SK282430B6 - Spôsob čistenia serínových proteáz použitím rekombinantného inhibítora z Erythrina caffra - Google Patents

Abstract

Je opísaný spôsob čistenia serínových proteáz zo zmesi proteínov založený na viazaní serínovej proteázy na imobilizovaný polypeptid, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, odstránení neviazaných podielov zo zmesi proteínov, oddelení serínovej proteázy od inhibítora, separácií imobilizovaného inhibítora od rozpustnej serínovej proteázy a izolácií serínovej proteázy, a ktorého podstata spočíva v tom, že sa ako polypeptid použije polypeptid, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie exogénnej nukleovej kyseliny a je vyčistený chromatograficky cez anex, katex alebo stĺpec chelátu niklu. Tento inhibítor má zlepšenú špecifickú aktivitu a je vhodný najmä na čistenie aktivátorov plazminogénu ako tkanivových aktivátorov plazminogénu t-PA a jeho derivátov.ŕ

Description

Vynález sa týka zlepšeného spôsobu čistenia serínových proteáz použitím rekombinantného inhibítora DE-3 z Erythrina caffra.

Doterajší stav techniky

Imobilizované inhibitory trypsínu z Erythrina (ETI) sú účinnými činidlami na afinitné chromatografické čistenie serínových proteáz, najmä aktivátorov plazminogénu (C. Heussen, J. Biol. Chem. 259 (1934) 11635 - 11638), β-trypsínu, α-chymotrypsínu a trombínu (S. Onesti et al., J. Mol. Recogn. 5 (1992) 105 - 114), Tieto inhibitory trypsínu sú známe dlho (C. Heussen, Haemostasis 11 (1982) P47 (Supplement) F. J. Joubert, Phytochemistry 21 (1982) 1213 - 1217; F. J. Joubert, Int. J. Biochem. 14 (1982) 187-193.

Inhibítor DE-3 z E. caffra je vhodný výhodne najmä na čistenie afmitnou chromatografiou aktivátorov plazminogénu (F. J. Joubert in Thrombosis and Haemostasis 57 (1987) 356 - 360). V tejto publikácii je opísaná aj kompletná sekvencia aminokyseliny tohto inhibítora. DE-3 sa môže izolovať zo semien E. caffra a čistiť (F. J. Joubert, Int. J. Biochem. 14(1982) 187- 193).

Teixeirom et al., Biochimica et Biophysica Acta 1217 (1994) 16 - 22 je opísaný rekombinantný ETI, ktorého špecifická inhibičná aktivita pre tkanivový aktivátor plazminogénu je približne 1,7.10⁹ U/mmol. Špecifická inhibičná aktivita prirodzeného ETI je oproti tomu približne 1,94.10’ U/mmol. To platí analogicky pre inhĺbičnú aktivitu proti trypsínu (2,63.10¹²) (3,21.10¹²). Tým je špecifická inhibičná aktivita rekombinantného ETI, vyrobeného podľa Teixeira, pre trypsín a tkanivový aktivátor plazminogénu menšia o 20 % ako aktivita prirodzeného ETI.

Rekombinant ETI sa podľa Teixeira získava a čistí zrážaním síranu amónneho 80 % sýtenie, dialýzou proti vode a štiepením kyanobromidu, pričom N-terminálne sekvencie sa odštiepia vrátane metionínu. Nakoniec sa uskutoční stĺpcová afinitná chromatografia (Sephadex 100).

Podstata vynálezu

Úlohou vynálezu je zlepšenie účinnosti spôsobu čistenia serínových proteáz použitím ETI.

Predmetom vynálezu je spôsob čistenia serínových proteáz zo zmesi proteínov viazaním serínovej proteázy na imobilizovaný polypeptid, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, odstránením neviazaných podielov zo zmesi proteínov, oddelením serínovej proteázy od inhibítora, separáciou imobilizovaného inhibítora od rozpustnej serínovej proteázy a izoláciou serínovej proteázy, ktorého podstata spočíva v tom, že sa ako polypeptid použije polypeptid, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie exogénnej nukleovej kyseliny (výhodne DNA) a čistí sa chromatograficky cez anex, katex alebo cez stĺpec chelátu s niklom.

S prekvapením sa zistilo, že rekombinantný polypeptid vyrobený podľa vynálezu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, má v protiklade k inhibítoru DE-3, izolovanému z prírodných zdrojov z E. caffra, značne väčšiu špecifickú aktivitu proti serínovým proteázam.

