SK1662000A3 - Expression vector for improved production of polypeptides in yeast - Google Patents

Description

Expresný vektor na zlepšenú produkciu polypeptidov v kvasinkách

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového expresného vektora na produkciu polypeptidu v kvasinkách, kvasinkového kmeňa transformovaného takýmto vektorom, spôsobu produkcie uvedeného vektora, kvasinkového kmeňa a polypeptidu.

Doterajší stav techniky

U kvasiniek sa v genetickom inžinierstve na expresiu bežne používajú striedajúce vektory obsahujúce nukleotidové sekvencie kódujúce určitý polypeptid v kombinácii so sekvenciami potrebnými pre uvedenú expresiu v kvasinkách, čiže kvasinkovým promótorom. Tieto striedajúce vektory obsahujú tiež sekvencie umožňujúce expresiu v baktériách, ako sú Escherichia coli, alebo iné mikroorganizmy. Takéto dodatočné nekvasinkové sekvencie sú užitočné len na zostrojenie vektorov. Sú však prebytočné na expresiu v kvasinkách. V skutočnosti môžu brániť účinnej expresii polypeptidu v kvasinkách, alebo spôsobiť retardáciu replikácie organizmu, nakoľko aj nadbytočné nukleotidy sa zdvojujú, čo je však energeticky náročný proces.

Kvasinka Saccharomyces cerevisiae sa často využíva ako vynikajúci mikroorganizmus na produkciu homológnych a heterológnych proteinov, nakoľko ich genetický systém je dobre známy, rýchlo rastú a sú technické výhody pri ich manipulácii. Ďalej, vývoj ich DNA transformačného systému pre zavedenie klónovaných génov a nie drahá a bezpečná produkcia pri jednoduchých podmienkach fermentácie činia tento organizmus zvlášť výhodným pre priemyselnú veľkovýrobu.

V súčasnosti je známych viacero polypeptidov kvasinkového pôvodu. Zvlášť zaujímavé sú superoxid dismutázy. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae obsahuje obsahuje dva druhy superoxid dismutáz (EC 1.15.11), med’/zinok-(Cu/Zn SOD) a mangán-(Mn SOD) obsahujúcu formu. Prvá (Cu/Zn SOD) je lokalizovaná v cytoplazme, zatiaľ Čo enzým obsahujúci mangán sa ohraničuje na mitochondriálnu matricu. Predpokladá sa, že tento enzým zabezpečuje ochranu in vivo voči voľným toxickým radikálom vznikajúcim v bunke ako medziprodukty normálneho metabolizmu (Bilinski a kol., Biochem.Biophys.Res.Commun . 130:533-539 (1985), Van Loon A.P.G.M. a kol. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:3820-3824 (1986), Lee F.J. a kol. J.Free Rad.Biol.Med. 1:319-325 (1985), Galiazzo F. a kol. Biochem.Biophys.Acta 965: 46-51 (1988)). Na základe týchto skutočností možno ho použiť pri ochrane, alebo liečbe potenciálnych poškodení u ľudí, vyplývajúcich najmä z dospievania

-2a starnutia buniek. (Rosen D.R. a kol. Náture 362,59-62 (1993), McCord J.M. a Fridovich I. J.Biochem. 244:6049-6055 (1969), McCord J.M. a kol. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 68:1024-1027 (1971), McCord J.M. N.Engl. J.Med. 312: 159-163 (1985)).

Cu/Zn SOD gén kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sa už klonoval a sekvenoval (Bermingham-McDonogh O. a kol. Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:4789-4793 (1988)) a štruktúra a mechanizmus účinku enzýmu sú dobre známe (Djinovic K. a kol. J.Mol.Biol.225: 791-809 (1992), ONeill P. a kol. Biochem.J.251: 41-46 (1988)).

Cu/Zn SOD je Často sa vyskytujúci metaloenzým v cytoplazme väčšiny aeróbnych a mnohých anaeróbnych organizmov. Jeho účinok katalyzuje dismutázu superoxidového aniónu na molekulu kyslíka a peroxid vodíka.

Podstatou vynálezu je zlepšenie výťažkov polypeptidov vo fermentačných procesoch kvasiniek transformovaných expresnými vektormi kódujúcimi takéto polypeptidy. Ďalším predmetom je poskytnúť také nové vektory, ktoré sú schopné exprimovať požadovaný polypeptid v kvasinkách vo väčších množstvách v porovnaní s predchádzajúcimi výrobnými postupmi. Ďalším predmetom sú nové kmene kvasiniek, ktoré sú transformované takýmito vektormi a sú výrazne lepšie ako divé kmene, alebo také, ktoré sú transformované striedajúcim vektorom.

Podstatou vynálezu je expresný vektor a tiež kmeň kvasiniek, a to kmeň Saccharomyces cerevisiae, transformovaný s uvedeným vektorom, produkujúci vysoké hladiny kvasinkového, alebo nekvasinkového polypeptidu, napr. enzýmu, ako je napr. Cu/Zn superoxid dismutáza, v porovnaní s divokým druhom, alebo kmeňom transformovaným so striedajúcim vektorom. Uvádzajú sa metódy prípravy takéhoto expresného vektora, kvasinkových kmeňov a endogénnych kvasinkových polypeptidov.

Výhody vynálezu budú zjavné odborníkom v danej oblasti z detailného opisu vynálezu a príslušných schém ilustrujúcich aj praktické aplikácie daného vynálezu.

V tomto vynáleze sa použili nasledovné DNA sekvencie primérov, ktorých štruktúry sú znázornené v Sequence Identification Listing (zozname sekvencií)(bp oblasti primérov sú z EMBL vektora, Génová banka prístup č.303279):

SEQ ID NO 1: je externý primér SOD-3, v protismere transkripcie 81-102 bp

SEQ ID NO 2: je externý primér SOD-2, v smere transkripcie 1018-1036 bp

SEQ ID NO 3: je interný primér SOD-4, oblasť 971-991 bp

-3Prehľad obrázkov na výkresoch

V nasledujúcom texte sa uvádza krátky opis k ilustráciám, ktoré v súbornej forme prezentujú vynález:

Obr.l znázorňuje výňatok kódovacej oblasti Cu/Zn SOD génu z kvasinkového kmeňa -S 288C, s vyznačenými polohami externých primérov SOD 3 a SOD 2 a interného priméra SOD 4 v protismere a v smere transkripcií SOD génového lokusu.

Obr.2 znázorňuje konštrukt nového molekulárneho plazmidu pEMBL-SOD 374, čo je plazmid pEMBLyex4 s 374 bp oblasťou v protismere transkripcie, kódovacia sekvencia a oblasť v smere transkripcie kvasinkového Cu/Zn SOD génu pod kontrolou kvasinkového promótora GAL/CYC.

Obr.3 znázorňuje mapu finálneho plazmidu pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli zahrňujúcu 374 bp oblasť v protismere transkripcie, kódovaciu sekvenciu a oblasť v smere transkripcie kvasinkového Cu/Zn SOD génu medzi reštrikčnými oblasťami EcoRI a Hind II, pod kontrolou kvasinkového GAL/CYC promótora. Obsahuje len kvasinkové sekvencie a repliky len v kvasinkách.

Podstata vynálezu

V prvej časti sa vynález týka nového expresného vektora pre produkciu polypeptidu v kvasinkách a zahrňuje sekvenciu kódujúcu daný polypeptid a iné sekvencie umožňujúce expresiu daného polypeptidu len v kvasinkách a uvedené sekvencie neobsahujú žiadne nekvasinkové sekvencie.

Výrazom expresný vektor sa rozumie vektor, a to hlavne DNA vektor, ako je plazmid obsahujúci sekvenciu kódujúcu polypeptid, sekvencia promótora v čítacom rámci s kódujúcou sekvenciou a iné voliteľné sekvencie, ktoré sú potrebné pre efektívnu produkciu alebo použitie vektora, ako je ori, rebríčková sekvencia, terminátor a sekvencia kódujúca polypeptid pre selekciu vektora. Takéto sekvencie sú odvodené len z kvasiniek a sú dobre známe v tejto oblasti výskumu.

Sekvencia kódujúca daný polypeptid je kvasinková, alebo nekvasinková sekvencia. Kvasinkové sekvencie sú napr. také kódujúce kvasinkový polypeptid s funkciami enzýmu, napr. antioxidačný enzým, ako je superoxid dismutáza SOD, antioxidant špecifický na tiol TSA, alebo cytochróm c peroxidáza, proteázy, napr. prekurzor cerevisinu PRB1, inhibítory proteináz, napr. inhibítor 2 proteinázy B, cytokíny a pod.

Sekvencie kódujúce nekvasinkový polypeptid sú odvodené z mnohých živých organizmov a to hlavne ľudí a zvierat. Takéto polypeptidy sú predovšetkým užitočné v

-4medicíne a zahrňujú ľudský inzulín, aktivátor tkanivového plazminogénu, interferóny, erytropoitein, rastové faktory, napr. keratinocytový rastový faktor, enzýmy, napr. tryptázu, aktivátor proteínu C, inhibítory enzýmov, napr .tkanivové inhibítory metaloproteináz(TIMP's), inhibítory elastáz a pod. Sekvencie kódujúce takéto užitočné polypeptidy sú známe.

