SU1523569A1 - Strain of citrobacter freundii bacteria for biotransformation of fumarate to l-malic acid - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть использовано в микробиологической, медицинской и пищевой отрасл х промышленности, в парфюмерии и металлургии / в качестве комплексообразовател  при извлечении некоторых металлов/. Целью изобретени   вл етс  штамм бактерий CITROBACTER FREUNDII ВКПМNВ-4090, обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза, более высокой степенью конверсии субстрата в L - блочную кислоту, что позволит повысить выход целевого продукта. Штамм обладает высоким, относительно стабильным уровнем фумарат - гидратазы, активность которой мало зависит от возраста и условий выращивани  культуры. Это позвол ет получать более 99% целевого продукта от потребленного количества субстрата. За счет роста предлагаемого штамма бактерий на среде с 3% ферментолизата БВК и последующей иммобилизации нативных клеток бактерий в каррагинан выход целевого продукта повышаетс . 1 табл.The invention relates to the production of organic acids by the microbiological method and can be used in the microbiological, medical and food industries, in perfumery and metallurgy (as a complexing agent in the extraction of certain metals). The aim of the invention is the bacterial strain CITROBACTER FREUNDII VKPMNB-4090, which has a high synthesizing activity, stability of biosynthesis, a higher degree of substrate conversion into L - malic acid, which will increase the yield of the target product. The strain has a high, relatively stable level of fumarate - hydratase, the activity of which depends little on the age and growing conditions of the culture. This makes it possible to obtain more than 99% of the target product from the amount of substrate consumed. Due to the growth of the proposed bacterial strain on the medium with 3% fermentolizat BVK and the subsequent immobilization of native bacterial cells in carrageenan, the yield of the target product increases. 1 tab.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , к производству органических кислот микробиологическим способом и может быть применено в микробиологической , медицинской, пищевой промышленности , в парфюмерии и металлур-г гии (в качестве комплексообразовател , при извлечении некоторых метал- лов).;The invention relates to biotechnology, the production of organic acids by the microbiological method and can be applied in the microbiological, medical, food industry, in perfumery and metallurgy (as a complexing agent, in the extraction of certain metals) .;

Цель изобретени  - штамм бактерий рода Citrobacter freundii (штамм ЗГ), обладающий высокой синтезирующей активностью, стабильностью биосинтеза , независ 1чей от возраста культуры, более высокой степенью конверсии субстрата в L- блочную кислоту, что позвол ет повысить выход целевого продукта .The purpose of the invention is a strain of bacteria of the genus Citrobacter freundii (strain ZG), which has a high synthesizing activity, stability of biosynthesis, regardless of the culture age, a higher degree of substrate conversion to L-malic acid, which allows to increase the yield of the target product.

Штамм Citrobacter freundii ЗГ получен из природных субстратов (огородные почвы) в результате селекции на среде с формиатом и депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика и имеет регистраци- . онный номер В-4090.Strain Citrobacter freundii ZG obtained from natural substrates (garden soil) as a result of selection on the medium with formate and deposited in the collection of industrial microorganisms VNIIGenetika and has a registration. The current number is B-4090.

Штамм Citrobacter freundii ВКПН № 8-4090 характеризуетс  следующими признаками.The Citrobacter freundii strain VKPN No. 8-4090 is characterized by the following features.

Морфологические и физиологические признаки.Morphological and physiological signs.

Клетки бактерий представл ют собой грамотрицательные подвижные перитриСЛ1 Гч5 СО СПBacterial cells are Gram-negative motile peritris1 Hc5 CO SP

О5O5

СОWITH

хиальные палочки с закругленными концами 0,4-0,5 X 1-2 им, капсул и спор не образуют. Факультативные анаэробы. Оптимальный рост наблюдаетс  при ZS-SO C. Односуточные колонии на м со-пептонном агаре (МПА) круглые, блест щие, прозрачные, однотипные , с ровными кра ми, диаметром 1-2 мм, позднее - серовато-белые, блест щие. При росте на твердых средах вокруг колоний на сут, по вл ютс  концентрические йруги в, виде швермеров.chial sticks with rounded ends of 0.4-0.5 X 1-2 them, capsules and spores do not form. Facultative anaerobes. Optimal growth is observed with ZS-SO C. One-day colonies on m-peptone agar (MPA) are round, shiny, transparent, of the same type, with smooth edges, 1-2 mm in diameter, and later grayish-white, shiny. With growth on solid media around the colonies of the day, concentric and circles appear, in the form of shvermerov.

