SK40198A3 - Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález opisuje génovú imunizáciu vhodnú na stimuláciu antigén-špecifickej imunitnej odpovede v cicavčích hostiteľoch vrátane človeka. Vynález opisuje podanie polynukleotidov viazaných na časticiach do cytoplazmy cieľových hostiteľských buniek, ktorými sú napríklad antigén prezentujúce bunky. Častice nesúce polynukleotidy kódujú antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu, ktorý sa hromadí v cytoplazme cieľových buniek. Expresia génu kódujúceho antigén vyvoláva imunitnú odpoveď špecifickú k tomuto antigénu, zahrňujúcu, ale neobmedzujúcu sa na, indukciu antigén-špecifických Tlymfocytov (CTL). Hromadenie antigénu v cytoplazme umožňuje prezentáciu antigénových peptidov na membráne pomocou endogénnych MHC proteínov I. triedy (proteíny hlavného histokompatibilného komplexu). Prezentácia antigénov cestou MHC proteínov I. triedy stimuluje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL). Špecifické CTL indukované antigénom potom cielene ničia hostiteľské bunky, ktoré antigén exprimujú, ako sú bunky nádorové či bunky infikované vírusom.

Doterajší stav techniky

Cytotoxické T-lymfocyty (CTL) sú u ľudí kritickou zložkou vyvolanej účinnej imunitnej odpovede na tumory alebo vírusové infekcie. Cytotoxické T-lymfocyty ničia neoplastické bunky alebo bunky nakazené vírusmi cestou rozpoznania antigénových peptidov predkladaných na MHC proteínoch I. triedy na povrchu zasiahnutých cieľových buniek. Tieto antigénové peptidy sú degradačnými produktmi cudzích proteínov prítomných v cytoplazme zasiahnutých buniek, ktoré sú spracované a predkladané cytotoxickým T-lymfocytom pomocou endogénnej dráhy MHC I. triedy.

Aj keď rozpoznanie cudzieho proteínu prezentovaného pomocou molekúl MHC I. triedy môže byť dostatočným signálom na rozpoznanie a deštrukciu zasiahnutej bunky pomocou cytotoxických T-lymfocytov, indukcia antigén-špecifických CTL z T-lymfocytových prekurzorov vyžaduje ešte ďalšie signály. Špecializované antigén prezentujúce bunky (APC) môžu zabezpečiť oboje, ako ligandy pre komplex antigén-MHC I. triedy, tak dodatočne signály pre fázu vyvolania imunity sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi.

Všeobecné vlastnosti APC zahrňujú expresiu proteínov MHC

I. a II. triedy a tiež expresiu stimulačných molekúl akými sú napríklad CD80 a CD86. Príklady APC zahrňujú makrofágy a dendritické bunky (vrátane kožných epidermálnych Langerhansových buniek, dermálnych dendritických buniek a dendritických buniek vyskytujúcich sa v lymfatických uzlinách a v slezine).

Pokusy o indukciu in vivo odpovede antigén-špecifických CTL imunizáciou hostitela pomocou usmrtených nádorových buniek, vírusom usmrtených buniek alebo ich proteínových častí boli väčšinou neúspešné, najmä preto, že proteíny z extracelulárnych tekutín nemohli vstúpiť do cytoplazmy a dosiahnuť tak svoju prezentáciu pomocou MHC antigénov I. triedy.

Génová imunizácia má niekolko výhodných vlastností. Existuje niekolko používaných metód génového prenosu in vivo vedúceho k transgénnej expresii. Patrí sem napríklad génový prenos sprostredkovaný retrovírusmi a adenovírusmi a priama injekcia holej DNA (prehľadný článok - pozri Krischnaw a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 521 až 522 a Pardoll a kol., 1995, Immunity 3: strana 165 až 169).

Williams a kol. (1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: strana 2726 až 2730) opísali expresiu proteínu luciferázy v intaktných epidermálnych bunkách, ktorá nasledovala po biolistickom (biobalistickom) zavedení luciferázového génu svätojánskej mušky. Do tejto štúdie neboli zahrnuté CTL, pozornosť nebola zameraná ani na usmrtenie hostiteľských buniek v procese vzniku bunkovo sprostredkovanej imunitnej odpovede.

Táng a kol. (1992, Náture 365: strana 152 až 154) využili biolistické (biobalistické) zariadenie na vytvorenie humorálnej odpovede na cudzí proteín. Do epidermálneho tkaniva myší bol zavedený gén kódujúci hGH pod kontrolou buď CMV promótora, alebo β-aktínového promótora. V myšiach, ktoré sa podrobili tomuto imunizačnému procesu, boli dokázané protilátky proti hGH. Táng a kol. však neopisujú génovú imunizáciu zameranú na bunkovo sprostredkovanú odpoveď. Taktiež neopisujú ani nenavrhujú priame využitie APC buniek na génovú imunizáciu.

Fynan a kol. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: strana 11478-11482) potvrdili výsledky Tanga a kol., keď použili plazmid obsahujúci DNA konštrukt kódujúci hemaglutinín glykoproteín chrípkového vírusu. Fynan a kol. porovnali humorálnu odpoveď vyvolanú zavedením DNA na potiahnutých zlatých časticiach do epidermy pomocou génovej pušky s ďalšími mechanizmami a zistili, že použitie biolistického (biobalistického) zariadenia viedlo k:

1. vzniku 95% ochrany proti letálnym následkom chrípkovej expozície,

2. zistilo sa, že ide o najúčinnejšiu cestu DNA imunizácie, ktorá sa ukazuje byť efektívnejšia ako postupy imunizácie pri sliznicovom, intrámuskulárnom alebo intravenóznom podaní antigénu a že

3. imunizácia vyžaduje 250 až 2500 krát menej DNA ako pri inokuláciách v štandardnom fyziologickom roztoku.

Priame využitie APC buniek na génovú imunizáciu nebolo v práci Fynana a kol. ani opísané, ani o ňom nebolo uvažované, ani nebola sledovaná imunita sprostredkovaná bunkami CTL.

Liu a jeho kolegovia (Montgomery a kol., 1993, DNA Celí Biol. 12: strana 777 až 783, Ulmer a kol., 1993, Science 259: strana 1745-1749), Donelly a kol., 1995, Náture Medicíne 1: strana 583 až 587) dokázali, že necielená nešpecifická intramuskulárna injekcia voľnej (nahej) DNA (naked DNA) indukuje u cytotoxických T-lymfocytov antigén špecifickú odpoveď na vírusové infekcie. Tieto štúdie však neopisujú cielené využitie genetického materiálu na génovú imunizáciu antigén prezentujúcich buniek.

Sun a kol. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: strana 2889 až 2893) využívajú biolistické (biobalistické) zariadenie na vyvolanie protinádorovej odpovede u myší. Autori vložili plazmidový konštrukt exprimujúci IL-6 priamo do miesta nádoru v myšiach. Expresia IL-6 vyvolávala formu cytokínovej génovej terapie nešpecifický zameranej na nádor. V práci nie je uplatnený nárok na vyvolanie špecifickej imunity k tumoru a nie je navrhnuté ani cielené využite APC buniek na génovú imunizáciu.

Kundig a kol. (1995, Science 268: strana 1343 až 1346) ukázali, že lokalizácia proteínového antigénu v lymfatických orgánoch je kritická pre indukciu antigén-špecifickej odpovede in vivo. Génová imunizácia nie je v práci opísaná.

Kovacsovics-Bankowski a Rock (1995, Science 267: strana 243 až 246) demonštrovali, že proteínový antigén, ktorý nie je normálne prezentovaný endogénnou dráhou MHC I. triedy, môže byť prijatý do cytoplazmy prostredníctvom fagozómu. Autori prišli s myšlienkou, že proteín viazaný na častice a internalizovaný vnútri fagozómu je prakticky schopný vstúpiť do cytoplazmy a byť použitý v cytoplazmovej dráhe prezentácie na antigénoch MHC

I. triedy. Kapacita vstupu funkčne intaktného genetického materiálu do cytoplazmy prostredníctvom fagozómov však nie je v práci uvedená.

Falo a kol. (1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653) ponúka in vivo podporu pre cestu antigénu z fagozómu do cytoplazmy a to tým, že ukázal, že vstup proteínového antigénu viazaného na časticiach priamo do zvierat navodí v antigénšpecifických CTL sprostredkovanú imunitu k nádoru u myší. Dokázali, že proteíny injikované priamo do zvierat in vivo môžu špecificky vstupovať cez tvorbu fagozómov do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek, ak sú podané naviazané na časticiach. Žiadne detaily týkajúce sa spôsobu génovej imunizácie však nie sú odporučené. Kapacita vstupu in vivo podávaného genetického materiálu do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek alebo ďalších typov funkčne intaktných buniek touto cestou nie je uvedená.

Pardoll a Backerleg (1995, Immunity 3: strana 165 až 169) vypracovali prehladný článok o imunológii vakcín obsahujúcich volnú DNA. Zdôraznili dôležitosť ďalšieho výskumu, aby bol objasnený a definovaný dosial neznámy mechanizmus DNA imunizácie. Zdôrazňujú najmä záver, že bude velmi dôležité spoznať mechanizmus, ktorým volná DNA aktivuje imunitnú odpoveď. Jedine takouto štúdiou je možné preukázať, že zavedenie rozumných modifikácií by mohlo maximalizovať ako kvalitatívne, tak aj kvantitatívne obmedzené možnosti tejto imunizácie.

