SK283760B6

SK283760B6 - Farmaceutický prostriedok na dopravu bioaktívnych látok

Info

Publication number: SK283760B6
Application number: SK993-99A
Authority: SK
Inventors: Paul R. Meers; Tong Shangguan; Shaukat Ali; Andrew S. Janoff; Charles Pak
Original assignee: The Liposome Company, Inc.
Priority date: 1996-10-15
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2004-01-08
Also published as: EP0966267A4; IL130822A0; HUP0000522A1; EP0966267B1; IL130822A; AU4672397A; AU725257B2; NZ336538A; ES2321769T3; WO1998016199A1; CA2276269C; SK99399A3; HUP0000522A3; NZ514133A; NO993257L; CA2276269A1; DE69739277D1; US6120797A; NO993257D0; EP0966267A1

Abstract

Farmaceutický prostriedok na dopravu bioaktívnych látok do buniek živočíchov obsahuje farmaceuticky prijateľný nosič; lipozóm s lipidickou zložkou, ktorá obsahuj N-acylfosfatidyletanolamín a prídavný lipid, pričom lipidická zložka obsahuje destabilizácie účinné množstvo N-acylfosfatidyletanolamínu a lipozóm je mnohovrstvový alebo veľký jednovrstvový lipozóm. ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutického prostriedku na dopravu bioaktívnych látok do buniek živočíchov.

Doterajší stav techniky

Fosfatidyletanolamíny („PE“) sú prirodzene sa objavujúce fosfolipidy, ktoré majú typicky dva acylové reťazce a fosforyletanolamínovú skupinu, viazané na glycerolovú kostru lipidov. N-acylované fosfatidyletanolamíny („NAPE“) sú PE, na ktoré je viazaný ďalší, tretí acylový reťazec cez aminoskupinu, obsiahnutú vo fosforyletanolamínovej skupine. Niektoré NAPE sa taktiež v malých množstvách nachádza v biologických membránach.

Väčšina PE normálne nevytvára dvojvrstvy pri neutrálnej hodnote pH. Namiesto toho vytvára vo vodnom prostredí šesťmiestne (H_n) štruktúry. Táto schopnosť môže byť spojená so zvýšenou schopnosťou fúzovania lipozómov, keď sú tieto lipidy začlenené do lipozomálnych dvojvrstiev pri vhodných podmienkach (Verkleij A. J. (1984) Biochim. Biophys. Acta. 799, 43 - 63; Cullis P. R. & de Kruijff B. (1979) Biochim. Biophys. 559, 399 - 420; Ellens H., Siegel, D. P., Alford A., Yeagle P. L., Boni L., Lis L. J., Quinn P. & Bentz J., (1989) Biochemistry 28, 3692 - 3703). NAPE naopak vo vodných disperziách, v neprítomnosti pridávaných dvojmocných katiónov, spontánne vytvára dvojvrstvy (Newman J. L., Stiers D. L., Anderson W. H & Schmid H. H. O., (1986) Chem. Phys. Lipids 42, 249 - 260; Akota S., Tellier C., Le Roux C. & Marion D. (1988), Chem. Phys. Lipids 46, 43 - 50; Lafrance D., Marion D & Pezolet M. (1990), Biochemistry 29, 4592 - 2599; Domingo J. C., Mora M. & De Madariaga M. A. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1148, 308 - 316.

Žiadny z uvedených dokumentov neopisuje štúdiu NAPE vzhľadom na ich schopnosť uľahčovať fúziu alebo destabilizovať dvojvrstvu v požadovanom mieste dopravenia, ale pri zachovaní si schopnosti tvoriť lipozómy, ktoré môžu stabilne obaľovať materiál. Žiadna z predchádzajúcich štúdii neopisuje použitie, kde môžu byť zahrnuté NAPE, na riadené dopravovanie lipozomálnych liečiv a žiadna neopisuje vytváranie NAPE, s cieľom vylepšiť takéto dopravovanie, hlavne in vivo. Navyše, žiadna z nich ani nevytvára ani neštuduje NAPE N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamín.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje lipozómy, ktoré obsahujú destabilizácie schopné množstvo N-acylfosfatidyletanolamínu („NAPE“). Tieto lipozómy sú užitočné na fúziu s bunkovými membránami v prítomnosti vhodných koncentrácií katiónov, keď sú umiestnené v blízkosti týchto buniek. NAPE sú fosfolipidy, založené na glycerole, ktoré majú na prvej a druhej pozícii glycerolovej kostry viazané nasýtené alebo nenasýtené, 14 až 24 uhlíkov dlhé acylové reťazce. Tretia pozícia je obsadená fosforyletanolamínom, na ktorého amínoskupine je viazaný tretí acylový reťazec so 4 až 24 uhlíkovými atómami a je nasýtený alebo nenasýtený. V súčasnom čase je uprednostňovaným NAPE N-C12 DOPE (N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamín). Destabilizácie schopné množstvo NAPE, obsiahnuté v lipidickej zložke lipozómov je obvykle od asi 10 molámych percent lipidickej zložky do asi 90 molárnych percent. Lipozóm, do ktorého je NAPE začlenený, môže byť jedno vrstvový, niekoľkokrátvrstvový alebo mnohovrstvový, ale prednostne je jednovrstvový. Lipidická zložka lipozómu zahŕňa, okrem NAPE, aspoň jeden ďalší lipid. Takýmito lipidmi môžu byť iba, ale nie iba, akékoľvek druhy lipidov, ako sú napr. fosfolipidy, glykolipidy a steroly, ktoré môžu byť použité pri príprave lipozómov. Prednostne zahŕňa tento prídavný lipid jeden alebo viacej fosfolipidov. Ešte výhodnejšie tieto zahŕňajú fosfatidylcholín („PC“), akým je diolejoylfosfatidylcholín („DOPC“) alebo fosfatidyletanolamín („PE“), ako napr. PE, vybraný zo skupiny, obsahujúcej transesterifikovaný fosfatidyletanolamín, dipalmitoylfosfatidyletanolamín, palmitoyl-olejoylfosfatidyletanolamín a diolejoylfosfatidyletanolamín; alebo PE, spojený s látkou, vybranou zo skupiny, obsahujúcou dikarboxylové kyseliny, polyetylenglykoly, polyalkylctery a gangliozidy.

Lipozómy môžu mať pripojenú navádzaciu látku a môžu obsahovať, buď v dvojvrstve, alebo vo vodnej časti, jednu alebo viac bioaktívnych látok. Pripojenie navádzacej látky na lipozóm je tu uprednostňované, s cieľom umiestniť lipozómy do blízkosti buniek, ktoré sú cieľom dopravenia obsahu lipozómov, kde môžu byť lipozómy v prítomnosti vhodnej koncentrácie katiónov lokálne destabilizované alebo fúzované s bunkami.

Lipozómy tohto vynálezu môžu takto dopravovať aktívne látky do buniek pomocou stretnutia sa týchto buniek s lipozómami v podmienkach, pri ktorých NAPE destabilizujú lipozomálnu dvojvrstvu na účely indukcie lokálneho uvoľnenia aktívnej látky lipozómov a/alebo fúzie lipozómov s bunkami. Takéto dopravenie môže byť uskutočňované in vitro alebo v tele cicavca a môže byť použité napr. na ex vivo transfekciu kmeňových buniek alebo dopravenie protirakovinovej liečebnej látky.

