JPH02501106A - 新規プラスミノゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５、請求項１記載のプラスミノゲン活性化因子とそれの医薬上許容される担体と からなる医薬組成物。

６、請求項４記載の形質転換された哺乳動物細胞を培養し、それにより産生じた プラスミノゲン活性化因子を単離することを特徴とするプラスミノゲン活性化因 子の調製方法。

明　細　書 新規プラスミノゲン活性化因子 発明の分野 本発明はプラスミノゲン活性化因子およびそのコーディング配列を有する組換え 型ＤＮＡ分子に関する。

発明の背景 フィブリン溶解は、特異的フィブリン溶解系の活性化後、脈管内および脈管外の フィブリン沈積物を除去する工程である。該工程は２つの主要な事象、すなわち 、プラスミン形成とフィブリン分解とからなる。第１の事象において、不活性な 先駆体のプラスミノゲンは、いわゆるプラスミノゲン活性化因子により、タンパ ク分解酵素であるプラスミンに変えられる。第２の工程において、プラスミンは 不溶性フィブリンネットワークを分解し、かくして血餅を溶解する。種々の起源 のプラスミノゲン活性化因子が知られている。これらのうち有力なものは、細菌 オリギンのストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）および両方共ヒ トオリギンであるウロキナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅＸＵ　Ｋ　）および組織プ ラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅＰ　ｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖ ａｔｏｒ）（ｔ　Ｐ　Ａ）である。

ウロキナーゼに関する生化学的研究は、３形態の酵素が存在することを示してい る。第１の形態は、約５４０００ダルトンの分子量（Ｍｒ）を有し、高Ｍｒ−Ｕ Ｋ（ＨＭＷ−ＵＫ）と称され；それは各々、１８０００および３３０００ダルト ンの２つのジスルフィド架橋鎖ＡおよびＢからなる。Ｂ鎖はウロキナーゼの活性 部位を有し、別のセリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）に よく類似している。第２の分子形のウロキナーゼは、分子量３３０００ダルトン で、既知アミノ酸配列から証明されたように、八−鎖（低分子量ＵＫ。

ＬＭ〜Ｖ−ＵＫ）のアミノ［２２１３５と１３６の間のタンパク質分解開裂によ り、ＨＭＷ−ＵＫから誘導される。ＨＭＷおよびＬＭＷ−［Ｋは両方共、治療に 用いられる優れたプラスミノゲン活性化因子である。しかしながら、ＵＫ−注入 の間に起こりうるプラスミノゲンの観察される全身的活性化により、出血の危険 性が増すため、血栓崩壊剤としてのそれらの使用は制限される。

最近、１本鎖の先駆体形のウロキナーゼの存在が示された。プラスミンへの暴露 を調整すると、この先駆体は２重鎖ＨＭＷ−ＵＫに活性化される。フィブリンに 結合した酵素的に活性なプラスミンを、α、−抗ブラスミンのようなプラスミン 抑制因子による不活性化から部分的に保護した場合、プロウロキナーゼ（ｐｒｏ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）の２本鎖分子への変形を、血餅表面に限定することができ た。したがって、プラスミノゲン活性化は、主として、系内にて生成されたＨＭ Ｗ−ＵＫ付近のフィブリンクロットを直接取り巻いている外界に限定できる。こ の点において、ＨＭＷ−ＵＫの先駆体の治療的使用は、活性酵素で観察される副 作用を回避することができる。実際に、ＵＫ−先駆体を用いる血栓崩壊は、ＵＫ により達成される血栓崩壊と比べ、非常に限定された全身性活性化の条件下にて 達成することができる。

しかしながら、最近、プロウロキナーゼ自体が、強力なプラスミノゲン活性化因 子であることが観察された。したがって、第３の形態のＵＫは、１本鎖のウロキ ナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｓｃｕ−Ｐ　Ａ　）である。したがって、 ５ｃｕ−ＰＡ誘発血栓崩壊の間に観察される限定全身性活性化は、フィブリンに 付随した５ｃｕ−ＰＡからＨＭＷ−ＵＫへの変形により生じるものではなく、む しろフィブリン表面での５ｃｕ−ＰＡによる直接的プラスミノゲン活性化により 生じるものである。実際、プラズマ・コンペティターの存在により、５ｃｕ−Ｐ Ａは、プラズマ相中のプラスミノゲンを活性化することができない。しかしなが ら、フィブリンが存在するやいなや、抑制が相殺され、プラスミンを形成する。

組織プラスミノゲン活性化因子は、免疫学的にウロキナーゼとは異なる。それは 、タンパク分解開裂により比較的活性な２本鎖分子に変換される１本のポリペプ チド鎖（７００００ダルトン）からなる。

１重鎖ｔＰＡのＣ０ＯＨ末端から誘導されるｔＰＡの軽鎖は、活性部位を有し、 他のセリンプロテアーゼとよく類似しくペン二カら（Ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａ ｌ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０上：２１４（１９８３））；１重鎖 ｔＰＡのＮＨ２末端から誘導される重鎮は、凝固およびフィブリン溶解系におけ る他のタンパク質の構造特性に類似する構造特性を有する。例えば、重鎮は、プ ロトロンビン、プラスミノゲンおよびウロキナーゼにおいて見られる構造に類似 する「クリングル（ｋｒ　ｉｎｇ　Ｉｅ）」構造を有し、またフィブロネクチン のフィブリン結合「フィンガー」一様構造に類似する成長因子一様ドメインおよ び別のドメインを有する。

ＨＭ〜Ｖ−ＵＫとｔＰＡとを比較することで、重要な類似点が明らかになる。両 方の分子のＢ鎖は、活性部位を有し、大いに相同しており、他のセリンプロテア ーゼ活性部位によく類似している。他方、両タンパク質のＮＨ２末端は異なる。

ｔＰＡ分子は２つのクリングルドメインを有しているのに対して、ウロキナーゼ 種は１つのドメインを有しているにすぎない。加えて、ｔＰＡはウロキナーゼに はないフィブリン結合機能を有する。

発明の要約 本発明は、ｔＰＡの重Ｎ　（鎖Ａ）から誘導されたポリペプチドを、ＵＫの重鎖 （鎖Ｂ）からのポリペプチドに融合させ、キメラまたは雑種プラスミノゲン活性 化因子を得るという知見にある。このように、ｔＰＡおよびＵＫよりも優れた異 なる免疫学的または生物学的特性を有する新規なプラスミノゲン活性化因子を調 製することができる。好ましいかかる新規なプラスミノゲン活性化因子は、ｔＰ Ａのフィブリン結合機能とウロキナーゼのプロテアーゼ機能を併用している。

本発明の代表的具体例は、Ｆｇ−ｔＰ　Ａ／Ｕ　Ｋ　４１０、Ｆｇ、ｔＰＡ／Ｕ Ｋ４１０／３６６、ｔＰＰＵＫ４１０／３６６およびＵＫ−に２４１０／３６６ からなる群より選択されたプラスミノゲン活性化因子第１図は本発明の組換え型 ＤＮＡ分子を説明しており、ＵＫから誘導された配列とｔＰＡから誘導された配 列を示す。

