SK70898A3 - Process for the preparation of dipeptide of l-alanyl-l-glutamin - Google Patents
Process for the preparation of dipeptide of l-alanyl-l-glutamin Download PDFInfo
- Publication number
- SK70898A3 SK70898A3 SK708-98A SK70898A SK70898A3 SK 70898 A3 SK70898 A3 SK 70898A3 SK 70898 A SK70898 A SK 70898A SK 70898 A3 SK70898 A3 SK 70898A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- alpha
- glutamine
- alanyl
- proteases
- protease
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Spôsob prípravyje založený na tom, že sa chránený L- -alanínester spolu s L-glutaminom alebo L-glutamínamidom dáva v reakčnom prostredí na báze organických rozpúšťadiel, miešateľných alebo nemiešateľných s vodou, s prísadou soli alkalických kovov alebo alkalických zemín a ďalších potrebných faktorov, do kontaktu s mikrobiálnou proteázou, voľnou alebo imobilizovanou, pri teplote 20 až 60 °C a hodnote pH 8 až 10. Chránený dipeptid je významnou východiskovou látkou na prípravu L-alanyl-L-glutamínu, ktorý sa vo forme infuznych roztokov používa pri liečení ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.The process is based on the fact that the L- -lanine ester together with L-glutamine or L-glutamine in the reaction medium on an organic basis solvents, miscible or immiscible with water, with the addition of alkali metal or alkaline salts soil and other necessary factors in contact with microbial protease, free or immobilized, at a temperature of 20 to 60 ° C and a pH of 8 to 10. The protected dipeptide is an important starting material for the preparation of L-alanyl-L-glutamine which has been found in the art infusion solutions used in the treatment of severe postoperative, traumatic, catabolic, septic and other stress conditions.
Description
Spôsob prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl -L-glutamínuA process for preparing a protected L-alanyl-L-glutamine dipeptide
Oblasť technikyTechnical field
Vynález sa týka spôsobu prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu všeobecného vzorca IThe invention relates to a process for the preparation of a protected L-alanyl-L-glutamine dipeptide of the general formula I
X - L - alanyl - L - glutamin - Y (I), kde X je chrániaca skupina N-alfa-formylová, N-alfa-fúrylakryloylová, N-alfa-benzoylová, N-alfa-benzoloxykarbonylová, N-alfa-fenylacetylová, N-alfa-terc.-butyloxykarbonylová alebo N-alfa-fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina alebo aminoskupina. Chránený dipeptid je výhodná východisková látka na prípravu voľného L-alanyl-Lglutamínu, ktorý sa vo forme iníuznych roztokov používa pri liečbe ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.X-L-alanyl-L-glutamine-Y (I) wherein X is a protecting group N-alpha-formyl, N-alpha-furylacryloyl, N-alpha-benzoyl, N-alpha-benzoloxycarbonyl, N-alpha-phenylacetyl, N-alpha-tert-butyloxycarbonyl or N-alpha-fluorenylmethoxycarbonyl and Y is hydroxyl or amino. The protected dipeptide is the preferred starting material for the preparation of free L-alanyl-Lglutamine, which is used in the form of infusion solutions in the treatment of severe post-operative, traumatic, catabolic, septic and other stress conditions.
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Ako je známe, používajú sa syntetické dipeptidy (alebo tripeptidy) ako zložky iníuznych roztokov na parenterálnu výživu. Ide o peptidy tých L-aminokyselin, ktoré sú pre organizmus potrebné, ale ktoré sú v roztoku buď nestále (glutamin) alebo len čiastočne rozpustné (cysteín, tyrozín). V porovnaní s voľnými aminokyselinami sú dipeptidy stálejšie a rozpustnejšie. Pretože biologická dostupnosť peptidov a tým aj ich využiteľnosť v organizme je veľmi dobrá, je možné aplikáciou dipeptidov zvýšiť prísun aminokyselín bez nežiadúcej záťaže organizmu (A. Veselková a spol., Čes. a Slov. Farm. 45, č. 1, str. 14-16, 1996).As is known, synthetic dipeptides (or tripeptides) are used as components of different solutions for parenteral nutrition. These are peptides of those L-amino acids that are necessary for the body, but which are either unstable (glutamine) or only partially soluble (cysteine, tyrosine) in solution. Compared to free amino acids, dipeptides are more stable and soluble. Because the bioavailability of peptides and thus their usefulness in the body is very good, the application of dipeptides can increase the supply of amino acids without undesirable strain on the organism (A. Veselkova et al., Ces. And Slov. Farm. 45, No. 1, p. 14) -16,1996).
Glutamin je v organizme dôležitým donorom dusíka. Hlavne v záťažových stavoch sa jeho spotreba zvyšuje, avšak v mnohých prípadoch jeho prirodzená tvorba nestačí. Prekážkou dodatočného prísunu je však nestálosť glutamínu vo vodnom prostredí a pri sterilizácii iníuznych roztokov jeho rozklad. (P. Fiirst so spol., Proc. Nutr. Soc. 49, 343359,1990). Glutamin sa však môže dodať do organizmu vo forme dipeptidov, z ktorých sa najlepšie osvedčil L-alanyl-L-glutamín, ktorý sa v plazme zdravých probandov rýchlo odbúrava plazmatickou proteázou na alanín a glutamin za rýchlej utilizácie zložiek (Fiirst a spol., citované vyššie; H. Lochs a spol., Metabolism 39, 833-836, 1990). KonvenčnáGlutamine is an important nitrogen donor in the body. Especially in stress states, its consumption increases, but in many cases its natural production is not enough. However, the additional supply is hampered by the instability of glutamine in the aqueous environment and its decomposition when sterilizing other solutions. (P. Fiirst et al., Proc. Nutr. Soc. 49, 343359, 1990). Glutamine, however, can be supplied to the body in the form of dipeptides, of which L-alanyl-L-glutamine has proven to be the best, which is rapidly degraded by plasma protease to alanine and glutamine in the plasma of healthy probands with rapid utilization of components (Fiirst et al. H. Lochs et al., Metabolism 39, 833-836 (1990). conventional
-2výživová terapia spomenutých stresových stavov však zlyhala a jedinou možnou cestou je dodanie glutamínu do organizmu vo forme infuznych roztokov doplnených alanylglutaminom.However, the nutritional therapy of these stress states has failed and the only possible route is to supply glutamine to the body in the form of infusion solutions supplemented with alanylglutamine.
