно. Затем пиво охлаждают до -1 С и ос- тавл ют выстаиватьс  на 2 дн при эт температуре, а затем готовое пиво

Иммобилизованные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae ввод т в виноградный сок, содержащий npiiMepHo 10% сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожени  свежеприготовленньш 35 раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавл ют в брод щую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным ди- ацетилом в содержащем фермент растворе определ ют и оно составл ет 0,10 чУмлн.

фильтруют.

Пример 5. Этот пример илПример 4. Получение фермен- 45 люстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице гел  альгината кальци . Влажные клетки штамма Bacillus Licheniformis, генерирующие ацетолактатную декарбокси- 50 лазу (50 г влажных клеток), суспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлористого натри . В образовавшуюс  суспензию добавл ют 100 мл 4%-ного раствора альгината натри , после 55 чего полученную смесь по капл м перета , способствующего созреванию вина.

Микроорганизмы Aerobacter aero- genes культивируют в 1 л среды, содержащей , г:

Na,jHPO , NaCl MgSO

12H20

CaCl FeSO MnCl

Глюкоза

6H /) ДН 0

1,5

9,0

1,3

1,5

0,15

0,45

0,02

0,01

90

нос т в 0,1 M раствор хлорида кальци . Таким образом, получают небольшие гранулы альгипата кальци , содержащие ацетолактатную дскарбоксилаа

5

0

Q

Дрожжевой экстракт 10 Т риптоза10

Культивирование ведут в бродильном чане емкостью 20 л при 37 С и аэрации, клетки собирают в средне- экспоненциальной фазе путем центрифугировани  и.затем промывают два раза фосфатным буфером при рН 6,8. Затем биомассу суспендируют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 п гомогенизируют в гомогенизаторе Мантон- Гаулина npii 600 атм. Разрушенные клетки затем удал ют центрифугированием и во всплывший при центрифугировании слой добавл ют ионообменную смолу ДЕ-52, которую загружают в колонку и фермент элюируют фосфатом концентрацией от 20 мМ до 0,6 М при рН 6,8. Фракции исследуют на ферментную активность, активные фракции объедин ют и к ним добавл ют сульфат аммони  в количестве 0,6 г/мл. Перед использованием фермента в процессе необходимое количество этой суспензии в сульфате аммони  центрифугируют и полученный осадок раствор ют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 и подвергают диализу на фоне того же буфера.

Иммобилизованные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae ввод т в виноградный сок, содержащий npiiMepHo 10% сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожени  свежеприготовленньш 5 раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавл ют в брод щую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным ди- ацетилом в содержащем фермент растворе определ ют и оно составл ет 0,10 чУмлн.

5

0

люстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице гел альгината кальци . Влажные клетки штамма Bacillus Licheniformis, генерирующие ацетолактатную декарбокси- лазу (50 г влажных клеток), суспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлористого натри . В образовавшуюс  суспензию добавл ют 100 мл 4%-ного раствора альгината натри , после чего полученную смесь по капл м перенос т в 0,1 M раствор хлорида кальци . Таким образом, получают небольшие гранулы альгипата кальци , содержащие ацетолактатную дскарбоксила

зу. Эти гранулы промывают 3 раза порци ми по 500 мл фосфатного буфера при рН 7 и затем используют аналогично ,примеру 1.

Пример 6. Влажные, свежепри- готовленные клетки Bacillus Liche- niformis (50 г), производ щие ацето- лактатдекарбоксилазу суспендируют в 250 мл О,1 М фосфатного буфера рН 6,0. Эту суспензию тщательно перемешивают при охлаждении до 5 С и при этой температуре в течение 30 мин по капл м добавл ют 50 мл фосфатного буфера, содержащего 2,5% глутарового альдегида. Реакционную смесь затем выдерживают в течение 3 ч при 5°С, после чего клетки, содержащие ацето- лактатдекарбоксилазу, удал ют из реакционной смеси путем центрифугировани . В последующем эти клетки промывают 5 раз порци ми по 250 мл фосфатного буфера. Полученный химически модифицированный фермент используют согласно предлагаемому способу , при этом химически модифициро- ванный фермент про вл ет превосходну стабильность по сравнению с немодифицированным ферментом, причем рН находитс  в интервале 4-6.

Предлагаемый способ позвол ет сог лано примеру 4 снизить содержание

Редактор Н. Рогулич Заказ 1228/58

Составитель А. Уль нова

Техред,л.Олейник Корректор М. Самборска 

Тираж 500

Подписнх)е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

ацетолактата и свободного диацетила с 1,9 до 0,10 ч,млн,

Claims (4)

1.. Способ получени  ферментированных спиртовых напитков, предусматривающий ферментацию сусла дро7кжами, созревание его и введение в процессе ферментации или после него, или в процессе созревани  фермента, о т- личающийс  тем, что, с целью снижени  содержани  диацетила, в качестве фермента используют ацето- лактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу,

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что фермент исполь .зуют в иммобштизованном виде.

3.Способ по п. 1,отличаю- щ и и с   тем, что дрожжи используют в иммобилизованном виде,

4.Способ по п. 1, о т л и ч ,9- ю щ и и с   тем, что ацетолактат- декарбоксилазу используют в химически модифицированном виде дл  обеспечени  стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5.

Подписнх)е