第２図は真核生物シャトルベクターＤＳＰ　１．１　ＢＧＨの最新の表示である （プファーら（Ｐｆａｒｒ　ｅｔ　ａｌ、）、ＤＮＡ５４，４６１−４６７．１ ９８５）。

発明の詳細 な説明の組換え型ＤＮＡ分子を用いた場合、変異およびキメラプラスミノゲン活 性化因子を、真核生物細胞、または他の宿主、例えば、細菌および酵母において 産生することでき、生物学的活性を示すことが明らかにされた。天然ウロキナー ゼおよびｔＰＡ分子は、以下の第１ａ表および第１ｂ表に示すコーディング配列 およびアミノ酸配列を有する。ヤコブスら（Ｊ　ａｃｏｂｓ　ｅｔ　ａｌ、）の 配列は、１３１にてＣｙｓの代わりにＴｒｐを、３６６にてＧｌｙの代わりにＣ ｙｓを、かつ４１０にてＡｌａの代わりにＶａｔを有する点において、他の人、 例えば、グンジラーら（Ｇｕｎｚｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、ホツペ・セイラーズ ・カイトクリット・ビューア・フイジオロジシエ・ケミ−（Ｈｏｐｐｅ　５ｅｙ ｌｅｒ″ＳＺ　、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、３６３　：　１１５５　（１ ９８２）　、ノーイネカー（Ｈｅｙｎｅｋｅｒ）、欧州特許公開明細書ＥＰ−Ａ −９２１８２号およびステンフェンスら（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｘｃ ｉｔｅ）により報告されている配列と異なることに注意すべきである。

本願発明において用いる変異およびキメラプラスミノゲン活性化因子は、天然ウ ロキナーゼおよびｔＰＡ分子のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列とは異なる配列を 有する。変異またはキメラプラスミノゲン活性化因子のコーディング配列は、第 １図に示されているような天然ＵＫおよびｔＰＡのコーディング配列とは異なる ものである。

したがって、本発明の組換え型ＤＮＡ分子は、例えば、クローニングまたは発現 ベクターのようなより大きなりＮＡ分子を単離するが、または中にあるいずれか の変異またはキメラコーディング配列である。本発明の組換え型分子は、以下に 説明するように、標準合成または遺伝学処理方法または両方の組み合わせにより 調製される。

本発明の組換え型ＤＮＡ分子内にて構成されたコーディング配列は、ＵＫおよび ｔＰＡのＤＮＡ分子から誘導された１または数個のＤＮＡ配列を組み合わせるか 、またはＵＫおよびｔＰＡ分子の決められｔ；領域内において１以上のコドンの １以上の置換、付加または欠失を行なうかである。本発明の典型的な組換え型Ｄ ＮＡ分子内の変異またはキメラプラスミノゲン活性化因子、明細書中に例示され ているそれらの組立ておよび使用が、第１ａ表および第１ｂ表に示された天然Ｕ ＫおよびｔＰＡと比較して第１図において説明されている。本発明の組換え型Ｄ ＮＡ分子により真核生物にて発現しｔ；変異またはキメラブラスミノゲン活性化 因子の発現および生物学活性を、以下の第２表に示す。すべての列挙したプラス ミド発現ベクターは、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンポリアゾニレ−ジョン部 位の初期プロモーターを用いる。

プラスミドの組立ては、以下の実施例において記載する。報告されている典型的 発現および生物学活性データーは、標準方法により得た（ドラビニール・ジェイ ・シー、テヌ・ジェイ・ピー、レマイレ・ジーおよびペチットジエイ・エフ（Ｄ ｒａｐｉｅｒ　Ｊ　、Ｃ，、ＴｅｎｕＪ、Ｐ、、ＬｅｍａｉｒｅＧ、およびＰｅ ｔｉｔ　Ｊ　Ｆ）　、バイオケミ−（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｅ）、ｌ上、４６３〜 ４７１，１９７９）。第１図および第２表もまた、各ベクターの産生物に付与さ れｊ；名称を示す。

天然に生じる多形体のいずれのものも本発明を実施するための出発物質として用 いることができ、天然ＵＫおよびｔＰＡ分子のコーディング配列は、ウロキナー ゼについてはヤコブスら（１９８５）により、ｔＰＡについてはペン二カら（１ ９８３）により用いられている方法のごとき標準方法により得ることができる。

また、例えば、ｔＰＡについては、オプデンアッカーら（Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、）、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・バイオケミストリー（Ｅ ｕｒ、Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、±２１　：　２６９　（１９８２）；ニドラ ンドら（Ｅｄｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ブロシイーデインダス・オン・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）　ＵＳＡ％　８０　：　３４９　（１９８３）；ゴエッデルら（Ｇｏｅｄ ｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）　、欧州特許公開明細書第９３６１９号；レビンソンら （Ｌｅｖｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、欧州特許公開明細書第１１７０５９号、 ゴールドバーブら（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）、ＰＣＴ　Ｗ○８５−０ ３９４９　；メイハックら（Ｍｅｙｈａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、）、欧州特許公開明 細書第１４３０８１号；およびＵＫについては、ハイネッカーら（Ｈｅｙｎｅｋ ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、欧州特許公開明細書第９２１８２号；ヒラマツら（Ｈ ｉｒａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、）　、欧州特許公開明細書第１５４２７２号； コバセビックら（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、）　、英国特許第２１３３ ７９７号参照。

本願明細書に示されている組換え型ＤＮＡ分子は、例示にすぎない。ＤＮＡ断片 の選択的または付加的組合せまたは塩基対の置換およびコドンの欠失は、分子遺 伝学の分野にてよく知られた方法により行なうことができる。真核生物細胞の発 現の際のかかる組合せ、置換および欠失の効果は、例えば、へりオンら（Ｈｅｒ ｉｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）（１９８３）により開示されているように、モノクロー ナル抗体全包含する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により容易に測定す ることができる。得られたタンパク質の活性は、例えば、色素産生基質５２４４ ４　（カビ・ビトラム、ストックホルム、スウェーデン（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕ ｍＳＳｔｏｃｋｈｏｌｍ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いる直接アミドライティック活 性検定法（Ｄｉｒｅｃｔ　ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｓｓａ ｙ）のような周知のスクリーン法またはプラスミノゲンのプラスミンへの触媒変 換を、色素産生基質５２２５１（カビ・ビトラム、ストックホルム、スウェーデ ン）により検出する検定により容易に検定することができる（ドラビニールら、 １９７９）。

プラスミノゲン活性化因子分子における突然変異は、周知方法により行なうこと ができる。ある種のかかる有用な方法については、ホトスタインら（Ｂｏｔｓｔ ｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅＸ　１９８５）参照。

これらは、例えば、コーディング配列を制限エンドヌクレアーゼで処理し、つづ いて所望によりエキソヌクレアーゼ、例えば、Ｂａ１３１またはヤエナリ（ｍｕ ｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで処理することによるコドンの欠失を包含する。

かかる欠失後、合成配列を挿入し、部分的またはすべての欠失領域を置換するこ とができる。

プラスミノゲン活性化因子のコーディング配列は、一般的には、生殖細菌細胞、 例えば、イー・コリーにおいてクローを発生させる。

クローニング後、コーディング配列を、選択された宿主にて作用する調節領域に フレームにて（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合し、遺伝発現単位を調製する。かかる宿 主は、クローニングおよび発現系が利用できるいづれの微生物または細胞とする こともできる。これらは、例えば、イー・コリー、パシラス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕ ｓ）およびストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような細菌；サ ツカロミセス（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびビチア（Ｐ　１ｃｈｉａ ）のような酵母、ＣＨＯ，Ｒ１６１０、ＮＩＨ３Ｔ３およびＣＯ５細胞のような 哺乳動物細胞を包含する。

有用な調節領域は、一般に、リポソームでのＲＮＡポリメラーゼ結合および転写 開始が必要なまたは望ましい配列からなる。細菌および酵母細胞の場合、コーデ ィング配列の下流に転写ターミネータ−を有し、発現を安定化させることが、時 には有利である。