Všetky uvedené sekvencie sú pod kontrolou kvasinkového promótora. Potrebné kvasinkové promótory sú známe a zahrňujú napr.GAL/CYC promótor.

Finálny vektor, ktorý je predmetom vynálezu, sa replikuje len v kvasinkových bunkách. Okrem nekvasinkovej sekvencie kódujúcej ľubovoľný nekvasinkový polypeptid, neobsahuje žiadne nekvasinkové sekvencie.

Podľa vynálezu je výhodným vektorom kvasinkový plazmid obsahujúci Cu/Zn SOD gén, ktorý je pod kontrolou GAL/CYC promótora a je to menovite plazmid pEMBLSOD,w/o MCS, w/o Coli.

Tento plazmid možno použiť ako východzí plazmid na zostrojenie expresného vektora, pričom Cu/Zn SOD gén sa vymení za sekvenciu kódujúcu ľubovoľný iný polypeptid. V ďalšej časti vynálezu je uvedená metóda produkcie už definovaného nového expresného vektora. Spôsob produkcie nového expresného vektora podľa vynálezu sa vyznačuje tým, že u striedajúceho vektora, ktorý exprimuje polypeptid v kvasinkovom kmeni, sa odstránia nekvasinkové sekvencie a sekvencia kódujúca daný polypeptid sa nahradí sekvenciou kódujúcou iný polypeptid.

Nové expresné vektory sa získavajú bežným spôsobom zo známych striedajúcich vektorov, ako sú kvasinkový integrovaný plazmid YIp, kvasinkový replikačný plazmid YRp, kvasinkový centromémy plazmid YCp, alebo kvasinkový epizomeálny plazmid Yep, ktoré sú zostrojené tak, aby obsahovali polypeptidový gén a neobsahovali žiadne nekvasinkové DNA sekvencie.

Počiatočné striedajúce vektory môžu už obsahovať sekvenciu kódujúcu žiadaný polypeptid pod kontrolou ľubovoľného kvasinkového promótora, napr. GAL/CYC promótora. Takýmto vektorom je napr. plazmid pEMBL-SOD 374, alebo pEMBL-SOD ATG. Tieto plazmidy sa používajú ako medziprodukty pri produkcii finálneho vektora podľa vynálezu. Ak gén nie je k dispozícii, konštrukcia začína izoláciou génu kódujúceho žiadaný polypeptid zo známeho zdroja, ktorý ho obsahuje, ako napr. z ľudských alebo zvieracích divých kmeňov mikroorganizmov. Gén sa znásobí dobre známou PRC metódou pomocou syntetických primérov, vloží do vektora, obyčajne striedajúceho vektora. Z intermediatových vektorov sa odstránia všetky nekvasinkové sekvencie, ako sú bakteriálne sekvencie, zahrňujúce viacnásobné miesta klonovania, akými sú replikácia ORI bakteriálneho pôvodu, selekčné

-5markery, miesto replikácie vláknitého baktériofágu fl, gény rezistentné voči ampicilínu a pod., za použitia bežných reštrikčných enzýmov.

Nasleduje podrobnejšia diskusia použitého spôsobu: expresia génu vyžaduje umiestnenie génu, ktorým je DNA kódujúca požadovaný polypeptid pod kontrolou silného kvasinkového promótora, ktorý bude riadiť syntézu príslušnej mesendžerovej RNA. Regulačné prvky DNA potrebné pre expresiu nesú kvasinkové vektory.

Tieto vektory sú „striedajúce vektory“, ktoré sa množia v kvasinkových kmeňoch a tiež v baktérii Escherichia coli pre ich ľahkú manipuláciu a prípravu väčších množstiev rôznych intermédiatových plazmidov.

Vyvinul sa veľký počet rôznych kvasinkových integrujúcich (YIp), replikujúcich (YRp), centromémych (YCp) a epizomálnych (YEp) plazmidových vektorov (Rose A.B., Broach J.R. Methods in Enzymology, 185:234-279 (1990), Schneider J.C., a Guarente L. Methods in Enzymology, 194:373-388 (1991)).

Plazmid, ktorý sa vybral na expresiu Cu/Zn SOD génu je špecifickým YEp (kvasinkový epizomálny plazmid)striedajúcim vektorom pEMBLyex4 s 8 800 bázovými pármi (Cesarani a Murray, v edícii Setlow J.K., Genetické inžinierstvo: princípy a metódy, zväzok 9, Plénum Press,NY 134-135 (1987)).

Takýto vektor nesie 2-mikrónový kvasinkový epizóm (malý dvojvláknový DNA plazmid prítomný v jadrách väčšiny kmeňov Saccharomyces cerevisiae), ktorý poskytuje vysokú mitotickú stabilitu a schopnosť samostatnej replikácie (Murray J.A.H., Mol.MicrobioL, 1:1-4 (1987), Hartley a Donelson, Náture, 286:860-864 (1980), Clark-Walker G.D. a Miklos G.L.G., Eur.J.Biochem., 41:359-365 (1974), Futcher A.B., a Cox B.S.J., Bacteriol., 157:283-290(1984)).

Perzistencia plazmidu je dôsledkom prítomnosti 2-mikrónovej zložky REP 3 lokusu (pre delenie plazmidu počas delenia bunky) a ARS sekvencie (pôvod replikácie).

Plazmid pEMBLyex4 nesie selektovateľné markery LEU 2 a URA 3, ktoré sú nesmieme užitočné pri výbere počiatočných transformantov kvasinkovej bunky a za účelom udržiavania konštantného tlaku s cieľom udržiavať plazmid v kvasinkovej bunke (Alani E. a kol., Genetics, 116:541 (1987), Gritz L. a Davies J., Gene, 25:179 (1983), Kaster K.R. a kol., Curr. Genet., 8:353 (1984), Rine J. a kol., Proc. Natl.Acad.Sci., USA, 80:6750 (1983)).

Vo všeobecnosti, tieto druhy plazmidov sa dobre udržiavajú aj v neprítomnosti pozitívnej selekcie. V tejto situácii môžu bunky stratiť plazmid rýchlosťou ca 4% za generáciu. pEMBLyex4 tvorí časť špeciálnej triedy 2-mikrónových vektorov s vysokým počtom kópií (ca 100-200 na bunku).

-6Použili sa aj kvasinkové kmene, ktoré nemajú 2-mikrónový epizóm (cir°) na propagáciu plazmidu. Je známe, že stabilita pEMBLyex4 je v takýchto kmeňoch veľmi veľká aj bez trvalého selekčného tlaku.

Plazmid pEMBLyex4 zahrňuje celú kazetu kvasinkového expresného hybridu UAS GAL/CYC. Promótorova kazeta obsahuje aktivačné miesto v protismere transkripcie (UAS sekvenciu) a promótorovu oblasť (TATA) vysokej hladiny transkripcie génu v smere transkripcie a reguláciu expresie, mnohonásobné miesto klonovania (MCS) pre inzerciu génu a zakončovaciu oblasť (Guarente L. a kol., Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 79:7410-7414 (1982)). Hybridová kazeta UAS gal/CYC má od 5' do 3' nasledujúce oblasti:

- 365 bp fragment (Sau3A-Xho I) z aktivačnej sekvencie v protismere transkripcie oblasti medzi kvasinkovými GAL4 a GAL 10 génami, ktorá obsahuje väzobnú oblasť pre produkt GAL 4;

- 250 bp oblasť (Xho I-Sst I) obsahujúcu promótor kvasinkového génu CyCl, ktorá nesie TATA a mRNA štartovné miesta, ale bez ATG oblasti;

- polylinker (Sst I-Hind III) o 95 bp s unikátnymi miestami pre pôsobenie reštrikčných enzýmov;

- 250 bp oblasť (v Hind III-SnaB I fragmente) nesúce terminujúce signály polyadenylácie a transkripcie z 2-mikrónového FLP génu.

Expresný systém je regulovaný génovými produktami GAL4 a GAL80. Proteín GAL4 je transkripčný aktivátor, ktorý sa viaže na UAS gal sekvencie. Aktivita GAL4 proteínu je inhibovaná viazaním GAL80 proteínu na jeho koncovú karboxylovú oblasť. Systém je potlačovaný glukózou, ktorá inhibuje väzbu GAL4 proteínu na UAS gal a je indukovaná galaktózou, ktorá spôsobuje disociáciu GAL80 proteínu z GAL4 proteínu.

V ďalšej časti vynálezu sa uvádza nový kvasinkový kmeň transformovaný expresným vektorom podľa vynálezu.

Druhy kvasiniek sú ktorékoľvek známe druhy použiteľné na expresiu kvasinkových a nekvasinkových polypeptidov, napr. Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces occedentalis, alebo druhy, ktoré nepatria k Sacharomyces, ako napr. Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Schwanniomyces occidentalis a Pichia stipitis.

