SK282860B6

SK282860B6 - Extrakt s inhibičnou aktivitou na trombín, spôsob jeho prípravy, polypeptid z tohto extraktu a spôsob jeho prípravy

Info

Publication number: SK282860B6
Application number: SK8-95A
Authority: SK
Inventors: J�Rgen Hemberger; Roy Sawyer; Sabine Wolf; Johannes Doot
Original assignee: Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-03
Publication date: 2002-12-03
Also published as: RU95105983A; NO950075L; AU682368B2; HU9500038D0; EP0652900B1; NO950075D0; CZ287794B6; PL179215B1; SK895A3; ZA943171B; PL307088A1; CA2139652C; DE69429062D1; NO318017B1; JP3537437B2; KR950702579A; GB9309509D0; WO1994026777A1; CA2139652A1; ES2167364T3

Abstract

Purifikovaný polypeptid s inhibičnou aktivitou na trombín, izolovaný z tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida, zvolený z polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 9000 +/-1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu alebo polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 14 000 +/-1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys. Spôsob výroby tohto polypeptidu, pri ktorom sa homogenizuje tkanivo alebo sekréty pijavíc radu Rhynchobdellida, z homogenátu sa vyrobí frakcia obsahujúca jeho vodorozpustné zložky a táto frakcia sa purifikuje trombín-špecifickou afinitnou chromatografiou, po ktorej nasleduje aspoň jeden ďalší stupeň gélovej filtrácie a aspoň jeden ďalší stupeň HPLC s rezervnými fázami. Extrakt obsahujúci vodorozpustné zložky homogenizovaného tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida ako medziprodukt na výrobu tohto polypeptidu. Farmaceutický prípravok obsahujúci tento polypeptid a farmaceuticky vhodný nosič. Použitie tohto polypeptidu na výrobu liečiva na liečenie chorôb spojených s trombózou alebo na inhibíciu agregácie krvných doštičiek v mimotelovej krvi.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka purifíkovaného polypeptidu, spôsobu jeho výroby a použitia, extraktu, ako medziproduktu na výrobu tohto peptidu a farmaceutického prípravku na báze tohto peptidu. Vynález sa predovšetkým týka inhibítorov trombínu získaných z tkaniva a sekrétov pijavíc.

Doterajší stav techniky

Trombín katalyzujc tvorbu fibrínových zrazenín, a preto indukuje koaguláciu krvi. Okrem toho má trombín niekoľko ďalších bioregulačných úloh, ako je priama aktivácia agregácie doštičiek a aktivácia inflamatomej odpovede prostredníctvom stimulácie syntézy aktivačného faktora doštičiek (PAF) bunkami endotelu. To znamená, že trombín má ústrednú úlohu pri poruchách spojených s trombózou, ako sú napríklad kardiovaskulárne choroby.

Existuje preto veľký záujem na stálom hľadaní nových a zlepšených inhibítorov trombínu a antikoagulačných činidiel.

Ako príklady dobre známych inhibítorov trombínu je možné uviesť heparín a hirudín.

Heparín urýchľuje antikoagulačnú aktivitu antitrombínu III. Používa sa vo veľkom rozsahu na liečbu chorôb ako je cievny tromboembolizmus, pri ktorých je účinnosť trombínu zodpovedná za vývoj alebo narastanie trombov. Nie je účinný pri liečbe prípadov, pri ktorých je znížená hladina antitrombínu III, ako napríklad prípadov, keď je trombóza sprevádzaná nefrózou alebo disseminovaným intravaskulámym koagulačným syndrómom (DIC). Okrem toho má heparín mnoho nežiaducich vedľajších účinkov, ako je hemorrhagia a trombocytopenia.

Hirudín je dobre známy a dobre charakterizovaný polypeptid, o ktorom je známe, že je špecifický pre trombín. Tento polypeptid je možné izolovať z extraktov slinnej žľazy a iných tkanív pijavíc druhu Hirudo medicinalis. Hirudín a jeho deriváty je tiež možné získať rekombinantnými technikami. Tento polypeptid má pomerne nízku molekulovú hmotnosť 7000 D a skladá sa z 65 aminokyselín. Sekvenciu aminokyselín hirudínu prvýkrát stanovili Dodt et al. (FEBS Letters, 165, 180 až 184, 1984). V pijavici lekárskej Hirudo medicinalis boli nalezené tri hlavné varianty hirudínu (HV1, HV2 a HV3), ktoré sa líšia len celkom asi v 10 % polôh aminokyselín. Najnápadnejší rozdiel je v prvých dvoch polohách N-terminálneho konca molekuly: vo variante hirudínu HV1 sú tu obsiahnuté zvyšky Val-Val a vo variante hirudínu HV2 sú tu zvyšky Ile-Thr. Tieto rozdiely nie sú príliš veľké a neovplyvňujú funkciu ani špecifičnosť interakcie hirudínu a trombínu. Hirudín je silný prírodný inhibítor koagulácie. Ukázal sa ako účinný pri prevencii cievnej trombózy, oklúzii umelých ciev a trombínom indukovanej disseminovanej intravaskulámej koagulácie, ale spôsobuje zvýšenú krvácavosť.

