SK252792A3 - Lipase from microorganism of race of candida and method of its immobilization - Google Patents

Lipase from microorganism of race of candida and method of its immobilization Download PDF

Info

Publication number
SK252792A3
SK252792A3 SK2527-92A SK252792A SK252792A3 SK 252792 A3 SK252792 A3 SK 252792A3 SK 252792 A SK252792 A SK 252792A SK 252792 A3 SK252792 A3 SK 252792A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
lipase
groups
candida
ester
alcohol
Prior art date
Application number
SK2527-92A
Other languages
Slovak (sk)
Inventor
Kurt Faber
Brigitte Berger
Original Assignee
Chemie Linz Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chemie Linz Gmbh filed Critical Chemie Linz Gmbh
Publication of SK252792A3 publication Critical patent/SK252792A3/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/004—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of alcohol- or thiol groups in the enantiomers or the inverse reaction

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Lipase from a microorganism of the genus Candida, which is covalently bonded to epsilon-amino groups of lysine by opened epoxide groups of an epoxide-activated macroscopic support by N-alkylation and thus immobilised, a process for its preparation, its use in a process for the enantioselective esterification of enantiomer mixtures of an alcohol, which contains at least one centre of asymmetry in the molecule, with the aid of an enol ester, and a process for the enantioselective transesterification of an enantiomer mixture of an alcohol, which contains at least one centre of asymmetry in the molecule, with the aid of the immobilised lipase in the presence of an enol ester.

Description

Lipáza z rnikroorganismu čeledi Candida a zpúsob je ji immobilixaceLipase from the Candida family and the method is immobilixation

Oblast technikyTechnical field

Vynález se týka lipázy z rnikroorganismu čeledi Candida a zpúsobu její immobilisace. Vynález se rovnéž týka zvýšení účinnosti a stálosti této lipázy.The present invention relates to a lipase from a Candida microorganism and to a method for immobilizing it. The invention also relates to increasing the efficiency and stability of this lipase.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Chirální, enancimerné čisté alkoholy jsou látky, které je možno použít pro rúzné účely, napríklad pro výrobu farmaceutických účinných látek nebo pro chemické látky, které mají své použití v zemédélství. Tyto alkoholy je možno získat napríklad enancioselektivní výmenou esterových skupin, pri níž se uvádí do reakce smés enanciomerú chirálního alkoholu s esterem karboxylové kyseliny za prítomnosti hydrolázy jako katalyzátoru. Vzhledem k tomu, že hydrolázy katalyzují reakci v obou smérech, vzniká požadovaný výsledný produkt pri téchto reakcích často velmi pomalú a s nedostatečnou optickou čistotou. V publikaci M. Oegueil-Castaing a další, Tetrahedron Letters, sv. 28, 9 (1987), 953 - 954 se proto navrhuje užít jako ester karboxylové kyseliny enolester vzhledem k tomu, že v tomto prípade již nemúže dojít ke zpétné reakci. Jak je však zrejmé z publikace Zakrzewska a další, Acta Med. Pol., 29,(1988), 1-2, str. 44, mohou aldehydy, vznikající □ ŕi výmene esterových skupin z enolesteru deaktivovat enzým reakci s koncovými funkčními skupinami aminokyselín enzýmu. V EP č. 321 918 se popisuje enzymatický zpúsob štepení racemátú pri použití enanciomerních smési racemického alkoholu púsobením vinylesteru nebo ve vinylesteru za prítomnosti lipázy, pŕičemž uvolnený aldehyd nemá púsobit deaktivaci lipázy. Bylo však také uvedeno, že pri opakovaném použití lipázy z čeledi Candida v prúbéhu takového postupu velmi rýchle klesá jak účinnost tohoto enzýmu, tak také jeho selektivita.Chiral enantiomerically pure alcohols are substances which can be used for various purposes, for example for the production of pharmaceutical active substances or for chemicals which have their use in agriculture. These alcohols can be obtained, for example, by enantioselective exchange of ester groups by reacting a mixture of enantiomers of a chiral alcohol with a carboxylic acid ester in the presence of a hydrolase catalyst. Because hydrolase catalyzes the reaction in both directions, the desired end product is often very slow and poor in optical purity. In M. Oegueil-Castaing et al., Tetrahedron Letters, Vol. 28, 9 (1987), 953-954, it is therefore proposed to use an enol ester as the carboxylic acid ester, since in this case the reverse reaction can no longer occur. However, as is clear from Zakrzewska et al., Acta Med. Pol., 29, (1988), 1-2, p. 44, aldehydes resulting from the exchange of ester groups from an enol ester can deactivate the enzyme by reacting with the terminal amino acid functional groups of the enzyme. In EP no. No. 321,918 describes an enzymatic process for resolving racemates using an enantiomeric racemic alcohol mixture by treatment with a vinyl ester or in a vinyl ester in the presence of a lipase, wherein the released aldehyde is not intended to inactivate the lipase. However, it has also been reported that the repeated use of Candida lipase during such a process decreases both the activity of this enzyme and its selectivity very rapidly.