Nasledujúce skratky a plné mená nimi predstavovaných zlúčenín, ktoré sa nachádzajú v opise: PE, fosfatidyletanolamín; PC fosfatidylcholín: PG, fosfatidylglycerol; PS, fosfatidylserín; DO-, diolejoyl-; NAPE N-acyl-fosfatidyletanol amín; NAE, N-acyl-etanolamín; N-C12-DOPE, N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamín; NBD-PE, N-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)fosfatidyletanolamín (transesteriflkovaný fosfatidylcholín z vajca); Rh-PE, N-(lisamín-rodamín B-sufonyl)fosfatidyletanolamín (transesterifikovaný fosfatidylcholín z vajca; TMR, tetrametylrodamín; TMR-70kD dextrán, s tetrametylrodamínom spojený 70kD dextrán; C₁₂E₈, oktaetylénglykolmonododecylctcr; RET, rezonančný prenos energie; LUV, veľký jednovrstvový lipozóm; TES, N-[tris(hydroxymetyl]-2-amínoetansulfónová kyselina; 'H-NMR, protónová nukleárna magnetická rezonancia; H_n , šesťstenná II; TLC, chromatografia na tenkej vrstve; BSA, hovädzí sérový albumín.

Tento vynález poskytuje lipozóm, ktorého lipidická zložka obsahuje N-acyl-fosfatidyletanolamín („NAPE“). NAPE sú fosfatidyletanolamíny, ktoré majú tri acylové reťazce, dva priamo viazané na glycerovú kostru a tretí, viazaný cez aminoskupinu fosforyletanolamínovej skupiny. NAPE majú teda nasledujúcu všeobecnú štruktúru chj-o-r¹

I

CH-O-R²

I

CH₂-0-P(0)₂-0-CH₂CH₂-NH-R^j , kde každý z R¹, R² a R³ je acylový reťazec, ktorý má štruktúru' -C(O)(CH₂)_nl(CH=CH)„,(CH₂)„₃(CH=CH)_n4 (CH₂)_n5(CH=CH)_n6(CH₂)_n7(CH=CH)_n8(CH₂)_n9CH₃. nl je celé číslo 1 až 22; n3 je celé číslo 1 až 19; n5 je celé číslo 1 až 16; n7 je celé číslo 1 až 13 a n9 je celé číslo 1 až 10. Acylové reťazce môžu byť nasýtené alebo nenasýtené, to znamená každý z n2, n4, n6 a n8 je nezávisle rovnajúci sa 0 alebo 1.

Acylové reťazce, viazané priamo na glycerolovú kostru NAPE, t. j. R¹ a R², majú vhodnú dĺžku na tvorbu stabilnej dvoj vrstvy. Podľa toho je súčet nl+2n2+n3+2n4+n5+ +2n6+n7+2n8+n9 určujúci dĺžku acylového reťazca v počte uhlíkových atómov celé číslo 12 až 22 a R¹ a R² majú do dĺžky nezávisle od 14 do 24 uhlíkových atómov. Prednostne majú R¹ a R² do dĺžky nezávisle od 16 do 18 uhlíkov. Aspoň jeden z R¹ a R² je nenasýtený, čo napomáha prechodu NAPE z fázy uprednostňujúcej dvojvrstvu do fázy, ktorá dvojvrstvu destabilizuje a aspoň jeden z n2, n4, n6 a n8 sa taktiež rovná 1. Viac je uprednostňované, keď sú obidva, R¹ a R², nenasýtené, to znamená, že pre R¹ a R² je aspoň jeden z n2, n4, n6 a n8 rovnajúci sa I. Najviac je uprednostňované, keď sú obidve, R¹ R², kyselina olejová, to znamená, že obidva majú 18 uhlíkov, obsahujú jednoduché a dvojité väzby a majú štruktúru

C(O)(CH₂)₇(CH=CH)(CH₂)₇CH₃.

Acylový reťazec, viazaný na amíioskupinu fosforyletanolamínu NAPE, môže mať 4 až 24 uhlíkov. To znamená, že pre R³ sa súčet Πΐ+2η2+η2+2η4+η5+2η6+η7+2η8+ +n9 rovná celému číslu 2 až 22; prednostne sa tento súčet rovná celému číslu 6 až 20. Prednostne je tento acylový reťazec nasýtený. Lepšie je, ak R³ je nasýtený a dlhý 12 uhlíkov. Najlepšie obsahuje NAPE, ktorý je začlenený do lipozómu, dva reťazce kyseliny olejovej a C-12 uhlíkový reťazec, viazaný na amínoskupinu a má takúto štruktúru:

CH₂-0-(01 (CH₂), (CH=CH) <CH₂)₁CH₃

I

CH-O-C(O) |CH₂)₇(CH=CH) (CH>),CH,

I

CH₂-O-P (O) ₂-O-CH₂CH₂NH-C (C ) (CHihoCH,.

t. j. N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamín; („A-C12-DOPE“).

NAPE sú prirodzene sa objavujúce lipidy, ktoré sa izolujú z rastlín, mikroorganizmov a. živočíchov (Bombstain R. A. (1965) Biochem. Biophys. Res. Cornmun, 21, 49 - 54; Čiarke N. G., Hazlewood G. P. & Dawson R.M.C. (1976) Chem.Phys. Lipids 17, 222 - 232; Dawson R. M. C., Čiarke N. G. & Quarles R. H. (1969) Biochem. J. 114, 265

- 270; Ellingson J. S. (1980) Biochemistry 19, 6176 - 6182; Epps D. E., Schmid P. C., Natarajan V. & Schmid H. H. O. (1979), Biochem. Biophy. Res. Cornmun. 90, 628 - 633; Epps D. E., Natarajan V., Schmid P. (1 & Schmid H. H. O (1980), Biochem. Biophys. Acta 618, 420 - 430; Ganley O. H., Graessle O. E & Robinson H. J. (1958) J. Lab. Cli. Med. 51, 709 - 714; Gray G. M. & Yardley H. J. (1975) J. Lipidis. Res. 16, 441 - 447; Hargin K. D. & Morrison W. R. (1980) J. Sci. Food. Agrc. 31, 877 - 888; Hazlewood G. P. & Dawson R. M. C. (1975), Biochem. J. 150, 521 - 525; Kuehl Jr., F. A. Jacob T. A., ganley O. H.,ormond R. E. & Meisinger M. A. P. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 5577

- 5578; MacMurray T. A & Morrison W. R. (1970) J. Sci Food. Agric. 21, 520 - 528; Matsumoto M. & Miwa M (1973) Biochem. Biophys. Acta 296, 350 - 364; Morrison W. R., mann D. L., Wong S. & Coventry A. M. (1975) J Sci. Food. Agric. 26, 507 - 521 Natarajan V., Reddy P. V., Schmid P. C. & Schmid H. H. O. (1982), Biochem. Biophys. Acta 712, 342 - 355; Natarajan V., Schmid P. C., Schmid H. H. O., Reddy P. V. & Zužarte-Augustín M. L (1985), Biochem. Biophys, Acta 835, 426 - 433; Reddy P. V., Schmid P. C., Natarajan V., Muramatsu T. & Schmid H. H. O. (1984), Biochem. Biophys. Acta 795, 130 - 136, Schmid P. C., Reddy P. V., Natarajan V. & Schmid H. H.