Glutamín aplikovaný vo forme dipeptidu je veľmi stály, nerozkladá sa na nežiadúce produkty a je omnoho viac rozpustnejší než vo voľnom stave, ako sa experimentálne dokázalo (P. Stehle, Klinische Emährung 35, 1991).Glutamine applied in the form of the dipeptide is very stable, does not decompose into undesirable products and is much more soluble than in the free state as experimentally demonstrated (P. Stehle, Klinische Emährung 35, 1991).
Alanylglutamin je možné pripraviť chemickou syntézou (P. Stehle a spol., J. Appl. Biochem, 4, 280-285, 1982), ktorá je však na výrobu vo veľkej miere z mnohých technických, ekonomických i ekologických dôvodov nevýhodná. Ďalej sa podarilo uskutočniť prvú modelovú enzýmovú syntézu alanylglutamínu na výskumné účely pomocou cysteínových proteáz papaínu (z Carica papaya) a ficínu (z Ficus carica). Pomocou týchto rastlinných proteáz sa však alanylglutamin nemôže vo veľkom množstve vyrábať, lebo sú to drahé a ťažko dostupné proteázy, nepoužiteľné na ekonomickú výrobu.Alanylglutamine can be prepared by chemical synthesis (P. Stehle et al., J. Appl. Biochem, 4, 280-285, 1982), which is, however, disadvantageous for production for a number of technical, economic and environmental reasons. Furthermore, the first model enzyme synthesis of alanylglutamine for research purposes was accomplished using cysteine proteases of papain (from Carica papaya) and ficin (from Ficus carica). However, with these plant proteases, alanylglutamine cannot be produced in large quantities because they are expensive and hardly available proteases, not usable for economic production.
Živočíšna výroba proteáz je tiež nevýhodná, pretože je drahá a ťažkopádna a je možné tak získavať len niektoré proteázy na špeciálne účely, napríklad pepsín z hovädzích žalúdkov alebo alfa-chymotrypsín z prasačích sliniviek. Naviac nebola v dostupnej literatúre zistená medzi proteázami živočíšneho pôvodu žiadna proteáza, ktorá by bola schopná syntetizovať alanylglutamin.Animal protease production is also disadvantageous because it is expensive and cumbersome and only certain proteases for special purposes can be obtained, such as pepsin from bovine stomachs or alpha-chymotrypsin from porcine pancreas. In addition, no protease capable of synthesizing alanylglutamine was found among the proteases of animal origin in the available literature.
Pozornosť sa preto obrátila na výskum mikrobiálnych proteáz, ktoré by boli schopné syntetizovať žiadaný dipeptid a ktoré by boli dostupné, lacné a umožňovali ekonomickú výrobu v prevádzkovom množstve. V odbornej a patentovej literatúre nie je doposiaľ známa žiadna mikrobiálna proteáza, ktorá by bola schopná syntetizovať žiadaný dipeptid, t.j. alanylglutamin. Na základe systematického výskumu, predovšetkým dostupných komerčných mikrobiálnych proteáz a mikroorganizmov, sa však podarilo nájsť vhodné proteázy, schopné syntetizovať chránený alanylglutamin.Attention has therefore been paid to the research of microbial proteases which are capable of synthesizing the desired dipeptide and which are affordable, inexpensive and allow economical production in bulk. To date, no microbial protease capable of synthesizing the desired dipeptide is known in the scientific and patent literature, i. alanyl. However, based on systematic research, in particular available commercial microbial proteases and microorganisms, suitable proteases capable of synthesizing protected alanylglutamine have been found.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Vynález sa teda týka spôsobu prípravy chráneného dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu všeobecného vzorca IThe invention therefore relates to a process for the preparation of the protected L-alanyl-L-glutamine dipeptide of formula I
X - L - alanyl - L - glutamín - Y (I),X - L - alanyl - L - glutamine - Y (I),
-3kde X je chrániaca skupina N-alfa-formylová, N-alfa-furylakryloylová, N-alfa-benzoylová, N-alfa-benzoloxykarbonylová, N-alfa-fenylacetylová, N-alfa-terc.-butyloxykarbonylová alebo N-alfa-fluorenylmetoxykarbonylová a Y je hydroxylová skupina či aminoskupina. Podstata vynálezu spočíva v tom, že sa chránený ester L-alanínu všeobecného vzorca II-3where X is N-alpha-formyl, N-alpha-furylacryloyl, N-alpha-benzoyl, N-alpha-benzoloxycarbonyl, N-alpha-phenylacetyl, N-alpha-tert-butyloxycarbonyl or N-alpha-fluorenylmethoxycarbonyl and Y is hydroxyl or amino. It is an object of the present invention to provide a protected L-alanine ester of formula II
X-L-Ala-R (Π), kde X je to isté, čo vo vzorci I a R je alkyl s 1 až 3 atómami uhlíka alebo benzyl, spolu s Lglutamínom alebo L-glutaminamidom uvádzajú do styku s voľnou alebo imobilizovanou mikrobiálnou proteázou alebo so zmesami týchto proteáz, v prostredí organického rozpúšťadla miešateľného alebo nemiešateľného s vodou, ktoré zahŕňa alkanoly s 1 až 5 atómami uhlíka, acetonitril, dimetylformamid, dioxán, dimetylsulfoxid, etylacetát, tetrachlórmetán alebo ich zmesi, s koncentráciou 0,5 až 99,5 objemových %, s prísadou solí alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami a dvojsódne soli kyseliny etyléndiaminotetraoctovej (EDTA), pri teplote od teploty miestnosti až do 60 C a pri hodnote pH 8 až 10.XL-Ala-R (Π), where X is the same as in formula I and R is alkyl of 1 to 3 carbon atoms or benzyl, together with Lglutamine or L-glutaminamide are contacted with free or immobilized microbial protease or mixtures of these proteases, in a water-miscible or water-immiscible organic solvent medium, comprising C1-C5 alkanols, acetonitrile, dimethylformamide, dioxane, dimethylsulfoxide, ethyl acetate, carbon tetrachloride or mixtures thereof, at a concentration of 0,5 to 99,5% by volume , with an addition of alkali metal or alkaline earth metal salts with inorganic acids and disodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), at room temperature up to 60 ° C and at a pH of 8 to 10 ° C.
