SK40198A3 - Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization - Google Patents
Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization Download PDFInfo
- Publication number
- SK40198A3 SK40198A3 SK401-98A SK40198A SK40198A3 SK 40198 A3 SK40198 A3 SK 40198A3 SK 40198 A SK40198 A SK 40198A SK 40198 A3 SK40198 A3 SK 40198A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- antigen
- cells
- vaccine
- host
- cell
- Prior art date
Links
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title abstract description 70
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title abstract description 65
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 title description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 162
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 143
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 139
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 130
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 127
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 127
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 122
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 45
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 45
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 40
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 22
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 18
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 8
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 claims description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010010995 MART-1 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 3
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims 24
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims 7
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims 2
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 claims 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 27
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 14
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 62
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 58
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 51
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 23
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 16
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 16
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 16
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 16
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 16
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 15
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 15
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 13
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 13
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 11
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 10
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 7
- -1 but not limited to Substances 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 5
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 5
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 4
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 4
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- GSSMIHQEWAQUPM-AOLPDKKJSA-N ovalbumin peptide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CN=CN1 GSSMIHQEWAQUPM-AOLPDKKJSA-N 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 210000003426 epidermal langerhans cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 210000003595 dermal dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100035526 B melanoma antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010035053 B7-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000038504 B7-1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000007697 B7-2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021800 B7-2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100039717 G antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121925 Hemagglutinin glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000874316 Homo sapiens B melanoma antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000886137 Homo sapiens G antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100207408 Homo sapiens TRA gene Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010075205 OVA-8 Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 229920006355 Tefzel Polymers 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100039094 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000026502 entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N ethene;1,1,2,2-tetrafluoroethene Chemical compound C=C.FC(F)=C(F)F QHSJIZLJUFMIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- JTTAUPUMOLRVRA-UHFFFAOYSA-N prothipendyl Chemical compound C1=CN=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 JTTAUPUMOLRVRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000957 prothipendyl Drugs 0.000 description 1
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000005851 tumor immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
- A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001103—Receptors for growth factors
- A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001148—Regulators of development
- A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
- A61K39/001151—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/001186—MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
- A61K39/001191—Melan-A/MART
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Oblasť technikyTechnical field
Vynález opisuje génovú imunizáciu vhodnú na stimuláciu antigén-špecifickej imunitnej odpovede v cicavčích hostiteľoch vrátane človeka. Vynález opisuje podanie polynukleotidov viazaných na časticiach do cytoplazmy cieľových hostiteľských buniek, ktorými sú napríklad antigén prezentujúce bunky. Častice nesúce polynukleotidy kódujú antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu, ktorý sa hromadí v cytoplazme cieľových buniek. Expresia génu kódujúceho antigén vyvoláva imunitnú odpoveď špecifickú k tomuto antigénu, zahrňujúcu, ale neobmedzujúcu sa na, indukciu antigén-špecifických Tlymfocytov (CTL). Hromadenie antigénu v cytoplazme umožňuje prezentáciu antigénových peptidov na membráne pomocou endogénnych MHC proteínov I. triedy (proteíny hlavného histokompatibilného komplexu). Prezentácia antigénov cestou MHC proteínov I. triedy stimuluje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL). Špecifické CTL indukované antigénom potom cielene ničia hostiteľské bunky, ktoré antigén exprimujú, ako sú bunky nádorové či bunky infikované vírusom.The invention provides gene immunization suitable for stimulating an antigen-specific immune response in a mammalian host, including a human. The invention provides administration of particle-bound polynucleotides to the cytoplasm of target host cells, such as antigen-presenting cells. Particles carrying polynucleotides encode an antigenic protein or antigenic protein fragment that accumulates in the cytoplasm of the target cells. Expression of the gene encoding the antigen elicits an immune response specific to that antigen, including, but not limited to, induction of antigen-specific T lymphocytes (CTLs). Antigen accumulation in the cytoplasm allows the presentation of antigen peptides on the membrane using endogenous MHC class I proteins (major histocompatibility complex proteins). Presentation of antigens by MHC class I proteins stimulates induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs). The specific CTL induced by the antigen then specifically destroys host cells that express the antigen, such as tumor cells or virus infected cells.
Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Cytotoxické T-lymfocyty (CTL) sú u ľudí kritickou zložkou vyvolanej účinnej imunitnej odpovede na tumory alebo vírusové infekcie. Cytotoxické T-lymfocyty ničia neoplastické bunky alebo bunky nakazené vírusmi cestou rozpoznania antigénových peptidov predkladaných na MHC proteínoch I. triedy na povrchu zasiahnutých cieľových buniek. Tieto antigénové peptidy sú degradačnými produktmi cudzích proteínov prítomných v cytoplazme zasiahnutých buniek, ktoré sú spracované a predkladané cytotoxickým T-lymfocytom pomocou endogénnej dráhy MHC I. triedy.Cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) are a critical component of human-induced effective immune responses to tumors or viral infections. Cytotoxic T lymphocytes destroy neoplastic cells or cells infected with viruses by recognizing antigenic peptides presented on MHC class I proteins on the surface of the affected target cells. These antigenic peptides are degradation products of foreign proteins present in the cytoplasm of the affected cells, which are processed and presented by cytotoxic T-lymphocytes using the endogenous MHC class I pathway.
Aj keď rozpoznanie cudzieho proteínu prezentovaného pomocou molekúl MHC I. triedy môže byť dostatočným signálom na rozpoznanie a deštrukciu zasiahnutej bunky pomocou cytotoxických T-lymfocytov, indukcia antigén-špecifických CTL z T-lymfocytových prekurzorov vyžaduje ešte ďalšie signály. Špecializované antigén prezentujúce bunky (APC) môžu zabezpečiť oboje, ako ligandy pre komplex antigén-MHC I. triedy, tak dodatočne signály pre fázu vyvolania imunity sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi.Although recognition of the foreign protein presented by MHC class I molecules may be a sufficient signal for the recognition and destruction of the affected cell by cytotoxic T lymphocytes, the induction of antigen-specific CTLs from T lymphocyte precursors requires additional signals. Specialized antigen-presenting cells (APCs) can provide both antigen-MHC class I ligands and additionally signals for the cytotoxic T-cell mediated immune-induction phase.
Všeobecné vlastnosti APC zahrňujú expresiu proteínov MHCGeneral properties of APCs include the expression of MHC proteins
I. a II. triedy a tiež expresiu stimulačných molekúl akými sú napríklad CD80 a CD86. Príklady APC zahrňujú makrofágy a dendritické bunky (vrátane kožných epidermálnych Langerhansových buniek, dermálnych dendritických buniek a dendritických buniek vyskytujúcich sa v lymfatických uzlinách a v slezine).I. and II. class and also expression of stimulatory molecules such as CD80 and CD86. Examples of APCs include macrophages and dendritic cells (including skin epidermal Langerhans cells, dermal dendritic cells and dendritic cells occurring in the lymph nodes and spleen).
Pokusy o indukciu in vivo odpovede antigén-špecifických CTL imunizáciou hostitela pomocou usmrtených nádorových buniek, vírusom usmrtených buniek alebo ich proteínových častí boli väčšinou neúspešné, najmä preto, že proteíny z extracelulárnych tekutín nemohli vstúpiť do cytoplazmy a dosiahnuť tak svoju prezentáciu pomocou MHC antigénov I. triedy.Attempts to induce in vivo antigen-specific CTL responses by immunizing the host with killed tumor cells, virus killed cells, or protein portions thereof were mostly unsuccessful, especially since proteins from extracellular fluids could not enter the cytoplasm and achieve their presentation by MHC antigens I. classes.
Génová imunizácia má niekolko výhodných vlastností. Existuje niekolko používaných metód génového prenosu in vivo vedúceho k transgénnej expresii. Patrí sem napríklad génový prenos sprostredkovaný retrovírusmi a adenovírusmi a priama injekcia holej DNA (prehľadný článok - pozri Krischnaw a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 521 až 522 a Pardoll a kol., 1995, Immunity 3: strana 165 až 169).Gene immunization has several advantageous properties. There are several methods of in vivo gene transfer resulting in transgenic expression. These include, for example, retrovirus and adenovirus-mediated gene transfer and direct injection of naked DNA (reviewed in Krischnaw et al., 1995, Nature Med. 1: 521-522; and Pardoll et al., 1995, Immunity 3: 165-169. ).
Williams a kol. (1991, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88: strana 2726 až 2730) opísali expresiu proteínu luciferázy v intaktných epidermálnych bunkách, ktorá nasledovala po biolistickom (biobalistickom) zavedení luciferázového génu svätojánskej mušky. Do tejto štúdie neboli zahrnuté CTL, pozornosť nebola zameraná ani na usmrtenie hostiteľských buniek v procese vzniku bunkovo sprostredkovanej imunitnej odpovede.Williams et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730) described the expression of luciferase protein in intact epidermal cells following biolistic (biobalistic) introduction of the firefly luciferase gene. CTL was not included in this study, nor was killing host cells killed in the process of developing a cell-mediated immune response.
Táng a kol. (1992, Náture 365: strana 152 až 154) využili biolistické (biobalistické) zariadenie na vytvorenie humorálnej odpovede na cudzí proteín. Do epidermálneho tkaniva myší bol zavedený gén kódujúci hGH pod kontrolou buď CMV promótora, alebo β-aktínového promótora. V myšiach, ktoré sa podrobili tomuto imunizačnému procesu, boli dokázané protilátky proti hGH. Táng a kol. však neopisujú génovú imunizáciu zameranú na bunkovo sprostredkovanú odpoveď. Taktiež neopisujú ani nenavrhujú priame využitie APC buniek na génovú imunizáciu.Tang et al. (1992, Nature 365: 152-154) utilized a biolistic (biobalistic) device to generate a humoral response to a foreign protein. A gene encoding hGH was introduced into mouse epidermal tissue under the control of either the CMV promoter or the β-actin promoter. Antibodies against hGH were detected in mice that were subjected to this immunization process. Tang et al. however, they do not describe gene immunization directed at a cell-mediated response. They also do not describe or suggest the direct use of APC cells for gene immunization.
Fynan a kol. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: strana 11478-11482) potvrdili výsledky Tanga a kol., keď použili plazmid obsahujúci DNA konštrukt kódujúci hemaglutinín glykoproteín chrípkového vírusu. Fynan a kol. porovnali humorálnu odpoveď vyvolanú zavedením DNA na potiahnutých zlatých časticiach do epidermy pomocou génovej pušky s ďalšími mechanizmami a zistili, že použitie biolistického (biobalistického) zariadenia viedlo k:Fynan et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-11482) confirmed the results of Tang et al. Using a plasmid containing a DNA construct encoding the hemagglutinin glycoprotein of influenza virus. Fynan et al. compare the humoral response induced by the introduction of DNA on coated gold particles into the epidermis using a gene rifle with other mechanisms and found that the use of a biolistic (biobalistic) device resulted in:
1. vzniku 95% ochrany proti letálnym následkom chrípkovej expozície,1. development of 95% protection against the lethal effects of influenza exposure;
2. zistilo sa, že ide o najúčinnejšiu cestu DNA imunizácie, ktorá sa ukazuje byť efektívnejšia ako postupy imunizácie pri sliznicovom, intrámuskulárnom alebo intravenóznom podaní antigénu a že2. it has been found to be the most effective DNA immunization pathway, which proves to be more effective than immunization procedures for mucosal, intra-muscular or intravenous administration of antigen, and
3. imunizácia vyžaduje 250 až 2500 krát menej DNA ako pri inokuláciách v štandardnom fyziologickom roztoku.3. immunization requires 250 to 2500 times less DNA than inoculation in standard saline.
Priame využitie APC buniek na génovú imunizáciu nebolo v práci Fynana a kol. ani opísané, ani o ňom nebolo uvažované, ani nebola sledovaná imunita sprostredkovaná bunkami CTL.Direct use of APC cells for gene immunization has not been reported by Fynan et al. neither described nor contemplated, nor was the CTL-mediated immunity monitored.
Liu a jeho kolegovia (Montgomery a kol., 1993, DNA Celí Biol. 12: strana 777 až 783, Ulmer a kol., 1993, Science 259: strana 1745-1749), Donelly a kol., 1995, Náture Medicíne 1: strana 583 až 587) dokázali, že necielená nešpecifická intramuskulárna injekcia voľnej (nahej) DNA (naked DNA) indukuje u cytotoxických T-lymfocytov antigén špecifickú odpoveď na vírusové infekcie. Tieto štúdie však neopisujú cielené využitie genetického materiálu na génovú imunizáciu antigén prezentujúcich buniek.Liu et al. (Montgomery et al., 1993, DNA Cell Biol. 12: 777-783, Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1749), Donelly et al., 1995, Nature Medicine 1: (583 to 587) demonstrated that non-targeted, non-specific, intramuscular injection of naked DNA induces an antigen-specific response to viral infections in cytotoxic T cells. However, these studies do not describe the targeted use of genetic material for the gene immunization of antigen-presenting cells.
Sun a kol. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: strana 2889 až 2893) využívajú biolistické (biobalistické) zariadenie na vyvolanie protinádorovej odpovede u myší. Autori vložili plazmidový konštrukt exprimujúci IL-6 priamo do miesta nádoru v myšiach. Expresia IL-6 vyvolávala formu cytokínovej génovej terapie nešpecifický zameranej na nádor. V práci nie je uplatnený nárok na vyvolanie špecifickej imunity k tumoru a nie je navrhnuté ani cielené využite APC buniek na génovú imunizáciu.Sun et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2889-2893) utilize a biolistic (biobalistic) device to elicit an anti-tumor response in mice. The authors inserted the plasmid construct expressing IL-6 directly into the tumor site in mice. IL-6 expression induced a non-tumor-specific form of cytokine gene therapy. There is no claim to induce specific immunity to a tumor, nor is it proposed or targeted to use APC cells for gene immunization.
Kundig a kol. (1995, Science 268: strana 1343 až 1346) ukázali, že lokalizácia proteínového antigénu v lymfatických orgánoch je kritická pre indukciu antigén-špecifickej odpovede in vivo. Génová imunizácia nie je v práci opísaná.Kundig et al. (1995, Science 268: 1343-1346) have shown that protein antigen localization in lymphatic organs is critical for inducing antigen-specific responses in vivo. Gene immunization is not described in the work.
Kovacsovics-Bankowski a Rock (1995, Science 267: strana 243 až 246) demonštrovali, že proteínový antigén, ktorý nie je normálne prezentovaný endogénnou dráhou MHC I. triedy, môže byť prijatý do cytoplazmy prostredníctvom fagozómu. Autori prišli s myšlienkou, že proteín viazaný na častice a internalizovaný vnútri fagozómu je prakticky schopný vstúpiť do cytoplazmy a byť použitý v cytoplazmovej dráhe prezentácie na antigénoch MHCKovacsovics-Bankowski and Rock (1995, Science 267: 243-246) demonstrated that a protein antigen that is not normally presented by the endogenous MHC class I pathway can be taken up into the cytoplasm via a phagosome. The authors came up with the idea that a particle-bound protein internalized inside the phagosome is practically capable of entering the cytoplasm and being used in the cytoplasmic pathway of presentation on MHC antigens
I. triedy. Kapacita vstupu funkčne intaktného genetického materiálu do cytoplazmy prostredníctvom fagozómov však nie je v práci uvedená.Class I. However, the capacity of entry of functionally intact genetic material into the cytoplasm via phagosomes is not reported.
Falo a kol. (1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653) ponúka in vivo podporu pre cestu antigénu z fagozómu do cytoplazmy a to tým, že ukázal, že vstup proteínového antigénu viazaného na časticiach priamo do zvierat navodí v antigénšpecifických CTL sprostredkovanú imunitu k nádoru u myší. Dokázali, že proteíny injikované priamo do zvierat in vivo môžu špecificky vstupovať cez tvorbu fagozómov do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek, ak sú podané naviazané na časticiach. Žiadne detaily týkajúce sa spôsobu génovej imunizácie však nie sú odporučené. Kapacita vstupu in vivo podávaného genetického materiálu do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek alebo ďalších typov funkčne intaktných buniek touto cestou nie je uvedená.Falo et al. (1995, Nature Med. 1: 649-653) offers in vivo support for the antigen pathway from the phagosome to the cytoplasm by demonstrating that particle-bound protein antigen entry directly into animals induces tumor-mediated immunity in antigen-specific CTLs. mouse. They have shown that proteins injected directly into animals in vivo can specifically enter the cytoplasm of antigen-presenting cells through phagosome formation when administered bound to particles. However, no details regarding the method of gene immunization are recommended. The capacity of the in vivo administered genetic material to enter the cytoplasm of antigen-presenting cells or other types of functionally intact cells by this route is not indicated.
Pardoll a Backerleg (1995, Immunity 3: strana 165 až 169) vypracovali prehladný článok o imunológii vakcín obsahujúcich volnú DNA. Zdôraznili dôležitosť ďalšieho výskumu, aby bol objasnený a definovaný dosial neznámy mechanizmus DNA imunizácie. Zdôrazňujú najmä záver, že bude velmi dôležité spoznať mechanizmus, ktorým volná DNA aktivuje imunitnú odpoveď. Jedine takouto štúdiou je možné preukázať, že zavedenie rozumných modifikácií by mohlo maximalizovať ako kvalitatívne, tak aj kvantitatívne obmedzené možnosti tejto imunizácie.Pardoll and Backerleg (1995, Immunity 3: 165-169) have written a review on the immunology of free DNA vaccines. They stressed the importance of further research to clarify and define the hitherto unknown mechanism of DNA immunization. In particular, they stress the conclusion that it will be very important to recognize the mechanism by which free DNA activates the immune response. Only by such a study can it be demonstrated that the introduction of reasonable modifications could maximize both the qualitatively and quantitatively limited possibilities of this immunization.