Zvolený nový kmeň kvasiniek je napr. Saccharomyces cerevisiae so zlepšenými vlastnosťami syntetizovať Cu/Zn SOD enzým pomocou inzercie relatívne homológneho génu vo vnútrobunkovom priestore.

-7Zvolenými intermediátnymi kvasinkovými kmeňmi sú podľa vynálezu napr. GRF 18 transformovaný s plazmidom pEMBL-SOD 374 alebo plazmidom pEMBL-SOD ATG, ktoré sa vyprodukovali, izolovali a charakterizovali.

Ďalšou podstatou vynálezu je spôsob prípravy kavsinkového kmeňa transformovaného expresným vektorom kódujúcim endogénny kvasinkový polypeptid, ktorý neobsahuje žiadne nekvasinkové sekvencíe a umožňuje nadprodukciu daného kvasinkového polypeptidu v danom kvasinkovom kmeni charakterizovanom tým, že tento kmeň je transformovaný s novým už predtým opísaným vektorom.

Transformácia sa uskutočňuje spôsobmi bežnými v tejto oblasti výskumu, ako sú LiCl metóda podľa Ito a kol., napr. modifikovaná R.H.Schiestlom a kol. (1989), Current Genetics, 16, 339-346, alebo metóda opísaná Hinnenom a kol., (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933.

V ďalšej časti vynálezu sa uvádza spôsob prípravy polypeptidu v kvasinkovom kmeni fermentáciou kvasinkového kmeňa transformovaného expresným vektorom podľa vynálezu.

Fermentácia sa uskutočňuje bežným spôsobom, jednotlivo, vo várkach s regulovaným prísunom glukózy počas rastovej fázy a indukciou expresie prídavkom galaktózy v strede rastovej fázy podľa Alberghina, Lilia a kol., (1991), Biotech and Appl.Biochem. 14, 82-92.

Nasledovné príklady ilustrujú vynález a zameriavajú sa na postupy súvisiace s izoláciou a charakterizáciou génu kvasinkového enzýmu, napr. Cu/Zn SOD génu, získaného z bežných kmeňov S.cerevisiae, na metódy expresie génu kvasinkového enzýmu v kvasinkových kmeňoch pod kontrolou silného kvasinkového promótora, na vývoj a charakterizáciu kvasinkového kmeňa produkujúceho vysoké hladiny enzýmu, napr. SOD proteínu.

V texte sa používajú nasledovné skratky:

ARS autonómne replikujúca sekvencia

EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová

EMBL Európske laboratórium molekulárnej biológie

LB médium Luria Bertani

MCS miesto násobného klonovania

PCR polymérázová reťazová reakcia

PIU Inhibičné jednotky pyrogalolu

REP Replikon (krátka DNA sekvencia, ktorá slúži v bunkách ako počiatok DNA replikácie)

-8SDS dodecylsulfát sodný

SOD superoxid dismutáza

TBE tlmivý roztok Tris-Borát-EDTA

TE tlmivý roztok Tris-EDTA w/o Coli bez sekvencii Escherichia coli w/o MCS bez násobného miesta klonovania

YCp kvasinkový centromémy plazmid

YEp kvasinkový episomálny plazmid

YEPD živná pôda zložená z kvasinkového extraktu, peptónu a dextrózy

YIp kvasinkový integračný plazmid

YRp kvasinkový replikačný plazmid

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Extrakcia a purifikácia kvasinkovej genomickej DNA

Tento príklad sa týka extrakcie a purifikácie kvasinkovej genomickej DNA, ktorá sa použije ako genetický zdroj na izoláciu kvasinkového Cu/Zn SOD génu.

Ako zdroj DNA pre izoláciu Cu/Zn SOD génu možno použiť ľubovoľný divý kmeň kvasiniek. V našom prípade sa DNA extrahovala z kmeňov Saccharomyces cerevisiae S288C, divý typ gal2 a divý typ W309.

Na podobnú extrakciu DNA sa mohli použiť iné divé druhy kvasiniek, napr.W303.

Haploidný kmeň S288C je typickým kvasinkovým kmeňom, ktorý využíva väčšina laboratórií molekulárnej biológie na celom svete pre izoláciu kvasinkových génov a pre genetické a biochemické výskumy (Mortimer R.K. a Johnoson J.R., Genetics, 113:13 (1986)). Kmeň W309 sa považuje za potencionálny alternatívny zdroj. Je známe, že oba kmene nesú kópiu divokého typu Cu/Zn SOD génu vo svojom genome. Kmene sa získali z Oddelenia fyziológie a všeobecnej biochémie, Univerzita Miláno.

Modifikovaná metóda Cryera, Ecclesiala a Marmura, Methods Celí Biology, 12:39-44 (1975) sa použila ako postup na extrakciu celkovej kvasinkovej genomickej DNA:

Kvasinkové bunky z Petriho misiek obsahujúcich YEPD živnú pôdu sa naočkovali do 200 ml kompletnej YEPD živnej pôdy (1% bakto-kvasinkový extrakt, 2% bakto-peptón, 2% dextróza a nechali kultivovať v 1 1 fľaši cez noc pri 30 °C za pretrepávania až do neskorej exponeciálnej fázy (ca 8 x 10⁷ buniek /ml).

-9Celkove sa použilo 8 x 10⁸ buniek na ertxakciu DNA. Bunky (10 ml) sa odstredili a skoncentrovali v polypropylénových skúmavkách a úsadok sa preniesol do 1,5 ml eppendorfových skúmaviek. Pridalo sa 300 mikrolitrov lýzovacieho tlmivého roztoku (0,15 M NaCl, 0,1 M EDTA, pH 8, 1% SDS) a 300 mikrolitrov sklených guličiek (priemer 0,5 mm). Bunky sa vortexovali päťkrát na ľade s 1 min. prestávkami:

Suspenzia buniek sa homogenizovala vortexovaním so 600 mikrolitrami fenolchloroform-TE roztoku a odstred’ovala 2 min. Vrchná vodná vrstva sa preniesla do eppendorfových skúmaviek, pridalo sa 600 mikrolitrov roztoku chloroform-izoamylalkohol (24:1) a zmes sa zamiešala.

Vrchná vrstva sa preniesla do novej skúmavky, inkulovala pri 37 °C, 30 min. s RNAázou pri výslednej koncentrácii 1 mg/ml. Po vyzrážaní v etanole sa sediment resuspendoval v TE tlmivom roztoku (10 mM Tris, 1 mM EDTa, pH 8).

Takýmto spôsobom sa z každého preparátu získalo ca 100 mg kvasinkovej genomickej DNA o koncentrácii 1 mg/ml. Toto množstvo bolo postačujúce pre mnohé experimenty.

Príklad 2: Izolácia chromozomálnej oblasti obsahujúcej Cu/Zn SOD gén

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) sa použila na izoláciu chromozomálnej oblasti nesúcej Cu/Zn SOD gén.

Cu/Zn SOD gén mapuje pravé rameno chromozómu X v S.cerevisiae medzi cyclrad6-SUP4-cdc8 klastrom a cdcll oblasťou (Chang a kol. J.Biol.Chem. 266:4417-4424 (1991)). Nemá intróny vo svojej kódujúcej sekvencii, čo znamená, že je možné izolovať celú prepisovanú oblasť priamo z genomickej DNA pomocou PRC. Na dôvažok sú známe 5’ oblasť v protismere transkripcie a 3'oblasť v smere transkripcie tohto génu.

Na účely PRC reakcie je potrebný celý rad syntetických oligonukleotidov (primérov), ktoré pokrývajú SOD gén medzi oblasťou v protismere a v smere transkripcie.

Na základe softvéru pre analýzu OLIGO primérov, verzia 4.0 (National Bioscienses Inc.Plymouth) sa navrhli priméry pre PCR, aby pokryli oblasť publikovanej sekvencie Cu/Zn SOD génu s 1037 bázami (Bermingham-McDonogh O., Gralla E., Valentíne J. PNAS.85, p.4789 (1988)) (EMBL/génová banka, prístup číslo JO3279).

-10Priméry sa syntetizovali v syntetizátore nukleových kyselín Applied Biosystem 392 (Perkin-Elmer Corp.,Foster City, CA) a purifíkovali gélovou filtráciou na kolónach Sephadex G-25 a NAP-25 (Pharmacia P-L Biochemicals Inc., Milwaukee, Wisconsin).

S cieľom zvýšiť pravdepodobnosť izolácie Cu/Zn SOD génu z kvasinkového genómu sa uplatnila metóda založená na tzv. „semi-nested PCR“. Táto používa dvojstupňový postup, ktorý vyžaduje tri odlišné priméry (obr.l).

Prvý stupeň, ktorý používa dva priméry (jeden v smere a druhý v protismere transkripcie, napr.SOD-3 a SOD-2), umožňuje amplifikáciu väčšej oblasti genómu. Za týmto stupňom nasleduje druhá amplifikácia, ktorá používa nový interný primér (SOD-4) a jeden z predošlých dvoch (SOD-3), čo v konečnom dôsledku umožňuje izoláciu SOD génu.