本発明の組換え型ＤＮＡ分子の発現について好ましい宿主は、噛乳動物細胞であ る。かかる細胞において、調節領域は、哺乳動物細胞発現ベクターの組立てにお いて通常用いられる領域、または同様の機能を発揮する領域とすることができる 。かがる領域は、典型的には、プロモーター領域、すなわち、ＲＮＡポリメラー ゼの結合およびＲＮＡ転写開始に作用し、組換え型プラスミノゲン活性化因子の コーディング配列の上流にある領域からなる。通常、哺乳動物細胞発現ベクター にて用いられるプロモーター、すなわち、本発明にて有用であるプロモーターは 、メタロチオネインプロモーター、特にサル、マウスおよびヒトのメタロチオネ インプロモーター；シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）初期プロモーターまた はｓＶ４０後期プロモーターのようなウィルス性プロモーター；マウス乳腺癌ウ ィルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ，ヒトＴ−細胞リンパ栄養性ウィルス（ＨＴＬＶ） Ｌ　ｎまたは■のＬＴＲまたはニワトリ肉腫ウィルスのＬＴＲのようなウィルス 性ＬＴＲを包含する。かがるプロモーターは、それらが天然にて存在する遺伝子 または細胞から誘導することができる。かかるプロモーターもまた修正し、その 配列を変えることができる。

一般的に、組換え型プラスミノゲン活性化因子のコーディング配列の下流に、ポ リアゾニレ−ジョン（ポリＡ）領域、すなわち、ＲＮＡトランスクリプトのポリ アゾニレ−ジョンに作用する領域が存する。かかるポリＡ領域は、明らかに、転 写を安定化する役割を果たす。哺乳動物細胞の発現ベクターにて通常用いられる ポリアゾニレ−ジョン領域、すなわち、本発明において有用であるポリアゾニレ −ジョン領域は、ＳＶ４０初期領域、ウシ成長ホルモンおよびヒトコラーゲンプ ロａ２　（Ｉ）のポリアゾニレ−ジョン領域を包含する。かかる領域は、それら が天然にて存在する遺伝子から誘導することができる。かかる領域はまた、ポリ アゾニレ−ジョンおよびトランスクリプト安定化機能が有意に逆に影響を及ぼさ ない条件にて修正され、その配列を変えることができる。

スプライシング部位、転写活性化因子およびエンハンサ−を含む他の調節機能部 もまた、遺伝子発現単位内に、または遺伝子発現単位からなるＤＮＡ分子内の別 の場所にて構成することができる。

異種ＤＮＡまたは宿主細胞に有意に逆の影響を及ぼすことなく、異種ＤＮＡを宿 主細胞に導入させるいずれかの方法により、哺乳動物細胞を組換え型プラスミノ ゲン活性化因子遺伝子発現単位でトランスフェクションに付す。かかる方法は、 リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ ｏｎ）　、原形質融合、微量注入およびウィルス性トランスフェクションを包含 する。

本発明のプラスミノゲン活性化因子遺伝子発現単位は、トランスフェクションの 前に、より大きなりＮＡ分子を組み入れることが好ましい。かかる大きなりＮＡ 分子は、組換え型プラスミノゲン活性化因子機能部に加えて、少なくとも遺伝選 択マーカーからなることが好ましい。該選択マーカーは、トランスフェクション に付された宿主細胞において、容易に検出可能な表現型変化を発現するいずれか の遺伝子または遺伝子類とすることができる。かかる表現型変化は、例えば、ウ シ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクターを用いた場合に起こりうるフォーカス形成 ：ネオマイシン、Ｇ４１８またはヒグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）　Ｂ 耐性に対する遺伝子のような薬剤耐性；またはキサンチン・グアニン・ホスホリ ボシル・トランスフェラーゼ（ｘｇｐｒｔ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）および ガラクトキナーゼ（ｇａｌＫ）のような他の選択可能なマーカーである。増幅機 能を付与する選択マーカーを用い、マーカーおよび遺伝子発現単位のトランスフ ェクション効率を増加させるか、または細胞内複製を強化するかのいずれかによ り、コピー数を増加させることができる。

遺伝子コピー数を増幅させるのにも役立つマーカーは、ジヒドロホレート・レダ クターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）　（メトトレキ セート耐性）　、ＣＡＤ　（Ｎ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパルテート耐性） ８よびアデノシンデアミナーゼ（２−デオキシフルホマイシン耐性）の遺伝子を 包含する。

組換え型プラスミノゲン活性化因子の遺伝子発現単位からなる大きなりＮＡ分子 は、哺乳動物細胞トランスフェクシントにおけるエビソマールメインテナンス能 を有し、または有していなくてもよいプラスミドとすることができる。安定した エビソマールメインテナンス能を有するかかるプラスミドは、ｔＰＡ遺伝子□発 現単位に加えて、メインテナンス機能部、すなわち、ＨＡＫ細胞にてＤＮＡに有 糸***染色体複製に独立して複製させる領域からなる。かかるメインテナンス機 能部は、典を的には、例えば、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）、シミアンウィル ス４０（ＳＶ４０）、ＢＫウィルス（ＢＫＶ）、アデノウィルス、エプスタイン ・バー・ウィルス（Ｅ　Ｂ　Ｖ）、ポリオーマウィルスおよび単純性庖疹ウィル ス（ＨＳ　Ｖ）のような動物ウィルスを包含するウィルス性起源にある。かかる メインテナンス機能部は容易に調製され、哺乳動物細胞の安定したエビソマール メインテナンスにて試験することができる。プラスミド、かくして、組換え型プ ラスミノゲン活性化因子遺伝子のコピー数は、一般的には１〜１０００の範囲に ある。

組換えをプラスミノゲン活性化因子の遺伝子発現単位を組み入れることのできる プラスミドは、多くの出所源から入手可能であり、または組換えｆｆ１ＤＮＡ法 による哺乳動物宿主における遺伝子発現の分野においてよく知られた方法により 組み立てることができる。該出所源の中、公共供託所として、メリーランド、ロ ックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ９ンを包含し、そのカタ ログにはいくつかの有用なプラスミドが含まれる。

遺伝子発現単位は、前記の増幅可能機能遺伝子のような他のＤＮＡ！能部と共に 、共トランスフェクションに付すことができる。かかる他のＤＮＡ機能部を、直 接または間接的に組換え型プラスミノゲン活性化因子遺伝子発現単位にリンクさ せ、または、すなわち、異なる分子上にてリンクさせないこともできる。例えば 、Ａｘｅ＋、米国特許第４３９９２１６号参照。

トランスフェクション後、遺伝子発現単位を有する細胞を、回収可能な量の組換 え型プラスミノゲン活性化因子を産生ずるような条件下、栄養培地にて培養する 。標準的な哺乳動物細胞培養培地を用いることができる。細胞培養は、大気圧、 ３０〜４５°Ｃ１好ましくは３５〜４２°Ｃ１最も好ましくは３７°Ｃにて保存 する。

標準プロトコルは、カルシウム沈澱法による組換え型プラスミノゲン活性化因子 の遺伝子発現単位からなるプラスミドＤＮＡでのトランスフェクション、約４〜 ６時間インキュベートした後、グリセロールショック処理を包含する。形質転換 は、一般的には、約１〜２０コピー数までのｔＰＡ遺伝子発現単位を有する宿主 細胞をもたらす。増幅法を用い、そのコピー数を約１０００まで増加させること ができる。形質転換の約２４時間後、細胞を選択培地に置き、約２〜３週間培養 する。生存コロニーを２４ウエル・マイクロタイタブレートに置き、交会するま で、すなわち、１／２〜１週間インキュベートする。ついで、該ウェルを組換え 型プラスミノゲン活性化因子産生について検定する。ついで、高産生コロニーを 、各約１週間、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５’７ラスコ、ローラーボトル、最後に産 生ユニットにて連続的にインキュベートすることにより膨張させる。産生ユニッ トにおいて、調整培地は、プラスミノゲン活性化因子を連続的に、または周期的 に採収することができるように、循環させ、まＩ；は周期的に取り出し、取り替 えることができる。産生ユニットは、粘着細胞用にデザインされたいずれかの培 養系、ファイバー、マイクロキャリアー、マイクロカプセルおよび細胞ファクト リ−を用いる細胞培養ユニットであることが好ましい。