Napriek neúspechom, spomenutým v predchádzajúcom literárnom prehlade, stále ostáva potreba vyvinúť postup génovej imunizácie, ktorý bude špecificky zameraný na taký typ buniek, ktorý bude v hostitelovi stimulovať antigén-špecifickú imunitnú odpoveď sprostredkovanú cytotoxickými T-lymfocytmi a tak umožní priamu špecifickú deštrukciu neoplastických alebo vírusmi infikovaných buniek v tele hostiteľa. Vynález opisuje riešenie oboch týchto požiadaviek.Despite the failures mentioned in the previous literature review, there remains a need to develop a gene immunization procedure that specifically targets a cell type that stimulates an antigen-specific immune response mediated by cytotoxic T lymphocytes in the host and thus permits direct specific destruction of neoplastic or virus infected cells in the host. The invention describes a solution to both of these requirements.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Vynález sa týka terapeutickej či profylaktickej génovej imunizácie cicavčích hostiteľov, ktorá zahrňuje vloženie DNA fragmentov kódujúcich antigénový proteín do cielových buniek cicavčieho hostiteľa, expresiu rekombinantných DNA fragmentov v hostiteľskej bunke a následnú prezentáciu antigénového peptidu či peptidov hostitelskou bunkou tak, že stimulujú bunkovo sprostredkovanú imunitu, humorálnu imunitu, alebo obe.The invention relates to therapeutic or prophylactic gene immunization of mammalian hosts which comprises introducing DNA fragments encoding the antigenic protein into the target cells of the mammalian host, expressing the recombinant DNA fragments in the host cell, and subsequently presenting the antigenic peptide (s) by the host cell to stimulate cell-mediated immune immunity, or both.
Vynález ďalej opisuje terapeutickú či profylaktickú génovú imunizáciu cicavčieho hostitela, čo zahŕňa vloženie DNA sekvencie kódujúcej antigénový proteín alebo biologicky aktívny fragment tohto proteínu do špecifickej cieľovej bunky cicavčieho hostitela. Antigénové peptidy, exprimované z DNA fragmentov, sú špecifické k postihnutej bunke a následne stimulujú produkciu k antigénu špecifických CTL, čím podporujú zničenie zasiahnutej bunky, ako je bunka neoplastická či vírusovo infikovaná bunka.The invention further provides therapeutic or prophylactic gene immunization of a mammalian host, which comprises inserting a DNA sequence encoding an antigenic protein or a biologically active fragment thereof into a specific target cell of the mammalian host. The antigenic peptides expressed from the DNA fragments are specific to the affected cell and consequently stimulate the production of antigen-specific CTLs, thereby promoting the destruction of the affected cell, such as a neoplastic or virally infected cell.
Vynález ďalej opisuje génovú imunizáciu s použitím polynukleotidov viazaných na častice, inokuláciu cicavčích hostitelov a následné preniknutie týchto častíc s transgénnymi polynukleotidmi do cytoplazmy cieľových buniek. Po pohltení touto cieľovou bunkou exprimujú polynukleotidy naviazané na častice proteín alebo biologicky aktívny fragment tohto proteínu, čím sa vytvorí vlastný antigénový peptidový fragment, ktorý je prezentovaný, na membráne cieľovej bunky pomocou endogénnej dráhy MHC I. triedy. Vlastná prezentácia antigénového peptidu alebo peptidov, ktoré sú predmetom nášho záujmu, pomocou prezentačnej dráhy MHC I. triedy stimuluje produkciu cytotoxických T-lymfocytov a tým stimuluje ničenie buniek ako sú neoplastické bunky a vírusovo infikované bunky.The invention further provides gene immunization using particle-bound polynucleotides, inoculation of mammalian hosts, and subsequent penetration of these particles with transgenic polynucleotides into the cytoplasm of target cells. Upon ingestion by this target cell, the particle-bound polynucleotides express a protein or biologically active fragment of the protein, thereby forming a self-antigenic peptide fragment that is presented on the membrane of the target cell via an endogenous MHC class I pathway. Self-presentation of the antigen peptide or peptides of interest using the MHC class I presentation pathway stimulates the production of cytotoxic T-lymphocytes and thereby stimulates the destruction of cells such as neoplastic cells and virally infected cells.
Ďalej vynález opisuje spôsob in vivo terapeutickej alebo profylaktickej génovej imunizácie cicavčích hostitelov, čo zahŕňa vytvorenie DNA fragmentov, ktoré exprimujú antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu, väzbu DNA fragmentu na povrch častice, čo vytvára takzvaný polynukleotid naviazaný na častici, a dodávku tohto na častici imobilizovaného polynukleotidu do cytoplazmy cieľovej bunky cicavčieho hostiteľa, kde sa exprimovaný antigénový proteín alebo fragment antigénového proteínu prezentuje na membránovom povrchu spomínanej cieľovej bunky pomocou prezentačnej dráhy MHC I. triedy.The invention further provides a method for in vivo therapeutic or prophylactic gene immunization of mammalian hosts, comprising forming DNA fragments that express an antigen protein or antigen protein fragment, binding the DNA fragment to a particle surface to form a so-called polynucleotide bound to the particle, and delivering the particle immobilized a polynucleotide into the cytoplasm of a target cell of a mammalian host, wherein the expressed antigen protein or antigen protein fragment is presented on the membrane surface of said target cell using an MHC class I presentation pathway.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu sú cicavčie hostiteľské bunky ľudského pôvodu.In a particularly preferred embodiment of the invention, the mammalian host cells are of human origin.
V ďalších výhodných uskutočneniach vynálezu exprimuje používaný DNA fragment:In other preferred embodiments, the DNA fragment used expresses:
1. antigén spôsobujúci odmietnutie tumoru (Tumor Rejection Antigén, TRA) alebo antigénový proteínový fragment1. Tumor Rejection Antigen (TRA) or antigenic protein fragment
2. Vírusový antigén alebo antigénový proteínový fragment2. Viral antigen or antigenic protein fragment
Príklady ludských TRA antigénov, ktoré môžu byť využité spôsobom podía vynálezu, zahrňujú ale neobmedzujú sa na MAGE-1, MAGE-3, Melan-A, gplOO, p53, CEA a HER2/neu. Príklady vírusových antigénov, ktoré môžu byť využité vo vynáleze, zahrňujú ale neobmedzujú sa len na HIV, gpl20, hiv, gpl60, nukleoproteín vírusu chrípky a povrchový antigén vírusu hepatitídy typu B.Examples of human TRA antigens that can be used by the method of the invention include, but are not limited to, MAGE-1, MAGE-3, Melan-A, gp100, p53, CEA, and HER2 / neu. Examples of viral antigens that can be used in the invention include, but are not limited to, HIV, gp120, HIV, gp160, influenza virus nucleoprotein, and hepatitis B virus surface antigen.
Vynález ako cieľové bunky výhodne používa antigén prezentujúce bunky (APC). Výhodná je lokalizácia týchto cieľových buniek v lymfoidnom tkanive alebo schopnosť migrácie do tohto tkaniva hostiteľa.The invention preferably uses antigen presenting cells (APCs) as target cells. Preferred is the localization of these target cells in the lymphoid tissue or the ability to migrate into the host tissue.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom na časticiach s použitím mikroprojektilového bombardovacieho zariadenia.In another preferred embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with a polynucleotide on particles using a microprojectile bombardment device.
V zvláštnom uskutočnení je cicavčí hostiteľ imunizovaný inokuláciou polynukleotidom viazaným na časticiach s použitím biolistického (biobalistického) procesu. V zvláštnom uskutočnení vynálezu je ľudský hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou biobalistického procesu tak, že tento polynukleotid vstúpi do cytoplazmy aspoň dostačujúceho počtu hostiteľských buniek. Transgénne polynukleotidy sú exprimované v biologicky účinnej koncentrácii tak, že antigénové peptidové fragmenty sú prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy a sú prezentované na membránovom povrchu hostiteľských buniek. Prezentácia vloženého antigénu na bunkových endogénnych hostiteľských membránach zvyšuje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov, ktoré ďalej cirkulujú v cicavčom organizme, výhodne potom v ľudskom hostiteľovi, a tak ničia neoplastické bunky a vírusovo infikované bunky. V špeciálnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ, vo výhodnom uskutočnení človek, imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou mikroprojektilového bombardovania tak, že polynukleotid imobilizovaný na časticiach preniká pomocou projektilu do cytoplazmy dostatočného počtu hostiteľských buniek, vrátane antigén prezentujúcich buniek. Pri bombardovaní kože môžu antigén prezentujúce bunky zahrňovať, ale neobmedzujú sa len na epidermálne Langerhansove bunky, keratinocyty alebo dermálne dendritické bunky. Ak je bombardované lymfoidné tkanivo, antigén prezentujúce bunky (APC) lymfoidného tkaniva, ktoré môžu byť zasiahnuté, zahrňujú okrem iného napríklad: reziduálne dendritické bunky, makrofágy, bunky stromy, T-lymfocyty alebo β-lymfocyty.In a particular embodiment, the mammalian host is immunized by inoculation with a particle-bound polynucleotide using a biolistic (biobalistic) process. In a particular embodiment of the invention, the human host is immunized with a particle-bound polynucleotide by a biobalistic process such that the polynucleotide enters the cytoplasm of at least a sufficient number of host cells. Transgenic polynucleotides are expressed at a biologically effective concentration such that the antigenic peptide fragments are presented using the endogenous MHC class I antigen presentation pathway and are presented on the membrane surface of the host cells. Presentation of the introduced antigen on cell endogenous host membranes increases the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, which in turn circulate in the mammalian organism, preferably the human host, thereby destroying neoplastic cells and virally infected cells. In a particular embodiment of the invention, the mammalian host, preferably a human, is immunized with the particle-bound polynucleotide by microprojectile bombardment so that the particle-immobilized polynucleotide penetrates into the cytoplasm of a sufficient number of host cells, including antigen-presenting cells. In skin bombardment, antigen presenting cells may include, but are not limited to, epidermal Langerhans cells, keratinocytes, or dermal dendritic cells. When lymphoid tissue is bombarded, antigen-presenting cells (APCs) of lymphoid tissue that may be affected include, but are not limited to: residual dendritic cells, macrophages, tree cells, T-lymphocytes, or β-lymphocytes.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný časticami s naviazaným polynukleotidom, ktorý je aplikovaný priamou injikáciou, zahrňujúci, okrem iného, injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu. Častice s naviazanými nukleotidmi vstupujú do hostiteľských buniek a exprimujú sa v biologicky účinnom množstve tak, že antigénové peptidové fragmenty sú prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC triedy a sú predkladané na membránovom povrchu bunky. Prezentácia na endogénnych membránach cieľových buniek zvyšuje indukciu antigén špecifických CTL, ktoré ďalej cirkulujú v cicavčom organizme a .tak ničia antigénov I. hostiteľskej neoplastické bunky alebo bunky infikované vírusmi.In another preferred embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with the polynucleotide-bound particles that is administered by direct injection, including, but not limited to, injection, dermal injection, lymphatic injection, and intravenous injection. The nucleotide-bound particles enter the host cells and are expressed in a biologically effective amount such that the antigenic peptide fragments are presented using the endogenous MHC class presentation pathway and are presented on the cell membrane surface. Presentation on endogenous membranes of the target cells increases the induction of antigen-specific CTLs, which further circulate in the mammalian organism and thus destroy the antigens of the I. host neoplastic or virus-infected cells.
V mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu sú častice s naviazaným polynukleotidom dodané do ludského hostitela subkutánnou injekciou a sú upravené tak, aby sa uľahčil fagozómom sprostredkovaný prenos do cytoplazmy APC, tu sa exprimujú v biologicky účinnej koncentrácii. Vynález dokazuje, že priama injekcia častíc s naviazanými polynukleotidmi (polynukleotidového komplexu) cestou subkutánnej inokulácie vedie k preniknutiu tohto komplexu do cieľových antigén prezentujúcich buniek . a antigén je potom exprimovaný v lymfoidnom tkanive.In a particularly preferred embodiment of the invention, the polynucleotide-bound particles are delivered to a human host by subcutaneous injection and are engineered to facilitate phagosome-mediated transfer to the cytoplasm of APCs, where they are expressed at a biologically effective concentration. The invention demonstrates that direct injection of particles with bound polynucleotides (polynucleotide complex) via subcutaneous inoculation results in penetration of this complex into target antigen-presenting cells. and the antigen is then expressed in lymphoid tissue.
V ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje subkutánna injekcia použitá na priame nasmerovanie inokula do APC častice s naviazaným polynukleotidom kódujúcim antigén (TRA) alebo jeho biologicky aktívny fragment. Špecificky nasmerované zavedenie častíc s naviazaným polynukleotidom kódujúcim TRA týmto spôsobom umožňuje zvýšiť vstup špecifických antigénových peptidov do spracovania v prezentačnej dráhe MHC antigénov I. triedy a zabráni tak vo väčšej miere translokácii imunizačných častíc v iných ako antigén prezentujúcich bunkách (APC).In another particularly preferred embodiment of the invention, the subcutaneous injection used to direct the inoculum directly into the APC particle is bound with a polynucleotide encoding an antigen (TRA) or a biologically active fragment thereof. The specifically directed introduction of particles with a TRA-encoding polynucleotide in this way makes it possible to increase the entry of specific antigen peptides into processing in the MHC class I antigen presentation pathway and thereby to a greater extent prevent translocation of immunizing particles in non-antigen presenting cells (APC).
V ďalšom mimoriadne výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje subkutánna injekcia použitá na priame nasmerovanie inokula do APC' častice s naviazaným polynukleotidom kódujúcim vírusový antigén alebo jeho biologicky aktívny fragment. Špecificky nasmerované zavedenie častíc s naviazaným polynukleotidom kódujúcim vírusový antigén týmto spôsobom umožňuje zvýšiť vstup špecifických antigénových peptidov do spracovania v prezentačnej dráhe MHC antigénov I. triedy a zabráni tak vo väčšej miere translokácii imunizačných častíc v πIn another particularly preferred embodiment of the invention, the subcutaneous injection used to direct the inoculum directly into the APC 'particle with the polynucleotide bound to the viral antigen or a biologically active fragment thereof is bound. Specifically directed introduction of polynucleotide-coupled particles encoding a viral antigen in this way allows for increased entry of specific antigenic peptides into processing in the MHC class I antigen presentation pathway, thereby preventing translocation of immunizing particles in π to a greater extent
iných ako antigén prezentujúcich bunkách (APC).other than antigen presenting cells (APC).
Odborníkom v danej oblasti je tiež známe, že častice vyrobené z rôznych materiálov, okrem iného napríklad zo zlata, železa a syntetických materiálov, môžu cez fagozóm vstúpiť do cytoplazmy antigén prezentujúcich buniek. Tento spôsob prenosu je vo vynáleze používaný na špecifické nasmerovanie APC.It is also known to those skilled in the art that particles made of various materials, including, but not limited to, gold, iron, and synthetic materials, can enter the cytoplasm of antigen-presenting cells through the phagosome. This transfer method is used in the invention to specifically target APC.
V nasledujúcom výhodnom uskutočnení sú cicavčie hostiteľské bunky imunizované injekciou, zahrňujúco okrem iného napríklad subkutánnu injekciu, epidermálnu injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu syngénnych antigén prezentujúcich buniek (APC), ktoré na svojom povrchu prezentujú antigén, ktorý do nich bol in vitro zavedený inkubáciou s časticami s naviazaným polynukleotidom.In the following preferred embodiment, the mammalian host cells are immunized by injection, including but not limited to subcutaneous injection, epidermal injection, dermal injection, lymphatic injection, and intravenous injection of syngeneic antigen presenting cells (APC), which present on their surface an antigen that has been in vitro introduced by incubation with the polynucleotide-bound particles.
Častice nesúce polynukleotid môžu napríklad vstupovať do antigén prezentujúcich buniek in vitro buď bombardovaním mikroprojektilmi, alebo prostredníctvom fagozómov. Špecificky sú cicavčie hostitelské bunky imunizované časticami nesúcimi polynukleotidy in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (APC), ktoré sú potom injikované do hostiteľského organizmu. Následne po príjme antigénu antigén prezentujúcimi bunkami sa transgénne polynukleotidy exprimujú v biologicky účinnom množstve tak, aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC antigénov I. triedy a sú · predkladané na membránovom povrchu antigén prezentujúcich buniek.For example, the polynucleotide-bearing particles may enter the antigen-presenting cells in vitro either by microprojectile bombardment or through phagosomes. Specifically, mammalian host cells are immunized with polynucleotide-bearing particles in vitro by transfecting antigen presenting cells (APCs), which are then injected into the host organism. Following antigen uptake by antigen-presenting cells, transgenic polynucleotides are expressed in a biologically effective amount such that the antigenic peptide fragments are processed and presented by the endogenous MHC class I antigen pathway and presented on the membrane surface of the antigen-presenting cells.
Po injekcii takto pripravených antigén prezentujúcich buniek dôjde na ich endogénnych bunkových membránach k prezentácii antigénu, ktorý odštartuje indukciu antigén12 špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidných tkanivách. Antigénom indukované špecifické cytotoxické T-lymfocyty (CTL) ďalej cirkulujú v cicavčom organizme, výhodne v ľudskom hostiteľovi, a tu ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.Upon injection of the antigen-presenting cells thus prepared, an antigen will be presented on their endogenous cell membranes, which will trigger the induction of antigen -12 specific cytotoxic T lymphocytes either at the injection site or in lymphoid tissues. Antigen-induced specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) further circulate in a mammalian organism, preferably a human host, and destroy neoplastic cells or virally infected cells.
V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, zahrňujúcou okrem iného napríklad subkutánnu injekciu, epidermálnu injekciu, dermálnu injekciu, lymfatickú injekciu a intravenóznu injekciu, obsahujúcou syngénne antigén prezentujúce bunky, ktoré boli podrobené in vitro transfekcii časticami nesúcimi polynukleotid. Cicavčí hostiteľ je pritom imunizovaný antigén prezentujúcimi bunkami, do ktorých boli transfekciou zavedené častice nesúce polynukleotid, a to tak, že častice s polynukleotidom vstúpili do APC in vitro a takto upravené antigén prezentujúce bunky (APC) sú potom injekciou vpravené do hostiteľského organizmu.In another preferred embodiment of the invention, the mammalian host is immunized by injection, including, but not limited to, subcutaneous injection, epidermal injection, dermal injection, lymphatic injection, and intravenous injection, containing syngeneic antigen-presenting cells that have been in vitro transfected with polynucleotide-bearing particles. The mammalian host is immunized with antigen-presenting cells into which the polynucleotide-bearing particles have been transfected by entering the polynucleotide particles into the APC in vitro, and the antigen-presenting cells (APC) are then injected into the host organism.