V prvom kole amplifikácie s PCR sa použili nasledovné priméry:

SOD -3 (primér v protismere transkripcie, oblasť 81-102 sekvencie v EMBL/génovej banky, prístup číslo JO3279):

SEQ ID No 1: 5'-GGA CGT AAG CAT CTC TGA AGT G-3' (22 mer,TM=66°C)

SOD-22 (primér v smere transkripcie, oblasť 1018-1036 sekvencie v EMBL/génovej banky, prístup číslo JO3279)

SEQ ID No 2: 5'GCC GTC GAC GGA CCC CTC AAG ACC CCT C (28 mer, TM=64°)

SOD-2 primér má zodpovedajúcu oblasť dľžky 19 báz (Tm=64°C) a 5'nezodpovedajúcu oblasť, ktorá nesie reštrikčnú oblasť BamH I.

DNA amplifikácia sa uskutočnila v 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCb, 500 mM každého deoxynukleotidu (dATP,dCTP, dGTP, dTTP), 0,5 mM každého priméru, 50 alebo 100 ng génomickej DNA a 2,5 jednotiek Taq DNA polymerázy (PerkinElmer Corp.) v 100 ml reakčného objemu. Použitý čas a teplota pri každom amplifikačnom stupni boli nasledovné: 1 min. pri 94 °C pre denaturáciu, 1,5 min. pri 63 °C pre aneláciu a 2 min. na predĺženie.

PCR reakcia vytvorila DNA fragment s dľžkou 965 bázových párov (bp), viditeľný pri elektroforéze na agarovom géli, ktorý môže obsahovať celú kódovaciu sekvenciu SOD génu s

- 11 462 bp, sekvenciu v protismere transkripcie s 331 bp a sekvenciu v smere transkripcie so 172 bp.

Druhé kolo (semi-nested PCR) sa uskutočnilo za použitia priméru SOD-3 a tretieho vnútorného priméru SOD-4, ktorý prekleňuje oblasť 971-991 sekvencie uloženej v EMBL/génovej banky, prístup číslo JO3279 a má nasledujúcu sekvenciu:

SEQ ID No 3: 5'-GCC GTC GAC ACA CTT GGT GAA TGA TCA AGG-3'

Primér SOD-4 má zodpovedajúcu oblasť dľžky 21 báz (TM = 60 °C) a 5'nezodpovedajúcu oblasť, ktorá nesie Sal 1 reštrikčné miesto.

Semi-nested PCR reakcia, uskutočnená za horeuvedených podmienok, avšak pri teplote anelácie 60 °C, dávala kratší DNA fragment s dĺžkou 920 bázových párov (bp), ktorý zahrňuje celú kódovaciu sekvenciu SOD génu so 462 bp, sekvenciu v protismere transkripcie s 331 bp a sekvenciu v smere transkripcie so 127 bp.

Príklad 3: Subklonovanie Cu/Zn SOD génu do plazmidového vektora pCR II

Tento príklad sa vzťahuje na subklonovanie Cu/Zn SOD génu do plazmidového vektora pCRII.

Po amplifikácii sa produkty reakcie naniesli na 1,2% agarózový gel s nízkym bodom topenia a previedla sa elektroforéza na príslušnom prístroji (MiniSubgel DNA celí, BIO-RAD Laboratories, Inc.Hercules,CA, USA). Zodpovedajúci pás DNA sa potom izoloval z agarózového gélu štandardným spôsobom a purifikoval extrakciou fenolom (Sambrook J., Fritsch E.F. a Maniatis T. Molekulárne klonovanie. Laboratórny postup, Cold Springs Harbor Laboratory, New York, 1989).

Purifikovaný DNA fragment sa nakoniec vložil, ligáciou za pomoci enzýmu T4 DNA Iigázy pri 12 °C po dobu 16 h, do násobného klonovacieho miesta (MCS) linearizovaného plazmidu pCR II bp za použitia TA klonovacieho systému (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

pCR II vektor je klonovaci vektor, ktorý obsahuje jednotlivé previsy 3'deoxytymidylátu, aby sa umožnila priama ligácia PCR produktov a génov rezistentných na ampicilín a kanamycín pre jeho selekciu v bunkách E.coli.

Konštrukt (t.j.pCR II plazmid a inzert) sa potom preniesol a replikoval v bunkách HB101 E.coli.

- 12Záverom sa plazmidová DNA extrahovala z bakteriálnych buniek lýzou v alkalickom prostredí podľa Bimboima a Dolyho (Bimboim H.C., J.Doly. 1979 Nucleic Acids Research 7:1513) a purifikovala cez náplne Nucleobond AX-100 (Macherey-Nagel GmbH, Duren, Germany).

Príklad 4: Konštrukcia plazmidu pEMBL-SOD 374

Konštrukt sa pripravil za použitia pEMBLyex4 plazmidu ako vektora, v ktorom sa klonovali už predtým izolovaný lokus obsahujúci SOD gén, oblasť v smere transkripcie a modifikovaná oblasť v protismere tanskripcie.

Konštrukt nazvaný pEMBL-SOD 374 je znázornený na obr.2. Je to konštrukt, v ktorom subklonovaný fragment nesie kódovaciu oblasť SOD génu (462 bp) a oblasť v protismere transkripcie s 374 bp.

Zostrojiť takýto konštrukt vyžaduje to, že fragment nesúci Cu/Zn SOD gén, predtým subklonovaný v pCR II plazmide, je priamo vyčlenený reštrikčnými enzýmami BamH I a SA II.

Uvedená enzýmová reakcia dala BamH I -Sa II 963 bp fragment, ktorý sa purifikoval gélovou elektroforézou a subklonoval na miestach BamH I-Sa II vektora pEMBLyex4.

Príklad 5: Príprava kvasinkových kmeňov X4004 a GRF18 transformovaných s pEMBL-SOD 374

Expresia kvasinkového Cu/Zn-SOD génu z plazmidu pEMBL-SOD 374 sa skúmala po jeho inzercii do dvoch odlišných kmeňov S.cerevisiae, ktoré sa bežne používajú na expresiu homológnych a heterológnych génov v kvasinkách (Martegani a kol., Appl.Microbiol.Biotechnology 37:604-608 (1992), Alberghina L. a kol., Biotechnology and Applied Biochemistry 14:82-92 (1991), Pradyuma K. a kol., Biotechnology and Bioeng. 40:235-246 (1992), Yong Soo Park a kol., Biotechnology and Bioeng. 41:854-861 (1993), Scott a kol.,Biotechnology and Bioeng. 41:801-810 (1993), Jih-Han Hsieh a kol., Biotechnology and Bioeng. 32:334-340 (1988)).

Použili sa nasledovné haploidné kmene:

-X4004, ktorých genotyp je: MATa/lys5/ura3/met2/trpl

-GRF18, ktorých genotyp je:MATa/leu2-3,112/His3-11,15

-13Tieto kmene môžu byť efektívne fermentované pri veľkej biomase v selektívnych alebo semisyntetických médiách, nakoľko sú prítomné markéry na plazmidovom vektore pEMBLyex4 (LEU2-d a URA3), ktoré dopĺňajú príslušnú auxotrofíu leucínu na Ieu2-GRF 18 kmeni (GRF 18 kmeň nesie leu 2-3,112 dvojitú mutáciu, ktorá sa vracia do pôvodného stavu mimoriadne zriedkavo) a uracilovú auxotrofíu na ura3-X4004 kmeni.

Samozrejme, že v dôsledku inzercie plazmidu nové kmene strácajú špecifickú auxotrofíu. GRF 18 s novým plazmidom bude stále auxotrofný k histidínu, zatiaľ čo X4004 s novým plazmidom bude stále auxotrofný k metioninu a tryptofánu.

Transformácia kvasiniek s plazmidovými koštrukciami sa uskutočnila nasledovne:

Pred transformáciou:

- kvasinkové kmene (X4004 alebo GRF 18) nanesené na Petriho misky vo forme prúžkov

- niekoľko buniek odobratých z misky sľučkou sa rozpustí v 10 ml sterilnej destilovanej vody

- opracovať ultrazvukom 5 s a spočítať počet buniek s Coulter Counter (O.Dôoopod 0,1)

- naočkovať okolo 4x10⁷ buniek do 200 ml (koncentrácia 2-3 x 10⁵ buniek/ml, ca. 0,6 OD₆oo) YEPD média (v 1 1 fľaši)

- kultivovať 16 h pri 30 °C za mierneho trepania (ca 6 generácií) do počtu buniek ca.lxl0⁷ buniek/ml (OD6oo ⁼ 2-3)

Kompletné médium YEPD na kultiváciu buniek pred transformáciou sa pripravilo nasledovne: 1% kvasinkový extrakt, 2% peptón, 2% glukóza, 2% Bacto agar (pre Petriho misky) a destilovaná voda.Všetky zložky sa autoklávujú 20 min. pri 120 °C.

