SU1151217A3 - Method of obtaining cholesterolesterase - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЭСТЕРАЗН , предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, отличающийс  тем, что, с целью повьшени  активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или Pseudoraonas spec, DSM 1280, a в качестве индуктора лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2% от массы среды. (ЛA method for producing cholesterol ester, which involves culturing the producing microorganism Pseudomonas on a nutrient medium containing mineral salts, phosphate buffer and inducer, followed by release of the enzyme from the culture fluid and / or cells, characterized in that, in order to increase the activity of the target product, as a producing microorganism strains of Pseudomonas spec. DSM 1281 or Pseudoraonas spec, DSM 1280, a as an inducer lecithin or soy lecithin in an amount of 0.5-2% by weight of the medium. (L

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  способа получени  холестеринэстеразнFIELD OF THE INVENTION The invention relates to the microbiological industry and concerns a method for producing cholesterol esterase.

Известен способ получени  холестеринэстеразн , предусматривающий культивирование продуцирующего штамм Nocardia cho estero icum NRRL 5767 или NRRL 5768 на питательной среде, содержащей необходимые мине1 альные соли и индуктор - холестериновый эфир или холестерин в количестве 1-10 г/л и экстракт дрожжей с пойледующим выделением фермента. Максимальна  активность фермента - 49,2. A method of producing cholesterol esterase is known, involving the cultivation of a strain producing Nocardia cho estero icum NRRL 5767 or NRRL 5768 on a nutrient medium containing the necessary mineral salts and the inducer is 1-10 g / l and yeast extract followed by release of the enzyme. The maximum enzyme activity is 49.2.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту  вл етс  способ получени  холестеринэстеразн 2J , предусматривающий культивировакие продуцирующих штаммов Pseudomonas fluorescens KY 3955, 4032 .и т.д. на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор - холестериновый эфир с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток. Согласно способу используют питательную среду, содержащую, г/л: холестериновый эфир-5, кукурузный экстракт 2, NaNO, 2, KjHPQ, 1, КС2 0,5 и MgSO, 2. Активность фермента - 17.The closest to the proposed technical essence and the achieved positive effect is the method of obtaining cholesterol esterase 2J, involving the cultivation of producing strains of Pseudomonas fluorescens KY 3955, 4032., Etc. on a nutrient medium containing mineral salts, phosphate buffer and inducer - cholesterol ester, followed by release of the enzyme from the culture fluid and / or cells. According to the method, a nutrient medium containing, g / l: cholesterol ester-5, corn extract 2, NaNO, 2, KjHPQ, 1, KC2 0.5 and MgSO2, is used. The enzyme activity is 17.

Известным способам присущ общий недостаток - низка  активность фермента .Known methods inherent in a common drawback - low enzyme activity.

Цель изобретени  - повышение активности целевого продукта.The purpose of the invention is to increase the activity of the target product.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  холестеринэстеразн, пр едусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер, и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или P seudomonas spec. DSM 1280, a в качестве индуктора - лецитин или соевый лецитин в количестве 0,5-2% от массы среды.The goal is achieved in that according to the method of obtaining cholesterol esterase, which controls the cultivation of the producing microorganism Pseudomonas on a nutrient medium containing mineral salts, phosphate buffer, and an inducer, followed by release of the enzyme from the culture fluid and / or cells, the Pseudomonas spec strains are used as the producing microorganism . DSM 1281 or P seudomonas spec. DSM 1280, a as an inductor - lecithin or soy lecithin in the amount of 0.5-2% by weight of the medium.

Примен емые в соответствии с изобретением микроорганизмы  вл ютс  очень похожими и обладают следующие признаки: грамотрицательный; об зательно аэробный; желтоватые колонки на агаре из пептонов м са; рост при 25, 30 и 37 С; отсутствие роста при 10j более размер клеток от 0,8 до 1 мкм, от 2 до 4 мкм; подвижность , lophotrich begeipelt; склонность к образованию цепей, отсутствие спор или продолжительных стадий: цитохром - оксидаза +; каталаза + ; индол-; нитрит-; желатина моносубстрат - деструкци : адонит + цитрат +; галактоза +; глюкоза +; изонит +; лактоза +; маннит +; манноза +; салицин +; сорбит +. The microorganisms used according to the invention are very similar and have the following characteristics: gram-negative; necessarily aerobic; yellowish columns on peptone macar agar; growth at 25, 30 and 37 C; no growth at 10j over cell size from 0.8 to 1 μm, from 2 to 4 μm; mobility, lophotrich begeipelt; tendency to the formation of chains, the absence of spores or prolonged stages: cytochrome - oxidase +; catalase +; indole-; nitrite-; gelatin monosubstrate - destruction: adonite + citrate +; galactose +; glucose +; isonite +; lactose +; mannitol +; mannose +; salicin +; sorbitol +.

Процесс культивировани  ведут в аэробных услови х при 15-45 С, предпочтительно между 25 и , использу  посевные культуры, выращенные на качалке или на воздухе - Pumbersкультуры . Максимальный выход достигаетс  после 1-2 суток культивировани  .The cultivation process is carried out under aerobic conditions at 15-45 ° C, preferably between 25 and, using sowing cultures grown on a rocking chair or in the air - Pumbers. The maximum yield is reached after 1-2 days of cultivation.