Častice nesúce polynukleotid môžu napríklad vstupovať do antigén prezentujúcich buniek in vitro buď ostreľovaním mikroprojektilmi alebo cestou využívajúcou prenos do cytoplazmy bunky cez fagozóm. Antigén prezentujúce bunky sú podrobené in vitro transfekcii antigénom, ktorý je kódovaný polynukleotidom a/alebo polynukleotidmi kódujúcimi molekulu alebo molekuly, ktoré zvyšujú účinnosť prezentačnej funkcie antigén prezentujúcich buniek. Takéto molekuly zahrňujú okrem iného napríklad cytokíny a stimulujúcich molekúl. Príklady cytokínov zahrňujú okrem iného napríklad IL-12, IL-2 a IL-4. Príklady stimulujúcich molekúl zahrňujú okrem iného napríklad antigény CD80 a CD86.For example, the polynucleotide-bearing particles may enter the antigen-presenting cells in vitro either by microprojectile bombardment or by a route utilizing transfer to the cell's cytoplasm through the phagosome. The antigen presenting cells are subjected to in vitro transfection with an antigen that is encoded by a polynucleotide and / or polynucleotides encoding a molecule or molecules that enhance the presentation function of the antigen presenting cells. Such molecules include, but are not limited to, cytokines and stimulating molecules. Examples of cytokines include, but are not limited to, IL-12, IL-2, and IL-4. Examples of stimulating molecules include, but are not limited to, CD80 and CD86 antigens.
Následne po vstupe do antigén prezentujúcich, buniek sa transgénny antigén kódovaný polynukleotidom exprimuje v biologicky účinnej koncentrácii tak, že antigénové peptidové fragmenty sú spracované a prezentované pomocou endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy a sú tak predložené na membránovom povrchu antigén prezentujúcich buniek (APC).Following entry into antigen-presenting cells, the transgenic antigen encoded by the polynucleotide is expressed at a biologically effective concentration such that the antigenic peptide fragments are processed and presented using the endogenous MHC class I antigen presentation pathway and are thus presented on the membrane surface of antigen presenting cells (APC). .
Po injekcii takýchto APC zvyšuje prezentácia antigénu na endogénnej bunkovej membráne takejto bunky indukciu cytotoxických T-lymfocytov. K tejto indukcii potom dochádza buď priamo v mieste injekcie alebo v lymfoidnom tkanive hostiteľa. Týmto antigénom indukované špecifické cytotoxické T-lymfocyty cirkulujú v cicavčom organizme, s výhodou v ľudskom organizme, a tak ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.Upon injection of such APCs, antigen presentation on the endogenous cell membrane of such a cell increases the induction of cytotoxic T-lymphocytes. This induction then occurs either directly at the injection site or in the lymphoid tissue of the host. The antigen-induced specific cytotoxic T lymphocytes circulate in a mammalian organism, preferably a human organism, and thus destroy neoplastic cells or virally infected cells.
Následne po vstupe do APC sa buď transgénny cytokín, alebo kostimulačná molekula, kódované polynukleotidom, exprimujú v biologicky účinnej koncentrácii tak, že vyvolajú funkciu prezentácie antigénu v APC, ktorá ďalej vyvolá indukciu antigén špecifickej odpovede, a to buď priamo v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive.Following entry into the APC, either the transgenic cytokine or the costimulatory molecule encoded by the polynucleotide is expressed at a biologically effective concentration by inducing an antigen presentation function in the APC, which in turn induces an antigen-specific response, either directly at the injection site or lymphoid tissue.
Odborníkom v danej oblasti je tiež dobre známe, že polynukleotidy môžu byť naviazané na častice zložené z rôznych materiálov, okrem iného napríklad zo zlata, železa a plastov.It is also well known to those skilled in the art that polynucleotides may be attached to particles composed of various materials, including, but not limited to, gold, iron, and plastics.
Odborníkom v danom odbore je ďalej dobre známe, že môžu byť použité rôzne rekombinantné vektory na to, aby generované transgénne sekvencie boli aplikované v požadovanej forme. Výhodný vektor, ktorý je uprednostňovaný kvôli tomu, že sa s ním veľmi dobre pracuje, je DNA plazmid.It is further well known to those skilled in the art that various recombinant vectors can be used to deliver the generated transgenic sequences in the desired form. A preferred vector, which is preferred because of its good handling, is the DNA plasmid.
Odborníkom v danej oblasti je ďalej dobre - známe, že antigén prezentujúce bunky môžu byť získané z rôznych hostiteľských tkanív, okrem iného napríklad z kostnej drene a periférnej krvi, a že menované antigén prezentujúce bunky môžu byť po in vitro manipulácii navrátené do daného hostiteľa.It is further well known to those skilled in the art that antigen-presenting cells can be obtained from a variety of host tissues, including but not limited to bone marrow and peripheral blood, and that said antigen-presenting cells can be returned to the host after in vitro manipulation.
Cieľom vynálezu je terapeutická alebo profylaktická génová imunizácia proti neoplastickým bunkám.It is an object of the invention to provide therapeutic or prophylactic gene immunization against neoplastic cells.
Ďalším cieľom vynálezu je terapeutická a profylaktická génová imunizácia proti vírusovým bunkám.A further object of the invention is therapeutic and prophylactic gene immunization against viral cells.
Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým smerovaním častíc nesúcich polynukleotidy, ktoré kódujú gény pre TRA (antigény spôsobujúce odmietnutie tumor), do hostiteľských antigén prezentujúcich buniek umiestnených v lymfoidnom tkanive hostiteľa alebo schopných migrovať do tohto tkaniva a tak sa podieľať na vyvolaní CTL odpovede.Another object of the invention is to gene immunize mammalian hosts, preferably humans, by specifically targeting polynucleotide-bearing particles encoding TRA (tumor rejection antigens) genes to host antigen-presenting cells located in or capable of migrating into the host's lymphoid tissue. participate in eliciting a CTL response.
Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým nasmerovaním častíc nesúcich polynukleotidy, ktoré kódujú gény vírusových antigénov do hostiteľských imunitných buniek, ktoré sa podieľajú na vyvolaní CTL odpovede.A further object of the invention is the gene immunization of mammalian hosts, preferably humans, by specifically targeting polynucleotide-bearing particles that encode viral antigen genes into host immune cells that are involved in eliciting a CTL response.
Ďalším cieľom vynálezu je génová imunizácia cicavčích hostiteľov, s výhodou ľudí, špecifickým nasmerovaním častíc nesúcich polynukleotidy kódujúce vírusové antigény do antigén prezentujúcich buniek umiestnených v lymfoidnom tkanive alebo schopných migrovať do tohto tkaniva a tak vyvolať CTL odpoveď.A further object of the invention is the gene immunization of mammalian hosts, preferably humans, by specifically targeting particles carrying polynucleotides encoding viral antigens to antigen presenting cells located in or capable of migrating into lymphoid tissue and thereby eliciting a CTL response.
Podrobný opis vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Termín „cicavčí hostite!,,, používaný v tomto vynáleze, , zahrňuje zástupcov živočíšnej, ríše vrátane okrem iného človeka.The term " mammalian host ", as used herein, includes representatives of the animal kingdom including, but not limited to, a human.
Termín „DNA fragment,,, používaný v tomto vynáleze, predstavuje akúkoľvek DNA alebo RNA nukleotidovú sekvenciu, ktorá obsahuje vhodnú kódujúcu oblasť a regulačné sekvencie, ktoré indukujú v cieľovej bunke expresiu antigénového proteínu alebo fragmentu antigénového proteínu, prezentovaného na bunkovej membráne prostredníctvom endogénnej prezentačnej dráhy MHC antigénov I. triedy.The term "DNA fragment", as used herein, means any DNA or RNA nucleotide sequence that includes a suitable coding region and regulatory sequences that induce expression in a target cell of an antigenic protein or antigenic protein fragment presented on a cell membrane via an endogenous presentation pathway. MHC class I antigens.
Termín „polynukleotid naviazaný na časticiach,,, používaný v tomto vynáleze, sa týka častíc vyrobených z rôznych materiálov, medzi ktoré patrí napríklad zlato, železo a syntetický plast, kde každá jednotlivá čiastočka obsahuje populáciu DNA fragmentov definovaných v predošlom odseku.The term "particle-bound polynucleotide" as used herein refers to particles made of a variety of materials, including, for example, gold, iron, and synthetic plastic, wherein each individual particle comprises a population of DNA fragments as defined in the preceding paragraph.
Vynález opisuje liečebnú alebo preventívnu genetickú imunizáciu cicavčieho hostiteľa, ktorá zahrňuje prenos DNA fragmentu k cieľovej bunke vnútri cicavčieho hostiteľa, expresiu tohto DNA fragmentu vnútri cieľovej bunky a následnú prezentáciu rekombinantného antigénového peptidu (rekombinantných antigénových peptidov) vnútri cieľovej bunky, čo vedie k stimulácii bunkovej či humorálnej imunity, poprípade oboch.The invention discloses therapeutic or preventive genetic immunization of a mammalian host comprising transferring a DNA fragment to a target cell within a mammalian host, expressing the DNA fragment within a target cell, and then presenting the recombinant antigen peptide (s) within the target cell, thereby stimulating the cell or cells. humoral immunity, or both.
Vynález sa ďalej týka liečebnej alebo preventívnej génovej imunizácie cicavčieho hostiteľa, ktorá zahrňuje prenos DNA fragmentu kódujúceho proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment k špecifickej cieľovej bunke vnútri cicavčieho hostiteľa. Antigénové peptidy vznikajúce expresiou z danej DNA sekvencie sú špecifické pre pozmenené bunky, akými sú napríklad bunky nádorové alebo bunky infikované vírusom. Dochádza k aktivácii cytotoxických T-lymfocytov (CTL) špecifických pre daný antigén a následne k cytotoxickej deštrukcii cieľových buniek, ktorými môžu byť napríklad bunky nádorové či bunky infikované vírusom.The invention further relates to therapeutic or preventive gene immunization of a mammalian host, which comprises transferring a DNA fragment encoding a protein or a biologically active fragment thereof to a specific target cell within the mammalian host. Antigenic peptides resulting from expression from a given DNA sequence are specific for altered cells, such as tumor cells or virus-infected cells. Activation of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) occurs, followed by cytotoxic destruction of the target cells, which may be, for example, tumor cells or virus-infected cells.
Vynález opisuje spôsob génovej imunizácie, ktorá slúži na liečbu či prevenciu nádorových ochorení či vírusových infekcií. Cytotoxické T-lymfocyty sú významnou zložkou imunitnej odpovede namierenej proti nádorom a vírusovým infekciám. Cytotoxické Tlymfocyty zabíjajú nádorové bunky a vírusom infikované bunky vďaka tomu, že dokážu rozpoznať antigénové peptidy prezentované molekulami MHC I: triedy na povrchu nádorových buniek. Tieto peptidy sú odvodené do nádorových antigénov, ktoré sú syntetizované pozmenenými bunkami a degradované v cytoplazme. Snahy indukovať nádorovo špecifické odpovede cytotoxických Tlymfocytov in vivo imunizáciou mŕtvymi nádorovými bunkami alebo ich stavebnými proteínmi bývajú spravidla neúspešné, pravdepodobne preto, že proteíny z extracelulárnej tekutiny nemôžu vstúpiť do cytoplazmy a nemajú teda možnosť byť prezentované prostredníctvom molekúl MHC I. triedy.The invention discloses a method of gene immunization for the treatment or prevention of cancer or viral infections. Cytotoxic T lymphocytes are an important component of the immune response against tumors and viral infections. Cytotoxic T lymphocytes kill tumor cells and virus-infected cells by recognizing antigenic peptides presented by MHC class I molecules on the surface of tumor cells. These peptides are derived into tumor antigens that are synthesized by the altered cells and degraded in the cytoplasm. Efforts to induce tumor-specific cytotoxic T lymphocyte responses in vivo by immunization with dead tumor cells or their building proteins tend to be unsuccessful, probably because proteins from the extracellular fluid cannot enter the cytoplasm and thus have no possibility of being presented by MHC class I molecules.
Špecifické uskutočnenie predkladaného vynálezu je spojené s genetickou imunizáciou pomocou častíc obsahujúcich DNA fragment, ktorého expresiou vzniká požadovaný protein. Takéto častice obsahujúce fragment DNA sú v ďalšom texte uvádzané ako „polynukleotid naviazaný na časticiach,,. V in vivo uskutočnení vynálezu sa ako najlepšie javí dodanie DNA fragmentu alebo požadovanej proteínovej častice do cieľovej hostiteľskej bunky v zloženej forme, napr. ako poťahované guľôčky alebo zlaté častice. Následne po podaní do cytoplazmy cieľovej hostiteľskej bunky je protein či biologicky aktívny fragment tohto proteínu touto bunkou exprimovaný. Exprimovaný proteín či proteínový fragment špecifický pre pozmenenú bunku poskytuje substrát na vytvorenie antigénového peptidu (antigénových peptidov) predkladaného T-lymfocytom prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy. Príslušná prezentácia požadovaného antigénového peptidu či antigénových peptidov prostredníctvom MHC molekúl I. triedy stimuluje produkciu cytotoxických látok T-lymfocytmi a tak zvyšuje deštrukciu pozmenených buniek.A specific embodiment of the present invention is associated with genetic immunization with particles comprising a DNA fragment, the expression of which produces the desired protein. Such particles comprising a DNA fragment are referred to hereinafter as "particle-bound polynucleotide." In an in vivo embodiment of the invention, delivery of the DNA fragment or protein of interest to the target host cell in a folded form, e.g. as coated beads or gold particles. Following administration to the cytoplasm of the target host cell, the protein or biologically active fragment of the protein is expressed by that cell. The expressed protein or protein fragment specific for the altered cell provides a substrate for the generation of the antigenic peptide (s) presented by the T lymphocyte via endogenous MHC class I molecules. Appropriate presentation of the desired antigen peptide (s) by class I MHC molecules stimulates the production of cytotoxic agents by T lymphocytes and thus increases the destruction of altered cells.
Vynález je založený na predpoklade, že DNA fragment exprimujúci TRA antigén alebo vírusový antigén alebo ich aktívne fragmenty môže byť špecificky nasmerovaný do cieľovej bunky a tu vyvolať kaskádu pochodov vedúcich k protinádorovej imunite sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi. Predkladaný vynález objasňuje indukciu imunity sprostredkovanej cytotoxickými T-lymfocytmi transfekciou cieľovej hostiteľskej bunky časticou obsahujúcou fragment DNA, ktorý kóduje antigénový proteín. Imunizujúci proteín je produkovaný intracelulárne a má teda prístup k MHC molekulám I. triedy. Výsledkom sú prirodzene spracované epitopy a transfekované bunky môžu. produkovať imunizujúci proteín po dobu niekoľkých dni, čím je potenciálne umožnená vyššia imunogénna stimulácia.The invention is based on the premise that a DNA fragment expressing a TRA antigen or a viral antigen or active fragments thereof can be specifically directed to a target cell and induce a cascade of processes leading to anti-tumor immunity mediated by cytotoxic T lymphocytes. The present invention elucidates the induction of cytotoxic T-cell mediated immunity by transfecting a target host cell with a particle comprising a DNA fragment that encodes an antigenic protein. The immunizing protein is produced intracellularly and thus has access to class I MHC molecules. The result is naturally processed epitopes and transfected cells can. to produce an immunizing protein for several days, potentially allowing for greater immunogenic stimulation.
V špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou bombardovania mikroprojektilom. Toto nešpecifické bombardovanie je uskutočnené, tak, aby jeho výsledkom bol vstup polynukleotidu naviazaného na časticiach do cytoplazmy dostatočného počtu hostiteľských buniek. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu medzi tieto hostiteľské bunky patria antigén prezentujúce bunky (APC), vynález však nie je obmedzený len na ne. V prípade bombardovania kože patria medzi APC, ktoré môžu byť zasiahnuté bombardovaním epidermálne Langerhansove bunky, keratinocyty alebo kožné dendritické bunky. V prípade bombardovania lymfoidného tkaniva patria medzi antigén prezentujúce bunky, ktoré môžu byť zasiahnuté bombardovaním dendritické bunky, makrofágy, bunky strómy, T-lymfocyty alebo B-lymfocyty. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnom množstve, takže je peptidových fragmentov zaistené spracovanie antigénových a ich prezentácia prostredníctvom endogénnych MHC molekúl I. triedy na membránach APC buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne APC podporuje indukciu antigén špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania alebo v lymfoidnom tkanive, kam sú bombardované bunky prenesené. Indukované antigén špecifické CTL cirkulujú v čelom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu v ľudskom, hostiteľovi s cieľom zničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.In a specific embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with a particle-bound polynucleotide by microprojectile bombardment. This non-specific bombardment is performed so as to result in the particle-bound polynucleotide entering the cytoplasm of a sufficient number of host cells. In a preferred embodiment of the invention, these host cells include, but are not limited to, antigen presenting cells (APCs). In the case of skin bombardment, APCs that may be affected by bombardment are epidermal Langerhans cells, keratinocytes or skin dendritic cells. In the case of lymphoid tissue bombardment, antigen-presenting cells that may be affected by bombardment include dendritic cells, macrophages, stroma cells, T-lymphocytes or B-lymphocytes. The transgenic polynucleotide is expressed in a biologically effective amount so that peptide fragments are provided for antigen processing and presentation by endogenous MHC class I molecules on APC cell membranes. Endogenous antigen presentation on the APC membrane promotes the induction of antigen-specific CTLs either directly at the bombardment site or in lymphoid tissue where the bombarded cells are transferred. Induced antigen-specific CTLs circulate in a frontal mammal, preferably a human, host to destroy tumor cells or cells infected with a virus.