細胞培養後、組換え塁プラスミノゲン活性化因子を、標準タンパク単離法により 調整培地から単離する。これらは、一般に、例えば、イオン交換、逆相およびア フィニティークロマトグラフィー操作を含む一連のクロマトグラフィー操作を包 含する。精製後、プラスミノゲン活性化因子を、非毒性、すなわち、有意に不利 な副作用がなく、かつ動物、特にヒトに投与した後、血栓崩壊を引き起こすに有 効な量のプラスミノゲン活性化因子からなる各投与単位のごとき医薬組成物に処 方する。一般に、心筋梗塞の治療用のかかる医薬組成物は、静脈内注射または注 入に適する形態であり、医薬上許容される希釈剤または担体中、プラスミノゲン 活性化因子０．１〜ｌｏｍｇ／艷からなる。急性の心筋梗塞を患っている大人に 対する典型的な始原は、プラスミノゲン活性化因子８０〜１５０ｍｇを１．２５ 〜６時間にわたって静脈内に注入することからなる。適当な希釈剤および担体は 、医薬組成物の調製方法として、製薬化学者によく知られている。

実施例 以下の実施例は例示であり、本発明を限定するもので１まなし）。すべての酵素 は商業的に入手することができ、実質的に供給者の指示にしたがって用いた。Ｄ ＮＡアダプターはＤＮＡ合成２こより調製し、それを、以下の第３表において示 す。

■ ぢ舌上　云■ｆ、呆ｇ 実施例１　ｐＵＬＢ　９１２２ ウロキナーゼ遺伝子を、ヤコブスら（１９８５）に記載されたｃＤＮＡクローン ｐＵＬＢ　１０００から単離した。

該遺伝子は、シグナル配列におけるａａ−１６から停止コドンまでのＵＫ−ｃＤ ＮＡ分子、ポリＣ拡張および１２４ｂｐのｐＢＲ３２２配列を含むＢｇｌ　Ｉ− Ｂｇ、］　Ｉ　（１４４０ｂｐ）断片上にて得た。この断片を７４　ＤＮＡポリ メラーゼ（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）（１９８２）　 ）で処理し、その５′末端上、２１ｂｐＨｉｎｄｌｆｆ−Ｂｇｌ　Ｉ　（平滑末 端部位）二重鎖合成りＮＡアダプター（第３表、アダプター１）に結紮し、ＡＴ Ｇ開始コドンおよびａａ−１６までのウロキナーゼシグナルペプチドに対応する 配列を再組立を行なった。

ついで、プレグロウロキナーゼ（ｐｒｅｐｒｏｕｒｏｋ　１ｎａｓｅ）であるｐ ｐＵＫのコード化した再組立て分子を、中間イー・コリー・プラスミド、ｐＵＬ Ｂ１２２１　（ヤコブスら（１９８４））に結紮しくマニアティスら（１９８２ ））、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌｌ？切断した。得られた組換え型プラスミド をさらに、第１に、エフセブンタリー（ｅｘｃｅｄｅｎｔａｒｙ）　３　’　ｐ 　Ｂ　Ｒ３２２配列を除去し、第２にｐＵＬＢ　１０００またはＩ）ＵＬＢ１１ ３５（ヤコブスら（１９８５））に存するＶａ１４１０についてのコドンを、ア ラニンを特定するコドンで置換する操作を行なった。この置換は、グンツラーら （Ｇｕｎｚｌｅｒｅｔ　ａｌ、）　（１９８２）　、ステラフェンスら（Ｓ　ｔ ｅｆｆｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｘ　ｌ　９８２）およびハイネカーら（Ｈｅｙｎｅ ｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、欧州特許公開明細書第９２１８’２号に報告されてい るアミノ酸配列が、４１０位にてアラニンを有するという事実を考慮して行なっ たものである。

この操作は、ａａ３９８から停止コドンまでのウロキナーゼコーディング配列お よびｐＢＲ３２２配列を含む２１１ｂｐＢａｍＨＩ−３ａｃＩ断片を、プラスミ ドから排除することにより行なった。

この断片を、５ａｃＩ部位のすぐ上流にあるアミノ酸３９８から停止コドンまで をコード化する４８ｂｐＢａｍＨＩ−３ａｃ　に重鎖合成りＮＡアダプター（第 ３表、アダプター２）により置換した。

この組立体から誘導する組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１１７を形質転換によ りイー・コリーのコンピテント細胞（マニアティスラ（１９８２））に導入した 。組換え型プラスミドを増幅させるため、１つの形質転換体をアンピシリンに富 んだ培地にて成長させｔ；。ｐｐＵＫ４１０のコード化１３０９ｂｐＨｉｎｄＩ ［［−５ａｃｌカセツト（第１図、ｐｐＵＫ４１０）を、適当な酵素での消化に よりプラスミドｐＵＬＢ９１１７から切除し、結紮により、真核生物シャトルベ クター、ＤＳＰ　１．１　ＢＧＨ（ブファーら、ＤＮＡ、４．４６１〜４６７． １９８５）に挿入した。第２図参照。

得られた雑種プラスミド、ｐＵＬＢ９１２２をイー・コリーのコンピテント細胞 に導入し、増幅させた。ついで、それを用い、真核生物Ｒ１６１０ハムスターお よびＣｏ５Ｉ細胞をトランスフェクションに付した。争件は以下のとおりであっ た：Ｃ５ＣＱグラジェント遠心により２回精製した純粋なｐＵＬＢ９１２２プラ スミドＤＮＡ２０μｇを、ウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　（１ ９７９）およびプファーら（１９８５）に記載されているリン酸カルシウム共沈 澱操作を介し、５％子ウシ胎児血清を補足したダルベツコ修正最小必須培地（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ 　ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中、約２Ｘ１０’細胞を有するＦ　８０　ｃ　ｍ 　２皿に加えた。４時間インキュベートした後、細胞をＤＭＥＭ中、１０％グリ セロールで４分間ショックを与えＩ；。３〜５日後、細胞上澄みを回収し、ｐＵ ＬＢ９１２２によりフード化された産生物の産生レベルおよび生物学的活性を検 定した。これは、ウロキナーゼに拮抗して増加したモノクローナル抗体（ＡＡＵ ２およびＡＡＵ６）を用い、ＥＬＩＳＡ法により培地中のｐｐＵＫ４１０の量を 測定すること（へりオンら（Ｈｅｒｉｏｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｘ　１９８３　）　） および色素産生基質（Ｓ２２５１）を用い、培地中のｐｐＵＫ４１０によるプラ スミノゲンの活性化強度を測定すること（ドラビニルら（Ｄｒａｐｉｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、）により行なった。データーを第２表に示す。

つづいて、ｐｐＵＫ４１０のコード化ＤＮＡ配列および非翻訳ＳＶ４０プロモー ターおよびＢＧＨポリＡを、５ａｌＩ発現カセットとして、ＢＰＶから誘導され た別の真核生物ベクターに導入した。

このＢＰＶ誘導の安定した発現ベクターはユニーク５ａｌＩ一部位およびイー・ コリーのシャトルに対する配列とは別のマウスｃＤＮＡ　ＤＨＦＲを有する。組 換え型プラスミド（ミニＢＰＶ　ＤＨＦＲ−ｐｐＵＫ４１０）を用い、前記のリ ン酸カルシウム共沈澱法によりＨＡＫ細胞を形質転換に付した。１１〜１４日後 、高濃度（２００〜４００ｎＭ）のメトトレキセートを含有する培地中、これら のトランスフェクションに付した細胞の直接選択により、個々のコロニーを得た 。つづいて、これらのコロニーをクローニングシリンダーにより１６〜１８日に おいて単離し、さらに増殖させ、拡張し、直接３２４４４検定によりＵＫ−活性 についてスクリーンに付し、関連するＵＫ−抗厘の存在を、前記のＥＬＩＳＡ法 によりモニターしｔこ。