Рост на м со-пептонном бульоне (МПБ) обильный, в виде муТи,. с сероватым оттенком, пленки не образует, в старых культурах муть, осадок. В 2 -часовых культурах образование индола не наблюдаетс . Сероводород образует .Growth on the moc-peptone broth (MPB) is plentiful, in the form of muti ,. with a grayish tint, the film does not form, in old cultures turbidity, sediment. No formation of indole was observed in 2 hour cultures. Hydrogen sulfide forms.

Штамм растет на жидкой среде из 21-ного муравьинокислого кальци  и 0, пептона. При этом дает муть по всей пробирке, образует газ и плотную пленку мела на поверхности среды за счет разложени  муравьиной кислоты.The strain grows in liquid medium from 21% calcium formate and 0, peptone. In this case, it gives turbidity throughout the test tube, forms a gas and a dense film of chalk on the surface of the medium due to decomposition of formic acid.

При росте на молоке происходит подкисление и коагул ци . Рост на картофельном агаре в виде серовато- белого налета. Культура обладает характерным запахом. Желатину не разжижает .With growth on milk, acidification and coagulation occur. Growth on potato agar in the form of a grayish-white bloom. Culture has a characteristic smell. Gelatin does not dilute.

Отношение к углеводам. Разлагает с образованием кислоты и газа глюкозу , фруктоау, галактозу, арабинозу, маннит, ксилозу, крахмал. Лактозу сбраживает медленно. Не растет на Сахарозе, декстрине, дульците, инозите . Испол ьзует в качестве источника углерода пируват, формиат, фумарат, глицерин. KNC рост не ингибирует. Ма- лонат не использует, может расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода 1% .лимонной кислоты.Attitude to carbohydrates. Decomposes with the formation of acid and gas, glucose, fruktoa, galactose, arabinose, mannitol, xylose, starch. Lactose is fermented slowly. Does not grow on sucrose, dextrin, dulcite, inositol. As a carbon source, it uses pyruvate, formate, fumarate, glycerin. KNC does not inhibit growth. Malonate does not use, it can grow on media containing 1% monmonic acid as the sole carbon source.

Отношение к азотистым веществам. Хорошо растет за счет аммонийного и аминного азота, пептона. Нитраты восстанавливает до нитритов. Обладает каталазной активностью.Relation to nitrogenous substances. It grows well due to ammonium and amino nitrogen, peptone. Nitrates restores to nitrites. It has catalase activity.

Штамм хорошо растет на лабораторных средах. Не испытывает потребности в факторах роста. Выращивание бактерий длитс  от 9 до 36 ч, лучше 12- 18 ч, при значени х величинь) рН 6,8- 8,0 (лучше при 7,0-7,2) и температур 20-37 0 (лучше при 25-30°С).The strain grows well in laboratory environments. No need for growth factors. The cultivation of bacteria lasts from 9 to 36 hours, better than 12 to 18 hours, with magnitudes of pH 6.8- 8.0 (better at 7.0-7.2) and temperatures of 20-37 0 (better at 25- 30 ° C).

5five

00

5five

00

5five

00

5five

00

5five

00

5five

Услови  хранени  штамма на твердых средах (МПА) под слоем стерильного вазелинового масла или в лиофйлизо- ванном состо нии.Storage conditions of the strain on solid media (MPA) under a layer of sterile vaseline oil or in a lyophilized state.