Imunizácia cicavčieho hostiteľa polynukleotidom naviazaným na časticiach môže byť uskutočnená pomocou biolistického (biobalistického) podania tak, že polynukleotid naviazaný na časticiach vstupuje do hostiteľských buniek, medzi ktoré patrí APC, prostredníctvom fagozómov. Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú prostredníctvom fagozómov do buniek buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste bombardovania (v koži či v lymfoidnom tkanive). Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostiteľskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické cytotoxické T-lymfocyty cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cieľom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.Immunization of a mammalian host with a particle-bound polynucleotide can be accomplished by biolistic (biobalistic) administration such that the particle-bound polynucleotide enters host cells, such as APC, through phagosomes. Particle-bound polynucleotides enter the cells via phagosomes either after they have been transferred to lymphoid tissue or directly at the site of the bombardment (skin or lymphoid tissue). Thus, the polynucleotides bound to the particles can enter the lymphoid tissue in two ways. Either the particle-bound polynucleotides are delivered to the lymphoid tissue where they are subsequently taken up by the cells of that tissue, or cells that have previously received the polynucleotides bound to the particles are transferred to the lymphoid tissue. The particle-bound polynucleotide is expressed in a biologically effective amount upon ingestion by the host cell, thereby ensuring processing of the antigenic peptide fragments by endogenous MHC class I molecules on the membranes of the antigen-presenting cells. Endogenous antigen presentation on the membrane of antigen presenting cells promotes the induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes either directly at the bombardment site or in lymphoid tissue. The induced antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes circulate throughout the mammalian, preferably human, host to destroy tumor cells or cells infected with the virus.
V inom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou injekcie. Môž ísť napríklad o injekciu subkutánnu, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú či intravenóznu. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po vstupe do hostiteľských buniek exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čim je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov a ich prezentácia prostredníctvom endogénnych MHC molekúl I. triedy na membránach APC buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne APC podporuje indukciu antigén-špecifických T-lymfocytov, ktoré cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľovi s cieľom zničiť nádorové bunky či bunky infikované.vírusom.In another embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with the particle-bound polynucleotide by injection. This may be, for example, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic or intravenous injection. The particle-bound polynucleotide is expressed in a biologically effective amount upon entry into host cells, thereby ensuring processing of antigenic peptide fragments and their presentation by endogenous MHC class I molecules on APC cell membranes. The endogenous presentation of the antigen on the APC membrane promotes the induction of antigen-specific T lymphocytes that circulate throughout the mammalian, preferably human, host to destroy tumor cells or virus-infected cells.
Cicavčí hostiteľ môže byť imunizovaný tak, že polynukleotid naviazaný na časticiach špecificky vstúpi do hostiteľských buniek, vrátane APC, prostredníctvom fagozómov. Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú do hostiteľských buniek prostredníctvom fagozómov buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste injekcie. Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostitelskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické CTL cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cielom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.The mammalian host may be immunized such that the particulate polynucleotide specifically enters host cells, including APCs, via phagosomes. The particulate polynucleotides enter the host cells via phagosomes either after they have been transferred to lymphoid tissue or directly at the injection site. Thus, the polynucleotides bound to the particles can enter the lymphoid tissue in two ways. Either the particle-bound polynucleotides are delivered to the lymphoid tissue where they are subsequently taken up by the cells of that tissue, or cells that have previously received the polynucleotides bound to the particles are transferred to the lymphoid tissue. The particulate polynucleotide is expressed in a biologically effective amount upon ingestion by the host cell, thereby ensuring processing of the antigenic peptide fragments by endogenous MHC class I molecules on the membranes of the antigen presenting cells. Endogenous antigen presentation on the membrane of antigen presenting cells promotes the induction of antigen-specific CTLs either directly at the bombardment site or in lymphoid tissue. The induced antigen-specific CTLs circulate throughout the mammalian, preferably human, host to destroy tumor cells or virus-infected cells.
V inom uskutočnení tohto vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou injekcie. Môže ísť napríklad o injekciu subkutánnu, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú či intravenóznu. Zloženie polynukleotidu naviazaného na časticiach je navrhnuté tak, aby v ňom boli obsiahnuté špecifické molekuly, ktoré zaistia ľahkú fagocytózu (t.j. napríklad prostredníctvom receptorov pre manózu či. prostredníctvom Fc receptorov),alebo tak, aby uľahčovalo prístup častice k cytoplazme (t.j. napríklad pomocou membránových fúznych proteínov, akými sú napríklad vírusový HA proteín či proteín lysterolyzín) . Polynukleotidy naviazané na časticiach vstupujú do hostiteľských buniek prostredníctvom fagozómov buď potom, čo sú prenesené do lymfoidného tkaniva, alebo priamo v mieste injekcie. Polynukleotidy naviazané na časticiach teda môžu do lymfoidného tkaniva vstupovať dvoma spôsobmi. Buď sú polynukleotidy naviazané na časticiach dopravené do lymfoidného tkaniva, kde sú následne prijímané bunkami tohto tkaniva, alebo sú do lymfoidného tkaniva prenesené bunky, ktoré prijali polynukleotidy naviazané na časticiach už predtým. Polynukleotid naviazaný na časticiach je po prijatí hostitelskou bunkou exprimovaný v biologicky účinnom množstve, čím je zaistené spracovanie antigénových peptidových fragmentov prostredníctvom endogénnych molekúl MHC I. triedy na membránach antigén prezentujúcich buniek. Endogénna prezentácia antigénu na membráne antigén prezentujúcich buniek podporuje indukciu antigén-špecifických CTL buď priamo v mieste bombardovania, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigénšpecifické CTL cirkulujú v celom cicavčom, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudskom, hostiteľova s cieľom ničiť nádorové bunky či bunky infikované vírusom.In another embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with the particle-bound polynucleotide by injection. This may be, for example, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic or intravenous injection. The particle-bound polynucleotide composition is designed to contain specific molecules that provide light phagocytosis (eg, via mannose receptors or Fc receptors), or to facilitate particle access to the cytoplasm (eg, via membrane fusion). proteins such as viral HA protein or lysterolysin). The particulate polynucleotides enter the host cells via phagosomes either after they have been transferred to lymphoid tissue or directly at the injection site. Thus, the polynucleotides bound to the particles can enter the lymphoid tissue in two ways. Either the particle-bound polynucleotides are delivered to the lymphoid tissue where they are subsequently taken up by the cells of that tissue, or cells that have previously received the polynucleotides bound to the particles are transferred to the lymphoid tissue. The particulate polynucleotide is expressed in a biologically effective amount upon ingestion by the host cell, thereby ensuring processing of the antigenic peptide fragments by endogenous MHC class I molecules on the membranes of the antigen presenting cells. Endogenous antigen presentation on the membrane of antigen presenting cells promotes the induction of antigen-specific CTLs either directly at the bombardment site or in lymphoid tissue. The induced antigen-specific CTLs circulate throughout the mammalian, preferably human, host, in order to kill tumor cells or virus-infected cells.
Vynález je priblížený niekoľkými príkladmi využívajúcimi myší model podrobne opísaný v príklade 2. Hlavným obmedzením pri štúdiu antigén-špecifickej nádorovej imunity na myšom modeli je absencia jednotného tumorového antigénu, ktorý by bol rozoznávaný CTL spolupracujúcimi s MHC I. triedy. Vzhľadom k tomu, že TRA nie sú nijako principiálne odlišné od ďalších bunkových proteínov až na skutočnosť, že hostiteľ k nim nie je tolerantný, možno na rovnaký účel použiť cudzí antigén syntetizovaný nádorom. Spôsoby nádorovej imunizácie podľa vynálezu sú veľmi uľahčené použitím myšieho melanómového modelu s definovaným endogénne syntetizovaným TRA, ktorým je gén pre OVA transfekovaný do melanómu BI6 odvodenému z myšej línie C57B1/6. Tento systém je výhodný z niekoľkých dôvodov: (1) melanóm BI6 je veľmi dobre preštudovaný myší nádor, (2) rastové charakteristiky in vivo a schopnosť metastázovať sú u tohto nádoru veľmi dobre známe, (3) ovalbumín má tiež dobre definovanú štruktúru. Spôsob spracovania a prezentácie OVA v bunkách myšej línie C57BL/6 je tiež dobre známy. Je dokonca známa štruktúra spracovaného peptidu prezentovaného pomocou MHCThe invention is illustrated by several examples using the mouse model detailed in Example 2. The main limitation in the study of antigen-specific tumor immunity in the mouse model is the absence of a single tumor antigen recognized by CTLs cooperating with MHC class I. Since TRAs are not principally different from other cellular proteins, except that the host is not tolerant to them, foreign tumor synthesized antigen can be used for the same purpose. The tumor immunization methods of the invention are greatly facilitated by using a mouse melanoma model with defined endogenously synthesized TRA, which is an OVA gene transfected into melanoma BI6 derived from mouse C57B1 / 6 line. This system is advantageous for several reasons: (1) melanoma BI6 is a very well studied mouse tumor, (2) in vivo growth characteristics and the ability to metastasize in this tumor is well known, (3) ovalbumin also has a well defined structure. The method of processing and presentation of OVA in C57BL / 6 mouse cells is also well known. The structure of the processed peptide presented by MHC is even known
I. triedy Kb. Tiež sú známe spôsoby stanovenia funkčnej expresie ovalbumínového peptidu (SIINFEKL) asociovaného s H2Kb využívajúce T-T hybridom 33.70.AI anti-OVA-Kb, pozri Kovacovics-Bankowski a kol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: strana 4942 až 4946). Spôsoby stanovenia in vivo indukcie cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou proti OVA sú v tomto systéme tiež dobre opísané (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785).Class I K b . Also Assays for the functional expression of ovalbumin peptide (SIINFEKL) associated with the H2K b TT hybridoma 33.70.AI using anti-OVA-K b, Kovacovics-Bankowski, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4942-4946). Methods for determining the in vivo induction of OVA-specific cytotoxic T lymphocytes are also well described in this system (Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785).
Jedno z uskutočnení vynálezu je imunizácia zvoleným polynukleotidom naviazaným na časticiach pomocou biolistického (biobalistického) zariadenia. Cicavčí hostite! je biobalisticky imunizovaný polynukleotidom naviazaným na časticiach tak, že prijatie tohto polynukleotidu v transfekovaných bunkách vyvolá sériu biologických udalostí, ktoré vedú k vzniku ochrannej imunity proti smrteľnému nádorovému ochoreniu. Vynález je niekoľkokrát opísaný na príklade kožného podania antigénu pomocou biobalistického zariadenia. Po prvé, preniknutie polynukleotidu naviazaného na časticiach a kódujúceho cudzorodý proteín β-gal vedie k expresii proteínu β-gal ako v epiderme tak aj v lymfatických uzlinách. Taktiež imunizácia pomocou OVA vedie k indukcii cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou k ovalbumínu. Po tretie, pri použití modelu OVA B-16 bolo preukázané, že zvieratá imunizované pomocou OVA sú chránené prd vznikom nádoru exprimujúceho OVA proteín a táto ochrana je antigénovo špecifická a závislá na CTL. Mechanizmus tejto ochrany je zložitejší ako kožné podanie na časticiach polynukleotidov viazaných na časticiach pomocou biobalistického zariadenia. Na indukciu antigén špecifických CTL z ich prekurzorov je nevyhnutné špecifické zamierenie polynukleotidu na fygocytujúce APC a/alebo expresia antigénu v lymfoidnom tkanive. Preto vo výhodnom uskutočnení vynálezu je cieľovou bunkou fagocytujúca APC a výhodne APC umiestnená v lymfoidnom tkanive alebo APC, ktorá do neho môže migrovať.One embodiment of the invention is immunization with a selected particulate polynucleotide using a biolistic (biobalistic) device. Mammalian host! is biobalistically immunized with a particle-bound polynucleotide such that the uptake of the polynucleotide in the transfected cells induces a series of biological events that result in protective immunity against a fatal cancer. The invention is described several times by way of example by the skin administration of an antigen by means of a biobalistic device. First, penetration of the particle-bound polynucleotide encoding the foreign β-gal protein leads to expression of the β-gal protein in both the epidermis and lymph nodes. Also, immunization with OVA leads to the induction of ovalbumin specific cytotoxic T lymphocytes. Third, using the OVA B-16 model, it has been shown that animals immunized with OVA are protected from the development of a tumor expressing the OVA protein and this protection is antigen specific and CTL dependent. The mechanism of this protection is more complex than cutaneous administration on particles of polynucleotides bound to the particles using a biobalistic device. In order to induce antigen specific CTLs from their precursors, specific targeting of the polynucleotide to phygocytic APCs and / or antigen expression in lymphoid tissue is necessary. Therefore, in a preferred embodiment of the invention, the target cell is phagocytic APC and preferably APC is located in lymphoid tissue or APC that can migrate therein.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný priamo injikovaným polynukleotidom naviazaným na časticiach, pričom injekčné podanie zahrňuje okrem iného napríklad podkožnú, epidermálnu, dermálnu, lymfatickú a intravenóznu injekciu. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnej koncentrácii tak, aby fragmenty antigénových peptidov boli produkované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchu APC buniek.In another embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with directly injected particle-bound polynucleotide, wherein the injection includes, but is not limited to, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic and intravenous injection. The transgenic polynucleotide is expressed at a biologically effective concentration such that antigenic peptide fragments are produced and presented by the endogenous MHC class I pathway and displayed on the surface of APC cells.
Prezentácia na bunkovej membráne APC urýchli indukciu antigénovo špecifických cytotoxických T-lymfocytov, ktoré obiehajú v tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ľudského hostiteľa a ničia nádorové alebo vírusovo infikované bunky.APC cell membrane presentation will accelerate the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes that circulate in the body of a mammalian host, in a preferred embodiment of the human host invention, and destroy tumor or virally infected cells.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú cieľové cicavčie bunky imunizované pomocou priamej injekcie polynukleotidov naviazaných na časticiach fagocytujúcej APC. Transgénny polynukleotid je exprimovaný v biologicky účinnej koncentrácii, takže antigénové peptidové fragmenty sú prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchu membrány antigén prezentujúcich buniek (APC). Prezentácia na bunkovej membráne APC spustí a zosilní indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL), ktoré sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa a ničia neoplastické bunky alebo vírusovo infikované bunky.In a preferred embodiment of the invention, the target mammalian cells are immunized by direct injection of polynucleotides bound to the particles of the phagocytic APC. The transgenic polynucleotide is expressed at a biologically effective concentration such that antigenic peptide fragments are presented by the endogenous MHC class I pathway and displayed on the membrane surface of antigen presenting cells (APCs). APC cell membrane presentation triggers and enhances the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs), which are circulated throughout the body of the mammalian host and killing neoplastic cells or virally infected cells.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je polynukleotid viazaný na časticiach ľudskému hostiteľovi podaný formou podkožnej injekcie. Vynález opisuje skutočnosť, že priama injekcia komplexu polynukleotidu naviazaného na časticiach vedie k cielenému dodaniu fagocytujúcej APC a génovej expresii v lymfoidnom tkanive. Toto cielené dodanie fagocytujúcim antigén prezentujúcim bunkám a/alebo táto génová expresia v lymfoidnom tkanive po subkutánnom podaní má za následok výrazne vyššiu indukciu antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL) z naivných prekurzorov.In a preferred embodiment of the invention, the particle-bound polynucleotide is administered to the human host by subcutaneous injection. The invention describes the fact that direct injection of a particle-bound polynucleotide complex results in targeted delivery of phagocytic APCs and gene expression in lymphoid tissue. This targeted delivery of phagocytic antigen-presenting cells and / or this gene expression in lymphoid tissue after subcutaneous administration results in a significantly higher induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) from naive precursors.
Vynález teda hlavne opisuje DNA fragmenty kódujúce proteín alebo jeho biologicky aktívny fragment, ktorý je schopný vstúpiť do antigén prezentujúcich buniek a byť v týchto bunkách exprímovaný. Požadovaný antigén je exprímovaný v cytoplazme APC a potom ďalej spracovaný dráhou MHC I. triedy, čo umožní týmto antigén prezentujúcim bunkám podieľať sa na indukcii antigén-špecifických CTL. Údaje uvedené v tomto opise podporujú nový predpoklad, že najúčinnejším spôsobom ako indukovať takéto antigén-špecifické cytotoxické T-lymfocyty je priamy prenos genetického materiálu do antigén prezentujúcich buniek APC schopných prejsť do lymfoidného tkaniva.In particular, the invention provides DNA fragments encoding a protein or a biologically active fragment thereof, which is capable of entering into and expressing antigen-presenting cells. The antigen of interest is expressed in the cytoplasm of APC and then further processed by the MHC class I pathway, allowing these antigen presenting cells to participate in the induction of antigen-specific CTLs. The data presented in this disclosure supports the new assumption that the most effective way to induce such antigen-specific cytotoxic T lymphocytes is by direct transfer of genetic material to antigen-presenting APCs capable of passing into lymphoid tissue.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekcie obsahujúcej syngénne APC prezentujúce antigén získaný po in vitro aplikácii polynukleotidu viazaného na časticiach. V zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou APC, ktoré boli transfekované polynukleotidom viazaným na časticiach tak, aby tento polynukleotid bol APC bunkami prijatý in vitro a tieto antigén prezentujúce bunky sú potom injikované hostitelovi. Po vstupe transgénneho polynukleotidu do APC je tento exprímovaný za dosiahnutia biologicky účinnej koncentrácie .tak aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení ľudského hostiteľa, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.In another embodiment of the invention, the mammalian host is immunized by injection, including, for example, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic and intravenous injection containing syngeneic APC presenting the antigen obtained after in vitro administration of the particle-bound polynucleotide. In a particular embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with APCs that have been transfected with a particle-bound polynucleotide such that the polynucleotide is taken up by the APC cells in vitro and these antigen-presenting cells are then injected into the host. Upon entry of the transgenic polynucleotide into the APC, it is expressed to obtain a biologically effective concentration so that the antigenic peptide fragments are processed and presented by the endogenous MHC class I pathway and exposed to the surface membrane of the antigen presenting cells. Thus, upon injection of these APCs, antigen presentation on their cell membranes induces the formation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes either at the injection site or in lymphoid tissue. Induced CTLs are distributed throughout the body of the mammalian host, preferably a human host, and destroy neoplastic or virally infected cells.