Napriek neúspechom, spomenutým v predchádzajúcom literárnom prehlade, stále ostáva potreba vyvinúť postup génovej imunizácie, ktorý bude špecificky zameraný na taký typ buniek, ktorý bude v hostitelovi stimulovať antigén-špecifickú imunitnú odpoveď sprostredkovanú cytotoxickými T-lymfocytmi a tak umožní priamu špecifickú deštrukciu neoplastických alebo vírusmi infikovaných buniek v tele hostiteľa. Vynález opisuje riešenie oboch týchto požiadaviek.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka terapeutickej či profylaktickej génovej imunizácie cicavčích hostiteľov, ktorá zahrňuje vloženie DNA fragmentov kódujúcich antigénový proteín do cielových buniek cicavčieho hostiteľa, expresiu rekombinantných DNA fragmentov v hostiteľskej bunke a následnú prezentáciu antigénového peptidu či peptidov hostitelskou bunkou tak, že stimulujú bunkovo sprostredkovanú imunitu, humorálnu imunitu, alebo obe.

Vynález ďalej opisuje terapeutickú či profylaktickú génovú imunizáciu cicavčieho hostitela, čo zahŕňa vloženie DNA sekvencie kódujúcej antigénový proteín alebo biologicky aktívny fragment tohto proteínu do špecifickej cieľovej bunky cicavčieho hostitela. Antigénové peptidy, exprimované z DNA fragmentov, sú špecifické k postihnutej bunke a následne stimulujú produkciu k antigénu špecifických CTL, čím podporujú zničenie zasiahnutej bunky, ako je bunka neoplastická či vírusovo infikovaná bunka.

Vynález ďalej opisuje génovú imunizáciu s použitím polynukleotidov viazaných na častice, inokuláciu cicavčích hostitelov a následné preniknutie týchto častíc s transgénnymi polynukleotidmi do cytoplazmy cieľových buniek. Po pohltení touto cieľovou bunkou exprimujú polynukleotidy naviazané na častice proteín alebo biologicky aktívny fragment tohto proteínu, čím sa vytvorí vlastný antigénový peptidový fragment, ktorý je prezentovaný, na membráne cieľovej bunky pomocou endogénnej dráhy MHC I. triedy. Vlastná prezentácia antigénového peptidu alebo peptidov, ktoré sú predmetom nášho záujmu, pomocou prezentačnej dráhy MHC I. triedy stimuluje produkciu cytotoxických T-lymfocytov a tým stimuluje ničenie buniek ako sú neoplastické bunky a vírusovo infikované bunky.

Ďalej vynález opisuje spôsob in vivo terapeutickej alebo profylaktickej génovej imunizácie cicavčích hostitelov, čo zahŕňa vytvorenie DNA fragmentov, ktoré exprimujú antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu, väzbu DNA fragmentu na povrch častice, čo vytvára takzvaný polynukleotid naviazaný na častici, a dodávku tohto na častici imobilizovaného polynukleotidu do cytoplazmy cieľovej bunky cicavčieho hostiteľa, kde sa exprimovaný antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu prezentuje na membránovom povrchu spomínanej cieľovej bunky pomocou prezentačnej dráhy MHC I. triedy.

Vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu sú cicavčie hostiteľské bunky ľudského pôvodu.

V ďalších výhodných uskutočneniach vynálezu exprimuje používaný DNA fragment:

1. antigén spôsobujúci odmietnutie tumoru (Tumor Rejection Antigén, TRA) alebo antigénový proteínový fragment

2. Vírusový antigén alebo antigénový proteínový fragment

Príklady ludských TRA antigénov, ktoré môžu byť využité spôsobom podía vynálezu, zahrňujú ale neobmedzujú sa na MAGE-1, MAGE-3, Melan-A, gplOO, p53, CEA a HER2/neu. Príklady vírusových antigénov, ktoré môžu byť využité vo vynáleze, zahrňujú ale neobmedzujú sa len na HIV, gpl20, hiv, gpl60, nukleoproteín vírusu chrípky a povrchový antigén vírusu hepatitídy typu B.

Vynález ako cieľové bunky výhodne používa antigén prezentujúce bunky (APC). Výhodná je lokalizácia týchto cieľových buniek v lymfoidnom tkanive alebo schopnosť migrácie do tohto tkaniva hostiteľa.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom na časticiach s použitím mikroprojektilového bombardovacieho zariadenia.

V zvláštnom uskutočnení je cicavčí hostiteľ imunizovaný inokuláciou polynukleotidom viazaným na časticiach s použitím biolistického (biobalistického) procesu. V zvláštnom uskutočnení vynálezu je ľudský hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou biobalistického procesu tak, že tento polynukleotid vstúpi do cytoplazmy aspoň dostačujúceho počtu hostiteľských buniek. Transgénne polynukleotidy sú exprimované v biologicky účinnej koncentrácii tak, že antigénové peptidové fragmenty sú prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy a sú prezentované na membránovom povrchu hostiteľských buniek. Prezentácia vloženého antigénu na bunkových endogénnych hostiteľských membránach zvyšuje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov, ktoré ďalej cirkulujú v cicavčom organizme, výhodne potom v ľudskom hostiteľovi, a tak ničia neoplastické bunky a vírusovo infikované bunky. V špeciálnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ, vo výhodnom uskutočnení človek, imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou mikroprojektilového bombardovania tak, že polynukleotid imobilizovaný na časticiach preniká pomocou projektilu do cytoplazmy dostatočného počtu hostiteľských buniek, vrátane antigén prezentujúcich buniek. Pri bombardovaní kože môžu antigén prezentujúce bunky zahrňovať, ale neobmedzujú sa len na epidermálne Langerhansove bunky, keratinocyty alebo dermálne dendritické bunky. Ak je bombardované lymfoidné tkanivo, antigén prezentujúce bunky (APC) lymfoidného tkaniva, ktoré môžu byť zasiahnuté, zahrňujú okrem iného napríklad: reziduálne dendritické bunky, makrofágy, bunky stromy, T-lymfocyty alebo β-lymfocyty.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný časticami s naviazaným polynukleotidom, ktorý je aplikovaný priamou injikáciou, zahrňujúci, okrem iného, injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu. Častice s naviazanými nukleotidmi vstupujú do hostiteľských buniek a exprimujú sa v biologicky účinnom množstve tak, že antigénové peptidové fragmenty sú prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC triedy a sú predkladané na membránovom povrchu bunky. Prezentácia na endogénnych membránach cieľových buniek zvyšuje indukciu antigén špecifických CTL, ktoré ďalej cirkulujú v cicavčom organizme a .tak ničia antigénov I. hostiteľskej neoplastické bunky alebo bunky infikované vírusmi.

V mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu sú častice s naviazaným polynukleotidom dodané do ludského hostitela subkutánnou injekciou a sú upravené tak, aby sa uľahčil fagozómom sprostredkovaný prenos do cytoplazmy APC, tu sa exprimujú v biologicky účinnej koncentrácii. Vynález dokazuje, že priama injekcia častíc s naviazanými polynukleotidmi (polynukleotidového komplexu) cestou subkutánnej inokulácie vedie k preniknutiu tohto komplexu do cieľových antigén prezentujúcich buniek . a antigén je potom exprimovaný v lymfoidnom tkanive.

V ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje subkutánna injekcia použitá na priame nasmerovanie inokula do APC častice s naviazaným polynukleotidom kódujúcim antigén (TRA) alebo jeho biologicky aktívny fragment. Špecificky nasmerované zavedenie častíc s naviazaným polynukleotidom kódujúcim TRA týmto spôsobom umožňuje zvýšiť vstup špecifických antigénových peptidov do spracovania v prezentačnej dráhe MHC antigénov I. triedy a zabráni tak vo väčšej miere translokácii imunizačných častíc v iných ako antigén prezentujúcich bunkách (APC).

V ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje subkutánna injekcia použitá na priame nasmerovanie inokula do APC' častice s naviazaným polynukleotidom kódujúcim vírusový antigén alebo jeho biologicky aktívny fragment. Špecificky nasmerované zavedenie častíc s naviazaným polynukleotidom kódujúcim vírusový antigén týmto spôsobom umožňuje zvýšiť vstup špecifických antigénových peptidov do spracovania v prezentačnej dráhe MHC antigénov I. triedy a zabráni tak vo väčšej miere translokácii imunizačných častíc v π

iných ako antigén prezentujúcich bunkách (APC).

Odborníkom v danej oblasti je tiež známe, že častice vyrobené z rôznych materiálov, okrem iného napríklad zo zlata, železa a syntetických materiálov, môžu cez fagozóm vstúpiť do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek. Tento spôsob prenosu je vo vynáleze používaný na špecifické nasmerovanie APC.

V nasledujúcom výhodnom uskutočnení sú cicavčie hostiteľské bunky imunizované injekciou, zahrňujúco okrem iného napríklad subkutánnu injekciu, epidermálnu injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu syngénnych antigén prezentujúcich buniek (APC), ktoré na svojom povrchu prezentujú antigén, ktorý do nich bol in vitro zavedený inkubáciou s časticami s naviazaným polynukleotidom.

Častice nesúce polynukleotid môžu napríklad vstupovať do antigén prezentujúcich buniek in vitro buď bombardovaním mikroprojektilmi, alebo prostredníctvom fagozómov. Špecificky sú cicavčie hostitelské bunky imunizované časticami nesúcimi polynukleotidy in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (APC), ktoré sú potom injikované do hostiteľského organizmu. Následne po príjme antigénu antigén prezentujúcimi bunkami sa transgénne polynukleotidy exprimujú v biologicky účinnom množstve tak, aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC antigénov I. triedy a sú · predkladané na membránovom povrchu antigén prezentujúcich buniek.

Po injekcii takto pripravených antigén prezentujúcich buniek dôjde na ich endogénnych bunkových membránach k prezentácii antigénu, ktorý odštartuje indukciu antigén12 špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidných tkanivách. Antigénom indukované špecifické cytotoxické T-lymfocyty (CTL) ďalej cirkulujú v cicavčom organizme, výhodne v ľudskom hostiteľovi, a tu ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, zahrňujúcou okrem iného napríklad subkutánnu injekciu, epidermálnu injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu, obsahujúcou syngénne antigén prezentujúce bunky, ktoré boli podrobené in vitro transfekcii časticami nesúcimi polynukleotid. Cicavčí hostiteľ je pritom imunizovaný antigén prezentujúcimi bunkami, do ktorých boli transfekciou zavedené častice nesúce polynukleotid, a to tak, že častice s polynukleotidom vstúpili do APC in vitro a takto upravené antigén prezentujúce bunky (APC) sú potom injekciou vpravené do hostiteľského organizmu.