Transformácia sa uskutočnila nasledovne: Celkove sa použilo 2x10 buniek (transformácia kmeňa s 1 mg plazmidovej DNA), napr. lxlO⁹ buniek pre 5 transformácií (100 ml kultivačnej kaše obsahujúcej lxlO⁷ buniek/ml). Transformácia sa uskutočnila s chloridom lítnym podľa metódy Itoa modifikovanej Schiestlom a Gietzom (R.H.Schiestl, R.D.Gietz, Vysokoúčinná transformácia intaktných buniek za použitia jednovláknových nukleových kyselín ako nosičov (1989), Current Genetics 16:339-346). Transformanty sa nanesú na agarové platničky (syntetické minimálne médium), v ktorých chýba leucín (s cieľom vyselektovať bunky GRF 18 obsahujúce plazmid), alebo uracil (s cieľom vyselektovať bunky X4004 obsahujúce plazmid) a kultivujú sa pri 30 °C. Jednotlivé kolónie sa udržujú buď pri

- 144°C nanesením na čerstvo pripravené selekčné Petriho misky, alebo pri 80 °C v 15% glycerole.

Všetky transformácie sa uskutočnili dvojmo podľa uvádzanej schémy:

plazmidová DNA (1 mg) Kvasinkový kmeň (2x10⁸ buniek) pEMBL-SOD 374 pEMBLyex4 pEMBL-SOD 374 pEMBLyex4

X4004

X4004 (negatívna kontrola) GRF 18

GRF18 (negatívna kontrola)

Kmeň GRF 18 sa kultivoval na syntetickom médiu bez aminokyseliny leucínu za účelom selekcie kmeňov obsahujúcich plazmid, zatiaľ čo v prípade X4004 sa kmene kultivovali na syntetickom médiu, ktoré neobsahovalo uracil.

Indukcia expresie sa v obidvoch prípadoch uskutočnila presunom z minimálneho média obsahujúceho glukózu do média obsahujúceho galaktózu ako zdroj uhlíka. Postupovalo sa nasledovne: po nanesení na Petriho misky sa transformanty kultivovali v 50 ml syntetického minimálneho média ( neobsahujúceho leucín pre transformované GRF 18, alebo uracil pre transformované X4004) obsahujúceho 2% glukózy pri 30 °C 12-14 h za mierneho trepania a prevzdušňovania až po dosiahnutie 2,5 - 3x10⁷ buniek/ml (ODeoir 4-5). Selekčné syntetické médium (50 ml) obsahujúce 2% galaktózy sa naočkovalo s 5x10⁷ buniek (2 ml predkultúry), aby sa dosiahlo lxlO⁶ buniek/ml. Kultivovalo sa 17-18 h (ca 7 generácií) pri 30 °C za mierneho trepania a prevdušňovania, aby sa dosiahlo 2 -3x10⁷ buniek/ml (OD6oo⁼4-5). Bunky v počte 2x10⁸ (napr. približne 10 ml kultúry) sa oddelili a použili na extrakciu proteínu.

Médium na kultiváciu transformovaných buniek sa pripravilo nasledovne:

Syntetické selekčné médium (na kultiváciu trasformovaných X4004 buniek): 2% zdroj uhlíka (glukóza alebo galaktóza), 2% Bacto agar (pre Petriho misky), 50 mg/l Llyzín.HCl, 50 mg/l L-metionín, destilovaná voda. Zložky sa autoklávujú 20 min. pri 120 °C, pridá sa Difco dusíková báza z kvasiniek (YNB) bez aminokyselín (prefiltrovaný zásobný roztok lOx (67g/l)), 50mg/ml L-tryptofan (prefitrovaný koncentrovaný zásobný roztok).

- 15Syntetické selekčné médium (pre kultiváciu transformovaných GRF18 buniek): 2% zdroj uhlíka (glukóza alebo galaktóza), 2% Bacto agar (pre Petriho misky), 50 mg/L Lhistidín, destilovaná voda. Zložky sa autoklávujú 20 min. pri 120 °C, pridá sa Difco dusíková báza z kvasiniek (YNB) bez aminokyselín (prefiltrovaný koncentrovaný zásobný roztok lOx (67 g/1)).

Viacerými spôsobmi možno zistiť, či mikrobiálny kmeň má schopnosť produkovať daný polypeptid.

Spočiatku sa odporúča vyhodnotiť produktivitu jednoduchého polypeptidového reťazca. V skutočnosti, prvou otázkou, na ktorú je potrebné zodpovedať, je tá, či expresný systém novej bunky pracuje efektívne vo vzťahu k biosyntéze požadovanej chemickej zlúčeniny. Za účelom zistenia, či dostatočné množstvo požadovanej chemickej substancie, ako napr. polypeptidu, je prítomné v bunkových extraktoch, sa proteínové extrakty najprv analyzujú na SDS polyakrylamidových géloch, ktoré uskutočňujú delenie podľa molekulovej hmotnosti polypeptidového reťazca. Nakoľko „izogénne“ kvasinkové kmene (pozri negatívne kontroly) nemajú SOD obsahujúci expresný plazmid, potom elektroforetický profil bunkového extraktu z kmeňa obsahujúceho plazmid možno porovnať s bunkovým extraktom získaným z pôvodného kmeňa.

So znalosťou molekulovej hmotnosti SOD (polypeptidový reťazec SOD je zložený zo 154 aminokyselín, čo zodpovedá molekulovej hmotnosti 15 700 Da) porovnali sa dva profily na prítomnosť oblasti na géli, ktorá zodpovedá uvedenej molekulovej hmotnosti SOD pásu.

Vizualizácia sa uskutočnila nešpecifickým farbením s Coomassie blue.

Použili sa nasledovné analytické techniky na vyhodnotenie produkcie klonov v súčinnosti s elektroforézou v SDS na plyakrylamidovom géli.

a/ Extrakcia kvasinkového proteínu

Nasledovný postup, ktorý sa použil na prípravu extraktov celkového proteínu z kvasiniek, bol Čiastočne modifikovanou metódou Jazwinskeho (S.Michail Jazwinski, 1990, Methods in Enzymology, zväzok 182, s. 154):

- 2x10⁸ buniek sa skoncentruje (v 15 ml kyvete s kónickým dnom) odstredením (4000 ot/min, 4°C, 5 min.)

- úsadok sa premyje sterilnou vodou pri 4°C (prenesie do Eppendorfových skúmaviek)

- úsadok sa rozsuspenduje v 400 mikrolitroch tlmivého roztoku lxPBS

- pridá sa 400 mikrolitrov sklenených guličiek (vychladených na -20 °C)

- pridajú sa 4 mikrolitre (1 mg/ml) pepstaínu (inhibítor proteáz)

- 16- vortexuje sa 3 min. (dvakrát na ľade)

- odložiť 10 mikrolitrov supematantu pri -20°C na stanovenie obsahu proteínu

Farbenie gélov s Coomassie blue jasne ukázalo vo vzorkách (GRF18 bunky transformované s plazmidom pEMBL-SOD 374) prítomnosť pásu zodpovedajúceho molekulovej hmotnosti kvasinkového proteínu Cu/Zn SOD, ktorý sa naniesol na ten istý gél.

Tieto pásy sa nepozorovali vo vzorkách negatívnej kontroly (GRF18 bunky transformované s plazmidom pEMBLyex4, ktorý nenesie SOD gén a X4004 bunky transformované s plazmidom pEMBLyex4, ktorý nenesie SOD gén). Na polyakrylamidový gél sa nanieslo približne rovnaké množstvo proteínových extraktov u každej vzorky (ca.l mg).

b/ Stanovenie aktivity SOD s PIU testom

Expresiu homológneho a heterológneho enzýmu možno určiť príslušným testom na stanovenie aktivity, preto sa vyhodnotenie expresie kvasinkových buniek transformovaných dvomi molekulovými konštruktami uskutočnilo kvantifikáciou aktivity SOD po indukcii kultúr. Rast kultúr sa zaznamenával stanovením počtu buniek počítačom buniek (Coulter counter ZBI) (Lotti a kol., Appl.Microbiol.Biotechnol.28:160-165 (1988)), alebo meraním absorbancie pri 600 nm. Proteínové extrakty sa pripravili tak ako je popísané v stati „Extrakcia kvasinkového proteínu“.

Prítomnosť Cu/Zn SOD aktivity v extraktoch kvasinkových buniek sa detegovala metódou Marklunda a Marklundovej, ktorá je založená na schopnosti enzýmu inhibovať autooxidáciiu pyrogalolu (Marklund S. a Marklund G., Eur.J.Biochem.47:469-474 (1974)).