Fylogenetický je pijavica lekárska Hirudo medicinalis členom podčeľade Hirudiniae, čeľade pijavíc Hirudinidae (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour, Oxford University Press, zv. 2, str. 688, 1986). Vývojovo pokročilejším druhom pijavíc je druh Hirudinaria manillensis, ktorý· náleží do podčeľade Hirudinariinae rovnakej čeľade Hirudinidae. Neočakávane bola nedávno zistená príbuzná, ale úplne odlišná izoforma hirudínu v pijavici Hirudinaria manillensis (pozri patentová prihláška PCT WO 90/05143). Táto izoforma sa líši takmer v 40 % polôh aminokyselín v porovnaní s hirudínom z Hirudo medicinalis. Dva uvedené druhy, totiž Hirudo medicinalis a Hirudinaria manillensis patria do radu pijavíc Arhynchobdellida. Okrem radu Arhynchobdellida existuje ešte jeden veľký rad pijavíc, t. j. Rhynchobdellida (R. T. Sawyer: „Leech Biology and Behaviour“, Oxford University Press, zv. 2, str. 651, 1986). Najlepšie preštudovaným členom radu Rhynchobdellida, pokiaľ sa týka slinných proteinov, je tzn. amazonská pijavica (Haementeria ghilianii). Bolo ukázané, že tento druh s prekvapením neobsahuje žiadny antitrombín (Budzynski et al.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168, 259 až 265, 1981). Miesto toho obsahuje Haementeria ghilianii fibrinogenolytický enzým hementín (US patent č. 4 390 630), ako i inhibítor krvného koagulačného faktora Xa (C. Condra et al.: Thromb. Haemost., 61, 437 až 441, 1986).

Na základe tohto objavu a ďalších prác sa všeobecne akceptuje, že aktivita antitrombínového typu je obmedzená na pijavice radu Arhynchobdellida, pričom sa predpokladá, že táto aktivita pri rade Rhynchobdellida chýba.

Napriek uvedenému vývoju pokračuje naďalej potreba vyvinúť ďalšie antikoagulanty a antitrombíny okrem heparínu a hirudínu, ktoré by mali zvýšenú aktivitu pri inhibícii tvorby zrazenín, trombínom indukovanej aktivácie doštičiek alebo aktivácie buniek endotelu. Požiadavkou tiež je, aby bolo možné tieto látky vyrábať v priemyselne zaujímavých množstvách.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je purifikovaný polypeptid s inhibičnou aktivitou na trombín, izolovaný z tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida zvolený z polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 9000 ±1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, alebo polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 14 000 ±1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín

Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Ďalej je predmetom vynálezu takisto spôsob výroby purifikovaného definovaného polypeptidu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa homogenizuje tkanivo alebo sekréty pijavíc radu Rhynchobdellida, z homogenátu sa vyrobí frakcia obsahujúca jeho vodorozpustné zložky a táto frakcia sa purifikuje trombín-špecifickou afinitnou chromatografiou, po ktorej nasleduje aspoň jeden ďalší stupeň gélovej filtrácie a aspoň jeden ďalší stupeň HPLC s reverznými fázami. Pri spôsobe podľa vynálezu sa prednostne postupuje tak, že sa predná tretina zmrazených a lyofilizovaných pijavíc homogenizuje so zmesou vody a acetónu.

Predmetom vynálezu je rovnako extrakt, ako medziprodukt na výrobu definovaného polypeptidu, ktorého podstata spočíva v tom, že obsahuje vodorozpustné zložky homogenizovaného tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida.

Ďalej je predmetom vynálezu takisto farmaceutický prípravok, ktorého podstata spočíva v tom, žc obsahuje definovaný polypeptid a farmaceutický vhodný nosič.

Konečne je predmetom vynálezu tiež použitie definovaného polypeptidu na výrobu liečiva na liečenie chorôb spojených s trombózou alebo na inhibíciu agregácie krvných doštičiek v mimotclovej krvi.

Vynález sa opiera o prekvapujúce zistenie, že je možné zlúčeniny majúce aktivitu antitrombínu izolovať z tkanív a sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida, prednostne čeľade Theromyzon a najvýhodnejšie druhu Theromyzon tessula tum, ktoré sú niekedy označované názvom „vtáčie pijavice“, pretože tento druh má výnimočne špecializovaný spôsob života v tom, že saje krv z nosových dierok vodných vtákov.

Zistilo sa, že aktivitu inhibujúcu trombín je možné namerať v extraktoch obsahujúcich vodorozpustné zložky týchto pijavíc. Z týchto extraktov je možné izolovať aktívny inhibítor trombínu.

Inhibítor trombínu prednostne zahŕňa aktívne fragmenty polypeptidu s relatívnymi molekulovými hmotnosťami asi 9000 a asi 14 000. Tieto aktívne polypeptidy je možné pripadne považovať za degradačné produkty rodičovského (prekurzorového) inhibítoru trombínu.

Inhibítor trombínu podľa tohto vynálezu je nový, pretože sa líši od známych antitrombínov, predovšetkým hirudinu, svojou molekulovou hmotnosťou, izoelektrickým bodom a N-terminálnou sekvenciou aminokyselín, ktorá má obmedzenú homológiu (nižšiu ako 40 %) s inými inhibítormi trombínu.

Označenie „±1000“, ktoré sa používa v súvislosti s relatívnou molekulovou hmotnosťou polypeptidov charakterizuje maximálnu odchýlku molekulovej hmotnosti. Prednostne je táto maximálna odchýlka ±500. Do rozsahu tohto vynálezu patria tiež hore a ďalej uvedené sekvencie, v ktorých sú niektoré aminokyseliny vymenené, za predpokladu, že sú zachované základné biologické vlastnosti. Do rozsahu vynálezu teda patria i sekvencie zahŕňajúce určité variácie, fragmenty, podjednotky, prirodzené mutácie a náhodne vytvorené umelé mutanty. Takisto sem patria hybridné proteíny, ako sú fiízované proteíny získané z uvedených peptidov.