Účelne a výhodne sa ako voľné imobilizované mikrobiálne proteázy používajú proteázy, vybrané zo súboru, ktorý zahŕňa proteázu z Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrio proteolyticus ATCC 15338, karboxypeptidasu Y zo Saccharomyces cerevisiae alebo Saccharomyces coreanus, proteinázu K z Tritirachium album, peptidyl Asp - metaloendopeptidázu z Pseudomonas fluorescens RK-9 (zbierka Výskumného ústavu antibiotík a biotransformácií), a to jednotlivo alebo v zmesi.Suitably and preferably, the free immobilized microbial proteases used are proteases selected from the group consisting of protease from Aspergillus oryzae, Streptomyces griseus, Vibrio proteolyticus ATCC 15338, carboxypeptidase Y from Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces coreanus, proteinase K from peptidase-Tritirachase from Pseudomonas fluorescens RK-9 (Collection of the Antibiotic and Biotransformation Research Institute), alone or in a mixture.
Ako prísady do reakčného, resp. kultivačného prostredia sú potrebné soli alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín s anorganickými kyselinami, hlavne sírany, dusičnany, chloridy alebo fosforečnany, a to jednotlivo alebo v zmesi; pri použití niektorých proteáz je účelná prísada chloridu zinočnatého, prípadne prísada L-cysteínu.As additives to the reaction, respectively. in the culture medium alkali metal or alkaline earth metal salts with inorganic acids, in particular sulphates, nitrates, chlorides or phosphates, are required individually or in a mixture; in some proteases, the addition of zinc chloride or the addition of L-cysteine is expedient.
Výhody spôsobu podľa vynálezu spočívajú v tom, že výroba mikrobiálnych proteáz, ktorá vychádza z dostupných surovín, je lacná, umožňuje jednoduchú izoláciu enzýmu na jednom mieste pomocou sledu bežných operácií a bežných zariadení. Ňa výrobu dipeptidov stačí napríklad príslušnú proteázu izolovať po kultivácii mikroorganizmu len do formy technického preparátu (nie je potrebná izolácia a purifíkácia až do kyslého stavu), lebo ten sa imobilizuje (napríklad pomocou sieťovacích činidiel, zapolymerovaním do polymémej siete, prípadne väzbou na organické polyméry či porézne anorganické materiály), čím enzým prejde do formy malých tuhých častíc (rovnako je možné použiť priamo rozpustnýThe advantages of the method according to the invention are that the production of microbial proteases, starting from the available raw materials, is inexpensive, allows easy isolation of the enzyme in one place by a sequence of conventional operations and conventional equipment. For the production of dipeptides, it is sufficient, for example, to isolate the protease in question after cultivation of the microorganism only in the form of a technical preparation (no isolation and purification up to the acid state is necessary), because it is immobilized (for example by crosslinking agents, polymerisation into a polymer network or by binding to organic porous inorganic materials), whereby the enzyme becomes small solid particles (it is also possible to use directly soluble
-4enzým zachytením do ultrafiltračných membrán) a používa sa opakovane vo vsádzkovom zariadení (napríklad 100 až 1000 x podľa stability enzýmovej aktivity a mechanickej odolnosti imobilizovaného preparátu) alebo v kontinuálne pracujúcom reaktore počas niekoľkých hodín, kedy sa enzýmový materiál musí pre manipulačné straty doplňovať. Po ukončení reakcie sa supematant (reakčná zmes) od imobilizovanej proteázy oddelí a zhromažďuje sa na ďalšie spracovanie.(By entrapment into ultrafiltration membranes) and used repeatedly in a batch device (for example, 100-1000 times depending on enzyme activity stability and mechanical resistance of the immobilized preparation) or in a continuously operating reactor for several hours when the enzyme material has to be replenished for handling losses. After completion of the reaction, the supernatant (reaction mixture) is separated from the immobilized protease and collected for further processing.