Pod pojmom „aktivita inhibítora DE-3 z E. caffra sa v podstate rozumie špecifická inhibičná aktivita pre serínové proteázy, najmä pre tkanivové aktivátory palzminogénu.

Špecifická inhibičná aktivita inhibítora je pritom približne 1,07 U/mg alebo vyššia oproti trypsínu. Inhibícia sa uskutočňuje pomocou väzby medzi inhibítorom a serínovou proteázou.

Spôsob podľa vynálezu je vhodný najmä výhodne na čistenie aktivátorov plazminogénu, ako napríklad tkanivových aktivátorov plazminogénu (t-PA) a ich derivátov (napríklad mutáciou a deléciou), vhodné t-PA a deriváty sú opísané napríklad v EP-B 0 093 619, USP 5,223 256, W0 90/09437 a T. J. R. Harrisom, Proteín Engeneering 1 (1987)449-458.

Výroba rekombinantného inhibítora sa môže uskutočňovať pomocou metód, ktoré sú odborníkovi bežne známe.

Na tieto účely sa najskôr vyrobí nukleová kyselina (výhodne DNA), ktorá je schopná produkovať proteín, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3. DNA sa klonuje na vektor, ktorý sa môže transferovať do hostiteľskej bunky a tam replikovať. Takýto vektor obsahuje prídavné k sekvencií inhibítora prvky operátora, ktoré sú nevyhnutné na expresiu DNA. Tento vektor, ktorý obsahuje inhibítor DNA a prvky operátora, sa transferuje do vektora, ktorý je schopný exprimovať DNA inhibítora.

Hostiteľská bunka sa získava z týchto buniek. Pritom sa pomocou vhodných opatrení zabezpečí, aby aktivátor mohol zaujať aktívnu terciámu štruktúru, v ktorej prejavuje vlastnosti inhibítora.

Pritom nie je nutné, aby inhibítor mal exaktnú sekvenciu aminokyseliny zodpovedajúcu SEQ ID NO:2. Rovnako sú vhodné inhibitory, ktoré majú v podstate rovnakú sekvenciu, a polypeptidy s aktivitou (schopnosťou viazať sa na serínové proteázy, najmä na t-PA) inhibítora z DE-3 z Erythrina caffra. Ukázalo sa, že je výhodná 80 % až 90 % zhoda sekvencie aminokyseliny. Sekvencia aminokyseliny SEQ ID NO:2 sa používa však výhodne, pričom v prípade expresie do prokaryotických hostiteľských buniek, ale nie po eukaryotickej expresii, je obsiahnutý N-terminálny metionín.

Ďalším predmetom vynálezu je nukleová kyselina, ktorá je v podstate identická s nukíeotidmi 9 až 527 SEQ ID NO:1 a je kódovaná pre polypeptidy s aktivitou inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, alebo nukleová kyselina, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid. Výhodná je DNA, najmä DNA sekvencia 9 až 527 SEQ ID NO:1. Na expresiu v eukaryotických alebo polykaryotických hostiteľských bunkách obsahuje nukleová kyselina na 5’-konci eukaiyotické alebo prokaryotické translačné a transkripčné signály, ktoré sú pre odborníka bežné.

Sekvencia nukleovej kyseliny inhibítora je výhodne identická s nukleotidmi 9 až 527 SEQ ID NO:1. Samozrejme je možné na uľahčenie výroby vektorov alebo na optimalizáciu expresie vytvoriť modifikácie. Takými modifikáciami sú napríklad:

zmena nukleovej kyseliny, aby sa zaviedli rôzne identifikačné sekvencie reštrikčných enzýmov na uľahčenie krokov ligácie, klonovania a mutagenézy, zmena nukleovej kyseliny na zabudovanie výhodného kodónu pre hostiteľskú bunku, doplnenie nukleovej kyseliny o dodatočné prvky operátora, aby sa optimalizovala expresia v hostiteľskej bunke,

Expresia inhibítora sa uskutočňuje výhodne v mikroorganizmoch, ako je E. coli. Expresia v eukaryotických bunkách, ako napríklad v kvasinkách, bunkách CHO alebo bunkách hmyzu je tiež možná.

Na to sa používajú biologicky funkčné plazmidy alebo vírusové vektory DNA, ktoré v podstate obsahujú nukleotidy 9 až 527 SEQ ID NO:1, alebo obsahujú nukleovú kyse2 linu, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid. Takými vektormi sa stabilne transformujú alebo transferujú prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky.