O. (1983), J. Biolo. Chem. 258, 9302 - 9306; Schmid H. H. O., Schmid P. C. & Natarajan V., (1990), Prog. Lipid. Res. 29, 1 - 43; Somerhaju P. & renkonen O. (1979), Biochem. Biophys. Acta 573, 83 - 89, ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz). NAPE môžu byť taktiež vytvorené synteticky, napríklad tak, ako je opísané ďalej, v príklade L Stručne, táto syntetická príprava zahŕňa rozpustenie fosfatidyletanolamínu („PE“), napr. DOPE, v organickom rozpúšťadle, napr. metylénchloride. Potom je do roztoku pridaný anhydrid mastnej kyseliny, ktorá má byť naviazaná na amínoskupinu PE, napr. anhydrid kyseliny laurovej. Po chromatografickej purifikácii je výsledná zlúčenina zhromaždená a skoncentrovaná vo vákuu; môže byť charakterizovaná mnohými spôsobmi, vrátane protónovej nukleárnej magnetickej rezonancie. Lipidická zložka lipozómov obsahuje „destabilizácie schopné“ množstvo NAPE, čo je také množstvo NAPE, ktoré, keď je začlenené do lipozómovej dvojvrstvy, je dostatočné na destabilizáciu tejto dvojvrstvy v prítomnosti vhodnej, napr. fyziologickej, koncentrácie katiónov. Tu použitý termín „destabilizácie dvojvrstvy“ znamená porušenie alebo rozpad lipidického usporiadania lipozomálnej lipidickej dvojvrstvy, na účely umožnenia lokálneho uvoľnenia lipozomálneho obsahu a/alebo indukcie fúzie lipozómov s inými lipidickými vrstvami, napr. bunkovými membránami, keď tieto sú v spojení s lipozómom. Destabilizácie schopné množstvo NAPE je také množstvo NAPE, ktoré indukuje vyšší stupeň nestability dvojvrstvy pri vhodných podmienkach, než ako by boli v prípade, keď dvojvrstva NAPE neobsahuje. Destabilizácie schopné množstvo NAPE typicky predstavuje asi 10 molámych percent lipidickej zložky lipozómu. Prednostne je toto množstvo od asi 10 molámych percent do asi 90 molámych percent lipidickej zložky, lepšie od 20 molámych percent do asi 80 molámych percent lipidickej zložky. Najlepšie, v súčasnom čase, predstavuje NAPE asi 70 molámych percent lipidickej zložky.

Predpokladá sa, že acylácia PE, čím vznikajú NAPE, vytvára na PE náboj, ktorý potláča sklon PE k vzniku nedvojvrstvových fáz; predpokladá sa, že tento náboj umožňuje, aby NAPE vytvárali stabilné dvojvrstvy. Prítomnosť dostatočnej koncentrácie, napr. fyziologickej úrovne, rôznych katiónov, napr. H*, Ca²⁺ alebo Mg²⁺, vyrovná tento protipôsobiaci náboj tretieho acylového reťazca a samotné NAPE sú potom z toho dôvodu nestabilné v komformácii dvojvrstvy. Podľa toho zahŕňajú „vhodné podmienky“, tu opísané na destabilizáciu dvojvrstvy obsahujúce NAPE, prítomnosť dostatočných koncentrácií jedného alebo viacej katiónov, ktorc sa môžu nachádzať v biologických tekutinách alebo môžu byť vytvorené v kultúrach. Meranie dodania lipozomálnych obsahov ,je ľahké pre bežného odborníka, ktorý má k dispozícii opis tohto vynálezu, použitím rutinných techník. Odborník môže napríklad do lipozómov, obsahuj úcich/neobsahujúcich NAPE, vložiť detekovateľný marker, inkubovať tieto lipozómy vo vhodnom bunkovom kultivačnom médiu a potom určiť percento detekovateľného markeru, dopraveného do buniek po inkubácii. Po takýchto pokusoch by odborník pozoroval, že bunky, inkubované s lipozómami obsahujúcimi NAPE, by obsahovali väčšie množstvo detekovateľného markeru ako bunky, inkubované s lipozómami neobsahujúcimi NAPE.

Meranie dopravovania lipozomálnych obsahov môže byť ľahké pre odborníka v odbore, ktorý má k dispozícii opis tohto vynálezu, použitím rutinných techník. Odborník môže napríklad uzavrieť detekovateľný marker do lipozómov, ktoré obsahujú/neobsahujú NAPE, inkubovať tieto lipozómy vo vhodnom bunkovom kultivačnom médiu a potom určiť percento detekovateľného markeru, dopraveného do buniek po inkubácii. Po vykonaní takýchto pokusov by odborník pozoroval, že bunky inkubované s lipozómami obsahujúcimi NAPE obsahujú väčšie množstvo detekovateľného markeru ako bunky inkubované s lipozómami neobsahujúcimi NAPE.

Lipidická zložka lipozómov zahŕňa, okrem NAPE, ďalší lipid. Takýmito lipidmi môžu byť hociktoré z mnohých lipidov, napr. fosfolipidy, glykolipidy či steroly, bežne používané v lipozómoch.

Prednostne zahŕňa tento prídavný lipid jeden alebo viacej fosfolipidov, napr. fosfatidylcholin („PC“), ako je diolejoylfosfatidylcholin („DOPC“). Napríklad, v niektorých príkladoch tohto vynálezu je prídavným lipidom DOPC; lipidická zložka lipozómov obsahuje asi 30 molárnych percent DOCP a asi 70 molámych % NAPE, N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamínu.

Prídavným lipidom môže byť taktiež fosfatidyletanolamín („PE“), ako je napr. transesterifikovaný PE („tPE“), dipalmitol PE („DPPE“), palmitol-olejoyl PE („POPE“), diolejoyl PE(„DOPE“); alebo PE, ktorého hlavná skupina je spojená s látkou, vybranou zo skupiny, obsahujúcej dikarboxylové kyseliny, polyetylénglykoly, polyalkylétery a gangliozidy. Takéto látky sú schopné brániť väzbe sériových proteínov na lipozómy, do ktorých boli tieto lipidy začlenené. Podľa toho, PE, obsahujúce takéto modifikácie hlavnej skupiny, „lipidy s modifikovanou hlavnou skupinou“ menia farmakologické chovanie lipozómov, predlžujú ich polčasy života a zvyšujú pomer pôvodných lipozómov, ktoré dosiahnu určené miesta terapeutického alebo diagnostického účinku (pozri Blume a spol. Biochem. Biophys. Acta. 1149 : 180 (1993); Gabizon a spol., Pharm. Res. 10(5): 703 (1993); Park a spol., Biochim. Acta. 1108: : 257 (1992); Woodle a spol., US patent č. 5 013556; a Alien a spol., US patent č. 4 837028 a 4 920016. ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz).

Medzi uprednostňované lipidy s modifikovanou hlavnou skupinou patrí fosfatidyletanolamín dikarboxylovej kyseliny („PE-DCA“) alebo poletylénglykolové konjugáty. V súčasnom čase je uprednostňovaným lipidom s modifikovanou hlavnou skupinou diolejoylfosfatidyletanolamín („DOPE-GA“). Množstvo lipidu s modifikovanou hlavnou skupinou, začlenené do lipozómov, záleží od mnohých faktorov, ktoré sú bežnému odborníkovi v odbore dobre známe alebo ktoré sú zistiteľné bez nutnosti robenia neobvyklých pokusov. Medzi ne patrí, ale nie iba: typ modifikácie hlavnej skupiny, typ a veľkosť lipozómov a požadované terapeutické použitie prípravku. Prednostne sú lipidy s modifikovanou hlavnou skupinou začleňované do lipozómov v koncentrácii aspoň 5 molámych percent lipidickej zložky lipozómu, lepšie asi 10 molámych percent lipidickej zložky lipozómu.