Inhibítor trombínu podľa vynálezu má antikoagulačné a antitrombotické vlastnosti. Môže sa preto používať pri všetkých klinických stavoch, pri ktorých je ovplyvnený koagulačný systém. Ide o liečbu trombózy, mŕtvice, infarktu myokardu, trombózy hlbokých ciev, obštrukcie artérií v končatinách, pulmonámej trombózy, trombózy retinálnej artérie alebo akýchkoľvek iných trombotických javov. Ďalej je možné inhibítor alebo inhibítory trombínu používať pri pacientoch s umelými arteriovenóznymi náhradami alebo pri pacientoch, ktorí sa podrobili koronárnej operácii by - pass. Polypeptidy podľa vynálezu je možné používať ako antikoagulanty pri profylaxii trombózy alebo arteriálnych reoklúzií, na konzerváciu krvi alebo krvných produktov a na mimotelový obeh krvi alebo plazmy.

Inhibítor trombínu (polypeptidy) podľa tohto vynálezu má biologickú aktivitu, ktorá je v podstate porovnateľná s hirudínom. Ich väzbová afinita k trombínu (inhibičná konštanta) je dokonca trocha vyššia ako v prípade hirudínu, ktorý je až dosiaľ najsilnejší známy inhibítor trombínu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Podrobnosti vzťahujúce sa na obrázky sú uvedené v príkladoch 1 až 10.

Na obr. 1 je znázornený elučný profil antitrombínu z afinitného stĺpca (príklad 3).

Na obr. 2 je uvedená gélová filtračná analýza antitrombínu získaného z T. tessulatum na náplni Biogel P4 (príklad

4) .

Obr. 3 uvádza analytickú HPLC s reverznými fázami (RP-HPLC) pozitívnych frakcií z afinitného stupňa (príklad

5) ·

Obr. 4 uvádza preparatívnu RP-HPLC pozitívnych frakcií z afinitného stupňa (príklad 5).

Na obr. 5 je uvedené porovnanie hirudínu a inhibítora podľa vynálezu pomocou HPLC (príklad 6).

Na obr. 6 je uvedená rechromatografia aktívnej pikovej frakcie 2 z RP-HPLC (príklad 7).

Na obr. 7 je uvedené hmotnostné spektrum aktívnej pikovej frakcie 2 z RP-HPLC (príklad 7).

Obr. 8 ukazuje IEF stopu aktívnej pikovej frakcie 2 z RP-HPLC (príklad 7).

Na obr. 9 je znázornená rechromatografia aktívnej pikovej frakcie 4 z RP-HPLC (príklad 9).

Na obr. 10 je uvedené hmotnostné spektrum aktívnej pikovej frakcie 4 z RP-HPLC (príklad 9).

Nasleduje podrobnejší opis tohto vynálezu.

Inhibítor alebo inhibítory trombínu podľa vynálezu je možné izolovať a purifikovať z tkanív alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida, prednostne čeľade Theromyzon. Inhibítory trombínu pripraviteľné z pijavíc čeľade Theromyzon majú podobnú aktivitu a len malé rozdiely. Ako príklady vhodných druhov z čeľade Theromyzon je možné uviesť T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. mollisimum, T. pallens, T. propinquum, T. rude, T. sexoculatum a najmä T. tessulatum.

Ako zdroje sa podľa vynálezu prednostne používajú slinné žľazy pijavíc. Pretože je však preparácia slinných žliaz zložitá a nie je možné pri nej zabrániť značnej strate materiálu, je tiež možné ako zdroje používať hlavy alebo predné tretiny pijavíc.

Prvý stupeň použitého postupu obyčajne zahŕňa prednostne dôkladné zmrazenie a/alebo lyofilizáciu tkaniva pijavíc pred homogenizáciou, ktorá sa obyčajne vykonáva v acetóne alebo zmesi acetónu a vody. Môžu sa však používať i iné poláme organické rozpúšťadlá na odstránenie zložiek, ktoré nie sú rozpustné vo vode. Extrakt získaný v stupni 1 sa ďalej pred uskutočnením afinitnej chromatografie prednostne centriíúguje, aby sa odstránili nežiaduce úlomky buniek. Afinitná chromatografia sa prednostne uskutočňuje pri použití stĺpca s miestami s trombínovou aktivitou. Pod označením „miesta s trombínovou aktivitou“, ako sa používa v tomto opise, sa rozumejú trombínové miesta na stĺpci, ku ktorým sa môže pripojiť inhibítor trombínu. Ako príklady miest s trombínovou aktivitou je možné uviesť imobilizovaný natívny alebo dezaktivovaný trombín vrátane peptidov odvodených od trombínu, peptidomimetík alebo iných trombínových derivátov. Trombín alebo deriváty trombínu sa podľa vynálezu imobilizujú na aktívnej gélovej matrice prednostne reakciou s azlaktónovou skupinou tejto gélovej matrici, čo sa vykonáva známymi metódami. Inak sa afinitná chromatografia uskutočňuje štandardnými technikami.

Spolu s afmitnou chromatografiou sa prednostne používa gélová filtrácia. Gélová matrica, ktoré sa podľa vynálezu používa, má vylučovaciu medzu molekulovej hmotnosti približne 5 kD a umožňuje frakcionáciu približne v rozmedzí od 1 do 5 kD.

Izolované antitrombínové extrakty sa ďalej prednostne purifikujú HPLC s reverznými fázami. Opísané polypeptidové fragmenty je možné získať purifikáciou izolovaných extraktov pomocou RP-HPLC. Ako príklady vhodných materiálov s reverznými fázami je možné uviesť silikagél modifikovaný alifatickými substituentmi C2 až C18. Polypeptidy podľa vynálezu je však možné purifikovať i inými dobre známymi chromatografickými postupmi. Podrobnosti purifikácie pomocou HPLC sú uvedené v príkladoch.