Expresívne vektory musia obsahovať promótor, ktorý umožní expresiu proteínu inhibítora v hostiteľskom organizme. Takéto promótoiy sú odborníkom známe a sú to napríklad lacpromótor (Chang et al., Náture 198 (1977) 1056), trp (Goedded et al., Nuc. Acids Res. 8 (1980) 4057), XPL-promótor (Shimatake et al., Náture 292 (1981) 128) a T5-promótor (US patent č. 4 689 4067). Vhodné sú aj syntetické promótory, ako napríklad tac-promótor (US patent č. 4 55 1 433). Vhodné sú tiež kopulované systémy promótorov, ako napríklad T7-RNA-polymeráza/promótor systém (Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113). Tiež sú vhodné aj hybridné promótory z promótora bakteriofágov a regiónu operátora mikroorganizmu (EP-A 0267 851). Dodatočne k promótoru je nevyhnutné účinné miesto väzby ribozómov. Pre E. coli sa toto miesto väzby ribozómov označuje ako Shine-Dalgamo-/SD/-sekvencia (Shine et al., Náture (1975) 25434; J. Sambrook et al., „Expression of cloned genes in E. coli“ in Molecular Cloning: A laboratory manuál (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, (USA).

Na zlepšenie expresie je možné exprimovať proteín inhibítora ako fúzny proteín. V tomto prípade sa obvykle fúzuje DNA, ktorá je kódovaná pre N-terminálnu časť endogénneho bakteriálneho proteínu alebo iného stabilného proteínu. Na 5'-konci sekvencie kódovanej pre proteín inhibítora. Príklady pre to sú lacZ, trpE.

Po expresii sa fuzne proteíny výhodne štiepia enzýmami, napríklad faktorom Xa (Nagal et al., Náture 309 (1984) 810). Ďalšími príkladmi miest štiepenia sú štiepne miesto IgA-proteázy (WO 91/11520) a štiepne miesto ubiquitinu (Miller et al., Bio/Technology 7 (1989) 698.

Rekombinantný proteín, získaný najskôr ako inaktívny inclusic bodies sa môže premeniť na rozpustný aktívny proteín spôsobmi, ktoré sú pre odborníka bežné. Na to sa inclusion bodies redukuje napríklad rozpustený s hydrochloridom guanidinu alebo močovinou v prítomnosti redukčného činidla, redukčné činidlo sa odstráni napríklad dialýzou a výhodne sa renaturuje použitím redoxného systému, ako napríklad redukovaného alebo oxidovaného glutatiónu.

Takéto metódy sú opísané napríklad v US patente 4 933 434, EP-B 0 241 022 a EP-A 0 219 874.

Tiež je možné sekrétovať proteíny ako aktívne proteíny z mikroorganizmov. Na to sa používa výhodne fúzny proteín, ktorý sa skladá zo signálnej sekvencie, ktorá je vhodná na sekréciu proteínov v použitých hostiteľských mikroorganizmoch (US patent č. 4 336 3367, a nukleovej kyseliny, ktorá je kódovaná pre proteín inhibítora. Proteín sa pritom sekretuje buď do média (u grampozitívnych baktérií), alebo do periplazmatického priestoru (u gramnegatívnych baktérií). Medzi sekvenciou signálu a sekvenciou kódovanou pre inhibitor je výhodne štiepne miesto, ktoré umožní odštiepiť proteín inhibítora buď pri procese, alebo pri prídavnom kroku. Takýmito signálnymi sekvenciami sú napríklad ompA (Ghrayeb et al., EMBO J. 3 (1984), 2437), a phoA (Oka .et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 (1985) 7212).

Ďalej obsahujú vektory ešte terminátoiy. Terminátory sú sekvencie DNA, ktoré signalizujú koniec transkripčného pochodu. Vyznačujú sa zvyčajne dvomi štruktúrnymi zvláštnosťami obrátene repetitívnym G/C-bohatým regiónom, ktorý môže tvoriť intramolekulovo dvojitú skrutkovicu, ako aj počtom U/, prípadne T/zvyškov. Príklady sú trp

-atenuátor a terminátor v DNA phagene fd, ako aj rmB (Brosium et al., J. Mol. Biol. 148 (1981) 107 - 127).

Dodatočne obsahujú expresívne vektory zvyčajne selektovateľný marker na selektovanie transformovaných buniek. Takými selektovateľnými markermi sú napríklad rezistentné gény pre ampicilín, chloramfenikol, kanamycin, neomycín a tetracyklín (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol. 32 (1978) 469). Vhodnými selektívnymi markermi sú aj gény pre esenciálne látky biosyntézy látok nevyhnutných pre bunku, ako napríklad histidín, tryptofán a leucín.