„Lipozómy“ sú samostatne sa skladajúce štruktúry, obsahujúce jednu alebo viacej lipidických dvojvrstiev, z ktorých každá obklopuje vodný priestor a obsahuje dve opačne položené vrstvy amfipatických lipidických molekúl. Amfipatické lipidy obsahujú polámu (hydrofilnú) hlavnú časť, kovalentne spojenú s jedným alebo dvoma nepolárnymi (hydrofóbnymi) acylovými reťazcami. Všeobecne sa predpokladá, že energeticky nevýhodné kontakty medzi hydrofóbnymi acylovými reťazcami a vodným médiom indikujú pri lipidických molekulách zmenu usporiadania do takého stavu, že ich poláme skupiny sú orientované smerom k vodnému médiu, zatiaľ čo acylové reťazce smerujú smerom dovnútra dvovrstvy. Takto je vytvorená stabilná štruktúra, v ktorej sú acylové reťazce chránené pred kontaktom s okolitým vodným médiom.

Jednovrstvové lipozómy sú lipozómy, ktoré majú jednu lipidickú dvojvrstvu. Môžu to byť buď malé jednovrstvové lipozómy („SUV“), ktoré majú priemerne priemer 25 až 50 nm, alebo veľké jednovrstvové lipozómy („LUV“), ktoré majú priemerne priemer väčší ako 50 nm. Niekoľkovrstvové lipozómy majú od jednej do niekoľko lipidických dvojvrstiev a mnohovrstvové lipozómy („MVL“) majú mnoho dvojvrstiev. Lipozóm tohto vynálezu môže byť jednovrstvový, niekoľkovrstvový alebo mnohovrstvový, ale prednostne je jednovrstvový a lepšie veľký jednovrstvový lipozóm.

Lipozómy môžu byť vytvorené mnohými spôsobmi (súhrn napr. pozri Deamer a Uster (1983)). Mnohovrstvové lipozómy môžu byť vytvorené napríklad metódou Banghema a spol., (1965) a metódou Lenka, Fountaina alebo Cullisa na prípravu MLV v podstate s rovnomerným rozdelením rozpustenej látky medzi lamelami (t. j. „SPLV“; pozri US patent č. 4 522 803, 4 588 578, 5 030 453, 5 169 637 a 4 975 282). Niekoľkovrstvové lipozómy môžu byť vytvorené napr. Boniho metódou na prípravu „IF“ lipozómov (interdigitation-fusion liposom) (pozri EP patent č. 510 086) alebo Papahadjopoulovu techniku odparenia prevrátenej fázy (US patent č. 4 235 871). Jednovrstvové lipozómy môžu byť vytvorené metódami, ako je vstrekovanie etanolu (pozri napr. Batzri a Kron 1973) alebo MLV technikami ako je sonikácia (Papahadjopoulos a spol., (1968) alebo pretláčanie (US patent č. 5 008 050 a US patent č. 5 059 421). Lipozómy tohto vynálezu môžu byť pripravené hociktorou v odbore všeobecne známou metódou na prípravu lipozómov, vrátane metód, uvedených v citovaných dokumentoch (ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz).

Lipozómy tohto vynálezu môžu byť dehydratované, uskladnené a potom znova zložené tak, že podstatná časť obsahov lipozómov zostane počas procesu dehydratácie/rehydratácie obsiahnutá vnútri. Dehydratácia lipozómov všeobecne vyžaduje použitie hydrofilných vysušujúcich ochranných látok na vnútornom a vonkajšom povrchu lipozomálnej dvoj vrstvy (pozri US patent 4 880 635, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz). Všeobecne sa predpokladá, že tieto hydrofilné látky bránia zmene usporiadania lipidov v lipozóme, takže veľkosť a obsah zostane počas sušiaceho postupu a následná rehydratácia je zachovaná. Najviac uprednostňovanými sušiacimi ochrannými látkami sú disacharidy, napr. laktóza, maltóza, trehalóza alebo sacharóza.

Lipozómy tohto vynálezu môžu obsahovať „navádzaciu látku“, t. j . látku, ktorá môže byť viazaná na lipozóm a ktorá potom smeruje lipozóm do špecifického miesta v tele cicavca. Predpokladá sa, že takéto smerované dopravenie je výsledkom rozpoznania nejakej látky na povrchu cieľovej bunky navádzacou látkou. Typicky medzi takéto navádzacie látky patria, ale nie iba, protilátky, ligandy bunkových receptorov, lektiny a pod. Navádzacie látky môžu byť na lipozóm viazané akýmkoľvek v odbore všeobecne prijímaným spôsobom pre kovalentnú alebo nekovalentnú väzbu takých látok a lipozómov. Medzi takéto spôsoby patria napríklad tie, ktoré sú opísané v nasledujúcich dokumentoch, ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz: US patent č. 5 399 331 opisuje viazanie proteínov na lipozómy s použitím väzbových činidiel, ktoré majú aspoň jednu maleimidoskupinu a reaktívny amín; v US patentoch č. 4 885 172, 5 059 421 a 5 171 578 sa proteíny na lipozómy viažu s použitím glykoproteínu strepavidínu; Sato a Sunamoto opisujú obaľovanie smerovaných lipozómov polysacharidmi.

Predkladané sú tu aj prostriedky, obsahujúce lipozómy tohto vynálezu. Medzi takéto prostriedky patria farmaceutické prostriedky, ktoré taktiež obsahujú „farmaceutický prijateľný nosič“, ktorým je nejaké médium, všeobecne prijateľné na použitie v spojení s podávaním lipozómov živočíchom, vrátane ľudí. Príprava farmaceutický prijateľných nosičov záleží od mnohých faktorov, ktoré sú v rámci znalostí bežného odborníka. Záleží, ale nie iba, od konkrétnej použitej bioaktívnej látky, jej koncentrácie, stability a zamýšľanej dostupnosti; choroby, poruchy alebo stavu liečeného prostriedkom; liečenej osoby, jej veku, veľkosti a všeobecného stavu; zamýšľanom spôsobe podávania prostriedku, napr. nosným, ústnym, očným, miestnym, transdermálnym, vaginálnym, podkožným, intraperitoneálnym, vnútrožilovým alebo intramuskulámym (pozri napríklad, Naim (1985), ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz). Typické farmaceutický prijateľné nosiče použité na parenterálne podávanie bioaktívnej látky, zahŕňajú napríklad D5W, vodný roztok obsahujúci 5 % w/v dextrózy, fyziologický soľný roztok. Farmaceutický prijateľné nosiče môžu obsahovať ďalšie prídavné zložky, ako napríklad tie, ktoré zvyšujú stabilitu lipozómov.

Ďalej je tu predkladaný spôsob dopravovania bioaktívnej látky do bunky. „Bioaktívna látka“, ktorá môže byť do buniek dopravená lipozómami, je hociktorá látka alebo skladba látky, ktorá môže byť pripravená v lipozómoch a byť podávaná živočíchom, prednostne človeku. Lipozómy naplnené bioaktívnymi látkami môžu pomôcť rozpusteniu tejto látky v lipide alebo vodnej fáze, použitej na prípravu vehikúl. Inou možnosťou je naplnenie lipozómov ionizovateľnými bioaktívnymi látkami tak, že sú najskôr vytvorené lipozómy, je určený elektrochemický potenciál, napr. pomocú gradientu na najkrajnejšej lipozomálnej dvojvrstve a potom je k vodnému médiu obklopujúcemu lipozómy pridaná ionizovateľná látka (pozri Balí a spol., US patent č. 5 077 056, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz).