V pu blikaci C. J. Gray a další, Enzymti Microb. Technol., sv. 12 (1990), str. 800 až 807 se popisuje, že stálosť lipázy z Candida cylindracea je pri opakovaném použití možno zvýšit rúznými immobilizačními postupy. Z téchto postupu však není uvedená výména esterových skupín pri použití enolesteru. Podstata vynálezuC. J. Gray et al., Enzymti Microb. Technol., Vol. 12 (1990) p. 800-807, it is described that the stability of a Candida cylindracea lipase can be increased by repeated immobilization procedures when used repeatedly. However, these procedures do not disclose the exchange of ester groups using an enol ester. SUMMARY OF THE INVENTION

Nyní bylo neočekávané zjišteno, že je možno zvýšit jak stálost lipázy z čeledi Candida proti pôsobení aldehydú, tak také účinnosť tohoto enzýmu a obvykle také jeho selektivitu tím zpusobem, že se lipáza pred svým použitím immobilizuje výmenou esterových skupín pri použití enolesterú reakcí epsilon-aminoskupin lysinu lipázy s epoxidovými skupinami makroporézního nosiče, aktivovaného témito epoxidovými skupinami, pŕičemž dochází k N-alkylaci. Touto immobilizací se zvyšuje jak stálost lipázy pri pôsobení aldehydú, tak také účinnosť tohoto enzýmu a jeho selektivita vzhledem k substrátu ve srovnání s neimobilizovanou lipázou, pŕičemž selektivita vzhledem k substrátu pri opakovaném použití neklesá, nýbrž zústává zcela stálá.It has now been unexpectedly found that both the Candida family's aldehyde stability and its efficacy, and usually its selectivity, can be enhanced by allowing the lipase to be immobilized by ester exchange using enol esters by the reaction of epsilon-amino groups of lysine prior to use. lipases with epoxy groups of the macroporous carrier activated by these epoxy groups, whereby N-alkylation occurs. This immobilization enhances both the stability of the aldehyde lipase and the activity of the enzyme and its selectivity to the substrate as compared to the non-immobilized lipase, while the selectivity to the substrate does not decrease during repeated use but remains completely stable.

Podstatu vynálezu tedy tvorí lipáza z čeledi Candida, která je zpracována tím zpusobem, že epsilon-aminoskupiny lysinu lipázy jsou N-alkylací kovalentné vázány na otevŕené epoxidové skupiny makroporézního nosiče, aktivovaného epoxidovými skupinami, čímž dochází k immobilizací enzýmu.Accordingly, the present invention provides a lipase from the Candida family which is treated in such a way that the epsilon-amino groups of the lysine lipase are covalently bound by N-alkylation to the open epoxy groups of the macroporous carrier activated by the epoxy groups, thereby immobilizing the enzyme.

Pod pojmem lipáza z mikroorganismu čledi Candida se rozumí jak suspenze mikroorganismu čeledi Candida bez jakéhokoliv čišténí, tak čišténé enzymatické frakce. Jednotlivými kmeny čeledi Candida (C.) jsou napríklad C. antarctica, C. rugosa nebo C. cylindracea. S výhodou se užívá lipázy z C. cylindracea. Lipázy z mikroorganismu čeledi Candida se bežne dodávají s rôznou čistotou.The term lipase from the Candida microorganism means both a suspension of the Candida microorganism without any purification and the purified enzymatic fraction. Individual strains of Candida (C.) are, for example, C. antarctica, C. rugosa or C. cylindracea. Preferably, C. cylindracea lipase is used. Lipases from a Candida microorganism are commonly supplied with varying purity.

K immobilisaci lipázy se užívá makroporézní nosič, aktivovaný epoxidovými skupinami. Tento nosič je možno získat napríklad tak, že se polymeruje v suspenzi vinylacetát a monomer, který je s vinylacetátem kopolymerovatelný, napríklad N,N '-divinylethylenmočovina ve vode, pak se částečnš zmýdelní acetátové skupiny na hydroxylové skupiny, načež se provádí reakce s epichlorhydrinem, který reaguje s volnými hydroxylovými skupinami za vzniku epoxidového kruhu. Tímto zpúsobem je ve výsledném kopolymeru vytvorená štruktúra s reaktivními epoxidovými skupinami, které jsou vhodné k väzbe nosiče na nejrúznéjší substráty. Nosiče tohoto typu a zpúsoby jejich výroby jsou popsány napríklad v publikaci K. Burg a další, Angew. Makromol. Chem. 157, (1988), str. 105 až 121. Tyto nosiče se bšžne obchodné dodávají. Zvlášté vhodným nosičem pro toto použití je Eupergit C (R ohm Pharma, SRN) nebo VA-Epoxy-Biosynth, (Riedel de Haen, SRN).A macroporous carrier, activated by epoxy groups, is used to immobilize the lipase. This carrier can be obtained, for example, by polymerizing a suspension of vinyl acetate and a monomer which is copolymerizable with vinyl acetate, e.g. which reacts with the free hydroxyl groups to form an epoxy ring. In this way, a structure is formed in the resulting copolymer with reactive epoxy groups that are suitable for binding the carrier to a wide variety of substrates. Carriers of this type and methods for their preparation are described, for example, in K. Burg et al., Angew. Dep. Chem. 157 (1988) p. 105 to 121. These carriers are commercially available. A particularly suitable carrier for this use is Eupergit C (R ohm Pharma, Germany) or VA-Epoxy-Biosynth, (Riedel de Haen, Germany).