Je známy celý rad vhodných bakteriálnych vektorov. Vektory boli opísané napríklad pre nasledujúce baktérie: Bacillus subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 5582), E. coli (Aman et al., Gene 40 (1985) 183, Studier et al., J. Mol. Biol. 189 (1986), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ, Microbial. 54 (1988) 655), Streptococcus lividans a Streptomyces lividans (US patent č. 4 747 056).

Expresia proteínu inhibítora je možná okrem v prokaryotických mikroorgariizmoch aj v eukaryotoch (ako napríklad CHO bunkách, kvasinkách alebo bunkách hmyzu). Ako eukaryotický systém sú výhodné bunky kvasiniek a bunky hmyzu. Expresia v bunkách sa môže uskutočňovať cez tri druhy vektorov kvasiniek (intejgrujúce YIp) yeast intcgrating plazmidové /vektory replikujúce YRp (yeast replicon plazmidové) vektory a epizomálne YEp/yeast episomal plazmidové/vektory. Podrobnosti k tomu sú opísané napríklad v S. M. Kingsman et al., Tibtech 5 (1987) ⁵³ -57.

Ďalšie genotechnologické spôsoby výroby a expresie vhodných vektorov sú opísané v J. Sambrook et al., „Expresion of cloned genes in E. coli“ v Molecular Cloning : A laboratory manuál (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.

Po výrobe nasleduje čistenie rekombinantného ETI chromatograficky alebo anexom, napríklad cez stĺpec Q-sepharosy*, katex (napríklad na báze sulfopropylu) alebo cez stĺpec chelátu niklu, ako je to opísané napríklad v Porsth, J.a. Olin, B. Biochemistry 22 (1983), 1621 - 1630. S prekvapením sa týmto spôsobom čistenia získa rekombinantný ETI, ktorého inhibičná aktivita oproti serinovým proteázam, ako napríklad trypsínu a tkanivovému aktivátoru plazminogénu; je podstatne vyššia ako inhibičná aktivita prirodzeného ETI.

Takto vyrobený a vyčistený polypeptid má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra a dá sa získať kultiváciou prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, ktoré sú transformované alebo transfekované exogénnou nukleovou kyselinou (výhodne DNA), ktorá zodpovedá v podstate sekvencií nukleotidu 9 až 527 SEQ ID NO:1, alebo nukleovou kyselinou, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid, spôsobom, ktorý umožni hostiteľským bunkám exprimovať za vhodných podmienok živín polypeptid a izoláciu žiadaného polypeptidu, ktorý má špecifickú aktivitu inhibítora asi 1,07 U/mg alebo vyššiu (výhodne 1,07 až 1,8 U/mg) proti trypsínu. Pri rôznych šaržiach rekombinantného ETI bola ako špecifická nájdená aktivita napríklad 1,2; 1,5 a 1,6 U/mg. Táto aktivita sa získa po chramatografickom čistení na anexe, katexe alebo na stĺpci chelátu niklu.

Ďalším predmetom vynálezu je spôsob výroby rekombinantného polypeptidu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra (ETI), kultiváciou prokaiyotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, ktoré sú transformované alebo transfekované exogénnou nukleovou kyselinou (výhodne DNA), ktorá v podstate zodpovedá sekvencií nukleotidov 9 - 527 SEQ ID NO: 1, alebo nukleovou kyse3

SK 282430 Β6 linou, ktorá je v rámci degenerácie genetického kódu kódovaná pre ten istý polypeptid, spôsobom, ktorý umožni hostiteľským bunkám, aby exprimovali za vhodných podmienok živín polypeptid, izoláciu polypeptidu z hostiteľských buniek a chromatografické čistenie na anexe, katexe alebo na stĺpci chelátu niklu.

Čistenie serínových proteáz použitím rekombinantného ETI sa uskutočňuje spôsobmi, ktoré sú pre odborníka bežné (porov. napríklad F. J. Joubert (1987)). Na to sa ETI viaže kovalentne na matricu (napríklad stĺpec CNBr-sepharosy) a zmes proteínov, ktorá obsahuje serínovú proteázu, sa vnesie za neutrálnych alebo mierne alkalických podmienok na stĺpec a uskutoční sa chromatografia. Elúcia sa uskutočňuje znížením pH pH 5,5 alebo použitím tlmivých roztokov, ktoré obsahujú chaotropné činidlá ako napríklad K.SCN. Čistota proteínu v eluáte je väčšia ako 95 % vzhľadom na serínovú proteázu. Na ďalšie použitie sa serínová proteáza výhodne prevedie dialýzou do teraz žiadaného tlmivého roztoku.