Bioaktívne látky môžu mať liečebnú aktivitu pri živočíchoch a môžu byť taktiež podávané na diagnostické účely. Bioaktívne látky, ktoré môžu byť spojené s lipozómami tohto vynálezu, zahŕňajú, ale nie iba, antivírusové látky ako sú acyclovir, zidovudin a interferóny; antibakteriálne látky ako sú amínoglykozidy, cefalosporíny a tetracyklíny; antifungálne látky ako sú polyénové antibiotiká, imidazoly a triazoly; antimetabolické látky ako sú kyselina listová a analógy purínu a pyrimidínu; antineoplastické látky ako sú antracyklínové antibiotiká a rastlinné alkaloidy; steroly ako je cholesterol, uhľohydráty, napr. cukry a škroby; aminokyseliny, peptidy, proteíny ako sú bunkové receptorové proteíny, imunoglobulíny, enzýmy, hormóny, neutrotransmitery a glykoproteíny; farbivá; rádioaktívne značky ako sú rádiozotopy a rádiozotopmi značené látky; látky neprepúšťajúce žiarenie; fluorescenčné látky; mydriatické zlúčeniny; bronchodilatátory; lokálne anestetiká; sekvencie nukleových kyselín ako sú mRNA, cDNA, genómová DNA a plazmidy; bioaktívne lipidy ako sú éterlipidy a ceramidy a pod.

Spôsob dopravenia bioaktívnej látky tohto vynálezu zahŕňa stretnutie sa bunky s prostriedkom obsahujúcim lipozóm podľa vynálezu. Takéto stretnutie je prednostne vykonávané v prítomnosti vhodnej koncentrácie, napríklad, ale nie iba, 1 - 3 mM katiónu, napr. Ca²⁺/Mg²⁺; toto stretnutie môže byť taktiež vykonané pri kyslom pH za neprítomnosti prídavných katiónov.

Toto dopravenie môže byť vykonané in vitro, ako napr. na diagnostické účely alebo ex vivo dopravenie liečebnej látky alebo nukleovej kyseliny do buniek kostnej drene, kde v tomto prípade prostriedok obsahuj ítci lipozóm obsahuje taktiež dvojmocné katióny. Druhou možnosťou je urobenie stretnutia in vivo, kde dané bunky sú prednostne cicavčie, je použitý farmaceutický prijateľný nosič a lipozómy pred nostne obsahujú navádzaciu látku. Pri lipozomálnom dopravovaní bioaktívnej látky in vivo, podľa spôsobu tohto vynálezu, môže byť dopravované terapeuticky alebo diagnosticky účinné množstvo liečebných alebo diagnostických látok do bunky cicavca postihnutého chorobou, poruchou alebo stavom, umožňujúcim diagnózu alebo liečenie danou látkou. Od tohto času môže byť takéto dopravovanie použité na diagnózu alebo liečenie choroby, porúch alebo stavov pri cicavcoch. Cicavce môžu byť napríklad postihnuté infekčnou mikrobiálnou chorobou, napr. vírusovými alebo bakteriálnymi infekciami; rakovinou, napr. rakovinou mozgu, pŕs, hrubého čreva, pľúc, vaječníkov, prostaty alebo žalúdka; zápalmi, napr. artritídou alebo autoimunitnými ochoreniami ako je reumatoídna artritída alebo juvenilná diabetes; a do buniek týchto cicavcov môže byť dopravené terapeuticky účinné množstvo antibakteriálnej, protirakovinovej alebo protizápalovej látky.

Dopravenie obsahu lipozómov môže byť uľahčené tým, že sa do lipozómov začlení NAPE, pretože NAPE destabilizujú lipozomálnu dvojvrstvu v prítomnosti vhodných koncentrácií, napr. fyziologickej, katiónov alebo pri kyslom pH za neprítomnosti ďalších zložiek. Destabilizácia sprostredkovaná NAPE, môže dokonca viesť k fúzii lipozómov s bunkovými membránami a z toho dôvodu k priamemu dopraveniu lipozomálnych obsahov do buniek.

Fúzia zahŕňa jednako väzbu lipozóm-bunka tak aj premiešanie lipidov a membrány, čo je možné stanoviť mnohými spôsobmi, ktoré sú známe bežnému odborníkovi v odbore, ktorý má k dispozícii opis tohto vynálezu. Medzi ne patria napríklad, ale nie iba, pokusy založené na fluorescencii, detailnejšie opísané ďalej v príklade 4. Stručne, lipozómy sú značené fluorescenčnými markermi, ako je N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)fosfatidyletanolamín („NBD-PE“) a N-(lisamín-rodamín B-sulfonyl)fosfatidyletanolamín („Rh-PE“) a potom sa spoja s bezfarebnými erytrocytmi, zbavenými hemoglobinového obsahu; bezfarebné erytrocyty sú obzvlášť vhodné na použitie pri meraní fúzie lipozóm-bunka, pretože tieto bunky nie sú schopné endocytózy lipozómov a začleňujú lipozomálne lipidy do svojich bunkových membrán iba pomocou fúzie. Bezfarebné erytrocyty môžu byť pripravené tak, ako už bolo skôr opísané (pozri Williamson P., Algarin L., Bateman J., Choe H. R. & Schlegel R. A. (1985) J. Celí Physiol, 123, 209 -

- 214; Clague M. J., Schod C., Zech L. & Blumenthal R (1990) Biochemistry 29, 1303 - 1309, ktorých obsahy sú tu zahrnuté ako odkaz), napr. pomocou napúčania erytrocytov v hypotonickom roztoku, na účely ich prasknutia a uvoľnenia ich hemoglobínu a následné uzavretie erytrocytov pomocou ich inkubácie vo vhodnom pufri.

Značené lipozómy môžu byť inkubované s bezfarebnými erytrocytmi v prítomnosti dvoj mocných katiónov, napr. Ca²⁺, Mg²⁺ alebo Ca²⁺/Mg²⁺, v rôznych koncentráciách, napr. 1 až 3 mM. Po odstránení nenaviazaných lipozómov je stupeň väzby lipozóm-bezfarebný erytrocyt stanovený pomocou merania množstva fluorescencie spojenej s bezfarebnými erytrocytmi.

Premiešanie lipidov je merané mnohými spôsobmi, ktoré sú dobre známe bežnému odborníkovi v odbore, vrátane napr. rezonančného prenosu energie („RET“), uvedeného ďalej v príklade 4 (a opísaného detailnejšie v Struck D. K., Hoekstra D. & Pagano R. E. (1981) Biochemistry 20, 4093 -

- 4099, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz).

Ako ukazuje obrázok 2, výsledkom inkubácie N-C12-DOPE/DOCP lipozómov (70 molárnych percent/30 molámych percent) s bezfarebnými erytrocytmi v prítomnosti 3 mM Ca²⁺ bolo viazanie lipozóm-erytrocyt aj premiešanie lipidov. Obrázky 4 a 5 taktiež ukazujú, že prítomnosť

NAPE, napr. N-C12-DOPE, v lipozómoch bola pre fúziu lipozómov s bunkami nutná. Výsledky (pozri obrázok 8) ďalej ukazujú, že k viazaniu a premiešaniu a teda fúzii lipozóm-bunka, môže dochádzať v neprítomnosti dvojmocných katiónov, ale v kyslom pH.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1

Kinetika väzby a premiešanie lipidov medzi lipozómami N-C12-DOPE/DOPC (70 : 30) a bezfarebnými erytrocytmi pri 37 °C, merané pomocou NBD/Rh RET. Lipozómy a erytrocyty boli inkubované pri 37 °C počas uvedených časových úsekov v prítomnosti 3 mM Ca²⁺; NBD a Rh fluorescencie boli merané potom, čo boli centrufugáciou odstránené nenaviazané lipozómy. Premiešanie lipidov a viazanie bolo vyjadrené v percentách hodnôt pri použití detergentu, ako je to opísané neskôr. Horná krivka : viazanie lipozómov; spodná krivka : premiešanie lipidov. Os X : : Čas (min.); Os Y % maximálne viazanie lipozómov a premiešanie lipidov.