実施例２　ｐＵＬＢ９１２０ ＨｅＬａ細胞からｍＲＮＡの逆転写により調製されたｃＤＮＡコーディング配列 （シ、ｏイニングら（Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、）、１９ブリノリシ ス）を、ＳＶ４０初期タ初期タンパクモプロモーターＨポリアゾニレ−ジョン部 位の間のＤＳＰｌ、ＩＢＧＨにフレームにて挿入しくポイチックら（Ｗｏｙｃｈ ｉｋ　ｅｔ　ａｌ、）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、）、８１：３ ９４４　（１９８４））；グツドウィンら（Ｇｏｏｄｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、 欧州特許公開明細書第１７３５５２号）、ｔＰＡ遺伝子発現単位を調製した。該 ｔＰＡ遺伝子発現単位を、プラスミド、ＤＳＰｌ、１ＴＰＡ２５ＢＧＨにおける ５ａｌＩ制限工ンドヌクレアーゼ切断部位の両末端にて結合した。

４０９　ｂ　ｐＤＮＡ断片は、酵素Ｈ４ｎｄｌ［［およびＲｓａＩで消化するこ とによりｔＰＡクローンから誘導した。この断片は、ＡＴＧ開始トリプレットに 対応する配列、シグナル配列、いわゆるフィンガーモジュール（ｆｉｎｇｅｒ　 ｍｏｄｕｌｅ）およびいわゆるｔＰＡ分子のＥＧＦモジュール（ａ　ａ　６７ま で）部を含む（ペン二カら、１９８３）。

他方、１２１９ｂｐＤＮＡ断片を、酵素Ｂａ１Ｉおよび５ａｉｌで消化すること により、ウロキナーゼｃＤＮＡ、クローンｐＵＬＢ１１３５（ヤコブスら、１９ ８５）から誘導しＩ；。この断片は、ウロキナーゼのタンパク質分解部における ａａ１４９から停止コドンまでのｃＤＮＡ分子を含み、３’ｐＢＲ３２２配列を 有する。

Ｒｓａ　ＩおよびＢａ１Ｉ末端を有し、ｔＰＡのアミノ酸６７およびプロウロキ ナーゼの１３６〜１４９をコード化する４３ｂｐ二重鎖合成りＮＡアダプター（ 第３表、アダプター３）を、その分野においてよく知られた化学合成法により調 製した。ついで、前記３つの断片を一緒に、予めＨ４ｎｄＩ［Ｉおよび５ａｉｌ で切断したイー・コリー中間ベクター（ｐＵＬＢｌ　２２１、ヤコブスら、１９ ８４）ＤＮＡに結紮した。コンピテントイー・コリーＭＭ２９４細胞に導入し、 増幅させ、得られた組換え型プラスミドを、さらに、外来性３’ｐＢＲ３２２配 列を除去する操作を行なった。これは実施例１における記載のように行なった。

最終組換え型分子、ｐＵＬＢ９１１５を用い、イー・コリーのコンピテント細胞 を形質転換し、増幅した。Ｆｇ、ｔ　ＰＡ／ＵＫ４１０のコード化１２４７ｂｐ Ｈｉｎｄｍ−５ａｃｌカセット（第１図）を、適当な酵素で消化することにより プラスミドｐＵＬＢ９１１５から切除し、結紮により真核生物シャトルベクター 、ＤＳＰ　１．１ＢＧＨに挿入した（ブファーら、１９８５）。得られた組換え 型プラスミド、ｐＵＬＢ９１２０を増幅し、ついでそれを用いて、実施例１に示 すように真核生物Ｒ１６１０ハムスター細胞をトランスフェクションに付した。

Ｆｇ、ｔＰＡ／ＵＫ４１０の産生検定および生物学活性の測定のようなさらなる 操作を、実施例１のように行なった。データーを第２表に示す。

ついで、Ｆｇ、ｔ　ＰＡ／ＵＫ４１０雑種分子を発現する不変細胞ラインを得る ため、Ｆｇ、ｔ　ＰＡ／ＵＫ４１０のコード化ＤＮＡ配列の他の真核生物発現ベ クターＢＰＶへの挿入を、実施例１のように行なった。しかしながら、用いるＢ ＰＶ−ベクターの型に依存するため、今回はＧ４１８抵抗性コロニー（４００μ ｇ　／　ｍｕ、ゲネチシン・ギブコ（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ　Ｇ　１ｂｃｏ）を選 択した。ついで、単離、増殖、生物学活性についての拡張およびスクリーニング 、およびＵＫ−抗原関連発現を実施例１のように行なった。トランスフェクショ ンを行なった細胞とこの組換え型プラスミドとの成長培地における産生および生 物学活性の試験を、実施例１のように行なった。データーを第２表に示す。

実施例３　ｐＵＬＢ９１２９ この組立体は、ナチュラル活性部位（Ａｒｇ１５６、Ｐｈｅ１５７、Ｌｙｓ１５ ８）における分子のタンパク質分解活性化を抑制するため、この部位を変形（Ｔ ｈｒ１５６、Ｐｈｅ１５７、Ｔｈｒ１５８）するように修正したプレプロウロキ ナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミドである。

プラスミドｐＵＬＢ９１１７から出発しく実施例１参照）、適当な酵素で消化し た後、３１７５ｂｐＢａｌＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を回収した。この断片はそ の３′末端に、ＡＴＧ開始シグナル、プレプロウロキナーゼのａａ１９からａａ １４９のコード化配列を、その５′末端に、ａａ３９８ないし停止シグナルのコ ード化配列を有し、これらの２つの領域はグラスミドに存するｐＵＬＢ１２２１ 配列により分けられている。他方、２９２ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｘｈ。

ＩｔＤＮＡ断片をｐＵＬＢ９１１７から誘導する：それはプレプロウロキナーゼ のａａ１６３からａａ２６０までをコード化する。該組立体に要する第３の断片 をまた、ｐＵＬＢ９１１７から調製する：それはプレプロウロキナーゼ分子のａ ａ２６０〜ａａ３９８’ｒコード化する４　１４ｂｐＸｈｏｌ［−ＢａｍＨ１断 片である。

最後に、前記２つのアミノ酸置換を含むａａ　１４９ないしａａ１６３をコード 化する二重鎖４１　ｂｐＢａ　ｌ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ合成りＮＡアダプター（第３ 表、アダプター４）を、周知化学合成法により調製した。ついで、前記の４つの 断片を一緒に結紮し、得られた組換え型プラスミド、ｐＵＬ８９１２８を、コン ピテントＭＭ２９４イー・コリー細胞に導入した。１つの形質転換体の増幅およ びプラスミドｐＵＬＢ９１２８の精製を行なった後、産生物５ｃｕｐａｎｃ　４ １０のコード化Ｈｉｎｄ■−５ａｃＩカセット（第１図）を、適当な酵素での消 化による１３０９ｂｐ断片として回収し、結紮により真核生物シャトルベクター ＤＳＰＩＩＢＧＨに導入した（ブフア−ら、ｌ　９８５）。得られた組換えをプ ラスミド、ｐＵＬＢ９１２９を用い、イー・コリーコンピテント細胞を形質転換 し、増幅した。

ついで、それを実施例１および２のように、Ｒ１６１０およびＣｏ５Ｉに導入し た。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノゲン活性化能を実施例１および２に おける記載のように試験した。