Chemická výroba L-alanyl-L-glutamínu pracuje výhradne vsádzkovo, je obmedzená únosným množstvom reakčnej zmesi, používa toxické látky (napr. fosgén), vysoké teploty a tlaky, znečisťuje okolie. Skupiny, ktoré spolu nemajú reagovať, je treba chrániť, napriek tomu môžu nastať nežiadúce reakcie. Pri chemickej výrobe hrozí predovšetkým epimerizácia na chirálnom uhlíku pripravovaného peptidu (vznik racemickej zmesi). Komplikovaná je aj izolácia chráneného peptidu až do čistej formy.The chemical production of L-alanyl-L-glutamine works solely in batches, limited by the carrying capacity of the reaction mixture, using toxic substances (eg phosgene), high temperatures and pressures, and polluting the environment. Groups that do not react together need to be protected, but unwanted reactions may occur. In chemical production, there is a particular risk of epimerization on the chiral carbon of the prepared peptide (formation of a racemic mixture). Also, the isolation of the protected peptide to the pure form is complicated.
Oproti tomu je spôsob výroby podľa vynálezu realizovateľný v bioreaktoroch jednoduchší, pracuje sa za prijateľných teplôt a tlakov, s bežnými látkami, za zachovania ekologických podmienok. Nenastávajú nežiadúce reakcie na sekundárnych skupinách a predovšetkým nehrozí nebezpečie spomenutej epimerízácie, lebo enzýmy sú prísne stereošpecifické, takže dáva (vzniká) homogénny dipeptid. Systematickým výskumom mikrobiálnych proteáz sa našlo niekoľko mikroorganizmov, produkujúce proteázy schopné syntetizovať chránený alanylglutamín. Sú to proteáza z Aspergillus oryzae (pleseň) a Streptomyces griseus (aktinomyceta), karboxypeptidáza Y zo Saccharomyces cerevisiae alebo Saccharomyces coreanus (kvasinky), proteináza K z Tritirachium album (huba), proteáza z Vibrio proteolyticue (baktérie), peptidyl-Asp-metaloendopeptidáza z Pseudomonas fragi a metaloendopeptidáza z Pseudomonas fluorescens (pseudomonády). Všetky menované proteázy sú endopeptidázy alebo karboxypeptidázy, lebo len tie sú schopné produkovať žiadaný dipeptid. Najvýhodnejšie sú serínové proteázy, lebo pri ich použití sa získa dipeptid za relatívne krátky čas a vo vysokom výťažku. Aj pri enzýmovej príprave je nutné používať chrániace skupiny, ale len pre alfa-aminoskupinu alanínu. Vhodné chrániace skupiny sú uvedené vyššie. Na syntézu sa používa alanín vo forme esteru, čo je už tiež uvedené.On the other hand, the process according to the invention is easier to implement in bioreactors, working at acceptable temperatures and pressures, with conventional substances, while maintaining environmental conditions. There are no adverse reactions on the secondary groups and, in particular, there is no danger of the epimerization mentioned, since the enzymes are strictly stereospecific, thus giving (homogeneous) a dipeptide. Systematic investigation of microbial proteases has found several microorganisms producing proteases capable of synthesizing protected alanylglutamine. They are protease from Aspergillus oryzae (fungus) and Streptomyces griseus (actinomycetes), carboxypeptidase Y from Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces coreanus (yeast), proteinase K from Tritirachium album (fungus), protease from Vibrio proteolyticue-peptidase (bacteria), from Pseudomonas fragi and metalloendopeptidase from Pseudomonas fluorescens (pseudomonas). All of the proteases mentioned are endopeptidases or carboxypeptidases because only they are capable of producing the desired dipeptide. Most preferred are serine proteases, as they use a dipeptide in a relatively short time and in a high yield. Also in the enzyme preparation it is necessary to use protecting groups, but only for the alpha-amino group of alanine. Suitable protecting groups are listed above. For the synthesis, alanine is used in the form of an ester, which is also mentioned above.
Pri uvedení spôsobu podľa vynálezu sa východiskové zlúčeniny uvádzajú vo vhodnom reakčnom prostredí do styku s niektorou z vyššie uvedených mikrobiálnych proteáz. Reakčné prostredie obsahuje organické rozpúšťadlo miesiteľné alebo nemiesiteľnéIn contacting the method of the invention, the starting compounds are contacted with one of the aforementioned microbial proteases in a suitable reaction medium. The reaction medium contains a miscible or immiscible organic solvent
-5s vodou a podľa povahy použitej proteázy ďalšie potrebné prísady, napríklad soli, EDTA, tlmivé roztoky, cysteín a ďalšie. Za stáleho miešania sa teplota a hodnota pH udržujú v potrebnom rozmedzí.With water and, depending on the nature of the protease used, other necessary ingredients such as salts, EDTA, buffers, cysteine and others. While stirring, the temperature and pH are kept within the necessary range.
Pri práci s imobilizovanou mikrobiálnou proteázou sa reakčná zmes postupne zhromažďuje a potom sa v nej jednorázovým procesom zo vzniknutého derivátu alanylglutaminu odstráni chrániaca skupina buď chemicky (napríklad kontaktnou hydrogenolýzou a pod.) alebo s výhodou enzýmovo, kedy sa využíva schopnosť niektorých amidáz oddelovať chrániace skupiny (penicilamidáza odstraňuje fenylacetylovú skupinu, peptidamidáza odštepuje amidovú skupinu glutaminamidu a pod.). Enzýmová metóda odštepovania chrániacich skupín umožňuje pri voľbe vhodnej chrániacej skupiny zostaviť v prevádzke napríklad sériu dvoch prietokových reaktorov, keď v prvom sa syntetizuje chránený alanylglutamín a v druhom sa odstraňuje chrániaca skupina, takže kontinuálne sa získa priamo žiadaný produkt, ktorý sa izoluje niektorým zo známych postupov, napríklad iontomeničovou chromatografiou, gélovou filtráciou, poprípade hydrofóbnou alebo afinitnou chromatografiou.When working with the immobilized microbial protease, the reaction mixture is gradually collected and then removed in a one-off process from the resulting alanylglutamine derivative either chemically (e.g., by contact hydrogenolysis, etc.) or preferably enzymatically, utilizing the ability of some amidases to separate the protecting groups ( penicilidase removes the phenylacetyl group, peptidamidase cleaves the amide group of glutaminamide and the like). The enzymatic cleavage method of the protecting groups allows, for example, a series of two flow reactors to be operated in the process of choosing a suitable protecting group, in which the protected alanylglutamine is synthesized in the first and the protecting group is removed in a second, so that the desired product is obtained directly. for example, ion exchange chromatography, gel filtration, optionally hydrophobic or affinity chromatography.