Obrázok 2

Závislosť viazania lipozómov (A) a premiešanie lipidov (B) medzi N-C12-DOPE/DOPC (70 : 30) a bezfarebnými erytrocytmi na dvojmocných katiónoch, meraná pomocou NBD/Rh RET. NBD/Rh-značené lipozómy a neznačené lipozómy boli inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny v prítomnosti uvedených koncentrácií katiónov. (A) a (B) : plné štvorčeky : Ca²⁺/Mg²⁺; plné trojuholníky : Ca²¹, plné kolieska : Mg²⁴. Os X : Koncentrácia katiónov (mM); Os Y : : (A) : % maximálne viazanie lipozómov, (B) : maximálne premiešania lipidov.

Obrázok 3

Závislosť viazania lipozómov (A) a premiešanie lipidov (B) na N-C12-DOPE, meraná pomocou NBD/Rh RET. Značené lipozómy a neznačené erytrocyty boli inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny v prítomnosti 3 mM Ca²⁺. Os X : : Molámy pomer N-C12-DOPE : DOPC, Os Y : (A) : % maximálne viazanie lipozómov; (B) : % maximálne premiešanie lipidov.

Obrázok 4

Porovnanie lipozómov obsahujúcich DOPG/DOPC-(80 : : 20), mozgový PS/DOPC-(80 : 20) a N-C12-DOPE/DOPC-(80 : 20), čo do viazania lipozómov (A) a premiešania lipidov (B) s bezfarebnými erytrocytmi, merané pomocou NBD/Rh RET. Lipozómy a eratrocyty boli inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny v prítomnosti 3 mM Ca²⁺. Os Y : (A) : % maximálne viazanie lipozómov; (B) : % maximálne premiešanie lipidov.

Obrázok 5

Fluorescenčná mikrofotografia premiešania lipidov medzi N-C12-DOPE/DOPC-(70 : 30) a bezfarebnými erytrocytmi. NBD/Rh značené lipozómy boli inkubované s crytrocytmi počas 30 minút s (A) alebo (B) 1,25 mM Ca²⁺/mg²⁺. Po inkubácii boli erytrocyty premyté s cieľom odstrániť neviazané lipozómi. Celkové zväčšenie je 1000-krát pre každú fotografiu.

Obrázok 6

Fluorescenčná mikrofotografia dopravenia obsahu z N-C12-DOPE/DOPC-(70 : 30) lipozómov do bezfarebných erytrocytov pri 37 °C. TMR-70kD dextran obsahujúce lipo zómy boli inkubované s erytrocytmi počas 30 minút s (A) alebo bez (B+C) 1,25 mM Ca²7Mg²*. Na fotografii D boli erytrocyty inkubované počas 30 minút voľným TMR-70kD dextranom v prítomnosti 1,25 mM Ca²⁺/Mg²⁺. Po inkubácii boli erytrocyty premyté na účely odstránenia neviazaných lipozómov. Celkové zväčšenie je 400-krát pre A, B a D a 1 OOO-krát pre C.

Obrázok 7

Viazanie a premiešanie lipidov medzi lipozómami obsahujúcimi N-C12-DOPE/DOPC-(70 : 30) a bunkami U-937, merané pomocou NBD/Rh RET. Lipozómy a bunky U-937 boli inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny v prítomnosti 3 mM Ca²⁺. Os Y : (A) : % maximálne viazanie lipozómov (ľavé stĺpce); (B) : % maximálne premiešanie lipidov (pravé stĺpce).

Obrázok 8 pH-závisloť viazania a premiešania lipidov medzi lipozómami obsahujúcimi N-C12-DOPE/DOPC-(70 : 30) a bezfarebnými erytrocytmi, meraná pomocou NBD/Rh RET. Lipozómy a erytrocyty boli inkubované pri uvedených hodnotách počas 1 hodiny v neprítomnosti dvojmocných katiónov. Os Y : (A) : % maximálne viazanie lipozómov; (B): % maximálne premiešanie lipidov.

Tento vynález bude lepšie vysvetlený v nasledujúcich príkladoch. Ale odborníci v odbore ľahko pochopia, že tieto príklady iba objasňujú tento vynález, ako je definovaný v po nich nasledujúcich nárokoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál : DOPC, mozgový PS, diolejoylfosfatidyletanolamín (DOPE), diolejoylfosfatidylglycerol (DOPG) bolí zakúpené od Avanti Polar Lipidis (Alebaster, AL). N-(7-Nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)fosfatidyletanolamín (vajce) (NBD-PE), N-(lisamín-rodamín B-sulfonyl)fosfatidyletanolamín (vajce) (Rh-PE), s tetrametylrodamínom spojený 70kD dextrán (TMR-70D) boli zakúpené od Molecular Proces (Eugen, OR). Oktaetylénglykolmonododecyléter (C₁₂E₈) a trietylamín boli zakúpené od Fluka (Roukonkoma, NY). N-[Tris(hydroxymetyl]-2-amínoetansulfónová kyselina (TES) bola zakúpená od Calbiochem (La Jolla CA). Anhydrid kyseliny laurovej bol zakúpený od Aldrich (Milwaukee, WI). Ľudský protrombín, faktor V/Va a faktor Xa boli zakúpené od Enzýme Research Laboratories Inc. (Soutj Bend, IN). Sarkozín-Pro-Arg-p-nitroanilid bol zakúpený od Sigma (St. Louis, MO). Bunky U-937 boli zakúpené od Američan Type Culture Collection (Rockvilie, MD).

Príklad 1

Syntéza a charakteristika NAPE

DOPE, rozpustený v CHC1₃ (500 mg, 0,67 mmol) bol miešaný počas 24 hodín pri izbvej teplote s anhydridom kyseliny laurovej (513 mg, 1,34 mmol) a trietylamínom (726 mg, 7,2 mmol). Chromatografia na tenkej vrstve ukázala, že zmizli všetky východiskové látky. Rozpúšťadlo bolo odparené a zostatok bol vyčistený kolónovou chromatografiou (flash) na silikagéli (230 - 400 mesh, Aldrich, Milwaukee, WI), s použitím gradientov rozpúšťadiel CHClj/MeOH, 100 : 0, 98 : 2, 95 : 5, 90 : 10 a 80 : 20. Žiadaná látka bola zhromaždená a skoncentrovaná vo vákuu. Získaný produkt bol rozpustený v minimálnom množstve CHClj a tento roztok bol pretlačený cez striekačkový filter Acrodisc® CR (0,2 pm, Fischer Scientific, Malvem, PA), s cieľom odstrániť silikagél. Po odstránení chloroformu bol produkt lyofilizovaný z cyklohexánu a bol charakterizovaný pomocou protónovej nukleárnej magnetickej rezonácie (H¹ NMR, Bruker Inštrument Inc., Mannig MA, 300 MHz, CDC1₃) a TLC. Väčšie množstvo N-C12-DOPE bolo zakúpené od Avanti Lipidis.