Pokusy s expresiou sa uskutočňovali ako várková fermentácia v kompletnom syntetickom médiu:

Kompletné syntetiské médium (Sherman F.,Methods in Enzymology, zv.194, Academia Press) s a bez medi (0,0025 g/1) a zinku (0,05 g/1) sa pripravilo nasledovne (v g/1): Bacto kvasinková dusíková báza w/o aminokyseliny (Difco Laboratories, Detroit,MI), 6,7; zdroj uhlíka (glukóza alebo galaktóza), 20; adenín sulfát, 50; uracil, 50; L-tryptofan, 50; Lhistidín, 50; L-arginín.HCl, 50; L-metionín, 50; L-tyrozín, 50; L-izoluecín, 50; L.lyzín.HCl, 50; L-fenylalanín, 50; kyselina L-glutamonová, 50; kyselina L-aspartová, 50; L-valín, 50; L-treonín, 50; L-serín, 50.

Tabuľka 1 uvádza údaje aktivity SOD (v kmeni GRF18) pri expresii SOD génu pred deléciou MCS a bakteriálne sekvencie z troch pokusov so spriemerovanými hodnotami:

- 17Tabuľka 1

Transformanty	1.PlU/ml	2.PIU/ml	3.PlU/ml	Priemerné hodnoty
PEMBL SOD 374 (v GRF 18)	575	168	180	301
PEMBLyex4 (vGRF 18)	18	10	12	13
Kúpené vinné kvasinky	22	-	-	22

Priemerné hodnoty expresie sú 301 PlU/ml pre vektor pEMBL-SOD 374 a 13 PlU/ml pre vektor pEMBLyex4 (bez inzertu). Tieto hodnoty sú dôležité pre posúdenie špecifičnosti expresie cieľového génu. Stanovuje sa v štandardizovaných laboratórnych várkových fermentáciach. Výsledky ukazujú v priemere 23 násobne zvýšenú hladinu expresie v porovnaní s pôvodným kmeňom (GRF 18 s plazmidom, ale bez inzertu). V porovnaní s kúpenými vínnymi kvasinkami (Seccoferm) sa pozoroval 22 násobný časový nárast expresie v laboratórnych várkových pokusoch. Ukazuje sa, že použitím nových konštruktov sa výrazne zvýšila hospodárnosť výrobného procesu.

Príklad 6: Preparát vektora pEMBL-SOD 374 w/o MCS

Z pokusov uvedených v príklade 5 možno vyvodiť uzáver, že účinnosť kvasinkového kmeňa GRF 18, ktorý obsahuje molekulárny konštrukt pEMBL-SOD 374, je veľmi vysoká. Ako kontrola slúžili tie isté kmene, ktoré neobsahovali žiaden konštrukt. Molekulárny konštrukt pEMBL-SOD 374 sa teda použil na vytvorenie finálneho expresného systému deléciou každej nekvasinkovej sekveneie.

Syntetická sekvencia „násobného klonovacieho miesta“ sa úplne deletovala dvojitým odštiepením na oboch koncoch polylinkera s enzýmami Sst I a Hind III. Táto operácia umožnila vyňatie celkove 95 báz umelej sekveneie z molekulárneho konštruktu pEMBL-SOD 374 a umožnila inzerciu úplného kvasinkového Cu/Zn SOD génu medzi zostávajúce prirodzené miesta.

18Podrobný postup:

1/ Kloň pEMBL-SOD 374 sa štiepil enzýmami Hind III a Sac I (New England Biolabs Inc.,USA) s cieľom vyňať polylinker zo zvyšku vektora. Enzým Hind III rozpoznáva unikátne sekvenčné miesto „A/AGCTT“ na jednom konci násobného klonovacieho miesta, zatiaľ čo enzým Sac I je izoschyzomérom enzýmu Sst I a rozpoznáva tú istú unikátnu sekvenciu „GAGCT/C“ na druhom konci násobného klonovacieho miesta.

Po tomto dvojitom štiepení sa izoloval elektroforézozu na agarovom géli a elektroelúciou fragment Hind III - Sac I s 8705 bázami, ktorý obsahuje všetky kvasinkové a bakteriálne sekvencie vektora pEMBL bez polylinkera.

Fragment s 8705 bázami sa nakoniec purifikoval s fenol-chloroformom a skoncentroval zrážaním v etanole.

2/ Na konce Hind III - Sac I fragmentu s 8705 bp sa pôsobilo enzýmom Polymerase I „Klenow fragment“ za účelom vytvorenia kompatibilných koncov na fragmente pre dalšie manipulácie. Toto pôsobenie otupí oba konce fragmentu zaplnením Hind III konca (ktorý je 5'prečnievajúci koniec) a štiepením Sac I konca (ktorý je 3'prečnievajúci koniec).

Fragment s tupými koncami sa nakoniec purifikoval s fenol-chloroformom a vyzrážal v etanole.

3/ DNA fragment nesúci kvasinkový Cu/Zn SOD gén a prítomný na klone pEMBLSOD 374 sa štiepil enzýmami Eco R I (New England Biolabs Inc.,USA) a Sal I (New England Biolabs Inc.,USA), ktoré rozpoznávajú príslušné miesta „G/AATTC“ a „G/TCGAC“. Toto dvojité štiepenie umožňuje izolovať fragment s 916 bp, ktorý nesie kvasinkovú sekvenciu 342 bp v protismere transkripcie, úplný otvorený čítací rámec kvasinkového Cu/Zn SOD génu s 462 bp a kvasinkovú sekvenciu 112 bp v smere transkripcie. Tento fragment s 916 bp, ktorý neobsahuje žiadne bakteriálne, alebo umelé sekvencie, sa izoloval elektroforézou na agarovom géli elektroelúciou a purifikoval s fenolchloroformom a zrážaním v etanole.

4/ Po purifíkácii sa na Eco R I-Sal I fragment pôsobilo enzýmom Polymerase I „Klenow fragment“, ktorý uskutočňuje vypľňanie Eco R I a Sal I koncov /oba sú 5'prečnievajúce konce), aby boli kompatibilné pre subklonovanie na konce purifikovaného pEMBL vektora, z ktorého sa predtým deletoval polylinker.

Fragment s tupými koncami sa znova prečistil s fenol-chloroformom a zrážaním v etanole.

-195/ Fragment s tupými koncami o 916 bp a obsahujúci kvasinkový Cu/Zn SOD gén sa nakoniec subklonoval do fragmentu pEMBL s tupými koncami o 8705 bp ligáciou za použitia enzýmu T4 DNA polymerázy (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim). Ligácia sa uskutočnila pri 16 °C za 20 h.

6/ Po transformácii ligačnej zmesi (fragmenty s tupými koncami s 916 bp a 8705 bp) do buniek E.coli (kmeň KL 1-Blue), previedol sa náhodný skríning s cieľom izolovať klony so správnymi sekvenciami. Niekoľko bakteriálnych klonov z transformácie sa kultivovalo cez noc pri 37 °C v LB médiu a DNA plazmid z klonov sa extrahoval s „mini preps“ metódou („Wizard“ minipreps DNA purification systém, Promega Corp., USA).

Amplifikácia s PCR a tiež DNA sekvenovanie sa použili na overenie prítomnosti a správnej orientácie fragmentu obsahujúceho kvasinkový Cu/Zn SOD gén v klonoch.

Správnosť sa potvrdila sekvenovaním elektroforézou na agarózovom géli.

Príklad 7: Príprava finálneho vektora pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli

Kloň „pEMBL-SOD 374 w/o MCS získaný podľa príkladu 6 nesie len kvasinkové sekvencie (funkčné kvasinkové sekvencie a kvasinkový Cu/Zn SOD gén) a bakteriálne sekvencie. Nekvasinková časť „pEMBL-SOD 374 w/o MCS“ klonu obsahuje počiatok replikácie baktérie E.coli, ampicilínový bakteriálny selekčný marker a počiatok replikácie odvodenej od vláknitého baktériofágu fl.

Táto oblasť pokrýva viac než 4000 báz a musí sa deletovať enzymaticky s cieľom získať finálny vektor, ktorý má len kvasinkové sekvencie. Po takejto manipulácii bude sa finálny vektor replikovať len v kvasinkových kmeňoch. A naozaj, jediné sekvencie prítomné vo finálnom vektore sú:

- Leu 2-d kvasinkový selekčný marker potrebný na výber transformantov kvasinkových buniek

- počiatok replikácie 2-mikrónového kvasinkového epizómu, ktorá zabezpečuje veľkú mitotickú stabilitu a replikáciu plazmidu

- celý kvasinkový expresný hybrid UAS GAL/CYC, ktorý poskytuje vysokú úroveň transkripcie génu pod jeho kontrolou

- kvasinkový SOD gén (so selekciou v protismere a v smere transkripcie), ktorý produkuje enzým Cu/Zn superoxid dismutázu.