Častice nesúce polynukleotid môžu napríklad vstupovať do antigén prezentujúcich buniek in vitro buď ostreľovaním mikroprojektilmi alebo cestou využívajúcou prenos do cytoplazmy bunky cez fagozóm. Antigén prezentujúce bunky sú podrobené in vitro transfekcii antigénom, ktorý je kódovaný polynukleotidom a/alebo polynukleotidmi kódujúcimi molekulu alebo molekuly, ktoré zvyšujú účinnosť prezentačnej funkcie antigén prezentujúcich buniek. Takéto molekuly zahrňujú okrem iného napríklad cytokíny a stimulujúcich molekúl. Príklady cytokínov zahrňujú okrem iného napríklad IL-12, IL-2 a IL-4. Príklady stimulujúcich molekúl zahrňujú okrem iného napríklad antigény CD80 a CD86.

Následne po vstupe do antigén prezentujúcich, buniek sa transgénny antigén kódovaný polynukleotidom exprimuje v biologicky účinnej koncentrácii tak, že antigénové peptidové fragmenty sú spracované a prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy a sú tak predložené na membránovom povrchu antigén prezentujúcich buniek (APC).

Po injekcii takýchto APC zvyšuje prezentácia antigénu na endogénnej bunkovej membráne takejto bunky indukciu cytotoxických T-lymfocytov. K tejto indukcii potom dochádza buď priamo v mieste injekcie alebo v lymfoidnom tkanive hostiteľa. Týmto antigénom indukované špecifické cytotoxické T-lymfocyty cirkulujú v cicavčom organizme, s výhodou v ľudskom organizme, a tak ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.

Následne po vstupe do APC sa buď transgénny cytokín, alebo kostimulačná molekula, kódované polynukleotidom, exprimujú v biologicky účinnej koncentrácii tak, že vyvolajú funkciu prezentácie antigénu v APC, ktorá ďalej vyvolá indukciu antigén špecifickej odpovede, a to buď priamo v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive.

Odborníkom v danej oblasti je tiež dobre známe, že polynukleotidy môžu byť naviazané na častice zložené z rôznych materiálov, okrem iného napríklad zo zlata, železa a plastov.

Odborníkom v danom odbore je ďalej dobre známe, že môžu byť použité rôzne rekombinantné vektory na to, aby generované transgénne sekvencie boli aplikované v požadovanej forme. Výhodný vektor, ktorý je uprednostňovaný kvôli tomu, že sa s ním veľmi dobre pracuje, je DNA plazmid.

Odborníkom v danej oblasti je ďalej dobre - známe, že antigén prezentujúce bunky môžu byť získané z rôznych hostiteľských tkanív, okrem iného napríklad z kostnej drene a periférnej krvi, a že menované antigén prezentujúce bunky môžu byť po in vitro manipulácii navrátené do daného hostiteľa.

Cieľom vynálezu je terapeutická alebo profylaktická génová imunizácia proti neoplastickým bunkám.

Ďalším cieľom vynálezu je terapeutická a profylaktická génová imunizácia proti vírusovým bunkám.

Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým smerovaním častíc nesúcich polynukleotidy, ktoré kódujú gény pre TRA (antigény spôsobujúce odmietnutie tumor), do hostiteľských antigén prezentujúcich buniek umiestnených v lymfoidnom tkanive hostiteľa alebo schopných migrovať do tohto tkaniva a tak sa podieľať na vyvolaní CTL odpovede.

Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým nasmerovaním častíc nesúcich polynukleotidy, ktoré kódujú gény vírusových antigénov do hostiteľských imunitných buniek, ktoré sa podieľajú na vyvolaní CTL odpovede.

Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým nasmerovaním častíc nesúcich polynukleotidy kódujúce vírusové antigény do antigén prezentujúcich buniek umiestnených v lymfoidnom tkanive alebo schopných migrovať do tohto tkaniva a tak vyvolať CTL odpoveď.

Podrobný opis vynálezu

Termín „cicavčí hostite!,,, používaný v tomto vynáleze, , zahrňuje zástupcov živočíšnej, ríše vrátane okrem iného človeka.

Termín „DNA fragment,,, používaný v tomto vynáleze, predstavuje akúkoľvek DNA alebo RNA nukleotidovú sekvenciu, ktorá obsahuje vhodnú kódujúcu oblasť a regulačné sekvencie, ktoré indukujú v cieľovej bunke expresiu antigénového proteínu alebo fragmentu antigénového proteínu, prezentovaného na bunkovej membráne prostredníctvom endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy.

Termín „polynukleotid naviazaný na časticiach,,, používaný v tomto vynáleze, sa týka častíc vyrobených z rôznych materiálov, medzi ktoré patrí napríklad zlato, železo a syntetický plast, kde každá jednotlivá čiastočka obsahuje populáciu DNA fragmentov definovaných v predošlom odseku.

Vynález opisuje liečebnú alebo preventívnu genetickú imunizáciu cicavčieho hostiteľa, ktorá zahrňuje prenos DNA fragmentu k cieľovej bunke vnútri cicavčieho hostiteľa, expresiu tohto DNA fragmentu vnútri cieľovej bunky a následnú prezentáciu rekombinantného antigénového peptidu (rekombinantných antigénových peptidov) vnútri cieľovej bunky, čo vedie k stimulácii bunkovej či humorálnej imunity, poprípade oboch.

Vynález sa ďalej týka liečebnej alebo preventívnej génovej imunizácie cicavčieho hostiteľa, ktorá zahrňuje prenos DNA fragmentu kódujúceho proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment k špecifickej cieľovej bunke vnútri cicavčieho hostiteľa. Antigénové peptidy vznikajúce expresiou z danej DNA sekvencie sú špecifické pre pozmenené bunky, akými sú napríklad bunky nádorové alebo bunky infikované vírusom. Dochádza k aktivácii cytotoxických T-lymfocytov (CTL) špecifických pre daný antigén a následne k cytotoxickej deštrukcii cieľových buniek, ktorými môžu byť napríklad bunky nádorové či bunky infikované vírusom.

Vynález opisuje spôsob génovej imunizácie, ktorá slúži na liečbu či prevenciu nádorových ochorení či vírusových infekcií. Cytotoxické T-lymfocyty sú významnou zložkou imunitnej odpovede namierenej proti nádorom a vírusovým infekciám. Cytotoxické Tlymfocyty zabíjajú nádorové bunky a vírusom infikované bunky vďaka tomu, že dokážu rozpoznať antigénové peptidy prezentované molekulami MHC I: triedy na povrchu nádorových buniek. Tieto peptidy sú odvodené do nádorových antigénov, ktoré sú syntetizované pozmenenými bunkami a degradované v cytoplazme. Snahy indukovať nádorovo špecifické odpovede cytotoxických Tlymfocytov in vivo imunizáciou mŕtvymi nádorovými bunkami alebo ich stavebnými proteínmi bývajú spravidla neúspešné, pravdepodobne preto, že proteíny z extracelulárnej tekutiny nemôžu vstúpiť do cytoplazmy a nemajú teda možnosť byť prezentované prostredníctvom molekúl MHC I. triedy.

Špecifické uskutočnenie predkladaného vynálezu je spojené s genetickou imunizáciou pomocou častíc obsahujúcich DNA fragment, ktorého expresiou vzniká požadovaný protein. Takéto častice obsahujúce fragment DNA sú v ďalšom texte uvádzané ako „polynukleotid naviazaný na časticiach,,. V in vivo uskutočnení vynálezu sa ako najlepšie javí dodanie DNA fragmentu alebo požadovanej proteínovej častice do cieľovej hostiteľskej bunky v zloženej forme, napr. ako poťahované guľôčky alebo zlaté častice. Následne po podaní do cytoplazmy cieľovej hostiteľskej bunky je protein či biologicky aktívny fragment tohto proteínu touto bunkou exprimovaný. Exprimovaný proteín či proteínový fragment špecifický pre pozmenenú bunku poskytuje substrát na vytvorenie antigénového peptidu (antigénových peptidov) predkladaného T-lymfocytom prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy. Príslušná prezentácia požadovaného antigénového peptidu či antigénových peptidov prostredníctvom MHC molekúl I. triedy stimuluje produkciu cytotoxických látok T-lymfocytmi a tak zvyšuje deštrukciu pozmenených buniek.

Vynález je založený na predpoklade, že DNA fragment exprimujúci TRA antigén alebo vírusový antigén alebo ich aktívne fragmenty môže byť špecificky nasmerovaný do cieľovej bunky a tu vyvolať kaskádu pochodov vedúcich k protinádorovej imunite sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi. Predkladaný vynález objasňuje indukciu imunity sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi transfekciou cieľovej hostiteľskej bunky časticou obsahujúcou fragment DNA, ktorý kóduje antigénový proteín. Imunizujúci proteín je produkovaný intracelulárne a má teda prístup k MHC molekulám I. triedy. Výsledkom sú prirodzene spracované epitopy a transfekované bunky môžu. produkovať imunizujúci proteín po dobu niekoľkých dni, čím je potenciálne umožnená vyššia imunogénna stimulácia.

V špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou bombardovania mikroprojektilom. Toto nešpecifické bombardovanie je uskutočnené, tak, aby jeho výsledkom bol vstup polynukleotidu naviazaného na časticiach do cytoplazmy dostatočného počtu hostiteľských buniek. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu medzi tieto hostiteľské bunky patria antigén prezentujúce bunky (APC), vynález však nie je obmedzený len na ne. V prípade bombardovania kože patria medzi APC, ktoré môžu byť zasiahnuté bombardovaním epidermálne Langerhansove bunky, keratinocyty alebo kožné dendritické bunky. V prípade bombardovania lymfoidného tkaniva patria medzi antigén prezentujúce bunky, ktoré môžu byť zasiahnuté bombardovaním dendritické bunky, makrofágy, bunky strómy, T-lymfocyty alebo B-lymfocyty. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnom množstve, takže je peptidových fragmentov zaistené spracovanie antigénových a ich prezentácia prostredníctvom endogénnych MHC molekúl I. triedy na membránach APC buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne APC podporuje indukciu antigén špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania alebo v lymfoidnom tkanive, kam sú bombardované bunky prenesené. Indukované antigén špecifické CTL cirkulujú v čelom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu v ľudskom, hostiteľovi s cieľom zničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.

Imunizácia cicavčieho hostiteľa polynukleotidom naviazaným na časticiach môže byť uskutočnená pomocou biolistického (biobalistického) podania tak, že polynukleotid naviazaný na časticiach vstupuje do hostiteľských buniek, medzi ktoré patrí APC, prostredníctvom fagozómov. Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú prostredníctvom fagozómov do buniek buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste bombardovania (v koži či v lymfoidnom tkanive). Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostiteľskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické cytotoxické T-lymfocyty cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cieľom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.

V inom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou injekcie. Môž ísť napríklad o injekciu subkutánnu, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú či intravenóznu. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po vstupe do hostiteľských buniek exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čim je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov a ich prezentácia prostredníctvom endogénnych MHC molekúl I. triedy na membránach APC buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne APC podporuje indukciu antigén-špecifických T-lymfocytov, ktoré cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľovi s cieľom zničiť nádorové bunky či bunky infikované.vírusom.

Cicavčí hostiteľ môže byť imunizovaný tak, že polynukleotid naviazaný na časticiach špecificky vstúpi do hostiteľských buniek, vrátane APC, prostredníctvom fagozómov. Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú do hostiteľských buniek prostredníctvom fagozómov buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste injekcie. Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostitelskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické CTL cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cielom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.

V inom uskutočnení tohto vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou injekcie. Môže ísť napríklad o injekciu subkutánnu, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú či intravenóznu. Zloženie polynukleotidu naviazaného na časticiach je navrhnuté tak, aby v ňom boli obsiahnuté špecifické molekuly, ktoré zaistia ľahkú fagocytózu (t.j. napríklad prostredníctvom receptorov pre manózu či. prostredníctvom Fc receptorov),alebo tak, aby uľahčovalo prístup častice k cytoplazme (t.j. napríklad pomocou membránových fúznych proteínov, akými sú napríklad vírusový HA proteín či proteín lysterolyzín) . Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú do hostiteľských buniek prostredníctvom fagozómov buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste injekcie. Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostitelskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigénšpecifické CTL cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cieľom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.

Vynález je priblížený niekoľkými príkladmi využívajúcimi myší model podrobne opísaný v príklade 2. Hlavným obmedzením pri štúdiu antigén-špecifickej nádorovej imunity na myšom modeli je absencia jednotného tumorového antigénu, ktorý by bol rozoznávaný CTL spolupracujúcimi s MHC I. triedy. Vzhľadom k tomu, že TRA nie sú nijako principiálne odlišné od ďalších bunkových proteínov až na skutočnosť, že hostiteľ k nim nie je tolerantný, možno na rovnaký účel použiť cudzí antigén syntetizovaný nádorom. Spôsoby nádorovej imunizácie podľa vynálezu sú veľmi uľahčené použitím myšieho melanómového modelu s definovaným endogénne syntetizovaným TRA, ktorým je gén pre OVA transfekovaný do melanómu BI6 odvodenému z myšej línie C57B1/6. Tento systém je výhodný z niekoľkých dôvodov: (1) melanóm BI6 je veľmi dobre preštudovaný myší nádor, (2) rastové charakteristiky in vivo a schopnosť metastázovať sú u tohto nádoru veľmi dobre známe, (3) ovalbumín má tiež dobre definovanú štruktúru. Spôsob spracovania a prezentácie OVA v bunkách myšej línie C57BL/6 je tiež dobre známy. Je dokonca známa štruktúra spracovaného peptidu prezentovaného pomocou MHC

I. triedy K^b. Tiež sú známe spôsoby stanovenia funkčnej expresie ovalbumínového peptidu (SIINFEKL) asociovaného s H2K^b využívajúce T-T hybridom 33.70.AI anti-OVA-K^b, pozri Kovacovics-Bankowski a kol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: strana 4942 až 4946). Spôsoby stanovenia in vivo indukcie cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou proti OVA sú v tomto systéme tiež dobre opísané (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785).

Jedno z uskutočnení vynálezu je imunizácia zvoleným polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou biolistického (biobalistického) zariadenia. Cicavčí hostite! je biobalisticky imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach tak, že prijatie tohto polynukleotidu v transfekovaných bunkách vyvolá sériu biologických udalostí, ktoré vedú k vzniku ochrannej imunity proti smrteľnému nádorovému ochoreniu. Vynález je niekoľkokrát opísaný na príklade kožného podania antigénu pomocou biobalistického zariadenia. Po prvé, preniknutie polynukleotidu naviazaného na časticiach a kódujúceho cudzorodý proteín β-gal vedie k expresii proteínu β-gal ako v epiderme tak aj v lymfatických uzlinách. Taktiež imunizácia pomocou OVA vedie k indukcii cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou k ovalbumínu. Po tretie, pri použití modelu OVA B-16 bolo preukázané, že zvieratá imunizované pomocou OVA sú chránené prd vznikom nádoru exprimujúceho OVA proteín a táto ochrana je antigénovo špecifická a závislá na CTL. Mechanizmus tejto ochrany je zložitejší ako kožné podanie na časticiach polynukleotidov viazaných na časticiach pomocou biobalistického zariadenia. Na indukciu antigén špecifických CTL z ich prekurzorov je nevyhnutné špecifické zamierenie polynukleotidu na fygocytujúce APC a/alebo expresia antigénu v lymfoidnom tkanive. Preto vo výhodnom uskutočnení vynálezu je cieľovou bunkou fagocytujúca APC a výhodne APC umiestnená v lymfoidnom tkanive alebo APC, ktorá do neho môže migrovať.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný priamo injikovaným polynukleotidom naviazaným na časticiach, pričom injekčné podanie zahrňuje okrem iného napríklad podkožnú, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú a intravenóznu injekciu. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnej koncentrácii tak, aby fragmenty antigénových peptidov boli produkované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchu APC buniek.

Prezentácia na bunkovej membráne APC urýchli indukciu antigénovo špecifických cytotoxických T-lymfocytov, ktoré obiehajú v tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudského hostiteľa a ničia nádorové alebo vírusovo infikované bunky.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú cieľové cicavčie bunky imunizované pomocou priamej injekcie polynukleotidov naviazaných na časticiach fagocytujúcej APC. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnej koncentrácii, takže antigénové peptidové fragmenty sú prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchu membrány antigén prezentujúcich buniek (APC). Prezentácia na bunkovej membráne APC spustí a zosilní indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL), ktoré sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa a ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je polynukleotid viazaný na časticiach ľudskému hostiteľovi podaný formou podkožnej injekcie. Vynález opisuje skutočnosť, že priama injekcia komplexu polynukleotidu naviazaného na časticiach vedie k cielenému dodaniu fagocytujúcej APC a génovej expresii v lymfoidnom tkanive. Toto cielené dodanie fagocytujúcim antigén prezentujúcim bunkám a/alebo táto génová expresia v lymfoidnom tkanive po subkutánnom podaní má za následok výrazne vyššiu indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL) z naivných prekurzorov.

Vynález teda hlavne opisuje DNA fragmenty kódujúce proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment, ktorý je schopný vstúpiť do antigén prezentujúcich buniek a byť v týchto bunkách exprímovaný. Požadovaný antigén je exprímovaný v cytoplazme APC a potom ďalej spracovaný dráhou MHC I. triedy, čo umožní týmto antigén prezentujúcim bunkám podieľať sa na indukcii antigén-špecifických CTL. Údaje uvedené v tomto opise podporujú nový predpoklad, že najúčinnejším spôsobom ako indukovať takéto antigén-špecifické cytotoxické T-lymfocyty je priamy prenos genetického materiálu do antigén prezentujúcich buniek APC schopných prejsť do lymfoidného tkaniva.

V ďalšom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekcie obsahujúcej syngénne APC prezentujúce antigén získaný po in vitro aplikácii polynukleotidu viazaného na časticiach. V zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou APC, ktoré boli transfekované polynukleotidom viazaným na časticiach tak, aby tento polynukleotid bol APC bunkami prijatý in vitro a tieto antigén prezentujúce bunky sú potom injikované hostitelovi. Po vstupe transgénneho polynukleotidu do APC je tento exprímovaný za dosiahnutia biologicky účinnej koncentrácie .tak aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení ľudského hostiteľa, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.

V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej lymfatickej a intravenóznej injekcie, obsahujúcou syngénne APC prezentujúce antigén získaný in vitro spoločnou inkubáciou s polynukleotidom viazaným na časticiach. Vo zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou - APC, ktoré boli transfekované polynukleotidom viazaným na polynukleotid bol prijatý časticiach tak, aby tento do cytoplazmy APC buniek prostredníctvom fagozómov a tieto antigén prezentujúce bunky sú potom injikované hostiteľovi. Po vstupe transgénneho polynukleotidu do APC je tento exprimovaný za dosiahnutia biologicky účinnej koncentrácie tak aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigénšpecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení ľudského hostiteľa, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.