V publikaci A. N. Glazer, The proteins, vyd. H. Neurath a R. L. Hill, Academic Press Londýn, 1976, sv. II, str. 1 až 109 se uvádí, že pri tomto zpúsobu immobilizace enzymú reagují v první rade epsilon-aminoskupiny lysinu s epoxidovými skupinami, čímž dochází k alkylaci aminoskupiny lysinu v uvedené poloze.A. N. Glazer, The proteins, eds. H. Neurath and R. L. Hill, Academic Press London, 1976, vol. II, p. 1 to 109, it is reported that in this method of enzyme immobilization, the epsilon-amino groups of the lysine react first with the epoxy groups, thereby alkylating the amino group of the lysine at said position.

Lipáza podie vynálezu je tedy vázána kovalentné na nosič svými epsilon-aminoskupinami lysinu alkylaci otevŕenými epoxidovými skupinami nosiče.Thus, the lipase of the invention is covalently bound to the carrier by its epsilon-amino groups of lysine by alkylation of the open epoxy groups of the carrier.

Pŕedmetem vynálezu je rovnež zpúsob výroby immobilizované lipázy. Postupuje se tak, že se makroporézní nosič, aktivovaný epoxidovými skupinami uvádí do styku s vodným roztokem lipázy z čeledi Candida pri teplote 15 °C až teplote deaktivace lipázy, s výhodou pri teplote IB až 30 °C, napríklad v tŕepací bance. POmer nosiče a lipázy je nutno volit tak, aby v reakční smési byla k dispozici na jednu volnou aminoskupinu lysinu v lipáze jedna epoxidová skupina nosiče. S výhodou se užije na 1 g nosiče 0,05 až 0,1 g lipázy. Lipáza múže být rozpušténa v čisté vodé nebo v roztoku pufru nebo soli. Tím dôjde k reakci epsilon-aminoskupin lysinu v lipáze s epoxidovými skupinami nosiče, čímž dochází k N-alkylaci, to znamená ke kovalentní vazbé mezi lipázou a nosičem. Po ukončené reakci se immobilizovaná lipáza odfiltruje, poprípadé po pŕidání soli, napríklad chloridu sodného do reakční smési a promyje se roztokem pufru. Immobilizovaná lipáza se pak uchováva až do použití v pufru, ve vlhkém stavu nebo v suchém stavu.The present invention also relates to a method for producing immobilized lipase. The process is carried out by contacting an epoxy-activated macroporous carrier with an aqueous solution of a lipid from the Candida family at a temperature of 15 ° C to a lipase deactivation temperature, preferably at a temperature of IB to 30 ° C, for example in a shaking flask. The carrier / lipase ratio must be selected so that one epoxy carrier group is available per free amino group of lysine in the lipase in the reaction mixture. Preferably, 0.05 to 0.1 g of lipase is used per g of carrier. The lipase may be dissolved in pure water or in a buffer or salt solution. This results in the reaction of the epsilon-amino groups of the lysine in the lipase with the epoxy groups of the carrier, thereby causing N-alkylation, i.e., a covalent bond between the lipase and the carrier. After completion of the reaction, the immobilized lipase is filtered off, optionally after addition of a salt, for example sodium chloride, to the reaction mixture and washed with a buffer solution. The immobilized lipase is then stored in buffer, wet or dry state until use.

Tímto zpúsobem získaná lipáza se užívá k enancioselektivní esterfikaci smesi enanciomerú chirálních alkoholú výménou esterových skupin pri použití enol-esterú.The lipase thus obtained is used to enantioselectively esterify a mixture of enantiomers of chiral alcohols by exchanging ester groups using enol esters.

Podstatu vynálezu tvorí také zpúsob enancioselektivní esterifikace alkoholu, obsahujícího alespoň jeden stred asymetrie v molekule, zpúsob spočívá v tom, že se alkohol esterifikuje za prítomnosti enol-esteru a lipázy z mikroorganismu čeledi Candida, v níž je epsilon-aminoskupina lysinu lipázy kovalentné vázána na otevrené epoxidové skupiny makroskopického nosiče, aktivovaného epoxidovými skupinami za současné N-alkylace. Vzniklý ester chirálního alkoholu a popŕípadé nezreagovaný alkohol je možno z reakční smési izolovat.The present invention also provides a process for the enantioselective esterification of an alcohol comprising at least one center of asymmetry in a molecule, the method comprising esterifying the alcohol in the presence of an enol ester and a lipase from a Candida microorganism in which the epsilon-amino group of lysine lipase is covalently bound to epoxide groups of the macroscopic carrier activated by epoxide groups with simultaneous N-alkylation. The resulting chiral alcohol ester and optionally unreacted alcohol can be isolated from the reaction mixture.