П р 1 м е р 1. Односуточные клетки бактерий С.freundiiBKHM № смывают с поверхности МПА 1-2 мл жидкой стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки перенос т в стерильную посевную жидкую среду того же состава (МПБ), начальное значение величины рН которой равно 7,0-7,2. Культуру выращивают 10-12 ч при йЗ-ЗО С в качалочных колбах емкостью 750 мл (объем среды 50 мл). Затем посевной материал в количестве 2-3 внос т в среду того же состава и выращивают в течение ч тем же способом, в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отдел ют от среды центрифугированием при 8000 об./мин в течение 10 мин.Example 1. One-day cells of bacteria C.freundiiBKHM No. were washed from the surface of MPA with 1-2 ml of sterile liquid tap water and transferred with a sterile pipette into a sterile inoculum liquid of the same composition (BCH), the initial pH value which is 7.0-7.2. The culture is grown for 10-12 hours at D3-ZO C in 750 ml rocking chair flasks (medium volume 50 ml). Then, seed in the amount of 2-3 is introduced into the medium of the same composition and grown for h in the same way, in similar rocking flasks with a medium volume of 125 ml. Cells are separated from the medium by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes.

Биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (р.Н 7,3) из расчета 6-16 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии. Определение фумарат-гидра- тазной активности клеток бактерий провод т известным способом по .количеству образовавшейс  L- блочной кис-i лоты из фумарата кали . Реакцию синтеза молочной кислоты провод т в течение 1 ч при на качалке при 175 об./мин.Biomass is suspended in 0.01 M phosphate buffer (p. H 7.3) at the rate of 6-16 mg of protein of bacteria cells in 1 ml of suspension. The determination of the fumarate hydratase activity of bacterial cells is carried out in a known manner by the amount of L-block acid formed from potassium fumarate. The lactic acid synthesis reaction is carried out for 1 hour with the rocking chair at 175 rpm.

Удельна  активность фумаразы 9 часовых клеток бактерий C.freundii 3 г равна 2,6 1U MM  блочной кислоты на мг белка за 1 с, что соответствует 97,9 от потребленного фумарата; у клеток 24-часовой культуры 3,1  блочной кислоты (99,2 от потребленного фумарата); у 48-часовой культу- . ры - 3,  блочной кислоты (98,9 от потребленного фумарата) и у 72-часовых клеток 2, , что соответствует 98,3 превращению фумарата в малат.The specific activity of fumarase of 9 clock cells of C.freundii bacteria is 3 g equal to 2.6 1U MM malic acid per mg of protein per second, which corresponds to 97.9 of the fumarate consumed; in 24-hour cell culture of 3.1 malic acid (99.2 from consumed fumarate); have a 48-hour culture. 3, block acid (98.9 from consumed fumarate) and 72-hour cells 2, which corresponds to 98.3 conversion of fumarate to malate.

Результаты сравнени  фумаратной активности штамма с известным штаммом Paracolobacter aerogenoides f 14 При инкубации целых клеток бактерий с фумаратом- кали  в течение 1 ч представлены в таблице.The results of the comparison of the fumarate activity of the strain with the known strain Paracolobacter aerogenoides f 14 When the whole cells of bacteria are incubated with fumaratomikal for 1 h, are presented in the table.

П р и м е р 2. Выращивание биомассы клеток бактерий C.freundii ВКПМ № В-4090 провод т, как описано в мере 1 в течение 12-14 ч.PRI mme R 2. The cultivation of the biomass of the cells of the bacteria C.freundii VKPM No. B-4090 is carried out as described in Measure 1 for 12-14 h.

Реакционна  Смесь дл  синтеза  блочной кислоты содержит в 1 млThe reaction mixture for the synthesis of malic acid contains in 1 ml

1,65 мг: белка клеток, либо 3,3 мг белка, либо ,95 мг белка клеток бактерий ., Опред еление фумарат-гидратаз- Ной активности провод т известным способом. Потребление фумарата от его исходного количества в реакционной смеси составл ет соответственно 52,8, 76,8 либо 79,21 с глубиной превращени  потребленного фумарата в  блочную кислоту5равной соответственно 87,2 либо 95,3, либо 99,2.1.65 mg: protein of cells, either 3.3 mg of protein, or, 95 mg of protein of bacterial cells. The determination of fumarate-hydratase activity is carried out in a known manner. The consumption of fumarate from its initial amount in the reaction mixture is 52.8, 76.8 or 79.21, respectively, with the conversion of the consumed fumarate into malic acid, equal to 87.2, or 95.3, or 99.2.