V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekcie, obsahujúcou syngénne APC prezentujúce antigén získaný in vitro pomocou polynukleotidu viazaného na časticiach. V tomto zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou APC, ktoré boli transfekované in vitro bombardovaním mikroprojektilmi obsahujúcimi polynukleotid viazaný na časticiach. Po tejto expozícii mikroprojektilom s transgénnym polynukleotidom exprimujú tieto antigén prezentujúce bunky požadovaný antigén v biologicky účinnej koncentrácii tak, aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostitela, vo výhodnom uskutočnení ludského hostitela, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.

injikované hostitelovi. polynukleotidy vniknú časticiach viazané buď bombardovaním

V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostitel imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekciu, obsahujúcou syngénne APC transfekované in vito polynukleotidom viazaným na časticiach. V tomto zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostitel imunizovaný pomocou APC, ktoré boli in vitro transfekované tak, že do nich bol in vito vpravený polynukleotid viazaný na časticiach a potom sú tieto APC Tieto na do bunky mikroprojektilmi alebo prostredníctvom fagozómov. APC bunky sa in vito transfekujú polynukleotidmi, ktoré kódujú antigén a/alebo molekulu alebo molekuly, ktoré zvyšujú účinnosť prezentácie antigénu na povrchu APC. Takýmito molekulami sú okrem iného napríklad cytokíny ako sú IL-12, IL-2 a/alebo IL-4 a/alebo kostimulačné molekuly ako sú CD80 a/alebo CD86. Po vstupe do antigén prezentujúcej bunky sú tieto polynukleotidy kódujúce transgénne antigény exprimované tak, aby bola dosiahnutá biologicky účinná koncentrácia a peptidové. fragmenty týchto antigénov mohli byť spracované a prezentované cez endogénnu dráhu MHC I. triedy na povrchovej membráne APC. Po injekcii takýchto antigén prezentujúcich buniek a prezentácii antigénu na ich bunkových membránach dôjde k zosilneniu indukcie antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL) buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostitela, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ludského hostitela, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky. Polynukleotidy kódujúce transgénne cytokíny a/alebo kostimulačné faktory sú po vstupe do APC tiež exprimované do takej miery, aby ich koncentrácia bola biologicky účinná a teda aby prezentácia antigénu na povrchu APC viedla k vyvolaniu antigén-špecifickej imunitnej odpovede buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive.

Odborník dokáže vložiť antigén spôsobujúci odmietnutie nádoru (TRA) alebo lubovolný vírusový antigén do systému podlá vynálezu. Príklady v súčasnosti dostupných TRA zahrňujú okrem iného napríklad MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, tyrozináza, Melan-A (MART-1), gplOO (pmell7), gp 75 (TRPÍ), CEA (karcino embryonálny antigén), ako aj antigény z tumorov spôsobených vírusmi HPV, HBV a EBV, ako aj onkogény asociované s tumormi/antigény kódované mutovanými génmi pre supresory tumorov, ako napríklad p53, pl6, RAS, HER2/neu, C-ABL a polymorfné antigény endoteliálneho mucínu (pozri súhrnný článok Maeuer a kol., 1996, Cancer Vaccines v Clinical Immunology Principles and ‘ Practice, nakladateľstvo Mosby, kapitola 123, strana 1904 až 1918 a Van den Eydne a kol., 1995, J. Exp. Med. 182: strana 689 až 698). Príklady dostupných prístupných vírusových antigénov zahrňujú okrem iného napríklad nukleoproteín vírusu chrípky (Donelly a kol, 1995, Náture Med. 1: strana 583 až 587), HIV gpl20, HIVgpl60 a povrchový antigén vírusu hepatitídy B (pozri súhrnný článok Pardoll a

Beckerleg,1995, Immmunity 3: strana 165 až 169).

Odborníkom v odbore je známe, že na konštrukciu rekombinantného vektoru môže byť použitý ľubovoľný dostupný eukaryotický promótor a/alebo enhancer schopný zosilniť expresiu transgénnej sekvencie DNA spolu s ľubovoľnou časticou za vzniku polynukleotidu viazaného na časticiach podľa vynálezu. Medzi takéto fragmenty promótorových sekvencií patrí okrem iného napríklad promótor cytomegalovírusu (CMV), promótor vírusu Rousovho sarkómu .(RSV), promótor vírusu myšej leukémie (MLV), promótor β-aktínu ako aj ľubovoľný bunkovo špecifický promótor alebo enhancer, o ktorom je známe, že je v cieľovej bunke aktívny.

Výhodným uskutočnením vynálezu je použitie DNA viazanej na časticiach na dopravu nukleovej kyseliny kódujúcej tumorový alebo vírusový antigén špecificky do APC v lymfoidnom tkanive, alebo do antigén prezentujúcich buniek schopných vstúpiť do lymfoidného tkaniva tak, aby došlo k stimulácii antigénšpecifických CTL. Tieto cytotoxické T-lymfocyty sú potom rozvádzané do tela hostiteľa a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.

Protinádorová imunita založená na výhodnom spôsobe použitia subkutánnej injekcie indukujúcej špecifickú odpoveď v antigén prezentujúcich bunkách lymfatických uzlín je opísaná v príkladoch 1, 2 a 3. Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu uskutočnenia vynálezu a nie sú v žiadnom prípade obmedzujúce.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje funkčnú prezentáciu ovalbumínu transfekovanými nádorovými bunkami línií M04 a EG7. Mikrokultúry boli pripravené z T-lymfocytov hybridómu RF33.70 (anti-OVA + K^b) a uvedeného množstva netransfekovaných (krúžky) (prázdne symboly) alebo transfekovaných (štvorčeky) a nádorových buniek v prítomnosti neprítomnosti (vyplnené symboly) dodaného exogénneho ovalbumínového peptidu SIINFEKL (10 ng/ml), pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45: strana 804 až 811. Po 18 hodinovej inkubácii boli odobraté supernatanty a bol v nich stanovený IL-2 ' pomocou indikátorovej bunkovej línie HT2 (pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45: strana 804 až 811). Obrázok A znázorňuje bunkovú líniu B16 a ovalbumínom transfekovaný subklon MO4, obrázok B potom líniu EL4 a ovalbumínom transfekovaný subklon EG7. Prezentácia ovalbumínových (OVA)peptidov transfekovanými nádorovými bunkami nebola významne zvýšená v prítomnosti exogénneho peptidu SIINFEKL v testovaných kultúrach.

Na vodorovných osiach sú uvedené počty APC, na zvislých osiach CPMxlO^-3.

Obrázok 2 ukazuje, že expresia ovalbumínu OVA bunkami melanómu MO4 odvodeného od línie BI6 neovplyvňuje in vivo rast nádorov alebo prežitie hostiteľa po podaní nádorových buniek. Myšiam boli intradermálne podané nádorové bunky M04 (krúžky) alebo B16 (štvorčeky) a dávka predstavovala 5xl0⁴ na myš do stredu oboch slabín. Velkosť nádoru (obrázok 2A) bola zisťovaná 3 krát týždenne a je vyjadrená ako priemerná plocha tumoru v milimetroch štvorcových ' (zvislá os)do doby, kým došlo k prvému úmrtiu v každej skupine. Prežitie (obrázok 2B) bolo zaznamenávané ako percento prežívajúcich zvierat a je uvedené na zvislej osi. Na vodorovnej osi sú v oboch prípadoch uvedené dni od poslednej imunizácie. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat a boli vždy tri krát opakované. Smrteľne choré myši boli usmrtené.

Obrázok 3 ukazuje, že imunizácia po kožnom podaní DNA kódujúcej OVA vyvoláva OVA špecifické cytotoxické T-lymfocyty a antigén špecifickú CTL sprostredkovanú ochranu pred inak smrteľným melanómom MO4, ktorý na svojom povrchu exprimuje OVA. Bunky sleziny opätovne imunizované in vitro po odobratí z OVAimunizovaných myší (génovo imunizované myši, pozri príklad 2) boli testované na svoju cytolytickú funkciu proti OVAtransfekovanému lymfómu EG7 (vyplnené štvorčeky) alebo proti netransfekovanému rodičovskému lymfómu EL4 (prázdne trojuholníky) (A) . Populácia efektorových buniek bola inkubovaná so samotným komplementom (prázdne štvorčeky) alebo s monoklonálnymi protilátkami proti CD4⁺ (vyplnené trojuholníky), CD8⁺ (prázdne trojuholníky) alebo Thyl.2⁺ (vyplnené krúžky) lymfocytom a s komplementom a potom bola stanovená ich cytolytická aktivita proti cieľovým bunkám nádorovej línie EG7.

Na vodorovnej osi je uvedený pomer E/T buniek, na zvislej osi je % špecifickej lýzy. Myši na obrázkoch C až F boli génovo imunizované OVA (vyplnené štvorčeky) alebo pomocou lacZ (prázdne krúžky). Ďalšia imunizácia bola vykonaná po 7 dňoch. 7 dní po poslednej imunizácii (tá prebehla v dni 0) boli myši exponované dávke buď melanómu B16 (D), alebo jeho OVA expr imu j úceho subklonu MO4 (C). Prípadne boli myši rozdelené do dvoch skupín z ktorých jedna bola zbavená lymfocytov CD8⁺ pomocou intraperitoneálnej injekcie monoklonálnej protilátky anti-CD8 7 a 9 dní po poslednej imunizácii. Intaktné myši (E) a myši zbavené lymfocytov CD8* boli 10. deň po poslednej imunizácii exponované dávke MO4. Prežitie je vyjadrené ako percento prežívajúcich zvierat (C až F). U zvierat, ktoré prežili 60. deň neboli pozorované žiadne známky tumoru. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat a boli vždy tri krát opakované. Smrtelne choré myši boli usmrtené v súlade s predpismi o starostlivosti o laboratórne zvieratá. Údaje na vodorovných časových osiach sú udávané v dňoch, na zvislých osiach v percentách prežívajúcich zvierat.