Použitý alkohol obsahuje alespoň jeden stred asymetrie a je tedy opticky aktívni. Je možno jej použít ve forme racemické smési enanciomerú nebo ve forme smési, obohacené jedním nebo druhým enanciomerem.The alcohol used contains at least one center of asymmetry and is thus optically active. It may be used in the form of a racemic mixture of enantiomers or in the form of a mixture enriched in one or the other enantiomer.

Lipázu, immobilizovanou zpúsobem podie vynálezu je možno užít k reakci jak s primárními, tak se sekundárními alkoholy. Je možno použít také dialkohol se dvéma stredy asymetrie v molekule, pŕičemž múže jít o smesi R,S-, S,R-, R,R- neboThe lipase immobilized by the process of the invention can be used to react with both primary and secondary alcohols. It is also possible to use dialcohol having two centers of asymmetry in the molecule, which may be mixtures of R, S-, S, R-, R, R- or

S,S-alkoholu. Výhodnými alkoholy pro použití jako substráty jsou sekundárni alkoholy, které v molekule obsahují jeden stred asymetrie.S, S-alcohol. Preferred alcohols for use as substrates are secondary alcohols having one asymmetric center in the molecule.

Z enol-esterú je možno užít napríklad enolestery, které byly popsány v EP 321 918. S výhodou se používají vinylestery nižších organických kyselín, zvláštš výhodnými estery pro toto použití jsou vinylacetát, vinylpropionát, nebo vinylbutyrát.The enol esters which can be used are, for example, the enol esters described in EP 321 918. Vinyl esters of lower organic acids are preferably used, particularly preferred esters for this use are vinyl acetate, vinyl propionate or vinyl butyrate.

Pri provádéní svrchu uvedené reakce se nechá reagovat na 1 g enanciomerní sraési chirálních alkoholú 2 až 30 g, s výhodou 6 až 10 g immobilizované lipázy a alespoň 5 ekvivalentú enolesteru, reakce se poprípade provádí v ŕedidle, inertním za reakčních podmínek za míchání nebo protŕepávání pri teploté 15 °C až deaktivační teploté lipázy, s výhodou pri teplote místnosti.In carrying out the above reaction, 2 to 30 g, preferably 6 to 10 g of immobilized lipase and at least 5 equivalents of enol ester are reacted to 1 g of the enantiomeric chiral alcohol precipitate, optionally in a diluent inert under reaction conditions with stirring or shaking. 15 ° C to the inactivation temperature of the lipase, preferably at room temperature.

Reakci je možno provádet v ŕedidle, inertním za reakčních podmínek, nebo je možno jako ŕedidlo užít ve velkém prebytku enolester, užitý pro výmenu esterových skupín. Reakce se s výhodou provádí nikoliv v ŕedidle, inertním za reakčních podmínek, nýbrž v enolesteru, který je užit k provádéní reakce.The reaction may be carried out in a diluent inert under the reaction conditions, or the enol ester used for the exchange of ester groups may be used in large excess as the diluent. The reaction is preferably carried out not in a diluent inert under the reaction conditions, but in an enol ester which is used to carry out the reaction.

Je účelné provádét reakci pri takových teplotách, pri nichž má lipáza nejvyšší účinnost. Tato teplota se obvykle uvádí pri dodání enzýmu výrobcem nebo je možno ji určit jednoduchými pokusy. Tímto zpúsobem se tvorí v závislosti na použité srnesi alkoholu, esteru a na špecifičnosti použité lipázy pŕevážné R- nebo prevažne S-, poprípade pŕevážné R,Snebo pŕevážné S,R-ester použitého alkoholu, kdežto odpovídající S- nebo R-, poprípade S,R-, R,S-, R,R- nebo S,S-alkohol se reakce neúčastní nebo se jí účastní pouze ve velmi nepatrné míŕe.It is expedient to carry out the reaction at temperatures at which the lipase has the highest efficiency. This temperature is usually given when the enzyme is supplied by the manufacturer or can be determined by simple experimentation. Depending on the alcohol / ester mixture used and the specificity of the lipase used, the predominantly R- or predominantly S- or predominantly R, or predominantly S, R-ester of the alcohol used is formed, while the corresponding S- or R- or S-, The R-, R-, S-, R-, R- or S-, S-alcohol does not participate in the reaction or only to a very minor extent.

Prúbeh reakce je možno sledovať vhodnými a v chémii enzymú známymi postupy, napríklad pri použití plynové chromatograf ie.The progress of the reaction can be monitored by suitable methods known in the art, for example using gas chromatography.