Bližšie podrobnosti spôsobu podľa vynálezu vyplývajú z nasledujúcich príkladov uskutočnenia, ktoré tento spôsob len ilustrujú, ale nijako neobmedzujú.The details of the process according to the invention are illustrated in more detail by the following examples, which are illustrative but not limiting.
Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Príklad 1Example 1
V termostatovej nádobke s objemom 50 ml sa pripravilo 30 ml zmesi obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 10 mM L cysteínu, 0,663 g N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 3,5 g L-glutamínu (0,8 M), 5 objemových % etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH sa za miešania upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,5 a po vytemperovaní zmesi na 35 °C sa za miešania pridalo 10 mg karboxypeptidázy Z zo Saccharomyces cerevisiae, čim sa začala reakcia. Reakčná zmes sa intenzívne miešala a počas reakcie sa teplota udržovala pomocou ultratermostatu na 35 °C a pH sa udržovalo pomocou pH-statu na hodnote 9,5. Počas reakcie sa odobrali vzorky s objemom 0,5 ml, v ktorých sa reakcia zastavila pridaním 0,5 ml 2 M kyseliny chlorovodíkovej. Vzorky sa hodnotili kapilárnou elektroforézou spojenou s vyhodnocovacim počítačom. Po 180 min reakcie, kedy sa jej koniec indikoval skoro úplnou spotrebou N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru, našla sa koncentrácia N-fenylacetyl-L-alanyl-6L-glutamínu 26,7 g/1, čo predstavuje konverziu 79,7 % vzťahujúce sa na východiskový acyldonorester.In a 50 ml thermostatic flask, 30 ml of a mixture containing 0.1 M potassium chloride, 5 mM EDTA, 10 mM calcium chloride, 10 mM L cysteine, 0.663 g N-phenylacetyl-L-alanine methyl ester (0.1 M) was prepared, 3.5 g of L-glutamine (0.8 M), 5 vol% ethanol and water to a total volume of 30 ml. The pH was adjusted to 9.5 with 2M sodium hydroxide with stirring, and after the mixture was allowed to warm to 35 ° C, 10 mg of carboxypeptidase Z from Saccharomyces cerevisiae was added with stirring to initiate the reaction. The reaction mixture was stirred vigorously and the temperature was maintained at 35 ° C with an ultratermostat during the reaction and the pH was maintained at 9.5 with a pH stat. During the reaction, 0.5 ml samples were taken in which the reaction was stopped by adding 0.5 ml of 2 M hydrochloric acid. Samples were evaluated by capillary electrophoresis coupled to an evaluation computer. After a reaction time of 180 min, the end of which was indicated by almost complete consumption of N-phenylacetyl-L-alanine methyl ester, the concentration of N-phenylacetyl-L-alanyl-6L-glutamine was found to be 26.7 g / l, representing a conversion of 79.7% to the starting acyldonorester.
Príklad 2Example 2
Analogicky ako v príklade 1 sa pripravilo 30 ml zmesi, ktorá obsahovala 0,1 M chloridu draselného, 30 mM dusičnanu sodného, 1 mM EDTA, 0,621 g N-benzoyl-Lalaninmetylesteru (0,1 M), 2,61 g L-glutamínamidu (0,6 M), 50 objemových % dimetylformamidu a vodu na celkový objem 30 ml. Za miešania sa pH zmesi upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,0 a po vytemperovaní zmesi na 40 °C sa pridalo 1,26 g proteázy z Aspergillus orazae, čo viedlo k začiatku reakcie. Za intenzívneho miešania reakčnej zmesi sa počas reakcie udržiavala teplota pomocou ultratermostatu na 40 °C a pH sa udržiavalo pomocou pH-statu na hodnote 9,0. Analogicky ako v príklade 1 sa z reakčnej zmesi odobrali vzorky a merali sa kapilárnou elektroforézou. Po 5 h reakcie, kedy sa už koncentrácia N-benzoyl-L-alaninmetylesteru udržovala prakticky na rovnakej hodnote, našla sa produkcia N-benzoyl-L-alanyl-L-glutamínamidu 15,6 g/1, čo vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester predstavuje konverziu 48,8 %.Analogously to Example 1, 30 ml of a mixture containing 0.1 M potassium chloride, 30 mM sodium nitrate, 1 mM EDTA, 0.621 g of N-benzoyl-lalanine methyl ester (0.1 M), 2.61 g of L-glutamine, were prepared. (0.6 M), 50% by volume of dimethylformamide and water to a total volume of 30 ml. While stirring, the pH of the mixture was adjusted to 9.0 with 2M sodium hydroxide, and after the mixture was allowed to warm to 40 ° C, 1.26 g of Aspergillus orazae protease was added, leading to the start of the reaction. With vigorous stirring of the reaction mixture, the temperature was maintained at 40 ° C with an ultratermostat during the reaction and the pH was kept at a pH of 9.0 using a pH-stat. Analogously to Example 1, samples were taken from the reaction mixture and measured by capillary electrophoresis. After a reaction of 5 hours, when the N-benzoyl-L-alanine methyl ester concentration was maintained at practically the same level, the production of N-benzoyl-L-alanyl-L-glutamine amide was found to be 15.6 g / l, representing the starting acyldonorester. conversion of 48.8%.