V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej lymfatickej a intravenóznej injekcie, obsahujúcou syngénne APC prezentujúce antigén získaný in vitro spoločnou inkubáciou s polynukleotidom viazaným na časticiach. Vo zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou - APC, ktoré boli transfekované polynukleotidom viazaným na polynukleotid bol prijatý časticiach tak, aby tento do cytoplazmy APC buniek prostredníctvom fagozómov a tieto antigén prezentujúce bunky sú potom injikované hostiteľovi. Po vstupe transgénneho polynukleotidu do APC je tento exprimovaný za dosiahnutia biologicky účinnej koncentrácie tak aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigénšpecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostiteľa, vo výhodnom uskutočnení ľudského hostiteľa, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.In another specific embodiment of the invention, the mammalian host is immunized by injection, including, for example, subcutaneous, epidermal, dermal lymphatic and intravenous injection, comprising syngeneic APC presenting the antigen obtained in vitro by co-incubation with the particle-bound polynucleotide. In a particular embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with - APCs that have been transfected with the polynucleotide bound to the polynucleotide has been taken up by particles so that it is injected into the cytoplasm of the APC cells by phagosomes and these antigen presenting cells are then injected. Upon entry of the transgenic polynucleotide into the APC, it is expressed to achieve a biologically effective concentration such that the antigenic peptide fragments are processed and presented by the endogenous MHC class I pathway and exposed to the surface membrane of antigen presenting cells. Thus, upon injection of these APCs, antigen presentation on their cell membranes induces the formation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes either at the site of injection or in lymphoid tissue. Induced CTLs are distributed throughout the body of the mammalian host, preferably a human host, and destroy neoplastic or virally infected cells.
V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekcie, obsahujúcou syngénne APC prezentujúce antigén získaný in vitro pomocou polynukleotidu viazaného na časticiach. V tomto zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostiteľ imunizovaný pomocou APC, ktoré boli transfekované in vitro bombardovaním mikroprojektilmi obsahujúcimi polynukleotid viazaný na časticiach. Po tejto expozícii mikroprojektilom s transgénnym polynukleotidom exprimujú tieto antigén prezentujúce bunky požadovaný antigén v biologicky účinnej koncentrácii tak, aby boli antigénové peptidové fragmenty spracované a prezentované endogénnou dráhou MHC I. triedy a vystavené na povrchovej membráne antigén prezentujúcich buniek. Po injekcii týchto APC tak prezentácia antigénu na ich bunkových membránach indukuje vznik antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostitela, vo výhodnom uskutočnení ludského hostitela, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.In another specific embodiment of the invention, the mammalian host is immunized by injection, including, for example, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic and intravenous injection, comprising syngeneic APC presenting an antigen obtained in vitro using a particle-bound polynucleotide. In this particular embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with APCs that have been transfected in vitro by bombardment with microprojectiles containing the particle-bound polynucleotide. Following exposure to the transgenic polynucleotide microprojectile, these antigen-presenting cells express the desired antigen at a biologically effective concentration such that the antigen peptide fragments are processed and presented by the endogenous MHC class I pathway and exposed to the surface membrane of antigen-presenting cells. Thus, upon injection of these APCs, antigen presentation on their cell membranes induces the formation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes either at the injection site or in lymphoid tissue. Induced CTLs are circulated throughout the mammalian host's body, preferably a human host, and destroy neoplastic or virally infected cells.
injikované hostitelovi. polynukleotidy vniknú časticiach viazané buď bombardovaníminjected to the host. polynucleotides penetrate particles bound either by bombardment
V ďalšom špecifickom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostitel imunizovaný injekciou, vrátane napríklad subkutánnej, epidermálnej, dermálnej, lymfatickej a intravenóznej injekciu, obsahujúcou syngénne APC transfekované in vito polynukleotidom viazaným na časticiach. V tomto zvláštnom uskutočnení vynálezu je cicavčí hostitel imunizovaný pomocou APC, ktoré boli in vitro transfekované tak, že do nich bol in vito vpravený polynukleotid viazaný na časticiach a potom sú tieto APC Tieto na do bunky mikroprojektilmi alebo prostredníctvom fagozómov. APC bunky sa in vito transfekujú polynukleotidmi, ktoré kódujú antigén a/alebo molekulu alebo molekuly, ktoré zvyšujú účinnosť prezentácie antigénu na povrchu APC. Takýmito molekulami sú okrem iného napríklad cytokíny ako sú IL-12, IL-2 a/alebo IL-4 a/alebo kostimulačné molekuly ako sú CD80 a/alebo CD86. Po vstupe do antigén prezentujúcej bunky sú tieto polynukleotidy kódujúce transgénne antigény exprimované tak, aby bola dosiahnutá biologicky účinná koncentrácia a peptidové. fragmenty týchto antigénov mohli byť spracované a prezentované cez endogénnu dráhu MHC I. triedy na povrchovej membráne APC. Po injekcii takýchto antigén prezentujúcich buniek a prezentácii antigénu na ich bunkových membránach dôjde k zosilneniu indukcie antigén-špecifických cytotoxických T-lymfocytov (CTL) buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive. Indukované antigén-špecifické CTL sú roznášané obehom po celom tele cicavčieho hostitela, vo výhodnom uskutočnení vynálezu ludského hostitela, a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky. Polynukleotidy kódujúce transgénne cytokíny a/alebo kostimulačné faktory sú po vstupe do APC tiež exprimované do takej miery, aby ich koncentrácia bola biologicky účinná a teda aby prezentácia antigénu na povrchu APC viedla k vyvolaniu antigén-špecifickej imunitnej odpovede buď v mieste injekcie, alebo v lymfoidnom tkanive.In another specific embodiment of the invention, the mammalian host is immunized by injection, including, for example, subcutaneous, epidermal, dermal, lymphatic and intravenous injection, comprising syngeneic APCs transfected in vitro with a particle-bound polynucleotide. In this particular embodiment of the invention, the mammalian host is immunized with APCs that have been transfected in vitro by incorporating the in-situ polynucleotide bound to the particles and then these APCs are introduced into the cell by microprojectiles or by phagosomes. APC cells are in vitro transfected with polynucleotides that encode an antigen and / or molecule or molecules that enhance the efficiency of antigen presentation on the surface of APCs. Such molecules are, for example, cytokines such as IL-12, IL-2 and / or IL-4 and / or costimulatory molecules such as CD80 and / or CD86. Upon entry into the antigen-presenting cell, these polynucleotides encoding transgenic antigens are expressed to achieve a biologically effective concentration and peptide. fragments of these antigens could be processed and presented through the endogenous MHC class I pathway on the APC surface membrane. Upon injection of such antigen-presenting cells and antigen presentation on their cell membranes, the induction of antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) at either the injection site or lymphoid tissue is enhanced. Induced antigen-specific CTLs are circulated throughout the mammalian host body, in a preferred embodiment of the human host invention, and destroy neoplastic or virally infected cells. Polynucleotides encoding transgenic cytokines and / or costimulatory factors are also expressed upon entry into APC to such an extent that their concentration is biologically effective and thus presentation of the antigen on the surface of the APC leads to eliciting an antigen-specific immune response either at the injection site or lymphoid tissue.
Odborník dokáže vložiť antigén spôsobujúci odmietnutie nádoru (TRA) alebo lubovolný vírusový antigén do systému podlá vynálezu. Príklady v súčasnosti dostupných TRA zahrňujú okrem iného napríklad MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, tyrozináza, Melan-A (MART-1), gplOO (pmell7), gp 75 (TRPÍ), CEA (karcino embryonálny antigén), ako aj antigény z tumorov spôsobených vírusmi HPV, HBV a EBV, ako aj onkogény asociované s tumormi/antigény kódované mutovanými génmi pre supresory tumorov, ako napríklad p53, pl6, RAS, HER2/neu, C-ABL a polymorfné antigény endoteliálneho mucínu (pozri súhrnný článok Maeuer a kol., 1996, Cancer Vaccines v Clinical Immunology Principles and ‘ Practice, nakladateľstvo Mosby, kapitola 123, strana 1904 až 1918 a Van den Eydne a kol., 1995, J. Exp. Med. 182: strana 689 až 698). Príklady dostupných prístupných vírusových antigénov zahrňujú okrem iného napríklad nukleoproteín vírusu chrípky (Donelly a kol, 1995, Náture Med. 1: strana 583 až 587), HIV gpl20, HIVgpl60 a povrchový antigén vírusu hepatitídy B (pozri súhrnný článok Pardoll aOne skilled in the art can insert a tumor rejection antigen (TRA) or any viral antigen into the system of the invention. Examples of currently available TRA include, but are not limited to, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, tyrosinase, Melan-A (MART-1), gp100 (pmell7), gp 75 (TRPI), CEA (carcino embryonic antigen) as well as tumor antigens from HPV, HBV and EBV as well as tumor-associated oncogenes / antigens encoded by mutated tumor suppressor genes such as p53, p16, RAS, HER2 / neu, C-ABL and endothelial mucin polymorphic antigens (see review by Maeuer et al., 1996, Cancer Vaccines in Clinical Immunology Principles and 'Practice, Mosby, Chapter 123, pp. 1904-1918 and Van den Eydne et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 689-698). Examples of available accessible viral antigens include, but are not limited to, influenza virus nucleoprotein (Donelly et al., 1995, Nature Med. 1: 583-587), HIV gp120, HIVgp160, and hepatitis B virus surface antigen (see review by Pardoll and
Beckerleg,1995, Immmunity 3: strana 165 až 169).Beckerleg, 1995, Immmmunity 3: 165-169).
Odborníkom v odbore je známe, že na konštrukciu rekombinantného vektoru môže byť použitý ľubovoľný dostupný eukaryotický promótor a/alebo enhancer schopný zosilniť expresiu transgénnej sekvencie DNA spolu s ľubovoľnou časticou za vzniku polynukleotidu viazaného na časticiach podľa vynálezu. Medzi takéto fragmenty promótorových sekvencií patrí okrem iného napríklad promótor cytomegalovírusu (CMV), promótor vírusu Rousovho sarkómu .(RSV), promótor vírusu myšej leukémie (MLV), promótor β-aktínu ako aj ľubovoľný bunkovo špecifický promótor alebo enhancer, o ktorom je známe, že je v cieľovej bunke aktívny.It is known to those skilled in the art that any available eukaryotic promoter and / or enhancer capable of enhancing expression of the transgenic DNA sequence together with any particle can be used to construct the recombinant vector to produce a polynucleotide bound to the particles of the invention. Such promoter sequence fragments include, but are not limited to, the cytomegalovirus (CMV) promoter, the Rous sarcoma virus (RSV) promoter, the mouse leukemia virus (MLV) promoter, the β-actin promoter as well as any cell-specific promoter or enhancer known that it is active in the target cell.
Výhodným uskutočnením vynálezu je použitie DNA viazanej na časticiach na dopravu nukleovej kyseliny kódujúcej tumorový alebo vírusový antigén špecificky do APC v lymfoidnom tkanive, alebo do antigén prezentujúcich buniek schopných vstúpiť do lymfoidného tkaniva tak, aby došlo k stimulácii antigénšpecifických CTL. Tieto cytotoxické T-lymfocyty sú potom rozvádzané do tela hostiteľa a ničia neoplastické alebo vírusovo infikované bunky.A preferred embodiment of the invention is the use of particle-bound DNA to deliver a nucleic acid encoding a tumor or viral antigen specifically to APCs in lymphoid tissue, or antigen presenting cells capable of entering lymphoid tissue to stimulate antigen-specific CTLs. These cytotoxic T lymphocytes are then distributed to the host and destroy neoplastic or virally infected cells.
Protinádorová imunita založená na výhodnom spôsobe použitia subkutánnej injekcie indukujúcej špecifickú odpoveď v antigén prezentujúcich bunkách lymfatických uzlín je opísaná v príkladoch 1, 2 a 3. Nasledujúce príklady sú uvedené na ilustráciu uskutočnenia vynálezu a nie sú v žiadnom prípade obmedzujúce.Antitumor immunity based on a preferred method of using a subcutaneous injection inducing a specific response in antigen presenting lymph node cells is described in Examples 1, 2 and 3. The following examples are provided to illustrate embodiments of the invention and are not in any way limiting.
Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Obrázok 1 znázorňuje funkčnú prezentáciu ovalbumínu transfekovanými nádorovými bunkami línií M04 a EG7. Mikrokultúry boli pripravené z T-lymfocytov hybridómu RF33.70 (anti-OVA + Kb) a uvedeného množstva netransfekovaných (krúžky) (prázdne symboly) alebo transfekovaných (štvorčeky) a nádorových buniek v prítomnosti neprítomnosti (vyplnené symboly) dodaného exogénneho ovalbumínového peptidu SIINFEKL (10 ng/ml), pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45: strana 804 až 811. Po 18 hodinovej inkubácii boli odobraté supernatanty a bol v nich stanovený IL-2 ' pomocou indikátorovej bunkovej línie HT2 (pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45: strana 804 až 811). Obrázok A znázorňuje bunkovú líniu B16 a ovalbumínom transfekovaný subklon MO4, obrázok B potom líniu EL4 a ovalbumínom transfekovaný subklon EG7. Prezentácia ovalbumínových (OVA)peptidov transfekovanými nádorovými bunkami nebola významne zvýšená v prítomnosti exogénneho peptidu SIINFEKL v testovaných kultúrach.Figure 1 shows functional presentation of ovalbumin by transfected tumor cells of the M04 and EG7 lines. Microcultures were prepared from RF33.70 hybridoma T cells (anti-OVA + K b ) and the indicated amount of untransfected (circles) (open symbols) or transfected (squares) and tumor cells in the absence (filled symbols) of the delivered exogenous SIINFEKL ovalbumin peptide. (10 ng / ml), see Rock et al., 1990, J. Immunol. 45: 804-811. After incubation for 18 hours, supernatants were harvested and assayed for IL-2 'by the HT2 indicator cell line (see Rock et al., 1990, J. Immunol. 45: 804-811). Figure A shows cell line B16 and ovalbumin transfected subclone MO4, figure B then line EL4 and ovalbumin transfected subclone EG7. The presentation of ovalbumin (OVA) peptides by transfected tumor cells was not significantly increased in the presence of exogenous SIINFEKL peptide in the test cultures.
Na vodorovných osiach sú uvedené počty APC, na zvislých osiach CPMxlO-3.The horizontal axes show the numbers of APC, the vertical axes CPMx10 -3 .
Obrázok 2 ukazuje, že expresia ovalbumínu OVA bunkami melanómu MO4 odvodeného od línie BI6 neovplyvňuje in vivo rast nádorov alebo prežitie hostiteľa po podaní nádorových buniek. Myšiam boli intradermálne podané nádorové bunky M04 (krúžky) alebo B16 (štvorčeky) a dávka predstavovala 5xl04 na myš do stredu oboch slabín. Velkosť nádoru (obrázok 2A) bola zisťovaná 3 krát týždenne a je vyjadrená ako priemerná plocha tumoru v milimetroch štvorcových ' (zvislá os)do doby, kým došlo k prvému úmrtiu v každej skupine. Prežitie (obrázok 2B) bolo zaznamenávané ako percento prežívajúcich zvierat a je uvedené na zvislej osi. Na vodorovnej osi sú v oboch prípadoch uvedené dni od poslednej imunizácie. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat a boli vždy tri krát opakované. Smrteľne choré myši boli usmrtené.Figure 2 shows that expression of ovalbumin by OVA cells by MO4-derived melanoma MO4 does not affect in vivo tumor growth or host survival after tumor cell administration. The mice were injected intradermally with M04 (circles) or B16 (squares) tumor cells and the dose was 5x10 4 per mouse in the middle of both flanks. Tumor size (Figure 2A) was measured 3 times per week and is expressed as the average tumor area in square millimeters (vertical axis) until the first death in each group occurred. Survival (Figure 2B) was recorded as a percentage of surviving animals and is shown on the vertical axis. The horizontal axis shows the days since the last immunization in both cases. In all experiments, the experimental groups consisted of five animals and were repeated three times. Fatally ill mice were sacrificed.
Obrázok 3 ukazuje, že imunizácia po kožnom podaní DNA kódujúcej OVA vyvoláva OVA špecifické cytotoxické T-lymfocyty a antigén špecifickú CTL sprostredkovanú ochranu pred inak smrteľným melanómom MO4, ktorý na svojom povrchu exprimuje OVA. Bunky sleziny opätovne imunizované in vitro po odobratí z OVAimunizovaných myší (génovo imunizované myši, pozri príklad 2) boli testované na svoju cytolytickú funkciu proti OVAtransfekovanému lymfómu EG7 (vyplnené štvorčeky) alebo proti netransfekovanému rodičovskému lymfómu EL4 (prázdne trojuholníky) (A) . Populácia efektorových buniek bola inkubovaná so samotným komplementom (prázdne štvorčeky) alebo s monoklonálnymi protilátkami proti CD4+ (vyplnené trojuholníky), CD8+ (prázdne trojuholníky) alebo Thyl.2+ (vyplnené krúžky) lymfocytom a s komplementom a potom bola stanovená ich cytolytická aktivita proti cieľovým bunkám nádorovej línie EG7.Figure 3 shows that immunization following cutaneous administration of DNA encoding OVA induces OVA-specific cytotoxic T-lymphocytes and antigen-specific CTL-mediated protection against the otherwise lethal melanoma MO4, which expresses OVA on its surface. Spleen cells re-immunized in vitro after removal from OVA immunized mice (gene immunized mice, see Example 2) were tested for their cytolytic function against OVAtransfected EG7 lymphoma (filled squares) or against untransfected parental lymphoma EL4 (open triangles) (A). The effector cell population was incubated with complement alone (open squares) or monoclonal antibodies against CD4 + (filled triangles), CD8 + (open triangles) or Thyl.2 + (filled circles) lymphocytes and complement, and then their cytolytic activity against EG7 tumor cell line target cells.