Účinnosť (aktivitu) inhibítorov trombínu v extraktoch a v špecifických frakciách získaných v purifikačných stupňoch je možné merať in vitro na základe predĺženého času vzniku zrazenín (F. Markwardt: Met. Enz., 19, 924 až 932,

SK 282860 Β6

1970) alebo na základe zníženia štepenia trombín-špecifického chromogénneho substrátu, ako je tosyl-glycyl-prolyl-arginín-4-nitroanilidacetát (Chromozym TH, Boehringer Mannheim, SRN), ako je to opísané v publikácii H. U. Bermeyer: Met. Enz. Anál., 3. vydanie, zv. 5, 365 až 394, 1988.

Ako už bolo uvedené, polypeptidy podľa tohto vynálezu sú vhodné ako farmaceutický účinné zlúčeniny vo farmaceutických prípravkoch a kombináciách.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu môžu prípadne obsahovať prídavné prísady, ako sú antikoagulanty, ako jc hirudín alebo heparín, alebo trombolytické činidlá, ako je aktivátor plazminogénu alebo hementín.

Nové polypeptidy a inhibítory trombínu podľa tohto vynálezu môžu vytvárať farmaceutický vhodné soli s akýmikoľvek netoxickými organickými alebo anorganickými kyselinami. Ako vhodné anorganické kyseliny je napríklad možné uviesť kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovú, kyselinu sírovú alebo kyselinu fosforečnú a soli kovov s kyselinami, ako je monohydrogenortofosforečnan sodný a hydrogensíran draselný. Ako príklady organických kyselín je možné uviesť monokarboxylové, dikarboxylové a trikarboxylové kyseliny, ako je kyselina octová, glykolová, mliečna, hroznová, malónová, jantárová, glutárová, fumarová, jablčná, vínna, citrónová, askorbová, maleínová, hydroxymaleínová, benzoová, hydroxybenzoová, fenyloctová, škoricová, salicylová, a sulfónové kyseliny, ako je kyselina metánsulfónová. Ako soli na karboxyterminálnom zvyšku aminokyseliny je možné uviesť netoxické soli karboxylovej kyseliny vytvorené s akoukoľvek vhodnou anorganickou alebo organickou bázou. Tieto soli zahŕňajú napríklad soli alkalických kovov, ako sú soli sodné a draselné, soli kovov alkalických zemín, ako soli vápenaté a horečnaté, soli ľahkých kovov zo skupiny Illa, ako sú soli hlinité a soli s organickými primárnymi, sekundárnymi alebo terciámymi amínmi, ako sú soli trialkylamínov vrátane trietylamínu, prokaínu, dibenzylamínu, 1-eténamínu, N,N'-dibenzyletyléndiamínu, dihydroabietylamínu a N-alkylpiperidínu.

Pod označením „farmaceutický vhodný nosič“ sa rozumie inertné netoxické pevné alebo kvapalné plnivo, riedidlo alebo zapuzdrovací materiál, ktoré nevykazuje nepriaznivú reakciu s účinnou zlúčeninou alebo s pacientom. Vhodné, prednostne kvapalné, nosiče sú v tomto odbore dobre známe. Ide napríklad o sterilnú vodu, roztok chloridu sodného, vodný roztok dextrózy, roztoky cukru, etanol, glykoly a oleje vrátane olejov ropného, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, ako je napríklad arašidový olej, sójový a minerálny olej.

Prípravky podľa vynálezu sa môžu podávať vo forme jednotkových dávok obsahujúcich obvyklé netoxické farmaceutický vhodné nosiče, riedidlá, adjuvanty a vehikulá, ktoré sú typické na parenterálne podávanie.

Pod označením „parenterálne podávanie“ sa tu rozumie podávanie vo forme subkutánnych, intravenóznych, intraartikulámych a intratrachealných injekcií a infúzií. Tiež sa môžu použiť iné druhy podávania, ako je orálne podávanie a topické podávanie. Parenterálne prípravky a kombinácie sa najvýhodnejšie podávajú intravenózne buď vo forme bolu, alebo vo forme konštantnej fúzie, čo sa vykonáva známymi technikami. Tablety a kapsuly na orálne podávanie obsahujú konvenčné excipienty, ako sú spojivá, plnivá, riedidlá, tabletovacie činidlá, mazadlá, napúčavé činidlá a namáčadlá. Tablety je možné známymi spôsobmi poťahovať. Orálne kvapalné prípravky môžu mať podobu vodných alebo olejových suspenzií, roztokov, emulzií, sirupov alebo elixírov alebo podobu suchého produktu určeného na rekonštitúciu pomocou vody alebo iného vhodného vehikulá pred použitím. Také kvapalné prípravky môžu obsahovať bežné prísady, ako sú suspenzné činidlá, emulgátory, nevodné vehikulá a konzervačné činidlá. Ako typické prípravky je možné uviesť vodné alebo olejové suspenzie, roztoky, emulzie, želé alebo prednostne emulzné masti.

Jednotkové dávky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať požadované denné množstvá proteínu podľa vynálezu alebo jeho zlomok. V poslednom prípade je výsledná denná dávka zostavená z niekoľkých poddávok. Optimálna terapeuticky vhodná dávka alebo dávkovací režim pre určitého pacienta (cicavca vrátane ľudí) závisí od rôznych faktorov, ako je účinnosť konkrétne použitej účinnej prísady, vek, telesná hmotnosť, všeobecný zdravotný stav, pohlavie, strava, čas a cesta podávania, rýchlosť vylučovania, účel liečby (t. j. terapia alebo profylaxia) a druh liečenej trombotickej choroby, proti doštičkovej alebo antikoagulačnej aktivity.

Pri použití prípravkov alebo kombinácií podľa vynálezu, ktoré sú užitočné ako antikoagulanty na liečbu pacientov in vivo, je preto považovaná farmaceutický účinná denná dávka peptidov podľa vynálezu v rozmedzí od asi 0,01 do asi 100 mg/kg telesnej hmotnosti, prednostne v rozmedzí od asi 0,1 do asi 10 mg/kg telesnej hmotnosti. Podľa druhu aplikačnej formy môže jednotková dávka obsahovať 0,5 až 10 mg inhibítoru trombínu. Vhodné farmaceutický účinné množstvo peptidov podľa vynálezu na dosiahnutie antikoagulačného účinku v mimotelovej krvi leží v rozmedzí od asi 0,2 do asi 150 mg/liter, prednostne od asi 1 do asi 20 mg/liter mimotelovej krvi.