Po dosažení produkce enanciomeru s dostatečnou čistotou, se reakce preruší a reakční smes se dále zpracovává. Immobilizovaná lipáza se odfiltruje a matečný louh se delí, pŕičemž dochází k izolaci požadovaných výsledných produktu. Izolace požadovaných produktu z reakční smési se provádí pomoci extrakce, destilace, chromatografie a podobne.After the enantiomer has been produced with sufficient purity, the reaction is discontinued and the reaction mixture is further processed. The immobilized lipase is filtered off and the mother liquor is separated, isolating the desired end products. Isolation of the desired products from the reaction mixture is accomplished by extraction, distillation, chromatography and the like.

Ve výhodném provedení se racemická smés alkoholu protŕepává s lipázou z Candida cylindracea, immobilizovanou pomoci VA-Epoxy-Biosynth, (Riedel-de-Haen, 5RN) ve vinylacetátu pri teplote místnosti. Po dosažení požadovaného prebytku enanciomeru vzniklého R- nebo S-, poprípade R,S- nebo S,R-esteru se enzým odfiltruje a požadované produkty se izolují destilací nebo chromatografií.In a preferred embodiment, the racemic alcohol mixture is shaken with a Candida cylindracea lipase, immobilized with VA-Epoxy-Biosynth, (Riedel-de-Haen, 5RN) in vinyl acetate at room temperature. After the desired excess enantiomer of the R- or S- or R, S- or S, R-ester formed is obtained, the enzyme is filtered off and the desired products are isolated by distillation or chromatography.

Je možno prokázat, že pri provádéní zpusobu podie vynálezu dochází ve srovnání s použitím neimobilizované lipázy jak ke zvýšení stálosti lipázy za prítomnosti acetaldehydu, tak ke zvýšení účinnosti a selektivity tohoito enzýmu. Zvlášté pŕekvapující je více než petinásobný vzestup selektivity, který zustává zcela stálý i pri opakovaném použití immobilizované lipázy.It can be shown that in carrying out the process of the present invention, both the stability of the lipase in the presence of acetaldehyde and the potency and selectivity of this enzyme are enhanced in comparison to the use of non-immobilized lipase. Particularly surprising is the more than a five-fold increase in selectivity, which remains completely stable even with repeated use of immobilized lipase.

Je zrejmé, že immobilizovaná lipáza a její použití pro enancioselektivní výmenu esterových skupin zpúsobem podie vynálezu tedy pŕedstavují podstatný technický pokrok.It will be appreciated that immobilized lipase and its use for the enantioselective exchange of ester groups by the method of the invention thus represent substantial technical progress.

Praktické provedení vynálezu bude osvetleno následujícími príklady.The following examples illustrate the invention.

Príklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

10,0 g prostredku VA-Epoxy-Biosynth (Riedel-de-Haen, SRN) se uvede do suspenze v 70 ml O,1N fosfátového pufru o pH 7,0, pridá se 300 mg lipázy z Candida cylindracea (AY-30, Firma Amano Pharm. Co., Japonsko) a smes se protrepává 3 dny pri 80 ot/min a teplote 27 °C. Pak se pridá 70 ml roztoku chloridu sodného, smes se zfiltruje, promyje se 2 x 30 ml 0,05 N fosfátového pufru o pH 7 a usuší.10.0 g of VA-Epoxy-Biosynth (Riedel-de-Haen, Germany) were suspended in 70 ml of 0.1N phosphate buffer pH 7.0, 300 mg of Candida cylindracea lipase (AY-30, Amano Pharm. Co., Japan) and shake at 80 rpm at 27 ° C for 3 days. Then 70 ml of sodium chloride solution are added, the mixture is filtered, washed with 2 x 30 ml of 0.05 N phosphate buffer pH 7 and dried.

Špecifická účinnost takto získané immobilizované lipázy se stanoví titrací vzniklé kyseliny octové pomoci 0,1 N hydroxidu sodného v prubehu hydrolýzy triacetinu v 0,1 N fosfátovém pufru o pH 7,00 a je 5,70 mikromol x min-·*· g-·*·. Špecifická účinnost neimmobilizované lipázy za týchž podmínek je 13 mikromol.minThe specific activity of the resulting immobilized lipase was determined by titrating the resulting acetic acid with 0.1 N sodium hydroxide solution during the hydrolysis of triacetin in 0.1 N phosphate buffer pH 7.00 and 5.70 micromoles per min - * · g · - · * ·. The specific activity of unimmobilized lipase under the same conditions is 13 micromol.min