Príklad 2

Príprava lipozómu

Veľké jednovrstvové vezikuly (LUV), znančené NBD/Rh, boli pripravené tak, ako to bolo opísané skôr (Mayer L. D., Hope M. J. & Cullis F. R. (1986) Biochim. Biophys. Acta 858, 161 - 168, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz). Stručne, zmes 70 molárnych percent N-dodekanoyl-diolejoylfosfatidyletanolamínu a. 30 molárnych percent diolejoylfosfatidylcholínu v chloroforme bola vysušená pomocou dusíka na tenkú vrstvičku, ktorá sa potom nechala počas noci vo vákuu, s cieľom odstrániť rozpúšťadlo Lipidická vrstvička bola potom hydratovaná roztokom NaCl pufrovaným TES (10 mM TES, 0,1 mM EDTA, 154 mM NaCl, pH 7,4); na zaistenie úplnej hydratácie bolo použité ľahké zatrepanie. Po desiatich cykloch zmrazenie/rozmrazenie v tekutom dusíku/vodnom kúpeli pri izbovej teplote bola vzorka desaťkrát pretlačená cez 0,1 nm polykarbonátový membránový filter (Poretics Corp., Livermore, CA). Výsledné lipozómy boli uložené pri 4 °C.

Pre LUV obaľujúci dextrán neboli použité žiadne fluorescenčné značené lipidy. Suchá lipidická vrstvička bola hydratovaná 50 mg/ml TMR-70D v roztoku pufrovanom 10 mM TES. Po zmrazeni/rozmrazení a pretlačení boli LUV oddelené od nezahaleného dextránu pomocou 45 x 1,3 kolóny Biogel-A50 pre gélovú filtráciu (Βίο-Rad Laboratories, Richmond, CA). Lipozómy boli uskladnené pri 4 °C a boli použité do jedného týždňa od prípravy. Koncentrácia na každú prípravu lipozómov bola určená pomocou fosfátového pokusu (Bartlett G. R. (1959) J. Biol. Chem, 234, 466 - 468. Približne 1 pm veľkosť lipozómov bola potvrdená na Nicomp submicron particle sizer (Nicomp Instruments Inc., Goleta, CA) s použitím quasielektrického rozptylu svetla.

Príklad 3

Príprava znova uzavretých a otvorených ľudských bezfarebných erytrocytov

Znova uzavreté bezfarebné erytrocyty sa nazývajú bezfarebné erytrocyty, pokiaľ nie je uvedené inak a boli pripravené tak, ako bolo skôr opísané (Williamson P., Algarin L., Bateman J.; Clague M. J., Schod C., Zech L. & Blumenthal R (1990) Biochemistry 29, 1303 - 1309. Stručne, čerstvá ľudská krv bola niekoľkokrát premytá studeným roztokom NaCl pufrovaným 10 mM TES, na účely odstránenia plazmy a bielych krviniek. 2 ml premytých erytrocytov (50 % hematokrit) sa nechali napučať v studenom hypotonickom roztoku, obsahujúcom 8 ml H₂O a 9,6 ml roztok NaCl pufrovaného 10 mM TES. Tieto erytrocyty boli centrifugované pri 850 xg počas 5 minút. Peleta sa resuspendovala v 40 ml studeného lyzačného pufŕa (10 mM Tris, 0,1 % BSA, 2 mM MgCl₂ a 0,1 mM EGTA) a bola inkubovaná na ľade aspoň 2 minúty. Po pridaní 5,5 ml 10 x pufra na znovuuzavretie (1,22 NaCl, 30 mM KC1, 0,15 M Na₂HPO₄ a 2 mM MgCl₂) bola vzorka inkubovaná pri 37 °C počas 40 minút. Znova uzavreté bezfarebné erytrocyty boli centrifugované pri 1750 xg poča s 10 minút a boli niekoľkokrát premyté, pokiaľ nebol v supematante pozorovaný žiadny hemoglobín. Znovauzavreté bezfarebné erytrocyty boli uskladnené pri 4 °C a boli použité do jedného týždňa.

Otvorené bezfarebné erytrocyty boli pripravené tak, ako už bolo opísané skôr (Seck T. L. & Kant J. A. (1974) Methods Enzymol, 31, 4231 - 4241, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz). Stručne, erytrocyty boli niekoľkokrát premyté roztokom NaCl pufrovaným 10 mM TES, na účely odstránenia plazmy a bielych krviniek. Peleta bola resuspendovaná v studenom 5 mM Na₂HPO₄ a bola centrigugovaná pri 1400 xg počas 15 minút. Výsledná peleta bola premývaná rovnakým pufrom až do prečistenia supematantu. Otvorené bezfarebné erytrocyty boli uskladnené v rovnakom pufre pri 4 °C a boli použité do jedného týždňa.

Príklad 4

Fluorescenčné pokusy s viazaním a premiešavaním lipidov

V každom pokuse bolo zmiešané buď 10 nmol lipozómov a 5 x 10⁸ bezfarebných erytrocytov alebo 10 nmol lipozómov a 1 x 10⁷ buniek U-937. Celkový objem bol doplnený na 100 pl roztokom NaCl pufrovaným 10 mM TES. Pre pokusy pri nízkom pH bol zmiešaný rovnaký objem roztoku NaCl pufrovaného 10 mM citrátom (50 mM citrál, 90 mM a NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 4,7) a zmesou lipozómy-erytrocyty a tak bola získaná konečná hodnota pH 4,9 a konečný objem 103 μΐ. Zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas uvedených časových intervalov s alebo bez dvojmocných katiónov. Zmes bola centrifugovaná počas 5 minút pri 350 xg, v prípade bezfarebných krviniek alebo 300 xg, v prípade buniek U-937. Nenaviazané lipozómy boli odstránené so supematantom, peleta bola resuspendovaná v 100 μΐ roztoku NaCl pufrovanom TES a potom bola prenesená do kyvety obsahujúcej rovnaký pufer pri izbovej teplote. Celkový objem kyvety bol 2 ml. Všetky údaje sú priemery troch rovnakých pokusov, pokiaľ nie je uvedené mak.

Premiešanie lipidov medzi lipozómy značenými NBD/Rd a neznačenými bezfarebnými erytrocytmi alebo bunkami U-937 bolo merané v roztoku NaCl pufrovanom 10 mM TES pomocou rezonančného prenosu energie NBD/Rh (Struck D. H., Hoekstra D. & Pagano, R. E. (1981) Biochemistry 20, 4093 - 4241. Fluorescencia NBD bola meraná pri izbovej teplote na PT1 Aplhascan™ fluorometri (South Brunswick, NJ) v kyvete za stáleho miešania. Exicitačná vlnová dĺžka bola 450 nm s 450 ± 20 nm filtrom (Griot, Irvine, CA) na ďalšie prečistenie svetelných lúčov. Emisná vlnová dĺžka bola 530 nm s a >500 nm hornofrekvenčným filtrom (Schott Glass Technologies, Duryea, PA). Fluorescencia NBD čerstvo pripravených zmesí lipozóm-bunka, t. j. bez inkubácie a točenia, bola taktiež meraná s alebo bez 0,2 % CuE₈, za účelom získania 0 % respektíve 100 % premiešania lipidov. Fluorescencia Rh v prítomnosti 0,2 % C₁₂E₈ bola použitá na meranie viazania lipozómov. Excitačná vlnová dĺžka bola 560 nm s 550 ± 20 nm filtrom (Griot, Irvine, CA) na ďalšie prečistenie svetelných lúčov. Emisná vlnová dĺžka bola 60 nm s a >570 nm homofrekvenčným filtrom (Schott Glass technologies, Duryea, PA). Rh fluorescencia samotných buniek v prítomnosti 0,2 % C₁₂E₈, bola zobraná ako 0 % viazanie. Rh fluorescencia čerstvo pripravených zmesí lipozóm-bunka bola meraná v prítomnosti 0,2 % C|₂E₈, na účely získania 100 % viazania. Rozsahy premiešavania lipidov a viazania boli vypočítané tak, ako je uvedené.