Obrázok 4 ukazuje, že antigén prezentujúce bunky internalizujú a potom exprimujú polynukleotidy naviazané na časticiach. Exprimovaný antigén je týmito bunkami spracovaný a prezentovaný dráhou MHC I. triedy. Dendritické bunky boli pripravené oddelením lymfocytov od kostnej drene a jej kultiváciou cez noc v médiu RPMI 1640 doplnenom 10% FCS (fetálne telacie sérum), L-glutamín, antibiotiká a 2-merkaptoetanol v 24 jamkových doskách s koncentráciou 10⁶ buniek na jamku. Po jednom dni boli bunky pri koncentrácii 2,5xl0⁵ buniek na jamku doplnené o GM-CSF (10³ U/ml, Sigma St. Luis, MO) a myší fIL-4 (10³ U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) . Volne adherujúce bunky boli odobraté 8. deň kultivácie. Prietokovou cytometriou bolo stanovené, že tieto dendritické bunky exprimujú antigény CD45, CD44, CDllb (Mac-1), CD18, CD80, CD86 a antigény MHC I. a II.

triedy. Dendritické bunky boli potom pulzované 2 hodiny pri 37^eC za a bez prítomnosti peptidu OVA (20 ng/ml) + β2-mikroglobínu ,(Iudský β2-Μ, 10 μΐ/ml, Sigma) v redukovanom sérovom médiu (Optimen, Gibco, Grand Island, NY) . Bunky boli potom dôkladne premyté v PBS a ožiarené (2000 rad) a injikované do natívnych myší. Uvedený počet dendritických APC buniek odvodených z kostnej drene bol spoločne kultivovaný s OVA kódujúcimi polynukleotidmi naviazanými na časticiach (ich príprava - pozri príklad 2) (50 μΙ/ml/lO⁶ buniek preparátu obsahujúceho 7 mg častíc na ml). Ako substrát na väzbu nukleotidov boli použité buď železné gulôčky (vyplnené štvorčeky) alebo zlaté guľôčky (vyplnené krúžky) alebo bol použitý rozpustný proteín OVA 2 mg/ml, prázdne štvorčeky). Inkubácia trvala 24 hodín, potom boli bunky APC premyté a uvedené množstvo APC bolo spoločne kultivované v mikrokultúre s T-lymfocytmi z hybridómu RF33.70 (anti OVA +K^b) . Po 18 hodinách inkubácie boli odobraté supernatanty a bol v nich stanovený IL-2 pomocou indikátorovej bunkovej línie HT2 (pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45, strana 804 až 811) .

Obrázok 5 znázorňuje porovnanie imunizácie pomocou polynukleotidov naviazaných na časticiach pri biobalistickom podaní a pri subkutánnej injekcii. Skupiny 5 myší línie C57B1/6 boli imunizované a po 7 dňoch bola dávka zopakovaná. Potom boli exponované intradermálnej injekcii 5xl0⁵ M05 nádorových buniek do každej slabiny o ďalších 7 dní neskôr. Imunizačné dávky obsahovali: (A) polynukleotid kódujúci β-gal naviazaný na časticiach, pripravený a biobalisticky aplikovaný podľa spôsobu opísaného v príklade 2; (B) polynukleotid kódujúci OVA naviazaný na časticiach, pripravený a biobalisticky aplikovaný podľa spôsobu opísaného v príklade 2; (C) zvýšené množstvo polynukleotidu kódujúceho OVA bez podporných častíc aplikovaný subkutánnou injekciou; (D) ekvivalentné množstvo polynukleotidu kódujúceho OVA, ktorý bol pripravený spôsobom podlá príkladu 2, ale bol aplikovaný subkutánnou injekciou. Znázornené údaje udávajú % zvierat v každej skupine, ktoré boli bez nádoru po 50 dňoch od expozície.

Obrázok 6 znázorňuje imunizáciu pomocou APC spoločne inkubovaných s polynukleotidom kódujúcim OVA naviazaným na časticiach. Takáto imunizácia chráni zvieratá pred melanómom línie MO5, ktorý na povrchu exprimuje OVA peptidy. Skupiny myší C57B1/6 boli jednorázovo subkutánne imunizované rovnako ako bolo uvedené pri obrázku 5 a potom boli exponované dávke 10⁵ nádorových buniek MO5 do každej slabiny 10 dní po imunizácii. Imunizačné dávky obsahovali: kontrolný polynukleotid kódujúci βgal naviazaný na časticiach (prázdne štvorčeky), 100 μΐ časticového roztoku s koncentráciou 7 mg/ml bolo aplikovaných do každej zadnej končatiny; rozpustný pAC-Neo-OVA (100 μΐ do každej zadnej končatiny, bol zachovaný približne rovnaký pomer DNA/zviera, prázdne krúžky); alebo 5xl0⁴ dendritických buniek odvodených z kostnej drene (vyplnené štvorčeky), opäť bolo aplikované 100 μΐ na jednu zadnú končatinu zvieraťa. Prežitie je vyjadrené ako percento prežívajúcich zvierat. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat. Smrteľne choré myši boli usmrtené v súlade s predpismi o starostlivosti o laboratórne zvieratá. Údaje na vodorovnej časovej osi sú v dňoch, údaje na zvislej osi v percentách prežívajúcich zvierat.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Model založený na myšom nádore OVA/B16

Myší model OVA/B16 sa použil na získanie údajov uvedených v príkladoch 2 a 3. Atraktivita myšieho systému OVA/B16 spočíva v niekoľkých skutočnostiach: (1) melanóm B16 je dobre preštudovaný myší nádor, (2) rastové vlastnosti a schopnosti metastázovať in vivo sú u tejto nádorovej línie dobre charakterizované a (3) štruktúra ovalbumínu je dobre definovaná. Spôsob spracovania a prezentácie AVA v bunkách myšej línie C57BL/6 je tiež dobre známy. Je dokonca známa štruktúra spracovávaného peptidu prezentovaného pomocou MHC I. triedy K^b. Rovnako sú známe spôsoby stanovenia funkčnej expresie ovalbumínového peptidu (SIINFEKL) asociovaného s H2- K^b využívajúci T-T hybridom 33.70.AI anti-OVA-K^b (pozri KovacovicsBankowski a kol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: strana 4942·až 4946). Spôsoby stanovenia in vivo indukcie cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou proti OVA sú v tomto systéme taktiež dobre opísané (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785).

Myšie a bunkové línie. Od Jackson Laboratoires, Bar Harbor, ME sa zakúpili 5 až 8 týždňov staré samičky myší C57BL/6. Línia EL4 je C57BL/6 T-lymfóm a línia EG7 je subklonom EL4 transfekovaným ovalbumínom z kuracích vajec (OVA), pozri Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785. Myší melanóm B16 odvodený od myšej línie C57BL/6 sa získal z Americkej zbierky tkanív (ATCC) (pozri Fidler a kol., 1976, Cancer Res. 36: strana 3160 až 3165). MO4 bol skonštruovaný transfekciou línie B16 plazmidom pAc-Nco-OVA ( pozri Falo a kol., Náture Med. 1: strana 649 až 653, Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785). Monoklonálne protilátky sa pripravili z hybridómov GK1.5 (antiCD4, ATCC TIB-207), 2.43 (anti-CD8 pripravené po imunizácii myší Balb/c nu/nu pomocou i.p. injekcie buniek GKfl.5 (2xl0⁶)a IFA (0, 5 ml/myš) .

Subklon MO4 sa izoloval po transfekcii melanómu BI6 pomocou OVA a následnej selekcii. Ako rodičovská melanómová línia BI6, tak aj OVA transfekovaná línia exprimujú podobné množstvo funkčného determinantu K^b na bunkovom povrchu, čo sa určilo z prezentácie peptidu odvodeného od OVA (SIINFEKL) Tlymfocytom línie RF33.70 (pozri obrázok 1) . Línia MO4/5 je schopná stimulovať bunky hybridómu aj v neprítomnosti z vonku pridaného peptidu (pozri obrázok 1), zatiaľ čo rodičovská línia BI6 nie. To dokazuje endogénnu produkciu, spracovanie a prezentáciu transfekovaného antigénu. Je dôležité poznamenať, že endogénna expresia OVA v bunkách línie M04 významne nezmenila in vivo imunogenitu nádoru (pozri obrázok 2) . Rast nádorov (pozri obrázok 2A) BI6 M04 je v naivných myšiach porovnateľný, tak ako je porovnateľné aj prežitie hostiteľských zvierat (pozri obrázok 2B) .

Príklad 2: Génová imunizácia pomocou biolistického (biobalistického) podania

Lokalizovanie expresie cudzorodých génov: Vzorky tkanív (pokožka alebo tekutina odsatá z lymfatických uzlín) sa odobrali 24 až 48 hodín po imunizácii, premyté a fixované v 2% formaldehyde - 0,2% glutaraldehyde v PBS (phosphate buffered saline - fosfátom pufrovaný fyziologický roztok) počas 30 minút a pri teplote 4°C. Fixované vzorky boli potom dôkladne premyté v PBS a 18 hodín inkubované vo farbiacom kúpeli s X-gal (1 mg/ml X-gal, 5 mM ferikyanid draselný, 5 mM Ferokyanid, 2mM MgCl₂ v PBS) pri teplote 37°C. Ofarbené tkanivo sa zalialo do parafínu a rozrezané na tenké rezy, ktoré sa ďalej dofarbili pomocou 0,1% jadrovej fast red.