Príklad 2 g, 9 mmol racemického endonorborn-5-en-2-olu se smísí se 200 mg lipázy z Candida cylindracea (AY-30, Firma Am ano Pharm. Co., Japonsko) a pak se smes protrepává v 10 ml vinylacetátu rýchlostí 200 ot/min pri teplote 20 °C. Prubeh reakce se sleduje plynovou chromatografi í. Po 4 hodinách se reakce preruší. Lipáza se odfiltruje a matečný louh se odparí ve vákuu. Odparek se chromatografuje bežnou chromatografií na sloupci silikagelu, čímž se získá (+)-endonorborn-5-en-2-ylacetát a (-)-endonorborn-5-en-2-ol.Example 2 g, 9 mmol of racemic endonorborn-5-en-2-ol are mixed with 200 mg of Candida cylindracea lipase (AY-30, Am Am Pharm. Co., Japan) and then shaken in 10 ml vinyl acetate at a rate 200 rpm at 20 ° C. The progress of the reaction was monitored by gas chromatography. After 4 hours the reaction was stopped. The lipase was filtered off and the mother liquor was evaporated in vacuo. The residue is chromatographed by conventional silica gel column chromatography to give (+) - endonorborn-5-en-2-yl acetate and (-) - endonorborn-5-en-2-ol.

Výsledky tohoto pokusu, týkající se účinnosti lipázy, pomeru enanciomerú a množství zreagovaného materiálu jsou shrnuty v následující tabulce 1.The results of this experiment regarding lipase activity, enantiomer ratio and amount of reacted material are summarized in Table 1 below.

Príklad 3Example 3

Postupuje se zpúsobem podie príkladu 2 s tím rozdílem, že se užije immobilizovaná lipáza podie príkladu 1. Výsled-The procedure of Example 2 is followed except that the immobilized lipase of Example 1 is used.

ky ky tohoto pokusu, pokud of this attempt if jde goes o účinnost lipázy, stupeň pŕemé- lipase activity, degree of conversion ny ny a pomšr and pomšr jednotlivých each enanciomerú enantiomer jsou shrnuty are summarized v následují v follow cí Whose tabulce table 1. First Tabúl board k to a 1 and 1 A A lipáza lipase akt. act. h ee h ee % ee % ee S WITH (-)alk. (-) vol. (+)est (+) Est 1. First V IN 39 39 51,4 51.4 66,5 66.5 8 8 2. Second V IN 1 1 11,0 11.0 54,0 54.0 4 4 3. Third V IN - - - - - - - - 1. First I I 100 100 62,2 62.2 91,3 91.3 42 42 2. Second I I 50 50 66,0 66.0 91,7 91.7 42 42 3. Third I I 23 23 59,1 59.1 91,8 91.8 42 42

Vysvetlivky k tabulce:Explanatory notes to the table:

A: počet použitíA: number of uses

V srovnávací enzýmIn the comparative enzyme

I: immobilizovaná lipázaI: immobilized lipase

Akt: relatívni účinnost, která se stanoví srovnáním rýchlosti v prúbšhu reakce až do uskutečnení 20 % reakce (tangentová metóda) %ee (-)Alk pŕebytek enanciomeru nezreagovaného (-)-endonorborn-5-en-2-olu %ee (+)Est: pŕebytek enanciomeru vytvoreného (+)-endonorborn-5-en-2-ylacetátuAct: relative potency, determined by comparing the rate of reaction during the reaction up to 20% reaction (tangent method)% ee (-) Alk excess enantiomer of unreacted (-) - endonorborn-5-en-2-ol% ee (+) Est: excess enantiomer of (+) - endonorborn-5-en-2-ylacetate formed

Pŕebytek príslušného enaciomeru byl stanoven pomoci plynovéchromatografického delení odpovídajícího menthylchlormravenčanu, který je možno získat derivatizací (-)-menthylchlormravenčanu zpúsobem podie publikace B. Berger a další, Tetrahedron: Asymmetry, 1 (1990), str. 541 - 546.The excess of the respective enantiomer was determined by gas chromatographic separation of the corresponding menthyl chloroformate, which can be obtained by derivatizing (-) - menthyl chloroformate as described by B. Berger et al., Tetrahedron: Asymmetry, 1 (1990), p. 541-546.

S: Selektivita reakce ve vztahu k požadovanému enanciomeruS: Selectivity of the reaction relative to the desired enantiomer

Tato hodnota se stanoví zpúsobem podie publikace Chen a další, J. Am. Chem. Soc., 104 (1982), str. 7294 - 7299.This value is determined according to Chen et al., J. Am. Chem. Soc., 104 (1982) p. 7294 - 7299

Claims (10)