実施例４　ｐＵＬＢ９１３４ この組立体は、ｐＵＬＢｌｏｏＯまたはｐＵＬＢｌ　ｌ　３５にて存ｔ６Ｃｙｓ ３６６についてのコドンを、グリシン特定コドンにより置換できるように修正し たプレプロウロキナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミドである 。この置換は、グンッラーら（１９８２）およびステラフェンスら（１９８２） において報告されているＵＫアミノ酸配列が、３６６位にてグリシンを有すると いうことを考慮してなされたものである。

ｐＵＬＢ９１１７から出発しく実施例１参照）、２６６１ｂｐＨｉｎｄＩ［［− ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を、適当な酵素での消化により産生した。この断片は、５ ′ないし３′にて、ウロキナーゼＤＮＡのａａ３９８ないし停止コドンの配列お よびｐＵＬＢｌ２２１から誘導される配列を有する。他方、ＡＴＧ開始シグナル のコード化１１４０ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｖａｌ［ＤＮＡ断片、シグナルペプ チドおよびウロキナーゼ分子のａａｌないしａａ３５８もまた、ｐＵＬ、Ｂ９１ １７から切除しＩ；（実施例１）。この組立体に要する第３のナチュラルＤＮＡ 断片は、酵素Ｆｎｕ４Ｈ１およびＢａｍＨｌでのｐＵＬＢ９１１７の消化により 調製した。それは、ウロキナーゼのａａ３６７ないしａａ３９８のコード化９５ ｂｐ長のストレッチＤＮＡである。最後に、前記の単一アミノ酸置換を含むａａ ３５８ないしａａ３６６のコード化二重鎖２６ｂｐ長のＡｖａｌｌ−Ｆｎｕ４Ｈ １合成りＮＡ断片を、その分野においてよく知られた方法により化学的に合成し た（第３表、アダプター５）。

ついで、前記４つの断片を一緒に結紮し、得られた組換え型グラスミド、ｐＵＬ Ｂ９１１９を増幅させるべきコンピテントＭＭ２９４イー・コリー細胞に導入し た。ｐＵＬＢ９１１９の精製後、ｐｐＵＫ４１０／３６６のコード化Ｈｉｎｄｎ ｌ−５ａｃＩカセット（第１図）を１３０９ｂｐ断片として回収し、結紮により 真核生物シャトルベクターＤＳＰ１．１ＢＧＨに導入した（プファーら、１９８ ５）。該組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１３４を用い、イー・コリーコンピテ ント細胞を形質転換し、増幅させた。

最後に、プラスミドｐＵＬＢ９１３４を、実施例１および２のようにＲ１６１０ およびＣｏ５Ｉ細胞において導入した。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノ ゲン活性化能を、実施例１および２における記載のように試験した。

実施例５　ｐＵＬＢ９１３５ 組換え型プラスミド、ｐｕＬＢ９１３５は、システィン３６６についてのコドン がグリシンについてのコドンで置換されている以外、ｐＵＬＢ９１２９　（実施 例３）と同じである。組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１３５を組立てるために 用いた操作は、実施例４に記載の操作と同じである。この組立てられた組換え型 ＤＮＡは、そのナチュラル活性化部位（ｓｃｕｐａ　ｎｃ４１０／　３６６）に てプレプロウロキナーゼを開裂できないようにコード化し、前記実施例における 記載のように、中間イー・コリープラスミド（ｐＵＬＢ９１３１）　ｔｒ：増幅 させる（第１図）。

ついで、１３０９ｂｐＨｉｎｄＤＩ−５ａｃＩカセツトをｐＵＬＢ９１３１から 切除し、ＤＳＰ　１．１　ＢＧＨに導入した（プ７アーら、１９８５）。ついで 、組換え型プラスミドｐＵＬＢ９１３５をイー・コリーにおいて導入し、増幅さ せた。

最後に、それを用い、実施例１および２のようにＲ１６１０およびＣｏ５Ｉ細胞 をトランスフェクションに付した（第２表）。分泌産物の発現レベルおよびプラ スミノゲン活性化能を実施例１および２に記載のように試験した。つづいて、５ ｃｕｐａ　ｎｃ４１０／　３６６を発現する不変細胞ラインを得るため、５ｃｕ ｐａ　ｎｃ４１０／　３６６のコード化ＤＮＡ配列の他の真核発現ベクターＢＰ Ｖへの導入を、実施例１のように行なった。その後、選択、コロニーの単離、増 殖、生物学活性の拡張およびスクリーニングおよびＵＫ−抗体関連発現を実施例 １のように行なった。

実施例６　ｐＵＬＢ９１２４ 組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１２４は、以前にグンツラーら（１９８２）お よびステラフェンら（１９Ｂ２）により公表されているアミノ酸配列に従う配列 を有するように、プレプロウロキナーゼのａａ３６６に対応するコドンを、グリ シンについてのコドンで置換する以外、ｐＵＬＢ９１２０　（実施例２参照）と 同じである。

このプラスミドを組み立てる操作は、ｔＰＡのＡＴＧ開始コドンからａａ６７ま で、およびプレプロウロキナーゼのａａ１３６ないし１４９の領域をコード化す るｐＵＬＢ９１１５　（実施例２参照）から精製された４５２ｂｐＨｉｎｄｎ［ −Ｂａｌ　Ｉ断片とＤＳＰ　１．１ＢＧＨのラージＨｉｎｄＩＩ［−５ａｃＩ断 片を含むｐＵＬＢ９１３４（実施例４参照）からの６９７５ｂｐＨｉｎｄＩＩ［ −Ｂａ　ｌ　Ｉ断片とを一緒に結紮することであり、本発明のすべてのＨｉｎｄ Ｉ［ｌ−３ａｃＩカセツトを、プレプロウロキナーゼのａａ１４９ないし停止コ ドンのコーディング配列を発現するように挿入する。

ついで、プラスミドｐＵＬＢ９１２４を実施例１および２のようにＲ１６１０細 胞に導入した。分泌産物、Ｆｇ、ｔ　ＰＡ／ＵＫ４１０／３６６の発現レベルお よびプラスミノゲン活性化能を、実施例１および２に記載されているように試験 した（第１図、第２表）。

実施例７　ｐＵＬＢ９１２５ この組合体は、ｔＰＡのＮＨ２一部（シグナル配列およびａａｌないしａａ３１ ３）とウロキナーゼのＣ０ＯＨ部（ａａ１９５ないし停止シグナル）からできて いる雑種分子のコード化組換え型プラスミドである。それは、以下の６つの断片 の結紮により得られるニープラスミドベクターＤＳＰ　１．１ＢＧＨから誘導さ れた６１８０ｂｐＨ４ｎｄＩ［ｌ−３ａｃＩＤＮＡ断片。真核生物細胞の組換え 型ＤＮＡを発現するすべての必要な配列を有する。

−ＤＳＰ　１．１．ＴＰＡ２５ＢＧＨから切除される８２２ｂｐＨｉｎｄＩＩ［ −ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片。開始シグナル、シグナルペプチドオ、１１．びｔＰＡ 分子のａａｌないしａａ２０４のコード化配列を有する。

−ＤＳＰ１．１．ＴＰＡ２５ＢＧＨから精製され、ｔＰＡ分子のａａ２０５−ａ ａ３１３をコード化する３２６ｂｐＥｃｏＲＩ−ＡｌｕＩＤＮＡ断片。

−その５′末端が平滑末端で、その３′サイドにてＢｃｌＩ結合性末端を有する ウロキナーゼのａａ１９５〜ａａ　ｌ　９９のコード化１２ｂｐ二重鎖合成りＮ Ａアダプター。

−ｐＵＬＢ９１１７　（実施例１参照）から精製され、プレプロウロキナーゼ分 子のａ　ａ４９９〜ａａ２８２をコード化する２４８ｂｐＢｃ　］　Ｉ−Ｔａｇ ｌＤＮＡ断片。