Удельна  активность фумаразы клеток C.freundii ВКПМ № в зави1523369The specific activity of fumarase cells of C.freundii VKPM No. in dependence1523369

в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, %: NayEP04 1,in a sterile synthetic medium with a pH value of 7.2, prepared in distilled water, of the following composition,%: NayEP04 1,

5 0,15; (mg,S04 0,2; MgSO,. х7Н20 0,02 CaCl2 6H O 0,01; FeS04 0,00005; , Zn+2 следы; глюкоза либо глицерин 1,0. Культуру5 0.15; (mg, S04 0.2; MgSO ,.x7H20 0.02 CaCl2 6H O 0.01; FeS04 0.00005;, Zn + 2 traces; glucose or glycerin 1.0. Culture

Q выращивают 2 ч при 28-30°С в кача- лочных-колбах емкостью 750 мл с объе мом среды 0 мл. Затем посевной материал R количестве 3-5 внос т вQ is grown for 2 hours at 28–30 ° C in 750-ml swing-flasks with a volume of 0 ml of medium. Then, seed amount R of 3-5 is added to

стерильную.жидкую среду того же сос- симости от количества белка, содержа- 5 тава в аналогичные качалочные колбы щегос  в 1 мл реакционной смеси,соот- с объемом среды 125 мл и выращивают ветственно равна либо 5,1-10, либо 3,7-10, либо 2,6-10- мИ на 1 мг белка за 1 с.sterile. liquid medium of the same proportion of the amount of protein, containing 5 similar flasks per 1 ml of the reaction mixture, corresponding to a medium volume of 125 ml and grown is either 5.1-10 or 3.7 -10, or 2.6-10-mI per 1 mg of protein per 1 second.

при той же температуре в течение 30- 48ч.at the same temperature for 30- 48h.

Клетки отдел ют от среды центрифуCells are separated from medium by centrifuge.

П р и м е р 3. Односуточные клетки 20 гированием при 8000 об,/мин в течениеPRI me R 3. One-day cells 20 girovania at 8000 rpm for

30thirty

C.freundii ВКПМ № B- j090 смывают с поверхности агаризованной (1,5 агара ) среды из ферментолизата биомассы микроорганизмов, выросших на углеводородах (3% ферментолизата БВК в во- 25 допроводной воде) 1-2 мл жидкой питательной среды того же состава и с помощью стерильной пипетки перенос т в жидкую посев ную среду того же состава (начальное значение рН 7,2). Культуру выращивают 10-12 ч при 28- 30°С в качаломных колбаХ емкостью 750 мл с объемом среды 50 мл. Затем посевной материал в количестве 2-3% внос т в среду того же состава и выращивают культуру 12-16 ч тем же способом в аналогичных качалочных колбах с объемом среды 125 мл. Клетки отдел ют от среды центрифугированием при 8000 об,/мин в течение 10 мин. ,C.freundii VKPM No. B-j090 is washed from the surface of the agar (1.5 agar) medium from the fermentolizate of the biomass of microorganisms grown on hydrocarbons (3% of the fermentolizate BVK in 25-way water) and using a sterile pipette, they are transferred to a liquid inoculum medium of the same composition (initial pH value 7.2). The culture is grown for 10–12 hours at 28–30 ° C in 750 ml capacity containers with a volume of 50 ml of medium. Then, seed in the amount of 2-3% is introduced into the medium of the same composition and the culture is grown for 12–16 h in the same way in similar rocking flasks with a medium volume of 125 ml. Cells are separated from the medium by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes. ,

Биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 (6-20 мг белка клеток бактерий в 1 мл суспензии ) и определ ют активность фумарат- гидратазы известным методом.The biomass is suspended in 0.01 M phosphate buffer pH 7.5 (6-20 mg of the protein of bacteria cells in 1 ml of suspension) and the activity of fumarate-hydratase is determined by a known method.