1. Lipáza z mikroorganismu čeledi Candida, v níž jsou epsilon-aminoskupiny lysinu kovalentné vázány N-alkylací pŕes otevŕené epoxidové skupiny makroporézního nosiče, aktivovaného epoxidovými skupinami, čímž dochází k immobilizaci lipázy.A lipase from a microorganism of the Candida family in which the epsilon-amino groups of lysine are covalently bonded by N-alkylation through an open epoxy group of a macroporous carrier activated by epoxy groups, thereby immobilizing the lipase. 2. Lipáza podie nároku 1, immobilizovaná na makroskopický nosič, získaný polymerací vinylacetátu a monomeru, kopolymerovatelného s vinylacetátem v suspenzi ve vodé s parciálním zmýdelnením acetátu za vzniku hydroxylových skupin, které se uvedou do reakce s epichlorhydrinem, který s volnými hydroxylovými skupinami tvorí epoxidové kruhy.Lipase according to claim 1, immobilized to a macroscopic carrier, obtained by polymerizing vinyl acetate and monomer copolymerizable with vinyl acetate in suspension in water with partial saponification of the acetate to form hydroxyl groups which are reacted with epichlorohydrin which forms epoxide rings with free hydroxyl groups . 3. Zpúsob immobilizace lipázy z mikroorganismu čeledi Candida, vyznačujicí se tím, žese makroporézní nosič, aktivovaný epoxidovými skupinami uvádí do reakce s lipázou, a to s roztokem lipázy z čeledi Candida ve vode,v pufru nebo v roztoku soli pri teploté 15 °C až pri deaktivační teploté lipázy, čímž dôjde N-alkylací ke tvorbe kovalentních vazeb mezi epsilon-aminoskupinami lysinu lipázy a otevŕenými epoxidovými kruhy makroporézního nosiče, aktivovaného epoxidovými skupinami.3. A method of immobilizing a lipase from a Candida microorganism, characterized in that the epoxy-activated macroporous carrier is reacted with a lipase with a Candida lipase solution in water, in a buffer or in a salt solution at a temperature of 15 ° C to at the deactivation temperature of the lipase, whereby by N-alkylation, covalent bonds are formed between the epsilon-amino groups of the lysine lipase and the open epoxide rings of the macroporous carrier activated by the epoxy groups. 4. Zpúsob podie nároku 3, vyznačujicí se tím, že se na 1 g makroporézního nosiče užije 0,05 až 0,1 g lipázy.Method according to claim 3, characterized in that 0.05 to 0.1 g of lipase is used per 1 g of macroporous carrier. 5. Použití lipázy podie nároku 1, k enancioselektivní výméné esterových skupin chirálního alkoholu pusobením enolesteru .Use of a lipase according to claim 1, for enantioselective exchange of ester groups of a chiral alcohol by the action of an enol ester. 6. Zpúsob enancioselektivní výmeny esterových skupin chirálního alkoholu, vyznačujicí se tím, že se alkohol esterifikuje za prítomnosti enolesteru a lipázy z mikroorganismu čeledi Candida, pomoci N-alkylace vázané pŕes epsilon-aminoskupinu lysinu na epoxidové skupiny makroporézního nosiče, aktivovaného epoxidovými skupinami, načež se vzniklý ester chirálního alkoholu a poprípade nezreagovaný alkohol z reakční smési oddelí.6. A process for the enantioselective exchange of ester groups of a chiral alcohol, characterized in that the alcohol is esterified in the presence of an enol ester and a lipase from a Candida microorganism by N-alkylation coupled via epsilon-amino group of lysine to epoxide groups of macroporous carrier the resulting chiral alcohol ester and any unreacted alcohol are separated from the reaction mixture. 7. Zpúsob podie nároku 6, vyznačující se tím, že se na 1 g chirálního alkoholu užije alespoň pét ekvivalentú enolesteru a 20 až 30 g immobilizované lipázy.Method according to claim 6, characterized in that at least five equivalents of enol ester and 20 to 30 g of immobilized lipase are used per 1 g of chiral alcohol. 8. Zpúsob podie nárokú 6 nebo 7, vyznačují- c í s e t í m, že se jako ŕedidlo pro esterifikační reakci užije enolester, který se současne užije jako jedno z reakčních složek.8. A process according to claim 6 or 7, wherein the diluent for the esterification reaction is an enol ester which is also used as one of the reactants. 9. Zpúsob podie nárokú 6až8,vyznačující s e t í m , že se jako enolester užije vinylacetát, vinylpropionát nebo vinylbutyrát.9. A process according to claims 6-8, wherein the enol ester is vinyl acetate, vinyl propionate or vinyl butyrate. 10. Zpúsob podie nárokú 6 až 9, vyznačující s e t í m , že se jako lipáza užije lipáza z mikroorganismu Candida cylindracea.10. The method of claims 6 to 9, wherein the lipase is a lipase from Candida cylindracea.
SK2527-92A 1991-08-30 1992-08-17 Lipase from microorganism of race of candida and method of its immobilization SK252792A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0171591A AT398310B (en) 1991-08-30 1991-08-30 IMMOBILIZED LIPASE, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND METHOD FOR INCREASING THE ENANTIOSELECTIVITY OF A CANDIDA LIPASE IN THE Esterification of CHIRAL ALCOHOLS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK252792A3 true SK252792A3 (en) 1995-11-08

Family

ID=3519425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK2527-92A SK252792A3 (en) 1991-08-30 1992-08-17 Lipase from microorganism of race of candida and method of its immobilization