Imobilizácia inhibítora všetky ďalšie kroky spôsobu čistenia serínovej proteázy a t-PA sa môžu uskutočňovať analogickým spôsobom ako pre inhibítor DE-3, izolovaný z E. caffra. Takéto spôsoby sú uvedené napríklad v EP-B 0 218 479, EP-B 0 112 122, USP 4 902 623. Imobilizácia sa výhodne uskutočňuje na inertnom nosiči, výhodne na CNBr-sapharose^R.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady a protokoly sekvencii ďalej opisujú vynález.

Príklad 1

Expresia ETI v E. coli a/ Génová syntéza

S použitím výhodného kodónu z E. coli sa zo sekvencie aminokyseliny z ETI z Erythrina caffra (Joubert und Dowdle, Trombosis and Haetnostasis 57 (3) (1987) 356 - 360) odvodila zodpovedajúca sekvencia nukleovej kyseliny a zosyntetizovala metódou Beattie a Lowler (Náture 352 (1991) 548 - 549). Aby sa uľahčilo klonovanie, zaviedlo sa na 5'-koniec miesto rezu pre reštrikčný enzým EcoRI a na 3'-koniec miesto rezu pre reštrikčný enzým HindlII. Nukleová kyselina, vyrobená syntézou, sa reštringovala enzýmami EcoRI a HindlII a ligovala klonovacím vektorom pBS (Stratagene, US, Catalogue No. 211201, Derivát des Phagen fl und Stratagene's pBS Plasmid mit T₃, und T₇ Promotor-Gen, Ampicillin-Resistanz-Gen, fl origin, CoIE-1 origin, lad Gen, LacZ Gen und einer Multiple Cloning Site), ktorý bol predtým tiež strávený EcoRI a HindlII. Vsádzka ligácie sa transformovala v Escherichia coli. Získané klony, selektované na ampicilíne, sa analyzovali reštrikciou s enzýmami EcoRI a HindlII. Výsledný kloň, pBS + ETI, obsahuje prídavný fragment EcoRI/HindlII s veľkosťou 539 bp s SEQ IDNO:1.

b/ Expresívny vektor

Plazmid pBS + ETI bol reštringovaný reštrikčnými enzýmami EcoRI a HindlII a 539 bp veľký fragment sa izoloval. Expresívny vektor pBTacl (Boehringer Mannheim GmbH, Katalóg č. 1081365, na báze pUC8, H. Haymerle et al., Nucl. Acid Res. 14 (1986) 8615 - 8624) sa tiež strávil enzýmami EcoRI a HindlII a izdoval sa približne 4,6 kb veľký fragment vektora. Obidva fragmenty sa ligovali a spolu s Helferovým plazmidom pUB8520 (Brinkmann et al., Gene 85 (1989) (109 - 114), ktorý obsahuje lac-represorový gén) sa transformovali do E. coli (DSM 5443). Selekcia klonov sa uskutočňovala cez ampicilínovú, prípadne kanamycínovú rezistenciu, sprostredkovanú plazeniami. Získaný plazmid pBTETI obsahuje v porovnaní s východiskovým vektorom pBTacl ďalší EcoRI/HindlII fragment s veľkosťou 539 bp.

Analogickým spôsobom sa môže namiesto DSM 5443 používať aj DSM 3689, ktorý už obsahuje 14 plazmid. V tomto prípade nie je Helferov plazmid pUB520 nutný.

c/ Expresia rekombinantného ETI (res. ETI) v E. coli

Na preskúšanie výkonu expresie sa kmeň E. coli DSM 5443 kultivoval s plazmidtni pBTETI a pUBS520 v LB médiu (Sambrook et al., Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor) za prítomnosti ampicilinu a kanamycínu (teraz 50 pg/ml) výslednej koncentrácie až do optickej hustoty (OD) 0,6 pri 550 nm. Expresia sa iniciovala pridaním 6 mM IPTG. Kultúra sa inkubovala ďalšie 4 hodiny. Následne nato sa E. coli zhromaždila odstredením a resuspendovala v tlmivom roztoku (50 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM EDTA); lýza E. coli sa dosiahla pôsobením zvuku. Novým odstredením sa zhromaždili nerozpustné frakcie proteínov (inclusion bodies) a resuspendovali pôsobením zvuku. Suspenzia sa doplnila 1/4 objemu vsadeného tlmivého roztoku (250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,01 M EDTA, 5 % SDS, 5 % merkapto-etanolu, 50 % glycerolu a 0,005 % brómfenolovej modrej) a analyzovala pomocou 12,5 % SDS-polyakrylamidového gélu. Ako kontrola sa uskutočnila preparácia s kultúrou E. coli (pBTE-TI/pUBS520), ktorá nebola doplnená IPTG a nanosená v polyakrylamidovom géle. V preparácii kultúry indukovanej IPTG sa môže po zafarbení gélu 0,2 % Cootnassieovou modrou R250 (rozpustenou, v 30 % metanole a 10 % kyseline octovej) a odfarbení gélu v zmesi metanolu a kyseliny octovej, pozorovať výrazný pás s molekulovou hmotnosťou asi 22 kD. Tento pás sa v preparácii neindukovanej E. coli buniek nenachádza.