−ｐＵＬＢ９１１７　Ｃ実施例１参照）から誘導され、プレプロウロキナーゼの ａａ２８２〜停止コドンをコード化する３９７ＭＴａｇｌ−５ａｃＩＤＮＡ断片 。

特にこの実施例において、ｔ　ＰＫＵＫ４１０　（第１図）と称される新規分子 のコーディングカセットは、発現ベクターＤＳＰ１．ＩＢＧＨのユニークＨｉ　 ｎｄＩ［［とＳａｃ　Ｉ部位の間の１８０５ｂｐ断片からなる（プファーら、１ ９８５）。ついで、組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１２５をコンピテントイー ・コリーＭＭ２９４細胞に導入し、増幅させた。

ついで、該プラスミドｐＵＬＢ９１２５を、実施例１および２のようにＲ１６１ ０およびＣｏ５１細胞に導入した。分泌産物の発現レベルおよびプラスミノゲン 活性化能を実施例１および２における記載のように試験した（第２表）。

実施例８　ｐＵＬＢ９１３７ ここに記載されている組立体は、ｔＰＡのクリングル２に対応するアミノ酸配列 がプレプロウロキナーゼのクリングルドメインとプロテアーゼ部の間に挿入され ている雑種分子のコード化組換え型プラスミドからなる。下文に概説されている 構成体は、いくつかのＤＮＡ断片を中間イー・コリープラスミドベクターにサブ クローニングすることにより得られる。実際には、該構成体を得るに必須の中間 ベクターではないが、ｐＪＲＤ１５ｇ（ダビソンら（Ｄａｖｉｓｏｎｅｔ　ａｌ 、）、１９８４）およびｐＪＲＤ１８４（ホイステルスプロイテら（Ｈｅｕｓｔ ｅｒｓｐｒｅｕｔｅ　ｅｔ　ａｔ、）、１９８５）を用いた。第１に、プレプロ ウロキナーゼのａａ６６〜ａａ１２１をコード化する１６４ｂｐＮｃｏ　Ｉ−Ｆ ｎｕ４ＨＩＤＮＡ断片を、ｐＵＬＢ９１１９　（実施例４）から切除し、二重鎖 ４０ｂｐＦｎｕ４Ｈ１−Ｓａ　Ｉ　Ｉ合成りＮＡ断片（第３表、アダプター７） をその分野においてよく知られた方法により調製した。アダプター７は、連続的 に、ウロキナーゼのａａ１２１−ａａ１３０およびｔＰＡのａａ１７３−ａａ１ ７５をコード化し、この配列は５ａｌＩ部位の直後にある。ついで、前記の２つ の断片を、イー・コリーのクローニングベクターｐＪＲＤＩ　８４から誘導され た２９１６ｂｐＳａｌ　Ｉ−ＮｃｏｌＤＮＡストレッチに結紮する（ホイステル スプロイテら、１９８５）。得られた中間組換え型プラスミド、ｐ’ＢＡｌを、 コンピテントＭＭ２９４イー・コリー細胞に導入し、増幅させた。第２に、ＤＳ Ｐｌ、ｌ。

ＴＰＡ２５ＢＧＨから誘導しくジュロイニングら（Ｓ　ｃｈｌｅｕｎｉｎｇ　ｅ ｔａｌ、）、１９８２年、７月２２−２３日、スイス、ローザンヌ、第６回国際 会議フィブリツリシス）、ｔＰＡ分子のａａ１６９〜ａａ２５５のコード化２５ ８ｂｐＰｓ　ｔ　１−Ｒｓａ　ｌＤＮＡ断片を消化により回収した。加えて、二 重鎖５５ｂｐＲｓａＩ−ＢａｌＩ合成りＮＡ断片（第３表、アダプター８）を調 製した。アダプター８は、連続的に、ｔＰＡのａａ２５５〜ａａ２６２、および ウロキナーゼのａａ１３９〜ａａ１４９をコード化する。２つの断片を、イー・ コリークローニングベクターｐＪＲＤ１５８から誘導された３４３６ｂｐＢａ　 Ｉ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　ｌＤＮＡストレッチに結紮した（ダビソンら、１９８４）。

ついで、得られた中間組換え型プラスミド、ｐＢＡ２を、コンピテントＭＭ２９ ４イー・コリー細胞に導入し、増幅させた。最後に、ウロキナーゼのａａ６６〜 ａａ１３０およびｔＰＡのａａ１７３−ａａ１７４のコード化１９８ｂｐＮｃｏ Ｉ−ＤｄｅＩＤＮＡ断片を、ｐＢＡｌから誘導しｔ；。加えて、ｔＰＡのａａ１ ７４〜ａａ２５５およびウロキナーゼのａａ１３９〜ａａ１４９のコード化２９ ７ｂｐＤｄｅ　１−Ｂａ　ｌ　ｌＤＮＡ断片をｐＢＡ２から切除した。これら２ つの断片を、ｐＵＬＢ９１１９　（実施例４）から誘導した３６７３ｂｐＮｃｏ 　ＩＢａ　Ｉ　ｌＤＮＡ断片に結紮しＩ；。ＤＮＡのこの最後の断片は、その３ ″において、ＡＴＧ開始シグナル、シグナルペプチドおよびプレプロウロキナー ゼのａａｌ−ａａ６６の配列を有する。その５′において、プレプロウロキナー ゼのａａ１４９ないし停止シグナルをコード化する。これら２つの３′および５ ′領域を分ける配列は、ｐＵＬＢ１２２１から生じる。

前記断片の結紮から得られた中間組換え型プラスミド（ｐＵＬＢ９１３６）を、 イー・コリーＭＭ２９４コンピテント細胞に導入し、増幅させた。ついで、それ を用い、適当な酵素で消化を行ない、ＵＫ−に２　４１０／３６６と称する産生 物に対応する１５５５ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−３ａｃＩコーデイングカセツト（第 １図）を誘導した。

このカセットを結紮によりシャトル真核生物発現ベクター、ＤＳＰｌ、１　ＢＧ Ｈ（プ７アーら、１９８５）に導入し、真核生物細胞をトランスフェクションに 用いる前に、得られ！二組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１３７を増幅した。

ついで、該プラスミドｐＵＬＢ９１３７を、実施例１および２のようにＲ１６１ ０およびＣｏ５Ｉ細胞にて挿入した。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノ ゲン活性化能を、実施例１および２における記載のように試験した。

実施例９　ｐＵＬＢ９１５１ この組立体は、雑種プラスミノゲンのコード化組換え型プラスミド、すなわち、 ウロキナーゼのＣ０ＯＨ末端部に結合したａａ２６２までのｔＰＡのＮＨ２末端 セグメント、該分子のａａ１３９から最終ａａからなる活性化因子である。それ は、プラスミドにて組み立てられたｔＰＡおよびウロキナーゼの相対的な大きさ により、ｐＵＬＢ９１２５（実施例７）とは異なる。

該組立体は、３つのＤＮＡ断片を含む。第１の２０６ｂｐＥｃ。

Ｒ１−Ｂａ１ＩＤＮＡ断片は、ｐＵＬＢ９１３６（実施例８）から切除し；それ はｔＰＡのクリングル２およびウロキナーゼのプロテアーゼ部を接合する配列を 提供する。第２のＡＴＧシグナル、シグナル配列およびｔＰＡのａａｌ−ａａ２ ０４．のコード化８２２ｂｐＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片は、プラス ミドＤＳＰ１．１．ＴＰＡ２５ＢＧＨのＤＮＡを適当な酵素で消化することによ り得た。

最後の断片は、６９７５ｂｐＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａ　１１ストレツチとして、ｐ ＵＬＢ９１３４　（実施例４）の消化により得た。この断片は、ウロキナーゼの ａａ１４９から停止シグナルまでのコーディング配列およびそのユニークＨｉｎ ｄＩ１１部位からそのユニーク５ａｃＩ部位における真核生物ベクターＤＳＰ　 １．ＩＢＧＨの配列を有する。