Príklad 3Example 3
Analogicky ako v príklade 1 sa pripravilo 30 ml zmesi, obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 50 mM síranu sodného, 4,38 g L-glutamínu (IM), 0,747 g Nbenzyloxykarbonyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 63 objemových % metanolu a vodu na celkový objem 30 ml. Za miešania sa pH zmesi upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 8,0 a po vytemperovaní zmesi na 30 °C sa za miešania pridalo 15 mg proteázy zo Streptomyces griseus, čim sa začala reakcia. Reakčná zmes sa intenzívne miešala, teplota sa udržiavala pomocou ultratermostetu na 30 °C a pH sa udržiavalo pomocou Ph-statu na hodnote 8,0. Vzorky sa odobrali a merali analogicky ako v príklade 1. Po 120 min reakcie sa nameralo 12,7 g/1 N-benzyloxykarbonyl-L-alanyl-L-glutaminu, čo predstavuje konverziu 39,3 %, vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester.Analogously to Example 1, 30 ml of a mixture containing 0.1 M potassium chloride, 5 mM EDTA, 50 mM sodium sulfate, 4.38 g L-glutamine (IM), 0.747 g Nbenzyloxycarbonyl-L-alanine methyl ester (0.1 ml) were prepared. M), 63 vol% methanol and water to a total volume of 30 ml. With stirring, the pH of the mixture was adjusted to 8.0 with 2M sodium hydroxide, and after the mixture was allowed to warm to 30 ° C, 15 mg of Streptomyces griseus protease was added with stirring to initiate the reaction. The reaction mixture was stirred vigorously, the temperature was maintained at 30 ° C with an ultrathermostet, and the pH was maintained at 8.0 using a Ph-stat. Samples were taken and measured analogously to Example 1. After 120 min of reaction, 12.7 g / L of N-benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-glutamine was measured, which represents a conversion of 39.3% relative to the starting acyldonorester.
Príklad 4Example 4
a) príprava čiastočne izolovanej technickej proteázy z Vibrio proteolyticus ATCC 15338(a) preparation of a partially isolated technical protease from Vibrio proteolyticus ATCC 15338
Kultúra uvedeného kmeňa sa udržiavala na šikmých agaroch so zložením:The culture of said strain was maintained on sloping agar with the composition:
Nutrient Agar Difco 3,1 %Nutrient Agar Difco 3.1%
7Difco agar chlorid sodný pH 7,07Difco agar sodium chloride pH 7.0
0,5 % 2,2 %0.5% 2.2%
Kultivácia prebiehala pri 28 °C na rotačnom trepacom stroji s počtom otáčok 240 min'1 v 500 ml varných bankách plnených 100 ml kultivačného média so zložením:The cultivation was carried out at 28 DEG C. on a rotary shaking machine at speeds 240 rpm in 1 500 ml round bottom flask filled with 100 ml of culture medium having the composition:
sacharóza 4 % com-steep liquor (CLS) 4 % hydrogénfosforečnan dvojsodný dodekahydrát 0,5 % síran amónny 0,5 % síran draselný 0,1% chlorid vápenatý 0,1 % síran horečnatý heptahydrát 0,05 % chlorid sodný 2,0 % pH 7,0sucrose 4% com-steep liquor (CLS) 4% disodium hydrogen phosphate dodecahydrate 0.5% ammonium sulfate 0.5% potassium sulfate 0.1% calcium chloride 0.1% magnesium sulfate heptahydrate 0.05% sodium chloride 2.0% pH 7.0
Banky I. generácie sa očkovali sterilné kľučkou zo šikmého agaru a kultivácia I. generácie prebiehala 24 h. Pri očkovaní 1 % inokula z baniek I. generácie prebiehala kultivácia Π. generácie tiež 24 h. O.D. na konci kultivácie bola 5,4 a hodnota pH bola 7,9. Obsah baniek sa odstredil pri 5000 g počas 30 min, čím sa záskal číry nahnedlý supematant s proteázovou aktivitou 0,28 mg azokaseinu/min/ml. Supematant sa zahustil na rotačnom vákuovom odparovači vybavenom výkonnou rotačnou olejovou vývevou pri 25 °C zhrubaGeneration 1 flasks were inoculated with sterile slant agar and the first generation was cultivated for 24 h. Inoculation of 1% inoculum from first generation flasks was followed by cultivation Π. generation also 24 h. O.D. at the end of the cultivation it was 5.4 and the pH was 7.9. The contents of the flasks were centrifuged at 5000 g for 30 min to give a clear brownish supernatant with a protease activity of 0.28 mg azocasin / min / ml. The supernatant was concentrated on a rotary vacuum evaporator equipped with a powerful rotary oil pump at 25 ° C approximately
5,5 x, pričom sa dosiahla proteázová aktivita zahusteného supematantu 0,65 mg azokazeínu/min/ml.5.5x, whereby a protease activity of the concentrated supernatant of 0.65 mg azocazein / min / ml was achieved.