Príklad 2 Renaturácia a čistenie recETI g nerozpustnej frakcie proteínov (Inclusion Bodies/IBs) sa rozpúšťalo s 0,1 M Tria-HCl, pH 8,5, 6 M guanidínu, 0,1 M DTE, 1 mM EDTA (90 minút pri 25 °C, Cprot = 10 mg/ml) a po ustanovení hodnoty pH na 2,5 (HC1) sa dialyzovalo proti 3 mol/1 guanidínu/HCl. Dialyzát sa odstredil (SS34, 13000 ot/m) a koncentrovaním cez YM 10 nastavil na C_prot = 36,9 mg/ml. Jednolitrová reakčná nádoba sa naplnila 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0,1 mM GSSG. Renaturácia sa uskutočňovala pri 20 °C 16-násobným prídavkom dialyzátu (teraz 600 pg proteínu/ml tlmivého roztoku) v časovom odstupe 30 minút.

Renaturácia poskytla 2,8 U/ml aktívneho ETI.

Čistenie recETI a/ cez anex resETI sa renaturuje v 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0,1 mM GSSG. Renaturát sa zriedi vodou v pomere 1 : 2, nastaví pomocou HC1 na pH 8,0, dialýzuje proti 50 mM Tris/HCl pH 8,0 a nanesie na stĺpec ekvilibrovanej Q-Sepharozy (5 mg proteín/ml gélu). Po premytí stĺpca ekvilibračným tlmivým roztokom a 50 mM Na₂HPO4/H₃PO₄, pH 8,0 (teraz 5 objemami stĺpca), sa uskutoční elúcia 50 mM/ NajHPO/HjPO.;, pH 8,0, 0,2 M NaCl.

SK 282430 Β6 b/ cez katex

Renaturovaný ETI sa nastavil prídavkom HC1 na pH 4,0 a dialyzoval proti 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0 (Cross Flow). Dialyzát sa odstredil (13 000 ot/m, 30 min. 33 34) a naniesol na TSK-SP-stĺpcc ekvilibrovany 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0, (katex s bočnými skupinami sulfopropylu, Merck, Deutschland, objem 15 ml). Po premytí stĺpca ekvilibračným tlmivým roztokom a 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0, 0,1 M NaCl, sa uskutoční elúcia 50 mM NaOAc/HCl, pH 4,0, 0,2 M NaCl.

Čistota eluátu sa skúšala pomocou SDE/PAGE a cez RP-HPLC.

Výsledok:

ETI sa viaže za použitých podmienok na stĺpec TSK-SP a môže sa eluovať 0,2 M NaCl. Analytika RP-HPLG ukazuje, že čistota je > 95 %.

Príklad 3

Porovnanie špecifickej aktivity resETI zo semien Erythrina caffra recETI a ETI, izolované zo semien E. caffra, sa dialyzovali proti 50 mM Na₂HPO4/H₃PO₄, pH 8,0,0,2 M NaCl a nastavili na koncentráciu proteínu 0,8 mg/ml. Koncentrácia proteínu sa určovala meraním UV-absorpcie pri 280 nm.

Stanovenie aktivity ETI

Inhibícia trypsínu ETI sa meria pomocou N-a-benzoylesteru (RAEE) ako substrátu, 40 μ roztoku trypsínu (0,13 mg/ml 2 mM HC1) sa zmieša v kremennej kyvete so 60 μ testovacieho tlmivého roztoku (0,1 M Tris/HCl, pH 8,0) a 100 pi roztoku ETI a 5 minút sa inkubuje pri 30 °C. Po prídavku 800 μΐ roztoku BAEE (20 mg BAEE x HC1) 100 ml testovacieho tlmivého roztoku) sa stanoví zvýšenie extinkcie pri 253 nm.