Na vodorovnej osi je uvedený pomer E/T buniek, na zvislej osi je % špecifickej lýzy. Myši na obrázkoch C až F boli génovo imunizované OVA (vyplnené štvorčeky) alebo pomocou lacZ (prázdne krúžky). Ďalšia imunizácia bola vykonaná po 7 dňoch. 7 dní po poslednej imunizácii (tá prebehla v dni 0) boli myši exponované dávke buď melanómu B16 (D), alebo jeho OVA expr imu j úceho subklonu MO4 (C). Prípadne boli myši rozdelené do dvoch skupín z ktorých jedna bola zbavená lymfocytov CD8+ pomocou intraperitoneálnej injekcie monoklonálnej protilátky anti-CD8 7 a 9 dní po poslednej imunizácii. Intaktné myši (E) a myši zbavené lymfocytov CD8* boli 10. deň po poslednej imunizácii exponované dávke MO4. Prežitie je vyjadrené ako percento prežívajúcich zvierat (C až F). U zvierat, ktoré prežili 60. deň neboli pozorované žiadne známky tumoru. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat a boli vždy tri krát opakované. Smrtelne choré myši boli usmrtené v súlade s predpismi o starostlivosti o laboratórne zvieratá. Údaje na vodorovných časových osiach sú udávané v dňoch, na zvislých osiach v percentách prežívajúcich zvierat.The horizontal axis shows the E / T cell ratio, the vertical axis shows the% specific lysis. The mice in Figures C to F were gene immunized with OVA (filled squares) or with lacZ (open circles). Further immunization was performed after 7 days. 7 days after the last immunization (which took place on day 0), mice were exposed to either a dose of either B16 melanoma (D) or its OVA expressing subclone MO4 (C). Alternatively, mice were divided into two groups, one of which was depleted of CD8 + lymphocytes by intraperitoneal injection of anti-CD8 monoclonal antibody 7 and 9 days after the last immunization. Intact mice (E) and CD8 * lymphocyte-depleted mice were exposed to the MO4 dose on day 10 after the last immunization. Survival is expressed as a percentage of surviving animals (C to F). No signs of tumor were observed in animals surviving day 60. In all experiments, the experimental groups consisted of five animals and were repeated three times. Fatal mice were sacrificed in accordance with laboratory animal care regulations. Data on horizontal timelines are given in days, on vertical axes as percentages of surviving animals.
Obrázok 4 ukazuje, že antigén prezentujúce bunky internalizujú a potom exprimujú polynukleotidy naviazané na časticiach. Exprimovaný antigén je týmito bunkami spracovaný a prezentovaný dráhou MHC I. triedy. Dendritické bunky boli pripravené oddelením lymfocytov od kostnej drene a jej kultiváciou cez noc v médiu RPMI 1640 doplnenom 10% FCS (fetálne telacie sérum), L-glutamín, antibiotiká a 2-merkaptoetanol v 24 jamkových doskách s koncentráciou 106 buniek na jamku. Po jednom dni boli bunky pri koncentrácii 2,5xl05 buniek na jamku doplnené o GM-CSF (103 U/ml, Sigma St. Luis, MO) a myší fIL-4 (103 U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) . Volne adherujúce bunky boli odobraté 8. deň kultivácie. Prietokovou cytometriou bolo stanovené, že tieto dendritické bunky exprimujú antigény CD45, CD44, CDllb (Mac-1), CD18, CD80, CD86 a antigény MHC I. a II.Figure 4 shows that antigen presenting cells internalize and then express particle-bound polynucleotides. The expressed antigen is processed by these cells and presented by the MHC class I pathway. Dendritic cells were prepared by separating lymphocytes from bone marrow and culturing overnight in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS (fetal calf serum), L-glutamine, antibiotics and 2-mercaptoethanol in 24 well plates at 10 6 cells per well. After one day, cells at 2.5x10 5 cells per well were supplemented with GM-CSF (10 3 U / ml, Sigma St. Luis, MO) and mouse fIL-4 (10 3 U / ml, Genzyme, Cambridge, MA ). Free adhering cells were harvested on day 8 of culture. By flow cytometry, these dendritic cells were determined to express CD45, CD44, CD11b (Mac-1), CD18, CD80, CD86 and MHC I and II antigens.
triedy. Dendritické bunky boli potom pulzované 2 hodiny pri 37eC za a bez prítomnosti peptidu OVA (20 ng/ml) + β2-mikroglobínu ,(Iudský β2-Μ, 10 μΐ/ml, Sigma) v redukovanom sérovom médiu (Optimen, Gibco, Grand Island, NY) . Bunky boli potom dôkladne premyté v PBS a ožiarené (2000 rad) a injikované do natívnych myší. Uvedený počet dendritických APC buniek odvodených z kostnej drene bol spoločne kultivovaný s OVA kódujúcimi polynukleotidmi naviazanými na časticiach (ich príprava - pozri príklad 2) (50 μΙ/ml/lO6 buniek preparátu obsahujúceho 7 mg častíc na ml). Ako substrát na väzbu nukleotidov boli použité buď železné gulôčky (vyplnené štvorčeky) alebo zlaté guľôčky (vyplnené krúžky) alebo bol použitý rozpustný proteín OVA 2 mg/ml, prázdne štvorčeky). Inkubácia trvala 24 hodín, potom boli bunky APC premyté a uvedené množstvo APC bolo spoločne kultivované v mikrokultúre s T-lymfocytmi z hybridómu RF33.70 (anti OVA +Kb) . Po 18 hodinách inkubácie boli odobraté supernatanty a bol v nich stanovený IL-2 pomocou indikátorovej bunkovej línie HT2 (pozri Rock a kol., 1990, J. Immunol. 45, strana 804 až 811) .classes. The dendritic cells are then pulsed for 2 h at 37 e C. and without OVA peptide (20ng / ml) + β2-microglobin, (human β2-Μ, 10 μΐ / ml, Sigma) in reduced serum media (OPTIMEM, Gibco, Grand Island, NY). Cells were then washed extensively in PBS and irradiated (2000 rad) and injected into native mice. The indicated number of bone marrow-derived dendritic APC cells was co-cultured with particle-bound OVA encoding polynucleotides (for preparation - see Example 2) (50 μΙ / ml / 10 6 cells of a preparation containing 7 mg particles per ml). Either the iron beads (filled squares) or the gold beads (filled circles) or soluble OVA protein 2 mg / ml (open squares) were used as the nucleotide binding substrate. Incubation lasted 24 hours, after which the APC cells were washed and the indicated amount of APC was co-cultured in a microculture with RF lymphocytes from RF33.70 (anti OVA + K b ). After 18 hours of incubation, supernatants were collected and assayed for IL-2 using the HT2 indicator cell line (see Rock et al., 1990, J. Immunol. 45, 804-811).
Obrázok 5 znázorňuje porovnanie imunizácie pomocou polynukleotidov naviazaných na časticiach pri biobalistickom podaní a pri subkutánnej injekcii. Skupiny 5 myší línie C57B1/6 boli imunizované a po 7 dňoch bola dávka zopakovaná. Potom boli exponované intradermálnej injekcii 5xl05 M05 nádorových buniek do každej slabiny o ďalších 7 dní neskôr. Imunizačné dávky obsahovali: (A) polynukleotid kódujúci β-gal naviazaný na časticiach, pripravený a biobalisticky aplikovaný podľa spôsobu opísaného v príklade 2; (B) polynukleotid kódujúci OVA naviazaný na časticiach, pripravený a biobalisticky aplikovaný podľa spôsobu opísaného v príklade 2; (C) zvýšené množstvo polynukleotidu kódujúceho OVA bez podporných častíc aplikovaný subkutánnou injekciou; (D) ekvivalentné množstvo polynukleotidu kódujúceho OVA, ktorý bol pripravený spôsobom podlá príkladu 2, ale bol aplikovaný subkutánnou injekciou. Znázornené údaje udávajú % zvierat v každej skupine, ktoré boli bez nádoru po 50 dňoch od expozície.Figure 5 shows a comparison of particle-bound polynucleotides immunization with biobalistic administration and subcutaneous injection. Groups of 5 C57B1 / 6 mice were immunized and the dose was repeated after 7 days. They were then exposed by intradermal injection of 5x10 5 M05 tumor cells into each flank another 7 days later. Immunization doses included: (A) a particle-bound β-gal encoding polynucleotide, prepared and biobalistically administered according to the method described in Example 2; (B) a particle-bound polynucleotide encoding OVA, prepared and biobally applied according to the method described in Example 2; (C) an increased amount of polynucleotide encoding OVA without support particles administered by subcutaneous injection; (D) an equivalent amount of a polynucleotide encoding OVA that was prepared by the method of Example 2 but was injected by subcutaneous injection. Data shown shows the% animals in each group that were tumor free after 50 days of challenge.
Obrázok 6 znázorňuje imunizáciu pomocou APC spoločne inkubovaných s polynukleotidom kódujúcim OVA naviazaným na časticiach. Takáto imunizácia chráni zvieratá pred melanómom línie MO5, ktorý na povrchu exprimuje OVA peptidy. Skupiny myší C57B1/6 boli jednorázovo subkutánne imunizované rovnako ako bolo uvedené pri obrázku 5 a potom boli exponované dávke 105 nádorových buniek MO5 do každej slabiny 10 dní po imunizácii. Imunizačné dávky obsahovali: kontrolný polynukleotid kódujúci βgal naviazaný na časticiach (prázdne štvorčeky), 100 μΐ časticového roztoku s koncentráciou 7 mg/ml bolo aplikovaných do každej zadnej končatiny; rozpustný pAC-Neo-OVA (100 μΐ do každej zadnej končatiny, bol zachovaný približne rovnaký pomer DNA/zviera, prázdne krúžky); alebo 5xl04 dendritických buniek odvodených z kostnej drene (vyplnené štvorčeky), opäť bolo aplikované 100 μΐ na jednu zadnú končatinu zvieraťa. Prežitie je vyjadrené ako percento prežívajúcich zvierat. Vo všetkých experimentoch pozostávali pokusné skupiny z piatich zvierat. Smrteľne choré myši boli usmrtené v súlade s predpismi o starostlivosti o laboratórne zvieratá. Údaje na vodorovnej časovej osi sú v dňoch, údaje na zvislej osi v percentách prežívajúcich zvierat.Figure 6 shows immunization by APC co-incubated with a polynucleotide encoding OVA bound to the particles. Such immunization protects the animals from the MO5 melanoma that expresses OVA peptides on the surface. Groups of C57B1 / 6 mice were immunized once subcutaneously as described in Figure 5 and then exposed to a dose of 10 5 MO5 tumor cells in each flank 10 days after immunization. Immunization doses consisted of: a control polynucleotide encoding βgal bound to the particles (open squares), 100 μΐ of a 7 mg / ml particle solution was applied to each hind limb; soluble pAC-Neo-OVA (100 μΐ per hindpaw, approximately the same DNA / animal ratio, open circles); or 5x10 4 bone marrow-derived dendritic cells (filled squares), again 100 µΐ was applied to one hindlimb of the animal. Survival is expressed as a percentage of surviving animals. In all experiments, the experimental groups consisted of five animals. Fatally ill mice were sacrificed in accordance with laboratory animal care regulations. Data on the horizontal timeline are in days, data on the vertical axis are in percent of surviving animals.
Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Príklad 1: Model založený na myšom nádore OVA/B16Example 1: Model based on OVA / B16 mouse tumor
Myší model OVA/B16 sa použil na získanie údajov uvedených v príkladoch 2 a 3. Atraktivita myšieho systému OVA/B16 spočíva v niekoľkých skutočnostiach: (1) melanóm B16 je dobre preštudovaný myší nádor, (2) rastové vlastnosti a schopnosti metastázovať in vivo sú u tejto nádorovej línie dobre charakterizované a (3) štruktúra ovalbumínu je dobre definovaná. Spôsob spracovania a prezentácie AVA v bunkách myšej línie C57BL/6 je tiež dobre známy. Je dokonca známa štruktúra spracovávaného peptidu prezentovaného pomocou MHC I. triedy Kb. Rovnako sú známe spôsoby stanovenia funkčnej expresie ovalbumínového peptidu (SIINFEKL) asociovaného s H2- Kb využívajúci T-T hybridom 33.70.AI anti-OVA-Kb (pozri KovacovicsBankowski a kol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: strana 4942·až 4946). Spôsoby stanovenia in vivo indukcie cytotoxických T-lymfocytov so špecificitou proti OVA sú v tomto systéme taktiež dobre opísané (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785).The OVA / B16 mouse model was used to obtain the data presented in Examples 2 and 3. The attractiveness of the OVA / B16 mouse system lies in several facts: (1) B16 melanoma is a well-studied mouse tumor, (2) growth properties and metastasis capabilities in vivo are in this tumor line well characterized and (3) the structure of ovalbumin is well defined. The method of processing and presentation of AVA in C57BL / 6 mouse cells is also well known. Even the structure of the processed peptide presented by MHC class I K b is known. Also Assays for the functional expression of ovalbumin peptide (SIINFEKL) to the associated H2-K b TT hybridoma 33.70.AI using anti-OVA-K b (see KovacovicsBankowski, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 : page 4942 · to 4946). Methods for determining the in vivo induction of OVA-specific cytotoxic T lymphocytes are also well described in this system (Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785).
Myšie a bunkové línie. Od Jackson Laboratoires, Bar Harbor, ME sa zakúpili 5 až 8 týždňov staré samičky myší C57BL/6. Línia EL4 je C57BL/6 T-lymfóm a línia EG7 je subklonom EL4 transfekovaným ovalbumínom z kuracích vajec (OVA), pozri Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785. Myší melanóm B16 odvodený od myšej línie C57BL/6 sa získal z Americkej zbierky tkanív (ATCC) (pozri Fidler a kol., 1976, Cancer Res. 36: strana 3160 až 3165). MO4 bol skonštruovaný transfekciou línie B16 plazmidom pAc-Nco-OVA ( pozri Falo a kol., Náture Med. 1: strana 649 až 653, Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785). Monoklonálne protilátky sa pripravili z hybridómov GK1.5 (antiCD4, ATCC TIB-207), 2.43 (anti-CD8 pripravené po imunizácii myší Balb/c nu/nu pomocou i.p. injekcie buniek GKfl.5 (2xl06)a IFA (0, 5 ml/myš) .Mouse and cell lines. 5 to 8 week old female C57BL / 6 mice were purchased from Jackson Laboratoires, Bar Harbor, ME. The EL4 line is C57BL / 6 T-lymphoma and the EG7 line is an EL4 subclone transfected with chicken egg ovalbumin (OVA), see Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785. Mouse melanoma B16 derived from mouse C57BL / 6 line was obtained from the American Tissue Collection (ATCC) (see Fidler et al., 1976, Cancer Res. 36: 3160-3165). MO4 was constructed by transfecting line B16 with the plasmid pAc-Nco-OVA (see Falo et al., Nature Med. 1: 649-653; Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785). Monoclonal antibodies were prepared from hybridomas GK1.5 (antiCD4, ATCC TIB-207), 2.43 (anti-CD8 prepared after immunization of Balb / c nu / nu mice by ip injection of GKf1.5 (2x10 6 ) and IFA cells (0.5) ml / mouse).
Subklon MO4 sa izoloval po transfekcii melanómu BI6 pomocou OVA a následnej selekcii. Ako rodičovská melanómová línia BI6, tak aj OVA transfekovaná línia exprimujú podobné množstvo funkčného determinantu Kb na bunkovom povrchu, čo sa určilo z prezentácie peptidu odvodeného od OVA (SIINFEKL) Tlymfocytom línie RF33.70 (pozri obrázok 1) . Línia MO4/5 je schopná stimulovať bunky hybridómu aj v neprítomnosti z vonku pridaného peptidu (pozri obrázok 1), zatiaľ čo rodičovská línia BI6 nie. To dokazuje endogénnu produkciu, spracovanie a prezentáciu transfekovaného antigénu. Je dôležité poznamenať, že endogénna expresia OVA v bunkách línie M04 významne nezmenila in vivo imunogenitu nádoru (pozri obrázok 2) . Rast nádorov (pozri obrázok 2A) BI6 M04 je v naivných myšiach porovnateľný, tak ako je porovnateľné aj prežitie hostiteľských zvierat (pozri obrázok 2B) .The MO4 subclone was isolated after transfection of BI6 melanoma with OVA and subsequent selection. Both the parent melanoma line BI6 and the OVA transfected line express similar amounts of a functional determinant of K b on the cell surface, as determined from the presentation of the OVA-derived peptide (SIINFEKL) by the RF33.70 line lymphocyte (see Figure 1). The MO4 / 5 line is able to stimulate hybridoma cells even in the absence of the outside peptide (see Figure 1), while the parent line BI6 does not. This demonstrates the endogenous production, processing and presentation of the transfected antigen. It is important to note that endogenous expression of OVA in cells of the M04 line did not significantly alter the tumor immunogenicity in vivo (see Figure 2). Tumor growth (see Figure 2A) BI6 M04 is comparable in naïve mice as is the survival of host animals (see Figure 2B).
Príklad 2: Génová imunizácia pomocou biolistického (biobalistického) podaniaExample 2: Gene immunization by biolistic (biobalistic) administration
Lokalizovanie expresie cudzorodých génov: Vzorky tkanív (pokožka alebo tekutina odsatá z lymfatických uzlín) sa odobrali 24 až 48 hodín po imunizácii, premyté a fixované v 2% formaldehyde - 0,2% glutaraldehyde v PBS (phosphate buffered saline - fosfátom pufrovaný fyziologický roztok) počas 30 minút a pri teplote 4°C. Fixované vzorky boli potom dôkladne premyté v PBS a 18 hodín inkubované vo farbiacom kúpeli s X-gal (1 mg/ml X-gal, 5 mM ferikyanid draselný, 5 mM Ferokyanid, 2mM MgCl2 v PBS) pri teplote 37°C. Ofarbené tkanivo sa zalialo do parafínu a rozrezané na tenké rezy, ktoré sa ďalej dofarbili pomocou 0,1% jadrovej fast red.Localization of foreign gene expression: Tissue samples (skin or lymph node aspirated fluid) were taken 24 to 48 hours after immunization, washed and fixed in 2% formaldehyde - 0.2% glutaraldehyde in PBS (phosphate buffered saline) for 30 minutes at 4 ° C. The fixed samples were then washed extensively in PBS and incubated in a X-gal staining bath (1 mg / ml X-gal, 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM Ferrocyanide, 2 mM MgCl 2 in PBS) for 18 hours at 37 ° C. The stained tissue was embedded in paraffin and cut into thin sections, which were further stained with 0.1% core fast red.