Do rozsahu vynálezu patrí tiež aplikácia imobilizovaného definovaného polypeptidu na implantovateľné alebo extrakorporálne (mimotelové) lekárske zariadenie, ktoré prichádza do styku s telesnými tekutinami, s cieľom dosiahnuť tromborezistencie povrchu tohto zariadenia. Polypeptid podľa vynálezu sa imobilizuje na takom lekárskom zariadení, aby bol jeho povrch biokompatibilný a tromborezistentný. Také implantovateľné alebo extrakorporálne zariadenia majú často namáčateľné povrchy, ktoré obyčajne indukujú agregáciu krvných doštičiek, čo je ich nevýhodou, pokiaľ majú byť použité v styku s krvou alebo inými telovými tekutinami. Ako príklady takýchto zariadení, ktoré bývajú obyčajne zhotovené z plastov a syntetických vláken, je možné uviesť protézy, umelé orgány, stehy, umelé vaskulárne segmenty, katetry, dialyzátory a skúmavky alebo nádoby na krv.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch vykonávania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter, ale rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Demonštrácia prítomnosti antitrombínu v T. tessulatum hlavičiek pijavice Theromyzon tessulatum sa homogenizuje v izotonickom roztoku chloridu sodného. Homogenát sa krátko odstredí, aby sa odstránila časticová látka a supernatant sa odloží na nasledujúce antitrombínové stanovenie a hematologické skúšky.

Na účely odhadu aktivity antitrombínu sa 20 μΐ už uvedeného extraktu zmieša s 10 μΐ trombínu (1 U). K vzniknutej zmesi sa pridá 100 μΐ roztoku fibrinogénu s koncentráciou 0,5 mg/ml, zmes sa premieša a jednu minútu inkubuje pri 37 °C.

Ďalšie podrobnosti tohto stanovenia sú opísané v práci R. T. Sawyer et al., Comp. Haematol. Int., 1, 35 až 41, 1991. V nasledujúcej tabuľke sú súhrnne uvedené hodnoty inhibície zrážacích parametrov in vitro pri použití surových extraktov z Theromyzon tessulatum:

Tabuľka 1

Demonštrácia prítomnosti antitrombínovej aktivity v T. tessulatum

	Normálna kontrola (s)	Surový extrakt (s)
Pretrombínový Čas (vonkajšia)	15	42
Aktivovaná PTT (vnútorná)	40	220
Trombinový čas (antitrombín)	45	> 600
Reptilázový čas	20	20

Z uvedených údajov je zrejmé, že hlavová časť pijavice Theromyzon tessulatum obsahuje vodorozpustný faktor alebo faktory, ktoré podstatne predlžujú trombinový zrážací čas.

Príklad 2

Chromogénna skúška inhibície trombínu a faktora Xa

a) Inhibicia trombínu μΐ roztoku trombínu (5 NIH-U trombinu/ml 250 mM fosfátového tlmivého roztoku s obsahom 0,05 % PEG 6000 s pH 6,5) sa preinkubuje s 880 μΐ trombínového skúškového tlmivého roztoku (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCI, 0,05 % PEG, pH 8,3) v kyvete fotometra 5 minút pri teplote miestnosti. Reakcia sa začne prídavkom 100 μΐ substrátového roztoku (4 mg Chromozymu TH, výrobok firmy Boehringer Mannheim, SRN, rozpusteného v 5 ml vody) a pri 25 °C sa odčítajú hodnoty absorpcie pri 400 nm v priebehu 5 minút s intervalom 30 sekúnd.

Na meranie inhibície aktivity sa 10 až 200 μΐ vzorka hirudínu, ako štandard, zmieša s 20 μΐ roztoku trombínu a zmes sa skúškovým tlmivým roztokom doplní na celkový objem 900 μΐ. Vzniknutá zmes sa 5 minút preinkubuje pri teplote miestnosti a reakcia sa začne prídavkom 100 μΐ substrátového roztoku.

b) Inhibicia aktivity faktora Xa μΐ roztoku faktora Xa (roztok s koncentráciou 10 U/0,5 ml zriedený vodou do celkového objemu 2,0 ml) sa preinkubuje s 880 μΐ skúškového tlmivého roztoku pre faktor Xa (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCI, 0,05 % PEG, pH 8,3) v kyvete fotometra 5 minút pri teplote miestnosti. Reakcia sa začne prídavkom 100 μΐ substrátového roztoku (3,5 mg Chromozymu X, výrobok firmy Boehringer Mannheim, SRN, rozpusteného v 5 ml vody) a pri 25 °C sa odčítajú hodnoty absorpcie pri 405 nm v priebehu 5 minút s intervalom 30 sekúnd.

Na meranie inhibície aktivity sa 10 až 200 μΐ vzorka zmieša s 20 μΐ roztoku faktora Xa a zmes sa skúškovým tlmivým roztokom doplní na celkový objem 900 μΐ. Vzniknutá zmes sa 5 minút preinkubuje pri teplote miestnosti a reakcia sa začne prídavkom 100 μΐ substrátového roztoku.