b) príprava dipeptidub) preparation of the dipeptide
Analogicky ako v príklade 1 sa namiešalo 10 ml zmesi, obsahujúcej po prepočte na výsledný objem 30 ml 0,1 M chloridu draselného, 10 mM chloridu vápenatého, 1 mM chloridu zinočnatého, 1 mM EDTA, 0,2385 g N-formyl-L-alanínpropylesteru (50 mM), 5,256 g L-glutamínu (1,2 M), 20 objemových % propanolu a vodu. Po vytemperovaní zmesi na príslušnú teplotu a úprave pH 2 M hydroxidom sodným na príslušnú hodnotu sa za miešania pridalo 20 ml zahusteného supematantu kultúiy Vibrio proteolyticus ATCC 15338, čím sa začala reakcia, pri ktorej bola teplota intenzívne miešanej zmesi udržiavaná pomocou ultratermostatu na 40 °C a pH sa udržiavalo pomocou pH-statu na hodnote 9,5.Analogously to Example 1, 10 ml of a mixture containing 30 ml of 0.1 M potassium chloride, 10 mM calcium chloride, 1 mM zinc chloride, 1 mM EDTA, 0.2385 g N-formyl-L- alanine propyl ester (50 mM), 5.256 g of L-glutamine (1.2 M), 20 vol% propanol and water. After warming the mixture to the appropriate temperature and adjusting the pH with 2M sodium hydroxide to the appropriate value, 20 ml of concentrated Vibrio proteolyticus ATCC 15338 culture supernatant was added with stirring to initiate a reaction where the temperature of the vigorously stirred mixture was maintained at 40 ° C using an ultratermostat. The pH was maintained at a pH of 9.5.
-8Pri analogickom odbere a analýze vzorkov ako v príklade 1 sa po 3 h reakcie našlo 7,2 g/1 N -formyl-L-alanyl-L-glutamínu pri konverzii 58,7 %, vzťahujúc sa na východiskový acyldonorester.In analogous sampling and analysis of the samples as in Example 1, after 3 hours of reaction, 7.2 g / l of N-formyl-L-alanyl-L-glutamine was found at a conversion of 58.7% based on the starting acyldonorester.
Príklad 5Example 5
a) príprava imobilizovanej proteázy(a) preparation of immobilized protease
V 50 ml nádobke sa sférické častice organického kopolyméru metakrylaldehyddivinylbenzén s obsahom 11,8 hmotnostných % metakrylaldehydových skupín s priemerom 150 až 300 pm v stechiometrickom pomere aktivovali hexametyléndiaminom a s množstvom 2 g sa miešali pomocou magnetického miešadla v 30 ml vody s 2 g proteinázy K z Tritirachium album v prítomnosti 1,6 ml 50 objemových % glutaraldehydu pri teplote miestnosti počas 6 h. Po reakcii sa imobilizované častice od supematantu oddelili dekantáciou a dôkladne premyli vodou. Získalo sa 5,4 g vlhkej hmoty imobilizovanej proteinázy K s špecifickou aktivitou 4,3 pmol L-leucínu/min/mg vlhkej hmoty (ďalej len j/min/mg - proteázová aktivita bola 0,11 mg azokazeínu/min/mg vlhkej hmoty). Pri pôvodnej aktivite proteinázy K 13,7 j/min/mg preparátu (0,37 mg azokazeínu/min/mg) to predstavuje výťažok imobilizácie zhruba 85 %.In a 50 ml vial, the spherical organic copolymer particles of methacrylaldehyddivinylbenzene containing 11.8% by weight of methacrylaldehyde groups with a diameter of 150 to 300 µm in a stoichiometric ratio were activated with hexamethylenediamine and mixed with 2 g of 2 g proteinase K protein album in the presence of 1.6 mL of 50 vol% glutaraldehyde at room temperature for 6 h. After the reaction, the immobilized particles were separated from the supernatant by decantation and thoroughly washed with water. 5.4 g of wet mass of immobilized proteinase K with a specific activity of 4.3 pmol L-leucine / min / mg wet mass were obtained (hereinafter referred to as j / min / mg - protease activity was 0.11 mg azocazein / min / mg wet mass). ). At the original proteinase K activity of 13.7 µ / min / mg preparation (0.37 mg azocazein / min / mg), this represents an immobilization yield of about 85%.
b) príprava dipeptidub) preparation of the dipeptide
Do reaktora s objemom 50 ml vybaveného kotvovým miešadlom s počtom otáčok 150 min*1, ktoré udržiavalo častive biokatalyzátora v dokonalom nadnášani, minimálne ich mechanicky poškodzujúc, a ktoré zaisťovalo dokonalé premiešavanie reakčnej zmesi, sa dalo 4,5 g vlhkého katalyzátora (približne 19000 j/min/30 ml, t.j. na pracovný objem raektora) a pridalo sa vždy 30 ml zmesi, obsahujúcej 0,1 M chloridu draselného, 5 mM EDTA, 10 mM chloridu vápenatého, 50 mM fosforečnanu tridraselného monohydrátu, 0,663 g N-fenylacetyl-L-alanínmetylesteru (0,1 M), 5,256 g L-glutamínu (1,2 M), 30 objemových % etanolu a vodu na celkový objem 30 ml. pH zmesi sa vždy upravilo 2 M hydroxidom sodným na hodnotu 9,7. V miešanom reaktore prebiehala vždy vsádzkovo reakcia v styku s imobilizovanou proteinázou K za udržiavania teploty pomocou ultratermostatu na 28 °C a pH pomocou pH-statu na hodnote 9,7 počas 60 až 80 min. Po reakcii sa reakčná zmes vždy odtiahla násoskou, vybavenou fritou proti úniku častíc, a zhromažďovala na ďalšie spracovanie.A 50 ml reactor equipped with a 150 min * 1 anchor stirrer, which kept the biocatalysts in perfect buoyancy, minimally mechanically damaging them, and which ensured perfect mixing of the reaction mixture, was charged with 4.5 g of wet catalyst (approximately 19000 µl). 30 ml of a mixture containing 0.1 M potassium chloride, 5 mM EDTA, 10 mM calcium chloride, 50 mM tripotassium phosphate monohydrate, 0.663 g N-phenylacetyl-L / min. -alanine methyl ester (0.1 M), 5.256 g of L-glutamine (1.2 M), 30 vol% ethanol and water to a total volume of 30 ml. The pH of the mixture was always adjusted to 9.7 with 2M sodium hydroxide. In the stirred reactor, the batch reaction was always in contact with the immobilized proteinase K while maintaining the temperature with an ultratermostat at 28 ° C and pH with a pH-value of 9.7 for 60 to 80 minutes. After the reaction, the reaction mixture was always drawn off with a siphon equipped with a sintered frit and collected for further processing.