Génová imunizácia: Častice zlata potiahnuté DNA sa pripravili zmiešaním 50 mg zlatých guľôčok s priemerom 0,95 μπι a 100 μΐ 0,1 M spermidínu. Táto zmes sa sonifikovala 5 sekúnd a potom k nej bolo po častiach v priebehu vortexovania pridaných 123 gg plazmidovej DNA a 200 μΐ CaCl2. Zmes sa nechala 5 až 10 minút precipitovať pri izbovej teplote. Tento materiál sa nechal sekúnd centrifugovať pri 10 000 rpm a potom bol 3 krát premytý v studenom etanole a resuspendovaný v 7 ml etanolu za vzniku preparátu s koncentráciou 7 mg zlata na 1 ml. Tento roztok sa potom vpravil do trubičky Tefzel* (Agracetus) a bolo mu ponechaných 5 minút na usadenie. Etanol sa potom odstránil a častice zlata sa pomocou 30 sekundovej rotácie pri 20 rpm prichytili na steny trubičky a vysušené pomocou N2. Vysušená trubička s usadenými zlatými časticami sa potom narezala na 0,5 palca (1,25 cm) dlhé časti, ktoré sa uchovali v parafínom zatavených sklených nádobkách spolu s desikantom. Zvieratá sa imunizovali dvoma nástrelmi (každý z nástrelov obsahoval 0,5 mg častíc zlata, t.j. 1,27 cm pôvodnej trubičky) do vyholenej ab'dominálnej (brušnej) oblasti pomocou zariadenia Accel Gene Delivery, pričom pracovný tlak pri nástrele bol 300 psi (2,067 MPa). Zvieratá sa imunizovali buď plazmidom pAc-Neo-OVA (Moore a kol., 1988, Celí 54: strana 777 až 785) alebo plazmidom pIEglacZ (získaný od Nadii Jourond), ktorý obsahuje gén lacZ pod kontrolou promótora CMV. Na pokusy so subkutánnym injekčným podaním polynukleotidov viazaných na časticiach (pozri obrázok 5) sa gulôčky pokryli DNA rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie a tiež sa injikovalo rovnaké množstvo DNA. Niektorým zvieratám (pozri obrázok 5) bol subkutánne injikovaný dodatočný voíný plazmid. Dávky sa podávali v 100 μΐ PBS do slabín, obojstranne. Na pokusy s in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (obrázok 4) boli častice potiahnuté DNA pripravené obdobným spôsobom, pričom boli spolu so zlatými gulôčkami použité aj gulôčky z oxidu železa Biomag s rovnakou hmotnosťou.Gene immunization: DNA coated gold particles were prepared by mixing 50 mg of gold beads with a diameter of 0.95 μπι and 100 μΐ of 0.1 M spermidine. This mixture was sonicated for 5 seconds and then 123 gg of plasmid DNA and 200 μΐ CaCl 2 were added portionwise during vortexing. The mixture was allowed to precipitate at room temperature for 5 to 10 minutes. This material was centrifuged for 10 seconds at 10,000 rpm and then washed 3 times in cold ethanol and resuspended in 7 ml ethanol to give a preparation of 7 mg gold per ml. This solution was then introduced into a Tefzel ® tube (Agracetus) and allowed to settle for 5 minutes. The ethanol was then removed and the gold particles were attached to the tube walls and dried over N 2 by spinning at 20 rpm for 30 seconds. The dried deposited gold particle tube was then cut into 0.5 inch (1.25 cm) long portions that were stored in paraffin-sealed glass containers with the desiccant. Animals were immunized with two bullets (each bullet containing 0.5 mg of gold particles, i.e., 1.27 cm of the original tube) into the shaved ab'dominal (abdominal) area using an Accel Gene Delivery, with a burst working pressure of 300 psi (2,067 MPa). Animals were immunized with either the plasmid pAc-Neo-OVA (Moore et al., 1988, Cell 54: 777-785) or the plasmid pIEglacZ (obtained from Nadia Jourond) containing the lacZ gene under the control of the CMV promoter. For experiments with subcutaneous injection of particle-bound polynucleotides (see Figure 5), the beads were coated with DNA in the same manner as above and the same amount of DNA was also injected. Some animals (see Figure 5) were injected subcutaneously with an additional free plasmid. Doses were administered in 100 µl PBS in the groin, bilaterally. For the in vitro transfection of antigen-presenting cells (Figure 4), DNA coated particles were prepared in a similar manner using Biomag iron oxide beads of the same mass together with the gold beads.
Pri pokusoch so subkutánnym injekčným podávaním polynukleotidov podlá vynálezu (pozri obrázok 5 a 6) sa častice potiahnuté DNA pripravili rovnakým spôsobom, ako bolo uvedené vyššie a tiež sa injikovalo rovnaké množstvo DNA alebo množstvo uvedené v opisoch obrázkov. Niektorým zvieratám (pozr-i obrázok 5 a 6) bol subkutánne injikovaný dodatočný volný plazmid. Dávky sa podávali v 100 μΐ PBS do oboch zadných končatínIn the subcutaneous injection experiments of the polynucleotides of the invention (see Figures 5 and 6), DNA coated particles were prepared in the same manner as above and the same amount of DNA or the amount shown in the descriptions of the figures was also injected. An additional free plasmid was injected subcutaneously with some animals (see Figures 5 and 6). Doses were administered in 100 μΐ PBS to both hind limbs
Pri pokusoch s in vitro transfekciou antigén prezentujúcich buniek (pozri obrázok 4 a 6) boli častice potiahnuté DNA pripravené obdobným spôsobom, pričom spolu so zlatými guľôčkami sa použili aj guľôčky z oxidu železa Biomag (Fe guľôčky) s rovnakou hmotnosťou. Dendritické APC sa získali z kostnej drene tak ako je uvedené v stručnom opise obrázkov s výnimkou toho, že v kultivačnom tkanivovom médiu s obsahom 25 μΐ 7 mg/ml roztoku polynukleotidu naviazaného na časticiach nebol pri teplote 37°C použitý IL-4 počas 18 hodín. Dendritické bunky s prijatým antigénom sa pripravili tak, ako je uvedené v stručnom opise obrázkov. Stručne povedané, dendritické bunky sa pripravili oddelením kostnej drene od lymfocytov a jej kultiváciou cez noc v médiu RPMI 1640 doplnenom o 10% FCS (fetálny teľací albumín), L-glutamín, antibiotiká a 2merkaptoetanol v 24 jamkových doskách s koncentráciou 106 buniek na jamku. Po jednom dni boli bunky s koncentráciou 2,5xl05 buniek na jamku doplnené o GM-CSF (103 U/ml, Sigma St. Louis, MO) a myší rIL-4 (IO3 U/ml, Genzyme, Cambridge, MA) . Voľne adherujúce bunky sa odobrali ôsmy deň kultivácie. Prietokovou cytometriou sa stanovilo, že tieto dendritické bunky exprimujú antigény CD45, CD44, CDllb (Mac-1), CD18, CD80, CD86 a antigény MHC I. a II. triedy. Dendritické bunky boli potom pulzované 2 hodiny pri 37°C za a bez prítomnosti peptidu OVA (20 ng/ml) + P2-mikroglobínu (ľudský β2-Μ, 10 μΐ/ml, Sigma) v redukovanom sérovom médiu (optimen, Gibco, Grand Island, NY). Bunky sa potom dôkladne premyli v PBS a ožiarili (2000 ras) a injikovali do naivných myší.In experiments with in vitro transfection of antigen-presenting cells (see Figures 4 and 6), DNA-coated particles were prepared in a similar manner using Biomag iron oxide beads (Fe beads) of the same mass were used together with the gold beads. Dendritic APCs were obtained from bone marrow as shown in the brief description of the figures, except that IL-4 was not used for 18 hours at 37 ° C in culture tissue medium containing 25 μΐ 7 mg / ml particle-bound polynucleotide solution. . Dendritic antigen-received cells were prepared as described in the brief description of the figures. Briefly, dendritic cells were prepared by separating bone marrow from lymphocytes and culturing it overnight in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS (fetal calf albumin), L-glutamine, antibiotics and 2-mercaptoethanol in 10-well plates at 10 6 cells per well . After one day, cells at 2.5x10 5 cells per well were supplemented with GM-CSF (10 3 U / ml, Sigma St. Louis, MO) and mouse rIL-4 (10 3 U / ml, Genzyme, Cambridge, MA ). Free adhering cells were harvested on day 8 of culture. By flow cytometry, these dendritic cells were determined to express CD45, CD44, CD11b (Mac-1), CD18, CD80, CD86 and MHC I and II antigens. classes. The dendritic cells were then pulsed for 2 hours at 37 ° C with and without OVA (20 ng / ml) + P2-microglobin (human β2-Μ, 10 μΐ / ml, Sigma) in reduced serum medium (optimen, Gibco, Grand Island, NY). Cells were then washed extensively in PBS and irradiated (2000 ras) and injected into naïve mice.
Testy cytotoxicity - splenocyty imunizovaných myší sa restimulovali spôsobmi podobnými už. opísaným spôsobom, len s m lými modifikáciami (Falo a kol., 1995, Nátur Med. 1: strana €49 až 653) . Týždeň po imunizácii boli splenocyty (3xl06) reStimulované spoločnou kultiváciou s ožiarenými (20 000 rad) bunkami EG7 (10xl06) . Efektorové bunky sa odobrali o 5 dní neskôr a kultivovali s 2,4xl04 cieľovými bunkami označenými pomocou 51Cr. Táto kultivácia sa vykonala v mikrotitračných doskách s guľatým dnom (200 μΐ) a v uvedenom pomere cieľových a efektorových buniek. V niektorých prípadoch boli efektorové bunky ešte pred testom zbavené subpopulácie T-lymfocytov pomocou monoklonálnej protilátky a komplementu (pozri Rocka a kol., 1993> J. Immunol. 150: strana 1244 až 1251) . po kultivácii trvajúcej 4 hodiny pri teplote 37°C boli spojené 100 μΐ množstvá supernatantov z troch rovnakých jamiek a bunky boli spočítané. Stanovilo sa percento špecifického uvoľnenia, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653. Výsledky sú uvádzané ako priemer z troch kultúr. Štandardná chyba priemeru nebola nikdy vyššia ako 15%.Cytotoxicity assays - splenocytes of immunized mice were restimulated by methods similar to those previously described. in the manner described, only with slight modifications (Falo et al., 1995, Nature Med. 1: 49-653). One week after immunization, splenocytes (3x10 6 ) were re-stimulated by co-culture with irradiated (20,000 rad) EG7 cells (10x10 6 ). Effector cells were harvested 5 days later and cultured with 2.4x10 4 target cells labeled with 51 Cr. This culture was performed in round bottom microtiter plates (200 μΐ) and at the indicated target to effector cell ratio. In some cases, effector cells were depleted of T-cell subpopulations by monoclonal antibody and complement prior to the assay (see Rocka et al., 1993> J. Immunol. 150: 1244-1251). after culturing for 4 hours at 37 ° C, 100 μΐ of supernatants from three equal wells were pooled and cells were counted. The percent specific release was determined, see Falo et al., 1995, Nature Med. 1: 649-653. Results are reported as the average of three cultures. The standard error of the average was never higher than 15%.
Testovanie ochrannej funkcie - myši línie C57BL/6 sa opísaným spôsobom imunizovali uvedeným antigénovým génovým konštruktom.' Zvieratám sa podali nádory a opísaným spôsobom bolo stanovené ich prežitie. 7 dní po poslednej imunizácii (deň 0) boli zvieratám imunizovaným OVA alebo lacZ intradermálne do stredu oboch slabín injikované melanómové bunky (2x1O4), čo je dvojnásobok LD50, alebo im bola injikovaná dávka nádorových buniek podľa časti 4. Prežitie je uvedené v % prežívajúcich zvierat. Melanómové bunky sa pred injekciou tri krát premyli v PBS a pomocou vylučovacej typánovej modrej bolo určené, že sú živé na viac ako 95 %. Všetky uvedené experimenty sa vykonali na piatich myšiach a aspoň tri krát sa opakovali. Smrteľne choré zvieratá boli usmrtené v súlade so smernicou o zaobchádzaní so zvieratami Centra pre medicínu Univerzity v Pittsburghu. V niektorých prípadoch boli myši zbavené subpopulácie buniek CD8+. To sa dosiahlo intraperitoneálnou injekciou anti CD8-mAB (2.34) na siedmy až deviaty deň po imunizácii. Injekčné podanie nádoru potom prebehlo ôsmy až desiaty deň, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653.Testing of protective function - C57BL / 6 mice were immunized as described with the antigenic gene construct described above. Animals were given tumors and their survival was determined as described. 7 days after the last immunization (day 0), animals immunized with OVA or lacZ were injected intradermally into the middle of both flanks with melanoma cells (2x10 4 ), twice the LD 50 , or injected with a tumor cell dose according to Part 4. Survival is given in% surviving animals. The melanoma cells were washed three times in PBS prior to injection and were determined to be viable by greater than 95% via typing blue. All experiments were performed in five mice and repeated at least three times. Fatally ill animals were killed in accordance with the Animal Welfare Directive of the University of Pittsburgh Medical Center. In some cases, mice were depleted of CD8 + cell subpopulations. This was achieved by intraperitoneal injection of anti CD8-mAB (2.34) on days 7 to 9 after immunization. Injection of the tumor was then performed on days 8 to 10, see Falo et al., 1995, Nature Med. 1: 649-653.
Tiež sa stanovila schopnosť biolistickej (biobalsitickej) imunizácie indukovať antigén-špecifickú cytotoxickú odpoveď. Naivné myšie línie C57BL/6 sa imunizovali dvoma navzájom sa prekrývajúcimi pulzmi do oblasti brucha, pričom celková dávka predstavovala 2,64 gg DNA kódujúcej OVA. 0 sedem dní neskôr bola imunizačná dávka zopakovaná. Bunky sleziny týchto myší restimulované in vitro boli schopné lyžovať syngénne bunky myšieho tymómu EG7 exprimujúce OVA, ale neboli už schopné spôsobiť lýzu netransfekovaných rodičovských buniek línie EL4 (pozri obrázok 3A). Z toho vyplýva, že lýza buniek bola antigénšpecifická a bola namierená na OVA exprimovaný transfekovanými nádorovými bunkami. Odstránenie T-lymfocytov z efektorových bunkových populácií pomocou monoklonálnych protilátok ďalej ukázalo, že lýza buniek bola závislá na Thyl+,CD8+ subpopuláciách. To je charakteristické pre efektorové CTL obmedzené na MHC I. triedy.The ability of biolistic (biobalsitic) immunization to induce an antigen-specific cytotoxic response was also determined. Naive mouse C57BL / 6 lines were immunized with two overlapping pulses in the abdomen, with a total dose of 2.64 gg of DNA encoding OVA. Seven days later the immunization dose was repeated. The spleen cells of these mice restimulated in vitro were able to lyse the mouse EG7 thymoma syngeneic cells expressing OVA, but were no longer able to cause lysis of untransfected parental cells of the EL4 line (see Figure 3A). As a result, cell lysis was antigen-specific and was directed to OVA expressed by transfected tumor cells. Removal of T lymphocytes from effector cell populations with monoclonal antibodies further showed that cell lysis was dependent on Thyl + , CD8 + subpopulations. This is characteristic of effector CTL restricted to MHC class I.
Skupinám myší imunizovaných vyššie opísaným spôsobom sa po 7 dňoch injikovali intradermálne bunky melanómu M04 a to na mieste vzdialenom od miesta imunizácie tak, aby mohla byť vyhodnotená schopnosť biobalistickej imunizácie poskytnúť ochrannú imunitu proti nádorom. Myši imunizované pomocou OVA boli chránené · pred smrteľným rozvojom nádoru, zatial čo u kontrolných myší, ktoré boli imunizované obdobne, len miesto OVA bol použitý reportérový gén lacZ, rástli nádory veľmi rýchlo a boli smrteľné asi v 60 % prípadov po 40 dňoch trvania pokusu (obrázok 3C) . Myši imunizované pomocou DNA pre OVA však nevykazovali žiadnu ochranu proti netransfekovanému rodičovskému melanómu B16 (obrázok 3D), z čoho vyplýva, že táto ochranná imunita bola antigén-špecifická a namierená proti OVA na povrchu nádorových buniek. Tiež sa stanovil príspevok efektorových buniek CD8+, a to tak, že sa opakovane podávali i.p. injekcie obsahujúce monoklonálnu protilátku anti-CD8 ešte pred podaním nádoru. Tým bola selektívne v skupinách imunizovaných a kontrolných (imunizovaných pomocou lacZ) zvierat odstránená subpopulácia lymfocytov CD8+, pozri Falo a kol., 1995, Náture Med. 1: strana 649 až 653. Zatiaľ čo zvieratá imunizované pomocou OVA boli chránené pred rozvojom nádoru M04, prežitie zvierat imunizovaných OVA, ale zbavených subpopulácie CD8+ Tlymfocytov bolo obdobné ako prežitie kontrolných zvierat, či už s alebo bez týchto lymfocytov. Z toho vyplýva, že CD8+ Tlymfocyty sú úplne nevyhnutné pre ochrannú protinádorovú odpoveď indukovanú imunizáciou podľa vynálezu.Groups of mice immunized as described above were injected intradermal melanoma M04 cells after 7 days at a site remote from the immunization site so that the ability of biobalistic immunization to provide protective immunity against tumors could be evaluated. Mice immunized with OVA were protected from lethal tumor development, whereas in control mice that had been immunized similarly, only the reporter lacZ gene was used instead of OVA, tumors grew very fast and were fatal in about 60% of cases after 40 days of the experiment ( 3C). However, mice immunized with DNA for OVA showed no protection against untransfected parental melanoma B16 (Figure 3D), suggesting that this protective immunity was antigen-specific and directed against OVA on the surface of tumor cells. The contribution of CD8 + effector cells was also determined by repeatedly injecting ip injections containing anti-CD8 monoclonal antibody prior to tumor administration. This selectively eliminates CD8 + lymphocyte subpopulation in groups of immunized and control (immunized with lacZ) animals, see Falo et al., 1995, Nature Med. 1: 649-653. While animals immunized with OVA were protected from M04 tumor development, survival of animals immunized with OVA but deprived of the CD8 + Tlymphocyte subpopulation was similar to that of control animals, with or without these lymphocytes. Accordingly, CD8 + T lymphocytes are essential for the protective anti-tumor response induced by the immunization of the invention.