Príklad 3

Purifikácia inhibítora trombínu z Theromyzon tessulatum Stupeň 1

Predná tretina pijavice Theromyzon tessulatum kŕmenej počas 1000 sekúnd sa ihneď zmrazí pri teplote -70 °C a lyofilizuje. K vzniknutému materiálu sa pridá 35 ml 40 % acetónu a suspenzia sa homogenizuje v zariadení Ultratorax tri razy, vždy 10 sekúnd. Potom sa suspenzia 2 minutý spracováva ultrazvukom, potom nasleduje prídavný homogenizačný stupeň (30 sekúnd). Homogenát sa 15 minút centrifuguje pri frekvencii otáčania 6000 min.'¹ a výsledný supematant (SI) sa odloží. K palete 1 sa pridá ďalších 35 ml 40 % acetónu a vykoná sa druhá homogenizácia (1 x 10 sekúnd; spracovanie ultrazvukom - 2 minúty; a 1 x 30 sekúnd). Homogenát sa opäť 15 minút centrifuguje pri frekvencii otáčania 6000 min.^-'. Získaný supematant 2 sa pridá k odloženému supematantu lak vzniknutej zmesi sa pridá 80 % objemových acetónu.

Hodnota pH sa kyselinou octovou nastaví na 4,0 a vzniknutá suspenzia sa 20 minút centrifuguje pri frekvencii otáčania 6000 min. Paleta 3 sa zahodí. Supematant 3 sa štyrikrát skoncentruje v rotačnom odparovači (Speed Vac)

Extrakt zbavený acetónu je pozitívny pri skúške antitrombínovej aktivity pri použití zrážacieho stanovenia podľa príkladu 1 a chromogénneho stanovenia podľa príkladu 2.

Stupeň 2

Extrakt zbavený acetónu sa nanesie na stĺpec PD-10 (Pharmacia) s cieľom výmeny tlmivého roztoku. Stĺpec sa ekvilibruje afinitným tlmivým roztokom (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCI, pH 7,4) a na stĺpec sa nanesie 2,5 ml extraktu zo stupňa 1. Eluát sa skúša na antitrombínovú aktivitu. Trombinový afinitný stĺpec sa pripraví nasledujúcim spôsobom:

400 mg suchej matrici Azlacton Tentacle Fractogel (E. Mcrck, Darmstadt, SRN) sa suspenduje v 7 ml kondenzačného tlmivého roztoku (50 mM fosfát, 150 mM NaCI, pH 7,5) a suspenzia sa nechá 2 hodiny stáť pri teplote miestnosti. Potom sa suspendovaná látka 2 x premyje centrifugáciou a resuspendovaním v kondenzačnom tlmivom roztoku. 5000 NIH-U hovädzieho trombínu (Sigma) sa rozpusti v 1 ml vody a hodnota pH roztoku sa nastaví na 7,5. Tento trombinový roztok sa ekvilibruje s kondenzačným tlmivým roztokom pomocou gélovej filtrácie na PD-10. K ekvilibrovanému trombínovému roztoku sa pridá síran sodný až do výslednej koncentrácie IM. Trombinový proteín sa ihneď nato pipetou pridá k aktivovanej gélovej matrici a nechá sa prebiehať kondenzácia počas 3 hodín pri 4 °C za mierneho miešania. Produkt sa 3x premyje vždy 5 objemami kondenzačného tlmivého roztoku. Na dezaktiváciu matrice sa pridá

1,5 ml etanolamínu a zmes sa mierne trepe cez noc pri 4 °C. Matrica sa 2x premyje vždy 5 objemami octanového tlmivého roztoku (100 mM octan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 4,0). Konečná ekvilibrácia sa vykoná dvojnásobným premytím vždy 5 objemami afínitného tlmivého roztoku.

Aktívne eluáty zo stĺpca DP-10 sa pomocou peristaltického čerpadla (prietok 10 ml/h) nanesú na afinitný stĺpec. Zachytí sa nenaviazaná frakcia a stĺpec sa premyje 12 ml afinitného tlmivého roztoku (premývacia kvapalina 1). Elúcia sa vykonáva 6 ml octanového tlmivého roztoku s pH 4,0 a zberajú sa frakcie s objemom 0,5 ml. Elučný profil z tohto stĺpca je znázornený na obr. 1.

Po prvej elúcii nasleduje druhý stupeň pri použití 6 ml octanového tlmivého roztoku s pH 3,0. Zberajú sa frakcie s objemom 1,5 ml. Stĺpec sa reekvilibruje s 25 ml afinitného tlmivého roztoku.

Výsledky extrakčného a afinitného stupňa sú súhrnne uvedené v nasledujúcej tabuľke 2.

Tabuľka 2

Výsledky afinitnej purifikácie inhibítora trombínu z Theromyzon tessulatum

Frakcia	Objer (nl)	ZrÄžací čas (B)	Inhibícia trombínu (IU)	Inhibícia F Xa (IU)
prázdná	__	20,5	0	0
acetónový extrakt	34	59,4	33	nestan.
nanaviaz. frakcia	34	24,3	1,8
premýv. kvapalina 1	24	20,2	1,6	1,0
afinit. eluát 1	4	> 600	25	0,2
afinit. eluát 2	4	22,1	0	0

Príklad 4

Gélová filtračná analýza aktívneho inhibítora trombínu z Theromyzon tessulatum

Aktívny materiál sa nanesie na stĺpec na gélovú filtráciu Biogel P4 (Biorad) s objemom 25 ml. Elúcia sa vykonáva 20 mM Tris.HCl, 50 mM NaCl s pH 7,4 pri prietoku 4 ml/h. Zberajú sa frakcie s objemom 1 ml, ktoré sa potom skúšajú na antitrombínovú aktivitu.