Удельна  активность фумаразы 12- часовых клеток бактерий C.freundii, выросших на среде в 3% ферментолизата BBKjpaBHa 2,4  блочной кислоты на 1 мг белка клеток бактерий за 1 с, что соответствует 99%-ному превращению потребленного фумарата.The specific activity of fumarase of 12-hour cells of C.freundii bacteria grown on the medium in 3% of BBKjpaBHa 2.4 malic acid fermentolizate per 1 mg of protein of bacterial cells in 1 s, which corresponds to 99% conversion of the fumarate consumed.

П р и м е р 4. Односуточные клетки бактерий C.freundii ВКПМ N В-4090 смывают с поверхности агаризованной (1,5 агара) среды МПА 1-2 мл стерильной водопроводной воды и с помощью стерильной пипетки перенос тEXAMPLE 4 One-day cells of C.freundii VKPM N-4090 bacteria were washed from the surface of an agar (1.5 agar) MPA medium. 1-2 ml of sterile tap water and transferred with a sterile pipette.

10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определ ют активность фумарат- гидротазы известным методом.10 minutes, then the biomass is suspended in 0.01 M phosphate buffer at pH 7.5 at the rate of 10–20 mg protein of bacterial cells and the activity of fumarate-hydrotase is determined by a known method.

Удельна  активность фумаразы клеток бактерий C.freundii ВКПМ В-4090, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицерином,соответственно равна 2,910 и 2,1  блочной кислоты на 1 мг клеток бактерий за 1 с.The specific activity of fumarase cells of C.freundii VKPM B-4090 bacteria grown on synthetic medium with glucose or glycerol is equal to 2.910 and 2.1 malic acid per 1 mg of bacteria cells, respectively, per 1 s.

П р и м е р 5. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПН Г В-4090- провод т либо на МПБ, как описано в примере 1 , либо на среде с 3% ферментолизата БВК, как описано в примере 3. ,PRI me R 5. Growing the biomass of the bacteria C.freundii VKPN GV-4090- is carried out either on the BCH, as described in example 1, or on a medium with 3% of fermentolizat BVK, as described in example 3.,

Исходна  удельна  фумарат-гидратаз на  активность клеток бактерий C.freundii , выросших на среде с МПБ, равн лась 8, на среде с ферментоли- затом БВК 5,7-10 мГ с .The initial specific fumarate hydratase on the activity of C.freundii bacteria cells grown on the medium with BCH equals 8, on the medium with the fermentative BVK 5.7-10 mG s.

Часть объема суспензии клеток бактерий хран т в течение 7 сут при (-4) - (6)°С в фосфатном буфере. По истечении указанного времени удельна  активность фумаразы клеток бактерий, выросших на МПБ, составл ет, 82,7%, а на среде с ферментолизатом БВК б1,4 от исходной удельной активности клеток бактерий.A portion of the volume of the bacterial cell suspension is stored for 7 days at (-4) - (6) ° C in phosphate buffer. After this time, the specific activity of the fumarase of bacteria cells grown on the BCH is 82.7%, and on the medium with the fermenolizate of BVK b1.4 from the initial specific activity of the bacterial cells.

Другую пблоаину объема суспензии клеток бактерий C.freundii хран т в течение 7 сут, при (-4) - (6) С в растворе фумарата. По истечении указанного времени удельна  ферментативна  активность клеток, выросших на МПБ, составл ет 108,6, а на среде с фер40Another pbloain volume of the cell suspension of bacteria C.freundii is stored for 7 days, at (-4) - (6) C in the fumarate solution. After this time, the specific enzymatic activity of cells grown on the BCH is 108.6, and on the medium with fer40

5555

акз- но т1523369Share t1523369

в стерильную синтетическую среду со значением величины рН 7,2, приготовленную на дистиллированной воде,следующего состава, %: NayEP04 1,in a sterile synthetic medium with a pH value of 7.2, prepared in distilled water, of the following composition,%: NayEP04 1,