Ďalším dôkazom podporujúcim tento mechanizmus protinádorovej imunity je demonštrácia expresie β-galaktozidázy v epiderme imunizovaných zvierat po biobalistickom vložení lacZ konštruktu a zaujímavé diskrétne oblasti špecifickej expresie v lymfatických uzlinách. Vzhladom k tomu, že tieto uzliny boli vzdialené od miesta imunizácie, zdá sa veľmi nepravdepodobné, že táto expresia v lymfatických uzlinách by bola priamo výsledkom fyzikálneho bombardovania. Preukázala sa prevaha zlatých častíc v epiderme a derme imunizovanej pokožky (neofarbenej) 24 hodín po imunizácii pomocou DNA a expresie lacZ v epidermálnych keratynocytoch po 48 hodinách. Pozorovali sa tiež diskrétne špecificky ofarbené oblasti v lymfatických uzlinách. Rovnakým spôsobom ošetrené zvieratá, ktoré boli imunizované nevhodnou DNA, nevykazovali žiadnu expresiu lacZ. Toto pozorovanie viedlo k ďalšiemu experimentu, ktorý je opísaný v príklade 3.Further evidence supporting this mechanism of anti-tumor immunity is the demonstration of β-galactosidase expression in the epidermis of immunized animals following biobalistic insertion of the lacZ construct and interesting discrete regions of specific expression in lymph nodes. Given that these nodes were remote from the site of immunization, it seems highly unlikely that this expression in lymph nodes would be the direct result of physical bombardment. The predominance of gold particles in the epidermis and dermis of the immunized skin (unstained) 24 hours after DNA immunization and lacZ expression in epidermal keratocytes after 48 hours was demonstrated. Discrete specific stained areas in the lymph nodes were also observed. In the same way, treated animals immunized with inappropriate DNA showed no expression of lacZ. This observation led to another experiment as described in Example 3.
Príklad 3: Génová imunizácia po subkutánnom podaníExample 3: Gene immunization after subcutaneous administration
Materiál a spôsoby indukcie protinádorovej imunity pomocou subkutánneho podania polynukleotidu naviazaného na časticiach sú podrobne opísané v príklade 1 a2.The material and methods of inducing anti-tumor immunity by subcutaneous administration of the particle-bound polynucleotide are described in detail in Examples 1 and 2.
Uvedené údaje dokazujú schopnosť špecifického zacielenia fagocytujúcich APC v lymfoidnom tkanive alebo APC schopných prejsť do lymfoidného tkaniva subkutánnou injekciou polynukleotidu naviazaného na časticiach v podmienkach in vivo.These data demonstrate the ability of specifically targeting phagocytic APCs in lymphoid tissue or APCs capable of passing into lymphoid tissue by subcutaneous injection of particulate polynucleotide under in vivo conditions.
Ochrana pred nádormi bola porovnateľná v skupinách myší imunizovaných polynukleotidom pAc-Neo-OVA naviazaným na časticiach ako pri priamom subkutánnom podaní, tak aj pri bi'obalistickom padaní (pozri obrázok 5) . V súlade s výsledkami z príkladu 2 neviedla imunizácia polynukleotidom kódujúcim antigén (napríklad pIEglacZ) k vzniku ochrannej Subkutánna injekcia pAC-Neo-OVA bez nosných častíc neviedla k vzniku ochrannej imunity (pozri obrázok 5). Z týchto vyplýva, že subkutánna injekcia polynukleotidu naviazaného na časticiach je aspoň rovnako účinná ako biobalistické podanie. Vzhľadom na to, že pri subkutánnej injekcii nedochádza k priamemu fyzikálnemu násilnému preniknutiu častice s naviazaným polynukleotidom do cytoplazmy cieľovej hostiteľskej bunky, je zrejmé, že na expresiu je nutný nejaký spôsob aktívneho bunkami absencie polynukleotidu pAc-Neo-OVA, ktorý nebol naviazaný na časticiach, tiež vedie k záveru, že transport častice fagocytózou je hlavným mechanizmom transdukcie. Z tohto mechanizmu transdukcie tiež vyplýva, že na expresiu transgénu sú vhodnejšie bunky schopné fagocytovať, vrátane APC.Tumor protection was comparable in groups of mice immunized with particle-bound pAc-Neo-OVA polynucleotide, both by direct subcutaneous administration and bioballistic fall (see Figure 5). Consistent with the results of Example 2, immunization with an antigen-encoding polynucleotide (e.g., pIEglacZ) did not result in protective subcutaneous injection of carrier-free pAC-Neo-OVA did not result in protective immunity (see Figure 5). It follows that subcutaneous injection of the particle-bound polynucleotide is at least as effective as biobalistic administration. Since subcutaneous injection does not involve direct physical forcible penetration of the polynucleotide-bound particle into the cytoplasm of the target host cell, it is apparent that some active cell-mediated absence of the pAc-Neo-OVA polynucleotide, which has not been attached to the particle, is required. it also concludes that the transport of a particle by phagocytosis is a major mechanism of transduction. This transduction mechanism also implies that cells capable of phagocytosing, including APC, are more suitable for transgene expression.
nevhodný imunity, taktiež zodpovedajúcemu nádoru proti údajov transportu endocytózy.inappropriate immunity, also corresponding to the tumor against endocytosis transport data.
polynukleotidupolynucleotide
Pozorovanie schopnými fagocytózy/ imunity po injekciiObservation by capable phagocytosis / immunity after injection
Ďalším dôkazom o tomto predpokladanom mechanizme účinku polynukleotidov naviazaných na časticiach je pozorovanie APC z dendritických buniek odvodených z kostnej drene, ktoré po spoločnej in vitro kultivácii s polynukleotidom kódujúcim ovalbumín (pAc-Neo-OVA, pripravený podlá príkladu 2), ktorý bol naviazaný na časticiach, dokázali stimulovať OVA špecifické Tlymfocyty (SIINFEKL+Kb) z hybridómu RF33.70 k produkcii IL-2 (pozri obrázok 4).Further evidence of this predicted mechanism of action of particle-bound polynucleotides is the observation of particle-bound APCs from bone marrow-derived dendritic cells which, after co-in vitro cultivation with a polynucleotide encoding ovalbumin (pAc-Neo-OVA, prepared according to Example 2). , were able to stimulate OVA-specific T lymphocytes (SIINFEKL + K b ) from RF33.70 hybridoma to produce IL-2 (see Figure 4).
Z toho vyplýva, že tieto APC funkčne exprimujú gén pre ovalbumín a vzniká v nich komplex ovalbumínového peptidu a Kb. Kvantitatívne je tento proces porovnatelný s podobným procesom pozorovaným pri pulznom prenose 2 mg/ml rozpustného proteínu OVA do antigén prezentujúcich buniek. Polynukleotidy naviazané na časticiach zlata alebo železa sú v tomto prípade porovnateľne účinné. Z toho vyplýva, že inkubácia polynukleotidu naviazaného na časticiach spolu s fagocytujúcimi APC v podmienkach in vitro vedie k endogénnej produkcii, spracovaniu a prezentácii transfekovaného antigénu. Polynukleotidy naviazané na časticiach tak môžu byť pohltené a exprimované antigén prezentujúcou bunkou a odpovedajúce peptidy môžu byť funkčne prezentované na povrchu týchto buniek tak, aby došlo k indukcii antigén-špecifickej imunitnej odpovede.Accordingly, these APCs functionally express the ovalbumin gene and form a complex of ovalbumin peptide and K b . Quantitatively, this process is comparable to a similar process observed with pulsed transfer of 2 mg / ml soluble OVA protein to antigen presenting cells. Polynucleotides bound to gold or iron particles are comparatively effective in this case. Accordingly, incubation of the particle-bound polynucleotide together with phagocytic APCs under in vitro conditions results in endogenous production, processing and presentation of the transfected antigen. Thus, the polynucleotides bound to the particles may be absorbed and expressed by the antigen-presenting cell, and the corresponding peptides may be functionally presented on the surface of these cells to induce an antigen-specific immune response.
Na obrázku 6 je znázornené, že APC, v tomto prípade subkutánne injikované dendritické bunky odvodené z kostnej drene, ktoré boli vyššie opísaným spôsobom in vitro inkubované s polynukleotidom kódujúcim antigén OVA naviazaným na časticiach, sú schopné vyvolať protinádorovú imunitu proti nádorovým bunkám exprimujúcim daný antigén. V danom prípade jednorazová imunizácia ožiarenými transfekovanými dendritickými bunkami (105) na jedno zviera (5xl04 buniek do každej zadnej končatiny) vyvolala úplnú protinádorovú imunitu. In vivo podané dendritické APC, ktoré sú dobrými stimulátormi antigén-špecifických CTL a protinádorovej imunity, sú po nasýtení peptidom in vitro aspoň porovnateľne imunogénne ako pri nasýtení antigénom pri spoločnej inkubácii s polynukleotidom naviazaným na časticiach.Figure 6 shows that APCs, in this case subcutaneously injected bone marrow-derived dendritic cells that have been incubated in vitro with a polynucleotide encoding a particle-bound OVA antigen as described above, are capable of eliciting anti-tumor immunity against tumor cells expressing the antigen. In this case, single immunization with irradiated transfected dendritic cells (10 5 ) per animal (5 x 10 4 cells per hindlimb) induced complete anti-tumor immunity. In vivo, administered dendritic APCs, which are good stimulators of antigen-specific CTLs and anti-tumor immunity, are at least comparable in immunogenicity with in vitro peptide saturation to antigen saturation when co-incubated with a particle-bound polynucleotide.
Subkutánna aplikácia polynukleotidu naviazaného na časticiach je tak výhodná predovšetkým vďaka tomu, že je možná cielená doprava antigénu do fagocytujúcich antigén prezentujúcich buniek (APC) hostiteľa, čo môže zvýšiť účinnosť génovej imunizácie a zároveň znížiť nežiaduce účinky ako sú, okrem iného napríklad vyvolanie tolerancie alebo mutagenéza po transfekcii normálnych, antigén neprezentujúcich buniek.Thus, the subcutaneous administration of the particle-bound polynucleotide is particularly advantageous because of the targeted delivery of the antigen to the phagocytic antigen presenting cells (APC) of the host, which may increase the efficiency of gene immunization while reducing adverse effects such as induction of tolerance or mutagenesis after transfection of normal, non-antigen presenting cells.
uf ' - 9?uf '- 9?
Claims (22)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53555695A | 1995-09-28 | 1995-09-28 | |
| PCT/US1996/015728 WO1997011605A1 (en) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK40198A3 true SK40198A3 (en) | 1998-11-04 |
Family
ID=24134735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK401-98A SK40198A3 (en) | 1995-09-28 | 1996-09-27 | Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0863704A4 (en) |
| JP (1) | JPH11512724A (en) |
| KR (1) | KR19990063672A (en) |
| CN (1) | CN1201369A (en) |
| AU (1) | AU716497B2 (en) |
| BG (1) | BG102355A (en) |
| CA (1) | CA2233278A1 (en) |
| CZ (1) | CZ92998A3 (en) |
| HU (1) | HUP9802651A3 (en) |
| NO (1) | NO981386L (en) |
| NZ (1) | NZ319891A (en) |
| PL (1) | PL325953A1 (en) |
| SK (1) | SK40198A3 (en) |
| TR (1) | TR199800573T2 (en) |
| WO (1) | WO1997011605A1 (en) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997044446A1 (en) * | 1996-05-24 | 1997-11-27 | University Of Maryland At Baltimore | Dna vaccines for eliciting a mucosal immune response |
| TW570803B (en) * | 1997-04-09 | 2004-01-11 | Duphar Int Res | Influenza vaccine |
| US6287569B1 (en) * | 1997-04-10 | 2001-09-11 | The Regents Of The University Of California | Vaccines with enhanced intracellular processing |
| CA2320626A1 (en) * | 1998-02-11 | 1999-08-19 | Maxygen, Inc. | Genetic vaccine vector engineering |
| EP1141314A2 (en) | 1998-12-31 | 2001-10-10 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| EP1180150A2 (en) * | 1999-04-21 | 2002-02-20 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid immunization |
| WO2002078733A1 (en) * | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Greenville Hospital System | Monocyte-specific particulate delivery vehicle |
| AU2002320314A1 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-21 | Chiron, Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US11529414B2 (en) | 2020-06-23 | 2022-12-20 | Orbis Health Solutions, Llc | Viral vaccines for in vivo expression of a nucleic acid encoding an immunogenic peptide and methods of using the same |
-
1996
- 1996-09-27 WO PCT/US1996/015728 patent/WO1997011605A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 TR TR1998/00573T patent/TR199800573T2/en unknown
- 1996-09-27 SK SK401-98A patent/SK40198A3/en unknown
- 1996-09-27 JP JP9513762A patent/JPH11512724A/en active Pending
- 1996-09-27 CA CA002233278A patent/CA2233278A1/en not_active Abandoned
- 1996-09-27 NZ NZ319891A patent/NZ319891A/en unknown
- 1996-09-27 CZ CZ98929A patent/CZ92998A3/en unknown
- 1996-09-27 HU HU9802651A patent/HUP9802651A3/en unknown
- 1996-09-27 AU AU72515/96A patent/AU716497B2/en not_active Ceased
- 1996-09-27 PL PL96325953A patent/PL325953A1/en unknown
- 1996-09-27 EP EP96933987A patent/EP0863704A4/en not_active Withdrawn
- 1996-09-27 KR KR1019980702134A patent/KR19990063672A/en not_active Application Discontinuation
- 1996-09-27 CN CN96198106A patent/CN1201369A/en active Pending
-
1998
- 1998-03-26 NO NO981386A patent/NO981386L/en unknown
- 1998-03-26 BG BG102355A patent/BG102355A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9802651A3 (en) | 2001-08-28 |
| PL325953A1 (en) | 1998-08-17 |
| WO1997011605A1 (en) | 1997-04-03 |
| EP0863704A1 (en) | 1998-09-16 |
| JPH11512724A (en) | 1999-11-02 |
| KR19990063672A (en) | 1999-07-26 |
| BG102355A (en) | 1999-04-30 |
| CZ92998A3 (en) | 1998-09-16 |
| EP0863704A4 (en) | 2003-09-10 |
| CN1201369A (en) | 1998-12-09 |
| AU7251596A (en) | 1997-04-17 |
| NO981386L (en) | 1998-05-28 |
| AU716497B2 (en) | 2000-02-24 |
| TR199800573T2 (en) | 1998-07-21 |
| NO981386D0 (en) | 1998-03-26 |
| CA2233278A1 (en) | 1997-04-03 |
| NZ319891A (en) | 1999-01-28 |
| HUP9802651A2 (en) | 1999-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6399054B1 (en) | Method for the production of activated marked tumor-specific T cells and use thereof in treatment of tumors | |
| Anguille et al. | Dendritic cells as pharmacological tools for cancer immunotherapy | |
| Gammon et al. | Improving the clinical impact of biomaterials in cancer immunotherapy | |
| US5951975A (en) | Induction of CTLs specific for natural antigens by cross priming immunization | |
| CN111148533A (en) | Compositions for chimeric antigen receptor T cell therapy and uses thereof | |
| CA2278678A1 (en) | Cancer immunotherapy with semi-allogeneic cells | |
| JP2007502780A (en) | Targeting dendritic cells in vivo | |
| US20090010948A1 (en) | Anti-tumor vaccines delivered by dendritic cells devoid of interleukin-10 | |
| MX2007006717A (en) | Alpha thymosin peptides as cancer vaccine adjuvants. | |
| JP2017509652A (en) | Medicament for use in a method of inducing or prolonging a cellular cytotoxic immune response | |
| Kramer et al. | Functionalisation of Virus‐Like Particles Enhances Antitumour Immune Responses | |
| SK40198A3 (en) | Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization | |
| US6491925B2 (en) | Compositions and methods for cancer prophylaxis and/or treatment | |
| Stevenson et al. | Tumor vaccines | |
| Varypataki et al. | Combined photosensitization and vaccination enable CD8 T-cell immunity and tumor suppression independent of CD4 T-cell help | |
| US20110262389A1 (en) | Tumor-derived Biological Antigen Presenting Particles | |
| US7176186B1 (en) | Stimulation of cell-mediated immune responses by targeted particulate genetic immunization | |
| Bronte | Genetic vaccination for the active immunotherapy of cancer | |
| Errington et al. | Allogeneic tumor cells expressing fusogenic membrane glycoproteins as a platform for clinical cancer immunotherapy. | |
| KR101506426B1 (en) | Method for Preparing nanometric vesicular T cell vaccine stabilized and potentiated by chemical fixation with paraformaldehyde | |
| CN115029311B (en) | Non-nucleated cell for targeted macrophage delivery and preparation method and application thereof | |
| Little et al. | Nonviral delivery of cancer genetic vaccines | |
| MXPA98002405A (en) | Stimulation of medium immune response in objective cells through genetic immunization in particu | |
| Reay | Dendritic cells: immunological features and utilisation for tumour immunotherapy | |
| Rasalkar Muley | Targeted Tumor Immunotherapy: Are Vaccines the Future of Cancer Treatment? |