Použitá gélová matrica P4 má vylučovaciu medzu molekulovej hmotnosti 5000 D, a preto umožňuje frakcionáciu v rozmedzí molekulovej hmotnosti 1000 až 5000 D. S prekvapením sa zistilo, že antitrombínová aktivita sa eluuje vo frakcionačnom objeme, t. j. vo frakcii so zdanlivou molekulovou hmotnosťou pod 5000 D (obr. 2). Toto správanie kontrastuje so správaním hirudínu (molekulová hmotnosť 7000 D), ktorý je za rovnakých podmienok obsiahnutý vo vylúčenom objeme. Na základe kalibrácie stĺpca P4 bola pre produkt majúci antitrombínovú aktivitu z Theromyzon tessulatum stanovená molekulová hmotnosť približne 3000 D.

Príklad 5

HPLC s reverznými fázami purifikovaného inhibítora trombínu z Theromyzon tessulatum

Aktívne eluáty sa po stupni afinitnej chromatografie, uskutočňovanom podľa príkladu 3, ďalej analyzujú RP-HPLC. 20 μΐ vzorka sa nastriekne na stĺpec pre HPLC (Li Chrospher 300 RP-18, 5 pm; E. Merck, Darmstadt, SRN) a eluuje nasledujúcim gradientom acetonitrilu pri prietoku 1,0 ml/min.

Tlmivy roztok A: 0,1 % kyselina trifluóroctová vo vode Tlmivý roztok B: 0,08 % kyselina trifluóroctová v acetonitrile

Gradient: 0 až 2 minúty 10 % B až 3 minúty nástrek až 28 minút 60 % B

Na obr. 3 je znázornená typická stopa zakreslená v zariadení na analytickú chromatografiu pri 220 nm. Inhibičná aktivita vzhľadom na trombín je zistená v píkoch označených ako pík 2 a pík 4. Informácia z analytickej HPLC sa bezprostredne použije pri vykonávaní preparatívnych separácií za rovnakých podmienok.

Preparatívne purifikácie sa vykonávajú pri použití 500 pl alikvotných vzoriek z afinitnej chromatografie (obr. 4). Zachytia sa jednotlivé pikové frakcie, vhodné frakcie sa spoja a skoncentrujú v rotačnom odparovači Speed Vac. Vysušené frakcie sa rekonštituujú vodou a podrobia skúšaniu na antitrombínovú aktivitu pomocou skúšky zrážacieho času a chromogénneho stanovenia opísaného v príklade 2.

Hlavné aktivity sa v obidvoch skúšobných systémoch zistia v pikových frakciách 2 a 4, pričom určitá aktivita sa tiež zistí v pikovej frakcii 5, čo je najpravdepodobnejšie spôsobené kontamináciou pikovej frakcie 5 pikovou frakciou 4. Všetky ostatné frakcie, ktoré zodpovedajú zvyšným píkom v chromatograme, nemajú vôbec žiadnu inhibičnú aktivitu vzhľadom na trombín. Súčet aktivity pikovej frakcie 2 a 4 predstavuje približne 93 % celkovej aktivity.

Príklad 6

Porovnanie inhibítora trombínu podľa vynálezu s hirudínom pri HPLC

Aby sa ešte viac potvrdilo, že molekula inhibítoru podľa tohto vynálezu je úplne odlišná od molekuly hirudínu, vykoná sa nasledujúci pokus. K aktívnej pikovej frakcii 2 z HPLC podľa príkladu 5 sa pridá purifikovaný hirudín v podobnej proteínovej koncentrácii a vzniknutá zmes sa podrobí RP-HPLC pri použití acetonitrilového gradientu (40 až 70 %). Zistia sa 2 pikové frakcie majúce antitrombínovú aktivitu (obr. 5). Z porovnávacích pokusov, pri ktorých sa nastrekujú inhibitory jednotlivo, je možné identifikovať piky spôsobom uvedeným na obr. 5.

Z obr. 5 je zrejmé, že antitrombin podľa vynálezu sa eluuje v úplne odlišnej polohe v porovnaní s hirudínom. To samé je možné potvrdiť s aktívnou pikovou frakciou 4 po separácii HPLC podľa príkladu 5.

Príklad 7

Ďalšia charakterizácia pikovej frakcie 2 s antitrombínovou aktivitou

Čistota

Spojená piková frakcia 2 z RP-HPLC sa rechromatografuje za rovnakých podmienok, ako sú podmienky uvedené na obr. 3. Ako je zrejmé z obr. 6, je možné z hlavnej aktívnej pikovej frakcie ešte oddeliť malé množstvo kontaminačného materiálu. Po druhej RP-HPLC sa získa homogénny prípravok (pozri tiež obr. 8, ktorý ukazuje kapilárnu elektroforézu tejto frakcie).

Inhibícia trombínu

Piková frakcia 2 z RP-HPLC je aktívna pri zrážacej skúške (trombínový čas > 600 s/5 μΐ) a pri chromogénnej antitrombínovej skúške vykonávanej spôsobom opísaným v príklade 2. Pri tejto poslednej skúške je aktivita 3,2 IU/250 μΐ. Inhibičnú aktivitu na faktor Xa nie je možné pri pikovej frakcii 2 zistiť pri použití skúšky opísanej v príklade 2, čo ukazuje, že maximálna anti-FXa aktivita je « 1 % antitrombínovej aktivity. Z toho sa dá urobiť záver, že tento inhibítor je vysoko špecifický pre trombín.

Titrácia aktívnych miest

Inhibičná konštanta proti trombínu sa stanoví spektrofluorometrickou titráciou štandardizovaného roztoku trombínu inhibítorom podľa vynálezu. Podrobnosti tejto metódy už boli opísané (G. W. Jameson et al., Biochem. J., 131, 107 až 117, 1973).