0,15; (mg,S04 0,2; MgSO,. х7Н20 0,02 CaCl2 6H O 0,01; FeS04 0,00005; , Zn+2 следы; глюкоза либо глицерин 1,0. Культуру 0.15; (mg, S04 0.2; MgSO ,.x7H20 0.02 CaCl2 6H O 0.01; FeS04 0.00005;, Zn + 2 traces; glucose or glycerin 1.0. Culture

выращивают 2 ч при 28-30°С в кача- лочных-колбах емкостью 750 мл с объемом среды 0 мл. Затем посевной материал R количестве 3-5 внос т вThey are grown for 2 hours at 28–30 ° C in 750-ml swirl flasks with a medium volume of 0 ml. Then, seed amount R of 3-5 is added to

стерильную.жидкую среду того же сос- тава в аналогичные качалочные колбы с объемом среды 125 мл и выращивают sterile. liquid medium of the same composition in the same rocking flasks with a medium volume of 125 ml and grown

при той же температуре в течение 30- 48ч.at the same temperature for 30- 48h.

Клетки отдел ют от среды центрифу0Cells are separated from medium by centrifuge.

5 five

10 мин, затем биомассу суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере при рН 7,5 из расчета 10-20 мг белка клеток бактерий и определ ют активность фумарат- гидротазы известным методом.10 minutes, then the biomass is suspended in 0.01 M phosphate buffer at pH 7.5 at the rate of 10–20 mg protein of bacterial cells and the activity of fumarate-hydrotase is determined by a known method.

Удельна  активность фумаразы клеток бактерий C.freundii ВКПМ В-4090, выросших на синтетической среде с глюкозой либо с глицерином,соответственно равна 2,910 и 2,1  блочной кислоты на 1 мг клеток бактерий за 1 с.The specific activity of fumarase cells of C.freundii VKPM B-4090 bacteria grown on synthetic medium with glucose or glycerol is equal to 2.910 and 2.1 malic acid per 1 mg of bacteria cells, respectively, per 1 s.

П р и м е р 5. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПН Г В-4090- провод т либо на МПБ, как описано в примере 1 , либо на среде с 3% ферментолизата БВК, как описано в примере 3. ,PRI me R 5. Growing the biomass of the bacteria C.freundii VKPN GV-4090- is carried out either on the BCH, as described in example 1, or on a medium with 3% of fermentolizat BVK, as described in example 3.,

Исходна  удельна  фумарат-гидратаз- на  активность клеток бактерий C.freundii , выросших на среде с МПБ, равн лась 8, на среде с ферментоли- затом БВК 5,7-10 мГ с .The initial specific fumarate hydratase activity of the cells of C.freundii bacteria grown on the medium with the BCH equals 8 on the medium with the fermentative BVK 5.7-10 mG s.

Часть объема суспензии клеток бактерий хран т в течение 7 сут при (-4) - (6)°С в фосфатном буфере. По истечении указанного времени удельна  активность фумаразы клеток бактерий, выросших на МПБ, составл ет, 82,7%, а на среде с ферментолизатом БВК б1,4 от исходной удельной активности клеток бактерий.A portion of the volume of the bacterial cell suspension is stored for 7 days at (-4) - (6) ° C in phosphate buffer. After this time, the specific activity of the fumarase of bacteria cells grown on the BCH is 82.7%, and on the medium with the fermenolizate of BVK b1.4 from the initial specific activity of the bacterial cells.

Другую пблоаину объема суспензии клеток бактерий C.freundii хран т в течение 7 сут, при (-4) - (6) С в растворе фумарата. По истечении указанного времени удельна  ферментативна  активность клеток, выросших на МПБ, составл ет 108,6, а на среде с фер0Another pbloain volume of the cell suspension of bacteria C.freundii is stored for 7 days, at (-4) - (6) C in the fumarate solution. After the indicated time, the specific enzymatic activity of cells grown on the BCH is 108.6, and on the medium with fer0

5five

15 15

ментолизатом БВК 98,0% от исходной удельной активности клеток бактерий.mentholizatom BVK 98.0% of the initial specific activity of bacterial cells.