Génová imunizácia: Častice zlata potiahnuté DNA sa pripravili zmiešaním 50 mg zlatých guľôčok s priemerom 0,95 μπι a 100 μΐ 0,1 M spermidínu. Táto zmes sa sonifikovala 5 sekúnd a potom k nej bolo po častiach v priebehu vortexovania pridaných 123 gg plazmidovej DNA a 200 μΐ CaCl₂. Zmes sa nechala 5 až 10 minút precipitovať pri izbovej teplote. Tento materiál sa nechal sekúnd centrifugovať pri 10 000 rpm a potom bol 3 krát premytý v studenom etanole a resuspendovaný v 7 ml etanolu za vzniku preparátu s koncentráciou 7 mg zlata na 1 ml. Tento roztok sa potom vpravil do trubičky Tefzel* (Agracetus) a bolo mu ponechaných 5 minút na usadenie. Etanol sa potom odstránil a častice zlata sa pomocou 30 sekundovej rotácie pri 20 rpm prichytili na steny trubičky a vysušené pomocou N₂. Vysušená trubička s usadenými zlatými časticami sa potom narezala na 0,5 palca (1,25 cm) dlhé časti, ktoré sa uchovali v parafínom zatavených sklených nádobkách spolu s desikantom. Zvieratá sa imunizovali dvoma nástrelmi (každý z nástrelov obsahoval 0,5 mg častíc zlata, t.j. 1,27 cm pôvodnej trubičky) do vyholenej ab'dominálnej (brušnej) oblasti pomocou zariadenia Accel Gene Delivery, pričom pracovný tlak pri nástrele bol 300 psi (2,067 MPa). Zvieratá sa imunizovali buď plazmidom pAc-Neo-OVA (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785) alebo plazmidom pIEglacZ (získaný od Nadii Jourond), ktorý obsahuje gén lacZ pod kontrolou promótora CMV. Na pokusy so subkutánnym injekčným podaním polynukleotidov viazaných na časticiach (pozri obrázok 5) sa gulôčky pokryli DNA rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie a tiež sa injikovalo rovnaké množstvo DNA. Niektorým zvieratám (pozri obrázok 5) bol subkutánne injikovaný dodatočný voíný plazmid. Dávky sa podávali v 100 μΐ PBS do slabín, obojstranne. Na pokusy s in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (obrázok 4) boli častice potiahnuté DNA pripravené obdobným spôsobom, pričom boli spolu so zlatými gulôčkami použité aj gulôčky z oxidu železa Biomag s rovnakou hmotnosťou.

Pri pokusoch so subkutánnym injekčným podávaním polynukleotidov podlá vynálezu (pozri obrázok 5 a 6) sa častice potiahnuté DNA pripravili rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie a tiež sa injikovalo rovnaké množstvo DNA alebo množstvo uvedené v opisoch obrázkov. Niektorým zvieratám (pozr-i obrázok 5 a 6) bol subkutánne injikovaný dodatočný volný plazmid. Dávky sa podávali v 100 μΐ PBS do oboch zadných končatín

Pri pokusoch s in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (pozri obrázok 4 a 6) boli častice potiahnuté DNA pripravené obdobným spôsobom, pričom spolu so zlatými guľôčkami sa použili aj guľôčky z oxidu železa Biomag (Fe guľôčky) s rovnakou hmotnosťou. Dendritické APC sa získali z kostnej drene tak ako je uvedené v stručnom opise obrázkov s výnimkou toho, že v kultivačnom tkanivovom médiu s obsahom 25 μΐ 7 mg/ml roztoku polynukleotidu naviazaného na časticiach nebol pri teplote 37°C použitý IL-4 počas 18 hodín. Dendritické bunky s prijatým antigénom sa pripravili tak, ako je uvedené v stručnom opise obrázkov. Stručne povedané, dendritické bunky sa pripravili oddelením kostnej drene od lymfocytov a jej kultiváciou cez noc v médiu RPMI 1640 doplnenom o 10% FCS (fetálny teľací albumín), L-glutamín, antibiotiká a 2merkaptoetanol v 24 jamkových doskách s koncentráciou 10⁶ buniek na jamku. Po jednom dni boli bunky s koncentráciou 2,5xl0⁵ buniek na jamku doplnené o GM-CSF (10³ U/ml, Sigma St. Louis, MO) a myší rIL-4 (IO³ U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) . Voľne adherujúce bunky sa odobrali ôsmy deň kultivácie. Prietokovou cytometriou sa stanovilo, že tieto dendritické bunky exprimujú antigény CD45, CD44, CDllb (Mac-1), CD18, CD80, CD86 a antigény MHC I. a II. triedy. Dendritické bunky boli potom pulzované 2 hodiny pri 37°C za a bez prítomnosti peptidu OVA (20 ng/ml) + P2-mikroglobínu (ľudský β2-Μ, 10 μΐ/ml, Sigma) v redukovanom sérovom médiu (optimen, Gibco, Grand Island, NY). Bunky sa potom dôkladne premyli v PBS a ožiarili (2000 ras) a injikovali do naivných myší.

Testy cytotoxicity - splenocyty imunizovaných myší sa restimulovali spôsobmi podobnými už. opísaným spôsobom, len s m lými modifikáciami (Falo a kol., 1995, Nátur Med. 1: strana €49 až 653) . Týždeň po imunizácii boli splenocyty (3xl0⁶) reStimulované spoločnou kultiváciou s ožiarenými (20 000 rad) bunkami EG7 (10xl0⁶) . Efektorové bunky sa odobrali o 5 dní neskôr a kultivovali s 2,4xl0⁴ cieľovými bunkami označenými pomocou ⁵¹Cr. Táto kultivácia sa vykonala v mikrotitračných doskách s guľatým dnom (200 μΐ) a v uvedenom pomere cieľových a efektorových buniek. V niektorých prípadoch boli efektorové bunky ešte pred testom zbavené subpopulácie T-lymfocytov pomocou monoklonálnej protilátky a komplementu (pozri Rocka a kol., 1993> J. Immunol. 150: strana 1244 až 1251) . po kultivácii trvajúcej 4 hodiny pri teplote 37°C boli spojené 100 μΐ množstvá supernatantov z troch rovnakých jamiek a bunky boli spočítané. Stanovilo sa percento špecifického uvoľnenia, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653. Výsledky sú uvádzané ako priemer z troch kultúr. Štandardná chyba priemeru nebola nikdy vyššia ako 15%.

Testovanie ochrannej funkcie - myši línie C57BL/6 sa opísaným spôsobom imunizovali uvedeným antigénovým génovým konštruktom.' Zvieratám sa podali nádory a opísaným spôsobom bolo stanovené ich prežitie. 7 dní po poslednej imunizácii (deň 0) boli zvieratám imunizovaným OVA alebo lacZ intradermálne do stredu oboch slabín injikované melanómové bunky (2x1O⁴), čo je dvojnásobok LD₅₀, alebo im bola injikovaná dávka nádorových buniek podľa časti 4. Prežitie je uvedené v % prežívajúcich zvierat. Melanómové bunky sa pred injekciou tri krát premyli v PBS a pomocou vylučovacej typánovej modrej bolo určené, že sú živé na viac ako 95 %. Všetky uvedené experimenty sa vykonali na piatich myšiach a aspoň tri krát sa opakovali. Smrteľne choré zvieratá boli usmrtené v súlade so smernicou o zaobchádzaní so zvieratami Centra pre medicínu Univerzity v Pittsburghu. V niektorých prípadoch boli myši zbavené subpopulácie buniek CD8+. To sa dosiahlo intraperitoneálnou injekciou anti CD8-mAB (2.34) na siedmy až deviaty deň po imunizácii. Injekčné podanie nádoru potom prebehlo ôsmy až desiaty deň, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653.

Tiež sa stanovila schopnosť biolistickej (biobalsitickej) imunizácie indukovať antigén-špecifickú cytotoxickú odpoveď. Naivné myšie línie C57BL/6 sa imunizovali dvoma navzájom sa prekrývajúcimi pulzmi do oblasti brucha, pričom celková dávka predstavovala 2,64 gg DNA kódujúcej OVA. 0 sedem dní neskôr bola imunizačná dávka zopakovaná. Bunky sleziny týchto myší restimulované in vitro boli schopné lyžovať syngénne bunky myšieho tymómu EG7 exprimujúce OVA, ale neboli už schopné spôsobiť lýzu netransfekovaných rodičovských buniek línie EL4 (pozri obrázok 3A). Z toho vyplýva, že lýza buniek bola antigénšpecifická a bola namierená na OVA exprimovaný transfekovanými nádorovými bunkami. Odstránenie T-lymfocytov z efektorových bunkových populácií pomocou monoklonálnych protilátok ďalej ukázalo, že lýza buniek bola závislá na Thyl⁺,CD8⁺ subpopuláciách. To je charakteristické pre efektorové CTL obmedzené na MHC I. triedy.

Skupinám myší imunizovaných vyššie opísaným spôsobom sa po 7 dňoch injikovali intradermálne bunky melanómu M04 a to na mieste vzdialenom od miesta imunizácie tak, aby mohla byť vyhodnotená schopnosť biobalistickej imunizácie poskytnúť ochrannú imunitu proti nádorom. Myši imunizované pomocou OVA boli chránené · pred smrteľným rozvojom nádoru, zatial čo u kontrolných myší, ktoré boli imunizované obdobne, len miesto OVA bol použitý reportérový gén lacZ, rástli nádory veľmi rýchlo a boli smrteľné asi v 60 % prípadov po 40 dňoch trvania pokusu (obrázok 3C) . Myši imunizované pomocou DNA pre OVA však nevykazovali žiadnu ochranu proti netransfekovanému rodičovskému melanómu B16 (obrázok 3D), z čoho vyplýva, že táto ochranná imunita bola antigén-špecifická a namierená proti OVA na povrchu nádorových buniek. Tiež sa stanovil príspevok efektorových buniek CD8⁺, a to tak, že sa opakovane podávali i.p. injekcie obsahujúce monoklonálnu protilátku anti-CD8 ešte pred podaním nádoru. Tým bola selektívne v skupinách imunizovaných a kontrolných (imunizovaných pomocou lacZ) zvierat odstránená subpopulácia lymfocytov CD8⁺, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653. Zatiaľ čo zvieratá imunizované pomocou OVA boli chránené pred rozvojom nádoru M04, prežitie zvierat imunizovaných OVA, ale zbavených subpopulácie CD8⁺ Tlymfocytov bolo obdobné ako prežitie kontrolných zvierat, či už s alebo bez týchto lymfocytov. Z toho vyplýva, že CD8⁺ Tlymfocyty sú úplne nevyhnutné pre ochrannú protinádorovú odpoveď indukovanú imunizáciou podľa vynálezu.