Krátko je možné túto skúšku opísať takto: Pri titračných experimentoch sa použije fluorogénny substrát Tos-Gly-Pro-Arg-AMC s koncentráciou 50 μΜ. Skúšanie sa vykonáva v 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05 % PEG

6000 s pH 7,8 pri 25 °C. Koncentrácia 20 pM titrovaného humánneho α-trombínu (aktívne miesta) sa inkubuje s inhibítorom pri hodnote 0,2 až 5 x E_o 10 minút a po pridaní substrátu sa meria ustálenie rýchlosti. Kinetické konštanty sa stanovia pri použití programu na nelineárnu regresnú analýzu GraFit (R. J. Leaterbarrov, Erithacus Software, Staines, Veľká Británia, 1980). Nameraná hodnota K, je 178 femtomoláma.

Molekulová hmotnosť

Molekulová hmotnosť aktívnej pikovej frakcie 2 sa stanovuje laserovou desorpčnou hmotnostnou spektrometriou pri použití metódy MALDI-TOF (Kratos). 0,5 μΐ vzorka zmiešaná s niekoľkými μΐ roztoku kyseliny dihydroxybenzoovej v acetonitrile slúži ako matrica. Zmes sa vysuší chladným vzduchom, v držiaku vzorky zo striebra a potom umiestni do prístroja. Výsledné hmotnostná spektrum sa kalibruje pomocou štandardných proteínov so známou molekulovou hmotnosťou. Pík zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 9000 D (obr. 7).

Izoelektrická fokusácia

Izoelektrický bod inhibítoru sa meria pomocou kapilárnej elektroforézy v režime IEF (Applied Biosystems). Ako je zrejmé z obr. 8, inhibičný pík je umiestnený pri hodnote pl 4,9 v porovnaní so štandardnými proteínmi.

Príklad 8

Sekvenčné údaje pikovej frakcie 2 s antitrombinovou aktivitou

Pomocou sekvenačného zariadenia Beckman Peptide Sequencer, ktoré pracuje pri použití štandardnej degradačnej chémie (edman) sa pri pikovej frakcii 2 z RP-HPLC (príklad 5) zistia nasledujúce N-terminálne sekvencie: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

Príklad 9

Ďalšia charakterizácia pikovej frakcie 4 s antitrombinovou aktivitou

Čistota

Spojená piková frakcia 4 z RP-HPLC sa rechromatografuje za rovnakých podmienok. Ako je zrejmé z obr. 9, je možné z hlavnej aktívnej pikovej frakcie ešte oddeliť malé množstvo kontaminačného materiálu. Po druhej RP-HPLC sa získa homogénny prípravok.

Inhibícia trombínu

Piková frakcia 4 z RP-HPLC je aktívna pri zrážacej skúške (trombinový čas > 600 s/5 μΙ) a pri chromogénnej antitrombínovej skúške vykonávanej spôsobom opísaným v príklade 2. Pri tejto poslednej skúške je aktivita 1,3 IU/250 μΐ. Inhibičnú aktivitu na faktor Xa nie je možné pri pikovej frakcii 4 zistiť pri použití skúšky opísanej v príklade 2, čo ukazuje, že maximálna anti-FXa aktivita je « 1 % antitrombínovej aktivity. Z toho sa dá urobiť záver, že tento inhibítor je vysoko špecifický pre trombín.

Titrácia aktívnych miest

Inhibičná konštanta proti trombínu sa stanoví spektrofluorometrickou titráciou štandardizovaného roztoku trombínu inhibítorom podľa vynálezu. Podrobnosti sú uvedené v príklade 7. Nameraná hodnota K, je 240 feratomolárna.

Molekulová hmotnosť

Molekulová hmotnosť aktívnej pikovej frakcie 4 sa stanovuje laserovou desorpčnou hmotnostnou spektrometriou pri použití metódy MALDI-TOF (Kratos), opísanej v príklade 7. Výsledné hmotnostné spektrum sa kalibruje pomocou štandardných proteínov so známou molekulovou hmotnosťou. Pík zodpovedá relatívnej molekulovej hmotnosti približne 14 000 (obr. 10).

Príklad 10

Sekvenčné údaje pikovej frakcie 4 s antitrombinovou aktivitou

Pomocou sekvenačného zariadenia Beckman Peptide Sequencer, ktoré pracuje pri použití štandardnej degradačnej chémie (edman) sa pri pikovej frakcii 4 z RP-HPLC (príklad 5) zistí nasledujúca N-terminálna sekvencia: Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Príklad 11

Pri použití rovnakého postupu, aký je opísaný v príkladoch 1 až 5, je možné izolovať polypeptidy s antitrombinovou aktivitou z nasledujúcich druhov Theromyzon: T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. sexoculatum.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Purifikovaný polypeptid s inhibičnou aktivitou na trombín, izolovaný z tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida zvolený z polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 9000 ±1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu, alebo polypeptidu s relatívnou molekulovou hmotnosťou 14 000 ±1000, ktorý má nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu aminokyselín

Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Pne Lys.
2. Spôsob výroby purifikovaného polypeptidu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa homogenizuje tkanivo alebo sekréty pijavíc radu Rhynchobdellida, z homogenátu sa vyrobí frakcia obsahujúca jeho vodorozpustné zložky a táto frakcia sa purifikuje trombínšpccifickou afinitnou chromatografiou, po ktorej nasleduje aspoň jeden ďalší stupeň gólovej filtrácie a aspoň jeden ďalší stupeň HPLC s reverznými fázami.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že sa predná tretina zmrazených a lyofilizovaných pijavíc homogenizuje so zmesou vody a acetónu.
4. Extrakt, ako medziprodukt na výrobu polypeptidu podľa nároku 1,v y značujúci sa tým, že obsahuje vodorozpustné zložky homogenizovaného tkaniva alebo sekrétov pijavíc radu Rhynchobdellida.
5. Farmaceutický prípravok, vyznačuj úci sa t ý m , že obsahuje polypeptid podľa nároku 1 a farmaceutický vhodný nosič.
6. Použitie polypeptidu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na liečenie chorôb spojených s trombózou alebo na inhibíciu agregácie krvných doštičiek v mimotovej krvi.