Aktivita ETI sa zisťuje podľa nasledujúceho vzorca:

U/ml = [^1Evzorka/^Etrypsín]. ^ctrypsín . 0,328 . V ^Evzorka: zvýšenie extinkcie/min. inhibovanej vzorky ^Etrypsín: zvýšenie extinkcie/min. neinhibovaného trypsínu ^ctrypsín: koncentrácia trypsínu v testovanej vsádzke V: predbežné zriedenie roztoku ETI proteín C aktivite 6pec, ektlvita

ZV/iľV /U/o^Z

ETI/aemená 0,81 0,71 0,68 recETI 0,83 0,89 1,07

Výsledok: špecifická aktivita recETI je o 20 % vyššia ako špecifická aktivita ETI izolovaného klasickým spôsobom zo semien E. caffra.

Pri ďalších šaržiach rekombinantného ETI sa ako špecifická aktivita našlo napríklad 1,2,1,5 a 1,6 U/mg.

Príklad 4

Kopulácia recETI na SNBr-Sepharozu

170 mg vyčistenej recETI sa dialyzovalo proti 0,05 M H₃BO₃/Na0H, pH 8,0, 0,5 M NaCl (kopulačný tlmivý roztok) a R zmiešalo sa so 7,5 g CNBr-Sepharozy^R (cez noc napučanej v 500 ml 1 mM HC1, potom odsatej a suspendovanej v kopulačnom tlmivom roztoku). Suspenzia sa inkubovala 90 minút pri teplote miestnosti, odsala a pretrepávala cez noc so 400 ml Tris HC1, pH 8,0, recETI sepharoza sa odsala a ekvilibrovala s 0,7 M arginín/H3P04, pH 7,5.

Príklad 5 mg rekombinantného aktivátora plazminogénu K2P (vyrobeného podľa WO 90/09437 alebo USP 5 223 2567 sa vnieslo na recETI-Sepharozu ekvilibrovanú 0,7 M arginín/H₃PO₄, pH 7,5. Po premytí ekvilibračným tlmivým roztokom a 0,3 M arginín/-H₃PO₄, pH 7,0 (teraz 5 objemami stĺpca) sa uskutočňovala elúcia s 0,3 M arginín/H₃PO₄, pH 4,5. Obsah aktivátora plazminogénu v eluáte sa stanovil s S 2288 ako substrátom (Kohnert et al., Prot. Engineer. 5 (1992) (93 - 100).

Výsledok: väzbová kapacita recETI-Sepharozy pre aktivátor plazminogénu je 1,2 mg a zodpovedá 0,63 MU (aktivátora plazminogénu/ml recETI-Sepharozy).

Protokol, týkajúci sa sekvencii

1. Všeobecné informácie: i/ Prihlasovateľ:

A. Meno: Boehringer Mannheim GmbH

B. Ulica: Sandhofer Str. 116

C. Miesto: Mannheim

E. Štát: Nemecko

E. Poštové smerovacie číslo: D-68305

G. Telefón: 0621/759-3197

H. Telefax: 0621/759-4457 ii/ Názov prihlášky vynálezu: Použitie rekombinantného inhibítora z Erythrina caffra na čistenie serínových proteáz iii/ Počet sekvencii: 2 iv/ Čitateľná forma komputera:

A. Nosič údajov: Floppy disk

B. Počítač: IBM PC compatible

C. Prevádzkovaný systém: PC-DOS/MS-DOS

D. Softvér: Patentln Release #1,0, Verše# 1,25 (EPA)

2. Informácie k SEQ ID NO:1: i/ Charakteristika sekvencie:

A. Dĺžka: 539 párov báz

B. Druh: nukleová kyselina

C. Forma fázy: dvojitá

D. Topológia: lineárna ii/ Druh molekuly: cDNS ix/ Znaky:

A. Meno/kľúč: CDS

B. Poloha: 9.. 527

D. Iné údaje: /note = „Met only included in prokaryotie expression“/ ix/ Znaky:

A. Meno/kľúč: misc-feature

B. Poloha: 1.. 8

D. Iné údaje: /funkcia = „multiple cloning site/ ix/ Znaky:

A. Meno/kľúč: misc-feature

B. Poloha: 528.. 539

D. Iné údaje: funkcia = „multiple cloning site“ xi/ opis sekvencie: SEQ ID NO:1:

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob čistenia serínových proteáz zo zmesi proteínov viazaním serínovej proteázy na imobilizovaný polypeptid s aktivitou inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, odstránením neviazaných podielov zo zmesi proteínov, oddelením serínovej proteázy od inhibítora, separáciou imobilizovaného inhibítora od rozpustenej serínovej proteázy a izoláciou serínovej proteázy, vyznačujúci sa tým, že sa ako polypeptid použije polypeptid, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie e xogénnej nukleovej kyseliny a je vyčistený chromatograficky cez anex, katex alebo stĺpec chelátu niklu.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že serínová proteázaje aktivátor plazminogénu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že aktivátor plazminogénu je tkanivový aktivátor plazminogénu alebo jeho derivát.
4. 4. Spôsob podľa nárokov laž 3, vyznačujúci sa t ý m , že inhibítor je imobilizovaný na inertnom nosiči.
5. 5. Spôsob podľa nárokov laž 4, vyznačuj úci sa t ý m , že exogénna nukleová kyselina zodpovedá v podstatnej miere sekvencii nukleotidov 9 až 527 v SEQ ID NO: 1 alebo nukleovej kyseline, ktorá v rámci degenerácie genetického kódu kóduje ten istý polypeptid.
6. 6. Použitie polypeptidu s aktivitou inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, ktorý je produktom prokaryotickej alebo eukaryotickej expresie exogénnej nukleovej kyseliny a je vyčistený chromatografícky cez anex, katex alebo chelát niklu, na afinitné chromatografické čistenie serínových proteáz.
7. 7. Použitie podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že serínová proteáza je aktivátor plazminogénu.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, vyznačujúce sa tým, že aktivátor plazminogénu je tkanivový aktivátor plazminogénu alebo jeho derivát.
9. 9. Spôsob výroby polypeptidu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, vyznačujúci sa tým, že sa kultivujú prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú transformované alebo transfekované exogénnou nukleovou kyselinou, ktorá v podstatnej miere zodpovedá sekvencii nukleotidov 9 až 527 z SEQ ID NO:1, alebo nukleovou kyselinou, ktorá v rámci degenerácie genetického kódu kóduje ten istý polypeptid, takým spôsobom, ktorý umožní hostiteľským bunkám, aby za vhodných živných podmienok exprimovali polypeptid, a potom sa izoluje žiadaný polypeptid, ktorý má špecifickú aktivitu inhibítora asi 1,07 U/mg v porovnaní s trypsínom.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že hostiteľské bunky sú bunky E. coli.
11. 11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že hostiteľské bunky sú bunky kvasiniek alebo bunky CHO.
12. 12. Nukleová kyselina obsahujúca 9 až 527 nukleotidov zo SEQ ID NO:1, ktorá kóduje polypeptid s aktivitou inhibítora DE-3 z Erythrina cafrra.
13. 13. Biologicky funkčný plazmid alebo vírusový vektor DNA ktorý obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 12.
14. 14. Prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú stabilne transformované alebo transfekované vektorom DNA podľa nároku 13.
15. 15. Polypeptid, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, pripraviteľný kultiváciou prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek, ktoré sú transformované alebo transfekované exogénnou nukleovou kyselinou, ktorá v podstate zodpovedá sekvencii nukleotidov 9 až 527 z SEQ ID NO:1, alebo nukleovou kyselinou, ktorá v rámci degenerácie genetického kódu kóduje ten istý polypeptid, tým spôsobom, ktorý umožní hostiteľským bunkám, aby za vhodných živných podmienok exprimovali polypeptid, izoláciou žiadaného polypeptidu, ktorý má špecifickú aktivitu inhibítora aspoň 1,07 U/mg v porovnaní s trypsínom.
16. 16. Polypeptid podľa nároku 15, vyznačujúci sa t ý m , že má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2 aje pripravený expresiou v prokaryotických hostiteľských bunkách.
17. 17. Polypeptid podľa nároku 15, vyznačujúci sa t ý m , že má aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2 bez N-terminálneho metionínu a je pripravený expresiou v eukaryotických hostiteľských bunkách.
18. 18. Spôsob výroby rekombinantného polypeptidu, ktorý má aktivitu inhibítora DE-3 z Erythrina caffra, vyznačujúci sa tým, že sa kultivujú prokaryotické alebo eukaryotické hostiteľské bunky, ktoré sú transformované alebo transfekované exogénnou nukleovou kyselinou, ktorá v podstatnej miere zodpovedá sekvencií nukleotidov 9 až 527 SEQ ID NO:1, alebo nukleovou kyselinou, ktorá v rámci degenerácie genetického kódu kóduje ten istý polypeptid, v podmienkach, keď dochádza k expresii polypeptidu v hostiteľských bunkách, ďalej sa polypeptid izoluje z hostiteľských buniek a chromatograficky čistí na anexc, katexe alebo na stĺpci chelátu niklu.