Ďalším dôkazom podporujúcim tento mechanizmus protinádorovej imunity je demonštrácia expresie β-galaktozidázy v epiderme imunizovaných zvierat po biobalistickom vložení lacZ konštruktu a zaujímavé diskrétne oblasti špecifickej expresie v lymfatických uzlinách. Vzhladom k tomu, že tieto uzliny boli vzdialené od miesta imunizácie, zdá sa veľmi nepravdepodobné, že táto expresia v lymfatických uzlinách by bola priamo výsledkom fyzikálneho bombardovania. Preukázala sa prevaha zlatých častíc v epiderme a derme imunizovanej pokožky (neofarbenej) 24 hodín po imunizácii pomocou DNA a expresie lacZ v epidermálnych keratynocytoch po 48 hodinách. Pozorovali sa tiež diskrétne špecificky ofarbené oblasti v lymfatických uzlinách. Rovnakým spôsobom ošetrené zvieratá, ktoré boli imunizované nevhodnou DNA, nevykazovali žiadnu expresiu lacZ. Toto pozorovanie viedlo k ďalšiemu experimentu, ktorý je opísaný v príklade 3.

Príklad 3: Génová imunizácia po subkutánnom podaní

Materiál a spôsoby indukcie protinádorovej imunity pomocou subkutánneho podania polynukleotidu naviazaného na časticiach sú podrobne opísané v príklade 1 a2.

Uvedené údaje dokazujú schopnosť špecifického zacielenia fagocytujúcich APC v lymfoidnom tkanive alebo APC schopných prejsť do lymfoidného tkaniva subkutánnou injekciou polynukleotidu naviazaného na časticiach v podmienkach in vivo.

Ochrana pred nádormi bola porovnateľná v skupinách myší imunizovaných polynukleotidom pAc-Neo-OVA naviazaným na časticiach ako pri priamom subkutánnom podaní, tak aj pri bi'obalistickom padaní (pozri obrázok 5) . V súlade s výsledkami z príkladu 2 neviedla imunizácia polynukleotidom kódujúcim antigén (napríklad pIEglacZ) k vzniku ochrannej Subkutánna injekcia pAC-Neo-OVA bez nosných častíc neviedla k vzniku ochrannej imunity (pozri obrázok 5). Z týchto vyplýva, že subkutánna injekcia polynukleotidu naviazaného na časticiach je aspoň rovnako účinná ako biobalistické podanie. Vzhľadom na to, že pri subkutánnej injekcii nedochádza k priamemu fyzikálnemu násilnému preniknutiu častice s naviazaným polynukleotidom do cytoplazmy cieľovej hostiteľskej bunky, je zrejmé, že na expresiu je nutný nejaký spôsob aktívneho bunkami absencie polynukleotidu pAc-Neo-OVA, ktorý nebol naviazaný na časticiach, tiež vedie k záveru, že transport častice fagocytózou je hlavným mechanizmom transdukcie. Z tohto mechanizmu transdukcie tiež vyplýva, že na expresiu transgénu sú vhodnejšie bunky schopné fagocytovať, vrátane APC.

nevhodný imunity, taktiež zodpovedajúcemu nádoru proti údajov transportu endocytózy.

polynukleotidu

Pozorovanie schopnými fagocytózy/ imunity po injekcii

Ďalším dôkazom o tomto predpokladanom mechanizme účinku polynukleotidov naviazaných na časticiach je pozorovanie APC z dendritických buniek odvodených z kostnej drene, ktoré po spoločnej in vitro kultivácii s polynukleotidom kódujúcim ovalbumín (pAc-Neo-OVA, pripravený podlá príkladu 2), ktorý bol naviazaný na časticiach, dokázali stimulovať OVA špecifické Tlymfocyty (SIINFEKL+K^b) z hybridómu RF33.70 k produkcii IL-2 (pozri obrázok 4).

Z toho vyplýva, že tieto APC funkčne exprimujú gén pre ovalbumín a vzniká v nich komplex ovalbumínového peptidu a K^b. Kvantitatívne je tento proces porovnatelný s podobným procesom pozorovaným pri pulznom prenose 2 mg/ml rozpustného proteínu OVA do antigén prezentujúcich buniek. Polynukleotidy naviazané na časticiach zlata alebo železa sú v tomto prípade porovnateľne účinné. Z toho vyplýva, že inkubácia polynukleotidu naviazaného na časticiach spolu s fagocytujúcimi APC v podmienkach in vitro vedie k endogénnej produkcii, spracovaniu a prezentácii transfekovaného antigénu. Polynukleotidy naviazané na časticiach tak môžu byť pohltené a exprimované antigén prezentujúcou bunkou a odpovedajúce peptidy môžu byť funkčne prezentované na povrchu týchto buniek tak, aby došlo k indukcii antigén-špecifickej imunitnej odpovede.

Na obrázku 6 je znázornené, že APC, v tomto prípade subkutánne injikované dendritické bunky odvodené z kostnej drene, ktoré boli vyššie opísaným spôsobom in vitro inkubované s polynukleotidom kódujúcim antigén OVA naviazaným na časticiach, sú schopné vyvolať protinádorovú imunitu proti nádorovým bunkám exprimujúcim daný antigén. V danom prípade jednorazová imunizácia ožiarenými transfekovanými dendritickými bunkami (10⁵) na jedno zviera (5xl0⁴ buniek do každej zadnej končatiny) vyvolala úplnú protinádorovú imunitu. In vivo podané dendritické APC, ktoré sú dobrými stimulátormi antigén-špecifických CTL a protinádorovej imunity, sú po nasýtení peptidom in vitro aspoň porovnateľne imunogénne ako pri nasýtení antigénom pri spoločnej inkubácii s polynukleotidom naviazaným na časticiach.

Subkutánna aplikácia polynukleotidu naviazaného na časticiach je tak výhodná predovšetkým vďaka tomu, že je možná cielená doprava antigénu do fagocytujúcich antigén prezentujúcich buniek (APC) hostiteľa, čo môže zvýšiť účinnosť génovej imunizácie a zároveň znížiť nežiaduce účinky ako sú, okrem iného napríklad vyvolanie tolerancie alebo mutagenéza po transfekcii normálnych, antigén neprezentujúcich buniek.

uf ' - 9?

Claims (22)

1. NÁROKY

   PATENTOVÉ

   1. ' Očkovacia látka obsahujúca polynukleotid naviazaný na časticiach s povrchom, na ktorom sú rozložené fragmenty DNA, expresiou ktorých vzniká antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy cieľovej bunky v cicavčom hostiteľovi tak, aby sa exprimoval uvedený antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu a bol prezentovaný na membránovom povrchu uvedenej cieľovej bunky mechanizmom MHC I. triedy.
2. 2. Očkovacia látka podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že expresiou DNA fragmentu vzniká antigén spôsobujúci odmietnutie tumoru (TRA), vírusový antigén alebo ich antigénové proteínové fragmenty.
3. 3. Očkovacia látka poľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy cieľových antigén prezentujúcich buniek.
4. 4. Očkovacia látka podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek nachádzajúcich sa alebo migrujúcich do lymfoidného tkaniva cicavčieho hostiteľa.
5. 5. Očkovacia látka podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený TRA antigén je vybraný zo skupiny tvorenej MAGE 1 a MAGE 3.
6. 6. Očkovacia látka podľa nároku 2, vyznačujúca tým, že uvedený TRA antigén je Melan-A.
7. 7. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený TRA je gplOO
8. 8. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený TRA antigén je p53.
9. 9. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený TRA antigén je CEA.
10. 10. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený TRA antigén je HER2/neu.
11. 11. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený vírusový antigén je gpl20 alebo HIV gpl60.
12. 12. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený vírusový antigén je nukleoproteín vírusu chrípky.
13. 13. Očkovacia látka podlá nároku 2, vyznačujúca sa tým, že uvedený vírusový antigén je povrchový antigén hepatitídy B.
14. 14. Očkovacia látka podlá ľubovoľného z nárokov 1 až 13, vyznačujúca sa tým, že je použiteľná na očkovanie cicavčieho hostiteľa pomocou biolistického zariadenia alebo je použiteľná na očkovanie cicavčieho hostiteľa pomocou injekčného podania.
15. 15. Očkovacia látka podlá lubovolného z nárokov 1 až 14, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cieľových buniek in vitro alebo in vivo.
16. 16. Očkovacia látka obsahujúca polynukleotid naviazaný na časticiach s povrchom, na ktorom sú rozložené fragmenty DNA, expresiou ktorých vzniká proteín, ktorý zosilňuje antigénB prezentačnú funkciu antigén prezentujúcej bunky, • vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy cieľovej bunky v cicavčom hostiteľovi tak, aby sa exprimoval uvedený proteín zosilňujúci prezentáciu antigénov v biologicky účinnej forme a biologicky účinnej koncentrácii.
17. 17. Očkovacia látka podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy cieľových antigén prezentujúcich buniek.
18. 18. Očkovacia látka podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že je schopná preniknúť do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek nachádzajúcich sa alebo migrujúcich do * lymfoidného tkaniva menovaného ľudského hostitela.
19. 19. Očkovacia látka podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že expresiou uvedeného fragmentu DNA vzniká kostimulačné molekula.
20. 20. Očkovacia látka podľa nároku 19, vyznačujúca sa tým, že uvedená kostimulačné molekula je vybraná zo skupiny tvorenej molekulami CD80 a CD86.
21. 21. Očkovacia látka podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že expresiou uvedeného fragmentu DNA vzniká cytokínu.
22. 22. Očkovacia látka podlá nároku 21, vyznačuj ú tým, že uvedená molekula cytokínu je vybraná zo tvorenej IL-12, IL-4 a IL-2.

    molekula c a sa skupiny

    1/6