П р и м е fj 6. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПМ М° В- 4090 провод т на МПБ, как описано в примере 1.Example 6. The cultivation of the biomass of C.freundii VKPM M ° B-4090 bacteria is carried out on the BCH, as described in Example 1.

Полученную суспензию клеток дел -г пополам и в однрй порции определ ют удельную активность фумарат-гидрата- зы, которую принимают за 100%.The resulting cell suspension is divided in half and in one portion determines the specific activity of fumarate hydratase, which is taken to be 100%.

Из другой порции суспензии клеток готов т биокатализатор путем иммоби- лизации нативных клеток бактерии C.freundii в каррагинан. Дл  этого 6 мл физиологического раствора (0,8S% NaCl в дистиллированной воде) помещают в стекл нный химический стакан емкостью 500 мл и добавл ют 0,35 г каррагинана. Суспензию каррагинана в физиологическом растворе оставл ют на 30-40 мин при комнатной температуре (18-22°С) дл  набухани . По истечении указанного времени суспензию I нагревают на вод ной бане до полного растворени  каррагинана (УО-ЭО С). Полученный раствор охлаждают до 5- и Добавл ют 1 мл суспензии клеток бактерий, быстро тщательно перемешивают и смесь охлаждают в течение 10 мин на лед ной бане или в морозил ке холодильника. Блок иммобилизованных клеток перенос т в стекл нный химический стакан емкостью lOO мл, содержащий 300 мл 0,3 М КС1, и выдерживают в течение 1б ч при комнатной температуре дл  увеличени  жесткости гел . По истечении указанного времен полученный блок гел  с иммобилизованными клетками бактерий протирают че- рез сито с диаметром  чеек 1 мл. do- лученные гранулы биокатализатора промывают 2-3 раза 0,05 М Фосфатным буфером с рН 7,5. Определение фумаратгидратазной активности провод т из- вестным методом по потреблению фума- рата и образованию L- блочной кис- лоты.A biocatalyst is prepared from another portion of the cell suspension by immobilizing the native cells of the C.freundii bacterium in carrageenan. To do this, 6 ml of a physiological solution (0.8S% NaCl in distilled water) are placed in a 500 ml glass beaker and 0.35 g of carrageenan is added. The suspension of carrageenan in physiological solution is left for 30-40 minutes at room temperature (18-22 ° C) for swelling. After this time, suspension I is heated in a water bath until the carrageenan is completely dissolved (PP-EO C). The resulting solution is cooled to 5 and 1 ml of the bacterial cell suspension is added, the mixture is mixed thoroughly and the mixture is cooled for 10 minutes in an ice bath or in the freezer of a refrigerator. The block of immobilized cells is transferred into a glass lOO ml glass beaker containing 300 ml of 0.3 M KCl and kept for 1 h at room temperature to increase the rigidity of the gel. After the indicated times, the obtained gel block with immobilized bacteria cells is wiped through a sieve with a cell diameter of 1 ml. The biocatalyst do-irradiated granules are washed 2-3 times with 0.05 M Phosphate buffer pH 7.5. The determination of fumarate hydratase activity is carried out by a known method for the consumption of fumarate and the formation of L-block acid.

Полученный таким образом биоката- пизатор содержал 0,8202 мг белка клеток бактерий в 1 мл реакционной смеси и про вл ет активность, равную 180 от исходной.The biocatapist obtained in this way contained 0.8202 mg of bacterial cell protein in 1 ml of the reaction mixture and exhibited an activity equal to 180 from the initial one.

При иммобилизации в каррагинан количество образовани  побочного про;When immobilized to carrageenan, the amount of formation of the side pro;

00

569569

0 0 0 0

8eight

дукта в виде L-аспарагиновой кислоты составл ет от 0-0,3 до 2,1-2,.The L-aspartic acid product is from 0-0.3 to 2.1-2.