Пример 1. Штамм Pseudomona spec, DSM 1280, перенесенный из охлажденной до низкой температуры ампулы в пробирку со скощенным агаром , предварительно культивировали в течение двух суток в основной культуральной среде при 30 С в аэробных услови х (качалочна  колба) и затем в количестве до 10% пересевали в среду , котора  имела на 1 л воды следующий состав:Example 1. A strain of Pseudomona spec, DSM 1280, transferred from a cold-cooled ampoule to a fast agar tube, was pre-cultured for two days in the main culture medium at 30 ° C under aerobic conditions (flask) and then in an amount up to 10 % were sown on Wednesday, which had the following composition per 1 l of water:

Двузамещенный фосфорнокислый натрий7 г Однозамещенньй фосфорнокисльй калий 3 г Хлористьй аммоний 1 г Хлористый натрий 0,05 г 1%-нь1Й раствор хлорного железа 0,1 мл 0,2%-ный раствор хлористой меди . 0,1 мл 1%-ный раствор сернокислого цинка 0,1 мл 10%-нЫй раствор хлористого кальци  1,0 мл 12%-ный раствор сернокислого магни  5,0 мл Соевый лецитин 1,5% РН : 7,0Disubstituted sodium phosphate 7 g Odisubstituted phosphate potassium 3 g Ammonium chloride 1 g Sodium chloride 0.05 g 1% ferric chloride solution 0.1 ml 0.2% copper chloride solution. 0.1 ml 1% solution of zinc sulphate 0.1 ml 10% solution of calcium chloride 1.0 ml 12% solution of magnesium sulphate 5.0 ml Soy lecithin 1.5% PH: 7.0

Культивирование производили при в качалочной колбе при соблюдении аэробных условий. Через 2 суток достигаетс  активность приблизительно 1500 v/л (раствор и биомасса: субстрат : холестерилолеат). Примерно такой же выход получали в том случае, когда при прочих равных услови х вместо Pseudomonas spec. DSM 1280 примен ли Pseudomonas .spec. DSM 1281. Пример 2. Из культурального раствора, полученного в соответствии с примером 1, выдел ли центрифугированием нерастворимую клеточную массу и примен ли ее дл  определени  холестеринового эфира. Определение производили в соответствии со следующей схемой реакций: 1.Холесте- Холестерин-Холестерин+ РИНОВЫЙ+ экстераза кислота Н.О эфир жирного р д 2.Холесте- Холестери-Холестенонн рин+1/2 0 ноксидаза+ 0 (катализа) Дл  измерени  примен ли следующие растворы: 1.Фосфатный буфер 0,5 М, рН 7,5, 0,4% тезита. 2.Холестеринолеат с 4 в тезитдиоксане (v/v 1/1). 3.Hj,0 примерно 0,6 м (5 мл пергидрола/100 мл) . 4.Каталаза (0,01 мг белка/мл). 5.Холестериноксидаза (мин. 50 v/мл). 6.Культуральный раствор (примерно 5000 v/л, 1:5 разбавленный , 0,01 мл- тест). .Дл  измерени  2,95 мл раствора 1 смешивают с 0,02 мл раствора 3. Через 5 мин добавл ют 0,01 мл раствора 6 и 0,02 мл раствора 5 и спуст  1 мин инициируют реакцию добавлением . 0,1 мл раствора 2. Расчет осуществл ют по формуле 3,12-51000 „/ . , Т5 5 0 ОТЛЕ/МИН v/л культурального раствора. Таким образом, предлагаемый способ позвол ет значительно повысить активность холестеринэстеразн.Cultivation was carried out with a rocking flask under aerobic conditions. After 2 days, an activity of approximately 1500 v / l is achieved (solution and biomass: substrate: cholesteryl oleate). Approximately the same yield was obtained when, ceteris paribus, instead of Pseudomonas spec. DSM 1280 Pseudomonas .spec. DSM 1281. Example 2. An insoluble cell mass was isolated from the culture solution prepared in accordance with Example 1 by centrifugation and used to determine cholesterol ester. The determination was carried out in accordance with the following reaction scheme: 1. Cholester-Cholesterol-Cholesterol + RHINOVA + Exterase acid N. O fatty ester 2. Cholester-Cholester-Cholestenonone rin + 1/2 0 Noxidase + 0 (catalysis) For measurement whether the following solutions: 1. Phosphate buffer 0.5 M, pH 7.5, 0.4% tesite. 2. Cholesterol oleate with 4 in tezitdioxane (v / v 1/1). 3.Hj, 0 approximately 0.6 m (5 ml perhydrol / 100 ml). 4. Catalase (0.01 mg protein / ml). 5. Cholesterol oxidase (min. 50 v / ml). 6. Cultural solution (approximately 5000 v / l, 1: 5 diluted, 0.01 ml test). To measure, 2.95 ml of solution 1 is mixed with 0.02 ml of solution 3. After 5 minutes, 0.01 ml of solution 6 and 0.02 ml of solution 5 are added and after 1 minute the reaction is initiated by addition. 0.1 ml of solution 2. The calculation is carried out according to the formula 3,12-51000. , T5 5 0 OTLE / MIN v / l culture solution. Thus, the proposed method allows to significantly increase the activity of cholesterol esterase.

Claims (1)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНЭСТЕРАЗН, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Pseudomonas на питательной среде, содержащей минеральные соли, фосфатный буфер и индуктор с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или клеток, отличающийся тем, что, с' целью повышения активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штаммы Pseudomonas spec. DSM 1281 или Pseudomonas spec. DSM 1280, а в качестве индуктора лецитин или соевый лецитин в коли- с честве 0,5-2% от массы среды.METHOD FOR PRODUCING CHOLESTERINESTERASINE, which involves culturing a producing microorganism Pseudomonas on a nutrient medium containing mineral salts, a phosphate buffer and an inducer, followed by isolation of the enzyme from the culture fluid and / or cells, characterized in that, in order to increase the activity of the target product, as a producing microorganism use strains of Pseudomonas spec. DSM 1281 or Pseudomonas spec. DSM 1280, and as an inductor lecithin or soya lecithin in the amount of 0.5-2% by weight of the medium. ωω 1151217 21151217 2