L00x[ (Ν_β·Νο) x Rod / Rsd] Nc“No ž premiešania lipidov ------------------------------| (Nsd-Ncd) x Rod/Rso] + Ncd’No ;

a

100 x Rso^Rco % via2ania = ._-__~_________

Rod “ Rcdz kde N_s : NBD fluorescencia vzorky; N_c : NBD fluorescencia samotných buniek; N_o : NBD fluorescencia čerstvo pripravenej zmesi lipozóm-bunka; N_SD : NBD fluorescencia vzorky v prítomnosti detergentu; N_CD : NBD fluorescencia samotných buniek v prítomnosti detergentu; R_Ou : Rh fluorescencia čerstvej pripravenej zmesi lipozóm-bunka v prítomnosti detergentu; R_SD : Rh fluorescencia vzorky v prítomnosti detergentu; R_{( n} : Rh fluorescencia samotných buniek v prítomnosti detergentu.

Percento viazania v prípade bezfarebných krviniek bolo upravené na zostatkovú nenaviazanú fluorescenciu predpokladaného 10 % supematantu, ktorý zostal v každej pelete. Čiže : % viazania (uprav.) =1,11 (merané percento) - 11/1

Podobné úpravy na premiešanie lipidov ktorýchkoľvek vzoriek s významným viazaním boli zanedbateľné.

Príklad 5

Fluorescenčná mikroskopia nmol N-C 12-DOPE/DOPC (70/30) lipozómov, obaľujúcich TMR-70kD dextrán alebo značených pomocou NBD/Rh a 5 x 10⁸ bezfarebných erytrocytov bolo inkubovaných pri 37 °C počas 30 minút s alebo bez 1,25 mM Ca²⁺/Mg²⁺. Na konci inkubácie bol ku každej vzorke pridaný ľadový roztok NaCl pufrovaný 10 mM TES s alebo bez Ca²⁺/Mg²⁺ do konečného objemu 1 ml. Vzorka bola centrifugovaná počas 5 minút pri 3500 xg a výsledná peleta bola raz premytá rovnakým pufŕom, s cieľom odstrániť nenaviazané lipozómy. Peleta bola potom resuspendovaná v rovnakom pufri a bola pozorovaná na fluorescenčnom mikroskope Olympus BH-2 (Olympus Corp. Lake Succes, NY), ktorý bol vybavený 545 nm excitačným filtrom (Olympus Corp) a a >580 dichroickým zrkadlom (Olympus Corp).

Príklad 6

Viazanie a premiešavanie s bezfarebnými erytrocytmi závislé od pH

Bezfarebné erytrocyty, pripravené podľa opísaného postupu, boli inkubovaná pri 30 °C počas 1 hodiny buď v médiu s pH 7,4, alebo pH 4,9 v neprítomnosti dvojmocných katiónov, s N-C 12-DOPE/DOPC (70/30) lipozómami, pripravenými podľa opísaných postupov. Rozsahy viazania lipozómov a premiešavania lipidov boli potom určené podľa uvedených postupov. Výsledky týchto pokusov sú uvedené na obrázku 8.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostriedok na dopravu bioaktívnych látok do buniek živočíchov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje a) farmaceutický prijateľný nosič; b) lipozóm s lipidickou zložkou, ktorá obsahuje i) N-acylfosfatidyletanolamín všeobecného vzorca

CHj-O-R¹

I

CH-O-R²

I

CH -O - P(O)₂ - O - CH₂ - CH₂NH - R³; a ii) prídavný lipid, kde každý z R¹, R² a R³ je nezávisle skupinou všeobecného vzorca

C(OXCH₂).₁(CH=CH),₂(CH₂UCH-CH)_rt<CH₂MCH-CH)_R4(CH₁)„(CH=CH)_rt(CHi)„,CH₃ nl je nula alebo celé číslo 1 až 22; n3 je nula alebo celé číslo 1 až 19; n5 je nula alebo celé číslo 1 až 16; n7 je nula alebo celé číslo 1 až 13; n9 jc nula alebo celé číslo 1 až 10;

pre každé R¹ a R² nezávisle je súčet nl+2n2+n3+2n4+n5+ +2n6+n7+2n8+n9 celé číslo 12 až 22;

pre R³ je súčet nl+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 celé číslo 2 až 22;

každý z n2, n4, n6 a n8 sa nezávisle rovná 0 alebo 1; aspoň jeden z n2, n4, n6 a n8 sa rovná 1 a lipidická zložka obsahuje destabilizácie účinné množstvo N-acylfosfatidyietanolamínu, pričom lipozóm je mnohovrstvový alebo veľký jednovrstvový lipozóm.
2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že v lipozóme pre jeden alebo obidva z R¹ a R² sa aspoň jeden z n2, n4, n6 alebo n8 rovná 1.
3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v lipozóme pre obidva z R¹ a R² sa aspoň jeden z n2, n4, n6 alebo n8 rovná 1.
4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že obidva R¹ a R² sú -C(O)(CH₂)₇(CH=CH)(CH₂)₇CH₃.
5. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že R³ je -C(O)(CH₂)4CH₃, -C(O)(CH₂)_l0CH₃ alebo -C(O)(CH₂)₁₄CH₃.
6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, žeR³jc -C(O)(CH₂)₁₀CH₃.
7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že N-acylfosfatidyletanolamínom je

CH, - O - (O)(CH,h(CH-CHXCH,XCH j

CH - O - C(OXCH₂)XCH=CH)(CH2XCH3

CH, - O - F(O)₂ - O - CH₂CH₂NH-C(O)(CH;)i,CHj.
8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že N-acylfosfatidyletanolamín predstavuje aspoň 10 molárnych percent lipidickej zložky.
9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že N-acylfosfatidylctanolamin predstavuje 10 až 90 molárnych percent lipidickej zložky.
10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že N-acylfosfatidyletanolamin predstavuje 20 až 80 molárnych percent lipidickej zložky.
11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že N-acylfosfatidyletanolamín predstavuje asi 70 molárnych percent lipidickej zložky.
12. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prídavným lipidom je fosfolipid.
13. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že fosfolipidom je fosfatidylcholín.
14. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že fosfatidylcholinom je diolejoylfosfatidylcholín.
15. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že lipidická zložka zahŕňa N-dodekanoylfosfatidyletanolamín a diolejoylfosfatidylcholin.
16. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že N-dodekanoylfosfatidyletanolamín predstavuje asi 70 molárnych percent lipidickej zložky a diolejoylfosfatidylcholín predstavuje asi 30 molárnych percent lipidickej zložky.
17. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že prídavným lipidom je fosfatidyletanolamín.
18. Farmaceutický prostriedok počla nároku 17, vyznačujúci sa tým, že fosfatidyletanolamín je vybraný zo skupiny obsahujúcej transesterifikovaný fosfatidyletanolamín, dipalmitoylfosfatidyletanolamín, palmitoylolejoylfosfatidyletanolamín a diolejoylfosfatidyletanolamín.
19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že fosfatidyletanolamín je spojený s látkou vybranou zo skupiny obsahujúcej dikarboxylové kyseliny, polyetylénglykoly, polyalkylétery a gangliozidy.
20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje navádzaciu látku vybranú zo skupiny obsahujúcej protilátky, ligandy bunkových receptorov a lektíny
21. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje bioaktívnu látku vybranú zo skupiny obsahujúcej antivírusové látky, antibakteriálne látky, antifugálne látky, antineoplastické látky, protizápalové látky, rádioaktívne látky, látky neprepúšťajúce žiarenie, fluorescenčné látky, mydriatické látky, bronchodilatátory, lokálne anestetiká, sekvencie nukleových kyselín a bioaktívne lipidy.