前記３つの断片を結紮し、１８２３ｂｐＨｉｎｄＩＩ［−３ａｃ　Ｉコーディン グカセットとして、ｔ　ＰＰＵＫ４１０／３６６　（第１図）と称される産生物 についての遺伝情報を有する組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１５１を得ｊ；。

プラスミドｐＵＬＢ９１５１は、真核生物Ｒ１６１０ハムスター細胞をトランス フェクションするのに使用する前に、イー・コリーのＭＭ２９４＝ンピテント細 胞に導入し、増幅させた。

ついで、プラスミドｐＵＬＢ９１５１を実施例１および２のようにＲ１６１０お よびＣｏ５１細胞にて導入した。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノゲン 活性化能を、実施例１および２における記載のように試験した（第２表）。

実施例１０　ｐＵＬＢ９１３９ 下車に記載の組換え型分子は、二重変異体プラスミノゲン活性化因子であり；そ れはアミノ酸置換およびいくつかのアミノ酸欠失の効果を併用している。組換え 型プラスミドは、以下の修正を伴うプレプロウロキナーゼのコーディング配列を 有する：ａ）アミノ酸Ｔｒｐ１３１をシスティン残基により置換する。これは、 グンツラーら（１９８２）およびステラフェンら（１９８２）により記載されて いるウロキナーゼ分子が、１３１位にてシスティンを有する点を考慮してなされ たものである。

ｂ）残基１３２から残基１４７に広がるアミノ酸配列を該分子から欠失させ、ｔ ＰＡ分子における場合のようにジペプチド５ｅｔ−Ｔｈｒにより置換しｔ；。

該組立ては、３つのＤＮＡ断片の結紮を包含する。第１のＤＮＡ断片は、３６７ ３ｂｐＢａｌｌ−ＮｃｏＩＤＮＡ断片として、ｐｕＬＢ９１１９（実施例４）か ら切除した。それは、その３″末端にて、ＡＴＧ開始シグナル、シグナル配列お よびプレプロウロキナーゼのａａｌ−ａａ６６のコドンからなる。プレプロウロ キナーゼのａａ１４９ないし停止コドンのコード化配列は、該断片の５″末端上 に位置する。

３′および５″末端の両方は、ｐＵＬＢ１２２１から誘導された配列により分離 する。第２のＤＮＡ断片は１６４ｂｐＮｃｏｌ−Ｆｎｕ４Ｈ１ｎ用４Ｈて、ｐＵ ＬＢ９１１９　（実施例４）から誘導した。

それは、プレプロウロキナーゼのａａ６６〜ａａ１２１をコード化する。第３の 断片は、周知の化学的方法により得られた二重鎖４３ｂｐＦｎｕ４Ｈ１−Ｂａ　 Ｉ　１合成りＮＡアダプター（第３表、アダプター９）である。前記３つの断片 を結紮し、得られｔ；中間組換え型プラスミドｐＵＬＢ９１３８を、増幅すべき イー・コリーのＭＭ２９４コンピテント細胞に導入した。１２６７ｂｐＨｉｎｄ ＩＩＩ−３ａｃＩコーデイングカセツトを、適当な酵素での消化によりｐＵＬＢ ９１３８から切除した：それは、ｐ　ｐＵＫ　（４１０／３６６／　１３１）ｄ ｅｌ（第１図）と称される産生物をコード化する。該カセットを真核生物シャト ルベクター、ＤＳＰｌ、１ＢＧＨ（プファーら、１９８５）に導入し、真核生物 Ｒ１６１０ハムスター細胞をトランスフェクションするのに用いる前に、得られ た組換え型プラスミド、ｐＵＬＢ９１３９を増幅した。

ついで、プラスミドｐＵＬＢ９１３９を実施例１および２のようにＲ１６１０お よびＣｏ５１細胞に導入した。分泌産生物の発現しベルおよびプラスミノゲン活 性化因子能を実施例１および２における゛記載のように試験した（第２表）。

実′謄例’１１　ｐＵＬＢ９１５２ ごの実施例は、不活性能（ａａ１５６および１５８が、ＡｒｇおよびＬｙｓ・の 代わりにＴｈｒである、実施例３参照）および非分解能（ａａ１３２〜１４７の 領域が欠失され、ジペプチド５ｅｒ−Ｔｈｒで置換されている、実施例１Ｏ参照 ）のプレプロウロキナーゼのコーディング配列を有する組換え型プラスミド、ｐ ＵＬＢ９１５２の組立てを記載している。この組立ては、５ｃｕｐａ　ｎｃ　（ ４１０／３６６／１３１）ｄｅ　ｌのＡＴＧ開始コドンからａａ１３５までの領 ′域をコード化するｐＵＬＢ９１３８　（実施例１０）から切・除した４　７２ 　ｂ、ｐｌＨ’ｉ　ｎ　ｄ’ＩＩＩ　−Ｂ　ａ　ｌ　Ｉ断片、およびＤＳＰｌ、 ＩＢ　Ｇ’Ｈ、ｃプファーら、１９８５）からの大きなＨ４ｎｄＩＩＩ−３ａｃ ■断片を含むｐＵＬＢ９１３５（実施例５）から精製した６９７５ｂ、ｐＨｉ　 ｎ　ｄＩ［ｌ−Ｂａ　Ｉ　Ｉの結紮により行なった。

ついでプラスミドｐＵＬＢ９１５２を、イー・コリーに導入し、増幅させ、最後 に実施例１および２のようにＲ１６１０およびＣ０５Ｉ細胞をトランスフェクシ ョンするように用いＩ；。分泌産生物の発現レベルおよびプラスミノゲン活性化 能を実施例１および２における記載のように試験した（第２表）。

前記説明および実施例は本発明およびその好ましい具体例を十分に記載している 。本発明は詳しく記載されている構成に限定されるものではなく、さらにすべて の修正も含めて、以下のクレームの範囲内である。

口 第　２　図 口ＳＰ１．１８ＧＨ 国際調査報告 １Ｉ１１＋＋＋Ｉ１１６Ｍｊｌムロ＊１Ｔ１１１＃内−暖・？Ｃτ／ＥＥ８７１ ０ＯＯｉＥ国際調査報告 ＦＩＥ　８７００ＣＨ８ ＳＡ　２０２０２

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｆｇ．ｔＰＡ／ＵＫ４１０、Ｆｇ．ｔＰＡ／ＵＫ４１０／３６６およびｔＰ ＰＵＫ４１０／３６６およびＵＫ−Ｋ２４１０／３６６からなる群より選択され るプラスミノゲン活性化因子。
2. ２．Ｆｇ．ｔＰＡ／ＵＫ４１０、Ｆｇ．ｔＰＡ／ＵＫ４１０／３６６またけｔＰ ＰＵＫ４１０／３６６およびＵＫ−Ｋ２４１０／３６６からなる群より選択され るプラスミノゲン活性化因子のコーディング配列からなる組換え型ＤＮＡ分子。
3. ３．哺乳動物の発現ベクターであって、プラスミノゲン活性化因子のコーディン グ配列が調節領域にアレームにて融合する請求項２記載の組換え型ＤＮＡ分子。
4. ４．請求項３記載の組換え型ＤＮＡ分子からなる形質転換された哺乳動物細胞。
5. ５．請求項１記載のプラスミノゲン活性化因子とそれの医薬上許容される担体と からなる医薬組成物。
6. ６．請求項４記載の形質転換された哺乳動物細胞を培養し、それにより産生した プラスミノゲン活性化因子を単離することを特徴とするプラスミノゲン活性化因 子の調製方法。