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0529424A3 (en)
JP (1) JPH05207881A (en)
KR (1) KR930004462A (en)
AT (1) AT398310B (en)
AU (1) AU649347B2 (en)
CA (1) CA2075699A1 (en)
CZ (1) CZ252792A3 (en)
HU (1) HUT63658A (en)
NZ (1) NZ243708A (en)
SI (1) SI9200192A (en)
SK (1) SK252792A3 (en)
YU (1) YU76692A (en)
ZA (1) ZA926022B (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3431204B2 (en) * 1993-04-22 2003-07-28 塩野義製薬株式会社 Norbornane type ester hydrolase
EP0893422A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-27 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Optically active alcohol and process for the production thereof
IL152290A0 (en) * 2002-10-14 2003-05-29 Enzymotec Ltd Immobilization of compounds on polymeric matrix
ITMI20070435A1 (en) 2007-03-05 2008-09-06 Innovate Biotechnology Srl 2 ', 3'-DI-O-acyl-5-FLUORONUCLEOSIDI

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3743824C2 (en) * 1987-12-23 1997-03-06 Hoechst Ag Process for the enzymatic resolution of racemic alcohols with / in vinyl esters by transesterification
DE3819467A1 (en) * 1988-06-08 1989-12-14 Basf Ag METHOD FOR PRODUCING A BIO CATALYST AND ITS USE FOR RAZEMATE CUTTING
US5108916A (en) * 1989-06-05 1992-04-28 Rhone-Poulenc Rorer, S.A. Process for stereoselectively hydrolyzing, transesterifying or esterifying with immobilized isozyme of lipase from candida rugosa
JPH03183480A (en) * 1989-12-13 1991-08-09 Ajinomoto Co Inc Immobilized lipase and ester exchange reaction of fat or oil with the same
DE4131546A1 (en) * 1991-09-21 1993-03-25 Chemie Linz Deutschland Candida lipase for high activity and aldehyde resistance - comprises covalent bonding to epoxy activated macroporous carrier for immobilisation and enantioselective esterification of chiral alcohol with enol ester

Also Published As

Publication number Publication date
AU649347B2 (en) 1994-05-19
CA2075699A1 (en) 1993-03-01
ATA171591A (en) 1994-03-15
SI9200192A (en) 1993-03-31
YU76692A (en) 1995-03-27
KR930004462A (en) 1993-03-22
ZA926022B (en) 1993-03-10
HU9202785D0 (en) 1992-12-28
EP0529424A3 (en) 1993-11-10
NZ243708A (en) 1993-10-26
AT398310B (en) 1994-11-25
EP0529424A2 (en) 1993-03-03
CZ252792A3 (en) 1993-03-17
AU2084492A (en) 1993-03-04
JPH05207881A (en) 1993-08-20
HUT63658A (en) 1993-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU637113B2 (en) Enzymes and their use
JP2641935B2 (en) How to immobilize lipase
JP3117157B2 (en) Acylation method of alcohol with immobilized enzyme
US4897352A (en) Acrylate based adsorbent resin for the immobilization of enzymes
US4923810A (en) Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess
SK252792A3 (en) Lipase from microorganism of race of candida and method of its immobilization
Kaga et al. Stabilization of Candida lipase against acetaldehyde by adsorption onto celite
US5229280A (en) Process for the continuous biotechnological preparation of optical isomer s(+) of 2-(6-methoxy-2-naphthyl) propionic acid
US20030175918A1 (en) Method for increasing the performance of immobilzed biocatalysts, and catalysts obtained thereby
Patel et al. Stereoselective enzymatic esterification of 3-benzoylthio-2-methylpropanoic acid
JPH0585157B2 (en)
DE4131546A1 (en) Candida lipase for high activity and aldehyde resistance - comprises covalent bonding to epoxy activated macroporous carrier for immobilisation and enantioselective esterification of chiral alcohol with enol ester
JP3509124B2 (en) Method for transesterification of fats and oils using immobilized lipase
CA2111595A1 (en) Process for the enzymatic preparation of optically active transglycidic acid esters
Wu et al. Stereoselective acylation of Dl‐menthol in organic solvents by an immobilized lipase from Pseudomonas cepacia with vinyl propionate
US5413935A (en) Process for selecting an enantiomer of a hydroxy lactone using pseudomonas lipase
JPH0616718B2 (en) Method for producing optically active indoline-2-carboxylic acid by immobilized enzyme or immobilized microorganism
US5726344A (en) Enantiomeric enrichment of bicyclic alcohols
EP0344791A2 (en) Process for the enzymatic resolution of the optical isomers of racemic ester derivatives of 3-mercapto-2-alkyl-propionic acid
JP2657886B2 (en) Immobilized enzyme and transesterification method using the same
JPH0588117B2 (en)
Mitsuda et al. Biological preparation of an optically activ alcohol. Part III. Enantioselective hydrolysis of. ALPHA.-cyano-3-phenoxybenzyl acetate with Arthrobacter lipase.
JPH06296499A (en) Production of optically active indoline-2-carboxylic acid by means of immobilized enzyme or microorganism
JP3018277B2 (en) Transfer method of ester
JPH01171497A (en) Optical resolution of racemic alcohol