-9Týmto spôsobom sa uskutočnilo 120 opakovaných vsádzkových konverzií; pri analogickom odbere a meraní vzorkov ako v príklade 1 bola priemerná produkcia Nfenylacetyl-L-alanyl-L-glutamínu 29,8 g/1, čo predstavuje priemernú konverziu východiskového acyldonoresteru približne 90 %. Špecifická aktivita imobilizovanej proteinázy klesla po 120 opakovaných vsádzkových konverziách, t.j. asi po 140 h prevádzky, na 3,9 j/min/mg vlhkej hmoty, čo reprezentuje operačný polčas biokatalyzátora asi 950 h.-9 In this way, 120 repeated batch conversions were performed; For example, for an analogous sampling and measurement as in Example 1, the average production of N-phenylacetyl-L-alanyl-L-glutamine was 29.8 g / L, which represents an average conversion of the starting acyldonorester of about 90%. The specific activity of the immobilized proteinase decreased after 120 repeated batch conversions, i. after about 140 h of operation, at 3.9 j / min / mg wet matter, which represents the operating half-life of the biocatalyst of about 950 h.
Priemyselné využitieIndustrial use
Chránené deriváty L-alanyl-L-glutamínu, pripravené pomocou mikrobiálnych proteáz spôsobom podľa vynálezu, sú výhodnými východiskovými látkami na prípravu dipeptidu L-alanyl-L-glutamínu, ktorý sa vo forme infiíznych roztokov používa na liečenie ťažkých pooperačných, traumatických, katabolických, septických a iných stresových stavov.Protected L-alanyl-L-glutamine derivatives prepared by microbial proteases according to the invention are preferred starting materials for the preparation of the L-alanyl-L-glutamine dipeptide, which is used in the form of infusion solutions for the treatment of severe postoperative, traumatic, catabolic, septic and other stress states.
Claims (4)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ98997A CZ99798A3 (en) | 1998-04-01 | 1998-04-01 | Process for preparing protected dipeptide of l-alanyl-l-glutamine |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK70898A3 true SK70898A3 (en) | 2000-03-13 |
Family
ID=5462585
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK708-98A SK70898A3 (en) | 1998-04-01 | 1998-05-26 | Process for the preparation of dipeptide of l-alanyl-l-glutamin |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ99798A3 (en) |
SK (1) | SK70898A3 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003106481A1 (en) * | 2002-06-17 | 2003-12-24 | Xiamen University | A process of producing ala-glu dipeptide |
-
1998
- 1998-04-01 CZ CZ98997A patent/CZ99798A3/en unknown
- 1998-05-26 SK SK708-98A patent/SK70898A3/en unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003106481A1 (en) * | 2002-06-17 | 2003-12-24 | Xiamen University | A process of producing ala-glu dipeptide |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ99798A3 (en) | 1999-10-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yamada et al. | Microbial and enzymatic processes for the production of biologically and chemically useful compounds [New Synthetic Methods (69)] | |
US8236533B2 (en) | Process for the production of γ-glutamylcysteine | |
Wada et al. | Enzymatic synthesis of N‐acyl‐l‐amino acids in a glycerol‐water system using acylase I from pig kidney | |
KR890004021B1 (en) | Method for producing l-systeine or/and l-systine | |
KR850001533B1 (en) | Enzymatic de esterification of cephalosporin methyl ester | |
SK70898A3 (en) | Process for the preparation of dipeptide of l-alanyl-l-glutamin | |
JP4300289B2 (en) | Hydrolysis or dehydration condensing enzyme, method for producing the enzyme, and method for synthesizing amide using the enzyme | |
RU2340667C2 (en) | METHOD OF CULTURING STRAIN Rhodococcus rhodochrous M33, WHICH PRODUCES NITRILEHYDRASE | |
JP2006067870A (en) | New aminoacylase and method for producing the same, and method for producing amino acid derivative by utilizing the new aminoacylase | |
CA1337936C (en) | Vibriolysin coupling process | |
Sharma et al. | Microbial transformations: production of D-amino acids using hydantoinase | |
AU2006228996B2 (en) | Process for the production of gamma-glutamylcysteine | |
JP2674078B2 (en) | Process for producing D-α-amino acid | |
JPS6319158B2 (en) | ||
US2953499A (en) | Process for producing l-glutamic acid from hardly soluble amino-acid | |
SU1486517A1 (en) | Method of producing carboxypeptidase | |
EP0352846B1 (en) | Process for the preparation of biocatalysts with previously absent stereoselective enzyme activity | |
SU1523569A1 (en) | Strain of citrobacter freundii bacteria for biotransformation of fumarate to l-malic acid | |
GB1577087A (en) | Enzyme preparation having l-amino acyl amidase activity | |
JP2674076B2 (en) | Method for producing D-α-amino acid | |
JPS58146287A (en) | Preparation of l-cysteine derivative | |
Kittelmann et al. | Isolation and characterization of N-acetyldehydroleucine acylase, a new enzyme from Zoogloea ramigera | |
JPS62143690A (en) | Production of sulfur-containing l-amino acid by enzymatic process | |
JPH0622776A (en) | Production of n-long-chain acylamino acid by fermentation method | |
JPS62220194A (en) | Production of sulfur-containing l-amino acid |