Пример 7. Выращивание биомассы бактерий C.freundii ВКПМ № провод т на среде с ферментолизатом БВК, как описано в примере 3.Example 7. The cultivation of the biomass of the bacteria C.freundii VKPM No. is carried out on a medium with fermentolizat BVK, as described in example 3.

Полученную суспензию клеток дел т пополам и в одной порции суспензии определ ют исходную удельную фумараз- ную активность, которую принимают за 100.The resulting cell suspension is divided in half and in one portion of the suspension the initial specific fumarase activity is taken, which is taken as 100.

Из другой половины суспензии клеток бактерий готов т биокатализатор путем иммобилизации нативных клеток бактерий в-каррагинан, как описано в примере 6,A biocatalyst is prepared from the other half of the bacterial cell suspension by immobilizing the native bacterial cells in-carrageenan, as described in Example 6,

Полученный таким образом биокатализатор содержит 0,1028 мг белка в 1 мл реакционной смеси и про вл ет удельную активность, равную 290% от исходной активности нативных клеток.The biocatalyst obtained in this way contains 0.1028 mg of protein in 1 ml of the reaction mixture and exhibits a specific activity equal to 290% of the initial activity of native cells.

Форм у лай 3 обретени  Штамм бактерии Citrobacter freun-i dii ВКПМ f В- 4090 дл  биотрансформа- ции фумарата в L- блочную кислоту.Forms of barking 3 gains Strain bacteria Citrobacter freun-i dii VKPM f B-4090 for biotransformation of fumarate into L-block acid.

0 и 40 , ;  0 and 40;

;„зо; „For

0 0 0 0

5five

5five

00

Врем  инкубации клеток,ч Образование  блочной кислоты , г/л Превращение фумарата в  блочную кислоту , % Скорость трансформации фумарата в  блочную кислоту, г/л-ч- Удельна  активность , г  блочной кислоты .- сухой биомассы МИН Cell incubation time, h Formation of malic acid, g / l Conversion of fumarate to malic acid,% Speed of transformation of fumarate into malic acid, g / l-h - Specific activity, g of malic acid .- dry biomass MIN

60,960.9

7В7B

26,026.0

3939

60,960.9

5,25.2

5,875.87

0,210.21

Claims (1)

<claim-text><table border="1"> <tbody><tr><td> Параметры</td><td> С.,£геип&lt;ХЫ ВКПМ № В4090</td><td> РагасоХоЬасСег аего* §епоХс1ез № 743</td></tr> <tr><td> Время инкубации клеток,ч</td><td> 1</td><td> 5</td></tr> <tr><td> Образование яблочной кислоты, г/л</td><td> 60,9</td><td> 26,0</td></tr> <tr><td> Превращение фумарата в яблочную кислоту , %</td><td> 78</td><td> 39</td></tr> <tr><td> Скорость трансформации фумарата в яблочную кислоту, г/л - ч*¹</td><td> 60,9</td><td> 5,2</td></tr> <tr><td> Удельная активность, г яблочной кислоты-· Г"’ сухой биомассы ‘Мин'^1,</td><td> 5,87</td><td> 0,21</td></tr> </tbody></table><claim-text> <table border = "1"> <tbody> <tr> <td> Parameters </ td> <td> C., £ geip &lt; XY VKPM № B4090 </ td> <td> RagasoHoSeg Aego * §EnocSec No. 743 </ td> </ tr> <tr> <td> Cell incubation time, h </ td> <td> 1 </ td> <td> 5 </ td> </ tr> <tr> <td> Formation of malic acid, g / l </ td> <td> 60.9 </ td> <td> 26.0 </ td> </ tr> <tr> <td> Conversion of fumarate to malic acid,% </ td> <td> 78 </ td> <td> 39 </ td> </ tr> <tr> <td> The rate of transformation of fumarate into malic acid, g / l - h * <sup> 1 </ sup> </ td> <td> 60.9 </ td> <td> 5.2 </ td> </ tr> <tr> <td> Specific activity, g malic acid- · G "’ dry biomass ‘Min '<sup> 1, </ sup> </ td> <td> 5.87 </ td> <td> 0.21 </ td> </ tr> </ tbody> </ table>