Podrobný postup prípravy vektora:

-201/ Kloň „pEMBL-SOD 374 w/o MCS“, predtým deletovaný z násobného klonovacieho miesta, sa odštiepil endonukleázou Stu I (v polohe 5942 pôvodného pEMBLyex4 vektora) a Nru I (v polohe 1791 pôvodného pEMBLyex4 vektora). Enzým Stu I (Pharmacia, Uppsala) rozpoznáva unikátne tupé miesto „AGG/CCT“ a enzým Nru I (Pharmacia, Uppsala) rozpoznáva unikátne tupé miesto „TCG/CGA“. Vzniklý Stu I-Nru I fragment so 4689 bp nesúci všetky bakteriálne sekvencie sa separoval od zvyšku pRMBL vektora gélovou elektroforézou. Dvojité štiepenie deletuje tiež časť kvasinkvého selekčného markera URA 3 na vektore, ale zachováva celú funkciu iného kvasinkového selekčného markera LEU-2d, ktorý možno použiť na selekciu klonov v priebehu ďalších manipulácií.

2/ Fragment vektora pEMBL obsahujúci len kvasinkové sekvencie a kvasinkový gén sa izoloval z agarózového gélu elektroelúciou a purifikoval fenol-chloroformom a zrážaním v etanole.

3/ Konce purifikovaného pEMBL vektora (oba konce sú tupé) sa opätovne spojili enzýmom T4 DNA ligázou (Boehring Mannheim GmbH, Mannheim) a ligačná zmes sa použila na transformáciu kvasinkového GRF 18 kmeňa.

4/ Klony z transformácie sa naniesli na agarové platničky so syntetickým minimálnym médiom neobsahujúcim leucín za účelom selekcie (so selekčným markerom Leu 2-d) GRF 18 buniek obsahujúcich deletovaný plazmid.

5/ Niekoľko kvasinkových kolónií získaných z transformácie sa testovalo s PCR s cieľom potvrdiť prítomnosť kvasinkového fragmentu obsahujúceho kvasinkový Cu/Zn SOD gén a tiež absenciu bakteriálnej sekvencie medzi Stu I a Nru I enzýmovými miestami. Za účelom potvrdenia prítomnosti kvasinkového fragmentu na finálnom konštrukte „pEMBLSOD w/o MCS w/o coli“, uskutočnila sa PCR amplifikácia s dvomi okrajovými primármi SOD pro A a SOD pro B. Elektroforetický pás s dľžkou 1133 bp potvrdil prítomnosť fragmentu obsahujúceho kvasinkvý Cu/Zn SOD gén v šiestich kvasinkových klonoch.

Správnosť sa potvrdila sekvenovaním na agarózovom géli.

Finálny vektor „pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli“, vzniklý z takýchto manipulácií, nenesie žiadnu bakteriálnu alebo umelú sekvenciu a replikuje sa len v kvasinkových kmeňoch, nakoľko má len kvasinkové sekvencie. Finálny vektor je znázornený ako reštrikčná mapa na obr. 3.

Príklad 8: Vyhodnotenie expresie kvasinkového Cu/Zn SOD génu v novom kvasinkovom kmeni

-21 Tento príklad slúži na vyhodnotenie expresie kvasinkového Cu/Zn SOD génu v novom kvasinkovom kmeni zostrojenom v príkladoch 6 a 7. Všetky pokusy sa uskutočnili ako v príklade 5 s kultiváciou kvasinkových buniek v kompletných syntetických médiách.

Tab. 2 znázorňuje aktivitu SOD v celkovom extrakte kvasinkových buniek pri expresii SOD génu po delécii MCS a bakteriálnych sekvencii v GRF 18-pEMBL SOD 374 v kompletnom syntetickom médiu:

Tab.2

Transformanty	PlU/ml
pEMBL-SOD 374 (v GRF 18)	138
pEMBLyex4 (v GRF 18)	17
pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli (GRF 18)	141

Výsledky pokusu naznačujú, že vektor pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli exprimuje kvasinkový Cu/Zn SOD gén vo vyššom výťažku ako vektor pEMBLyex4 (v GRF 18).

Príklad 9: Izolácia a purifikácia kvasinkovej Cu/Zn SOD

Produkcia cieľového polypeptidu, akým je kvasinková superoxid dismutáza, sa robí pri aeróbnych podmienkach vo fermentoroch riadených počítačmi, napr. podľa Alberghina a kol. ibid. Kontrolovanými parametrami fermentácie sú teplota, rozpustný kyslík, pH a koncentrácia etanolu.

Purifikácia polypeptidu zahrňuje nesledovné stupne:

1. Kvasinkové bunky sa vo fermentačnej zmesi priamo lýzujú homogenizáciou s homogenizátormi, ako napr. APV Gaulin pri teplote medzi 20 a 30 °C a tlaku medzi 600 a 800 bar v 3 cykloch, alebo v guličkovom mlyne, napr. Dyno Milí Model KDL naplnenom guličkami premytými kyselinou s priemerom 0,3 mm a recirkuláciou suspenzie cez mlyn pri 160 ml/min počas 1-2 min a laboratórnej teplote.

2. Separácia zvyškov buniek a proteínov sa uskutočnila odstredením, napr. s Beckmann J2-21 odstredivkou s uhlovým rotorom JA-10 po dobu 60 min a rýchlosti 14 000

-22g, alebo mikrofiltráciou, napr. filtráciou s tangenciálnym tokom Minitan (Millipore Corp.,

Bedford) za použitia membrány s 0,45 pm pór am i.

3. Zahustenie a výmena tlmivého roztoku· pomocou ultrafiltrácie a diafiltrácie: Podmienky: Filtrácia s tangenciálnym tokom s Minitan (Millipore Corp.,Bedford) za použitia nitrocelulózovej membrány s priepustnosťou 10 000 Da (PLGCOMP 04 membrána). Tlmivý roztok: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0.

4. Purifikácia chromatografiou s výmenou katiónov, napr. DEAE-Sepharose. Podmienky: Nanášací tlmivý roztok: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; elučný tlmivý roztok: 20 mM Tris-HCl,pH8,0, IMNaCl.

5. Zahustenie a výmena tlmivého roztoku pomocou ultrafiltrácie a diafiltrácie za účelom získania finálnej SOD v tlmivom roztoku. Podmienky: Filtrácia s tangenciálnym tokom s Minitan (Millipore Corp.,Bedford) za použitia membrány s priepustnosťou 10 000 Da. Tlmivý roztok: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0.

Na konci fermentácie je aktivita prinajmenšom 5 000 PlU/ml.

Výťažok získaný s novým kmeňom podľa vynálezu je prinajmenšom 10 krát vyšší v porovnaní s výťažkom v tom prípade ,ak sa použili bežné pekárske kvasnice. Z 1 g pekárskych kvasníc možno izolovať 5 000 PIU, zatiaľ čo z 1 g pEMBL-SOD 374 GRF 18 kvasiniek sa izoluje najmenej 40 000 PIU.

-23ZOZNAM SEKVENCII (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) ŽIADATEĽ:

(A) MENO: PENTAPHARM AG (B) ULICA: ENGELGASSE 109 (C) MESTO: BASEL (D) KRAJ: BS (E) ŠTÁT: ŠVAJČIARSKO (F) PSČ: CH-4002 (G) -TELEFÓN: xx41-61-7064848 (H) TELEFAX: xx41-61-3199619 (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: ZLEPŠENÁ PRODUKCIA POLYPEPTIDOV V KVASINKÁCH (iii) POČET SEKVENCII: 3 (iv) PARAMETRE POČÍTAČA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: Kompatibilný s IBM PC (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS / MS-DOS (D) SOFTVÉR: Patent In Release # 1.0, Verzia # 1,30 (EPO) (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU ID NO:1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (iii) HYPOTETICKÁ: ŽIADNA (iv) V PROTISMERE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Saccharomyces cerevisiae

-24(B)KMEŇ: S288C (vii) BEZPROSTREDNÝ ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: EMBL No JO3279 (viii) POLOHA V GENÓME:

(B) POLOHA V MAPE : 81-102 (C) JEDNOTKY: bp (ix) RYS:

(A) MENO/KĽÚČ : rôzne rysy (B) LOKALIZÁCIA: 1..22 (xi) POPIS SEKVENCIE: IDENT:ČÍSLO SEKVENCIE : 1: GGACGTAAGC ATCTCTGAAG TG (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENT.ČÍSLOM: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (génomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ŽIADNA (iv) V PROTISMERE: ÁNO (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Saccharomyces cerevisiae (B) KMEŇ: S288C (vii) BEZPROSTREDNÝ ZDROJ:

(A) KNIŽNICA : EMBL No JO3279 (viii) POLOHA V GENÓME:

(B) POLOHA V MAPE: 1018-1036 (C) JEDNOTKY: bp (ix) RYS:

(A) MENO / KLÚČ: rôzne_ rysy (B) LOKALIZÁCIA: L.28 (ix) RYS:

-25(A) MENO/KLÚČ: väzba_primér (B) LOKALIZÁCIA: 1..28 (xi) POPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENT.ČÍSLOM: 2: GCCGTCGACG GACCCCTCAA GACCCCTC (2) INFORMÁCIA PRE SEKVENCIU S IDENT.ČÍSLOM: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (génomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ŽIADNA (iv) V PROTISMERE: ÁNO (v) TYP FRAGMENTU: vnútorný (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Saccharomyces cerevisiae (B) KMEŇ: S288C (viii) POLOHA V GENÓME:

(C) JEDNOTKY: bp (ix) RYS:

(A) MENO/KLÚČ: rôznerysy (B) LOKALIZÁCIA: 1..30 (ix) RYS:

(A) MENO / KLÚČ: väzba_primér (B) LOKALIZÁCIA: L.30 (ix) RYS:

(A) MENO/KLÚČ: väzba_primér (B) LOKALIZÁCIA: L.30 (xi) POPIS SEKVENCIE: IDENT:ČÍSLO SEKVENCIE: 3: GCCGTCGACA CACTTGGTGA ATGATCAAGG

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Expresný vektor pre produkciu kvasinkového,· alebo nekvasinkového polypeptidu v kvasinkách zahrňujúci sekvenciu kódujúcu daný polypeptid a sekvencie umožňujúce expresiu daného polypeptidu v kvasinkách, vyznačujúci sa tým, že okrem sekvencie kódujúcej nekvasinkový polypeptid, tento vektor nemá žiadne sekvencie nazývané nekvasinkové sekvencie, ktoré umožňujú expresiu v baktériách, alebo v mikroorganizmoch iných než kvasinky.
2. 2. Vektor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sekvencia kódujúca daný polypeptid je kvasinková sekvencia pod kontrolou kvasinkového promótora.
3. 3. Vektor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje sekvenciu kódujúcu kvasinkový enzým pod kontrolou kvasinkového promótora.
4. 4. Vektor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je to plazmid pozostávajúci hlavne zo sekvencie kódujúcej polypeptid, promótora v čítacom rámci s kódujúcou sekvenciou, z potrebných funkčných sekvencii vybraných z ORI, vedúcej sekvencie, terminátora a sekvencie kódujúcej polypeptid pre selekciu vektora.
5. 5. Vektor podľa nárokov 1 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že je to kvasinkový plazmid obsahujúci Cu/Zn SOD gén, ktorý je pod kontrolou GAL/CYC promótora.
6. 6. Vektor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pozostáva v podstate z nasledovných sekvencii:

   - Leu 2-d kvasinkvého selekčného markera

   - pôvodnej replikácie 2-mikrónového kvasinkového epizómu

   - celého kvasinkového expresného UAS GAL/CYC systému

   - kvasinkového SOD génu (s funkčnými kvasinkovými sekvenciami v smere a protismere transkripcie), ktorý produkuje enzým Cu/Zn superoxid dismutázu.
7. 7. Vektor podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že sekvencie sú usporiadané tak, ako je znázornené na obr. 3.

   -278. Vektor podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa získa nasledovným postupom:

   - izoláciou kvasinkovej genómovej DNA z kmeňa Saccharomyces cerevisiae,

   - izoláciou chromozomálneho fragmentu s Cu/Zn SOD génom a oblasťami v protismere a v smere transkripcie,

   - subklonovaním daného fragmentu do plazmidového vektora pCR 11 a extrakciou plazmidovej DNA,

   - vybratím fragmentu nesúceho Cu/Zn SOD gén pomocou reštrikčných enzýmov BamH I a Sal I a jeho purifikáciou,

   - subklonovaním purifikovaného fragmentu na miestach BamHI -Sal I vektora pEMBLyex4 s cieľom získať vektor pEMBL-SOD 374, ktorý nesie Cu/Zn gén a od kvasiniek odvodenú sekvenciu v protismere transkripcie,

   - deléciou násobného klonovacieho miesta polylinkera z prvého príkladu vektora pEMBLSOD 374 dvojitým štiepením oboch koncov polylinkera s enzýmami Sst I a Hind III,

   - izoláciou fragmentu Hind III - Sac I z horeuvedených kvasinkových a bakteriálnych sekvencii vektora pEMBL bez polylinkera, elektroelúciou po elektroforéze na agarózovom géli,

   -, purifikáciou a koncentráciou Hind III-Sac I fragmentu,

   - dvojitým štiepením DNA fragmentu druhej vzorky klonu pEMBL-SOD 374 nesúceho Cu/Zn SOD gén s enzýmami Eco Rl a Sal I za účelom izolácie fragmentu nesúceho celý otvorený čítací rámec Cu/Zn SOD génu spolu z kvasiniek odvodenými sekvenciami v protismere a v smere transkripcie, otupením koncov a purifikáciou Eco Rl-Sal I fragmentu, subklonovaním Eco Rl-Sal I fragmentu do Hind III-Sac I fragmentu s tupými koncami pomocou enzýmovej ligácie, izoláciou klonov so správnymi sekvenciami z ligačnej zmesi skríningom a overením amplifikácie s PCR a sekvenovaním DNA s cieľom získať vektor pEMBL-SOD w/o MCS, štiepením klonu pEMBL-SOD w/o MCS s endonukleázami Stu I a Nru I, separovaním vzniklého Stu I - Nru I fragmentu obsahujúceho všetky bakteriálne sekvencie gélovou elektroforézou, izoláciou zvyšného fragmentu s tupými koncami, len s kvasinkovými sekvenciami, elektroelúciou z agarózového gélu a jeho purifikáciou, spojením koncov fragmentu ligáciou enzýmom za účelom získania vektora pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli.

   -289. Vektor podľa nárokov 1, 4 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že sekveneia kódujúca daný polypeptid je nekvasinková sekveneia pod kontrolou kvasinkového promótora.
8. 10. Vektor podľa z nárokov 1,4 alebo 6, vyznačujúci sa tým, že sekveneia kódujúca daný polypeptid je ľudská alebo zvieracia sekveneia pod kontrolou kvasinkového promótora.
9. 11. Kvasinkový kmeň transformovaný vektorom podľa niektorého z nárokov 1,4 alebo 6.
10. 12. Kvasinkový kmeň transformovaný s vektorom podľa nárokov 7 alebo 8.
11. 13. Kvasinkový kmeň, ktorým je GRF 18 transformovaný s vektorom definovaným v nároku 8.
12. 14. Spôsob produkcie a expresie vektora podľa nárokov 1 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že zo striedajúceho vektora schopného expresie polypeptidu v kvasinkovom kmeni sa odstránia nekvasinkové sekvencie a sekveneia kódujúca daný polypeptid sa nahradí sekvenciou kódujúcou iný polypeptid.
13. 15. Spôsob produkcie expresného vektora definovaného v nároku 6, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce stupne:

    - izoláciu génomovej DNA z kmeňa Saccharomyces cerevisiae,

    - izoláciu chromozómového fragmentu nesúceho Cu/Zn SOD gén a oblasti v protismere a v smere transkripcie,

    - subklonovanie daného fragmentu do plazmidového vektora pCR II a extrakciu plazmidovej DNA,

    - vyňatie fragmentu nesúceho Cu/Zn SOD génu za použitia reštrikčných enzýmov BamH I a Sal I a purifikáciou tohto fragmentu,

    - subklonovanie purifikovaného fragmentu na miestach BamH I- Sal I vektora pEMBLyex4 za účelom produkcie vektora pEMBL-SOD 374 nesúceho Cu/Zn SOD gén a z kvasiniek odvodenú sekvenciu v protismere transkripcie,

    - delécia násobného klonovacieho miesta polylinkera z prvej vzorky vektora pEMBL-SOD 374 dvojitým štiepením oboch koncov polylinkera s enzýmami Sst I a Hind III,

    -29- izoláciu Hind III - Sac I fragmentu z horeuvedených kvasinkových a bakteriálnych sekvencii vektora pEMBL bez polylinkera, elektroelúciou po elektroforéze na agarózovom géli,

    - purifikáciu a koncentráciu Hind ΠΙ-Sac I fragmentu,

    - dvojité štiepenie DNA fragmentu druhej vzorky klonu pEMBL-SOD 374 nesúceho Cu/Zn SOD gén s enzýmami Eco Rl a Sal I za účelom izolácie fragmentu nesúceho celý otvorený čítací rámec Cu/Zn SOD génu spolu z kvasiniek odvodenými sekvenciami v protismere a v smere transkripcie,

    - otupenie koncov a purifikácia Eco Rl - Sal I fragmentu,

    - subklonovanie Eco Rl - Sal I fragmentu do Hind III - Sac I fragmentu s tupými koncami pomocou enzýmovej ligácie,

    - izolácia klonov so správnymi sekvenciami z ligačnej zmesi skríningom a overením amplifikáciou s PCR a sekvenovaním DNA s cieľom získať vektor pEMBL-SOD w/o MCS,

    - Štiepenie klonu pEMBL-SOD w/o MCS s endonukleázami Stu I a Nru I, separácia vzniklého Stu I-Nru I fragmentu obsahujúceho všetky bakteriálne sekvencie gélovou elektroforézou,

    - izoláciu zvyšného fragmentu s tupými koncami, len s kvasinkovými sekvenciami, elektroelúciou z agarózového gélu a jeho purifikáciu,

    - spojenie koncov fragmentu ligáciou enzýmom za účelom získania vektora pEMBL-SOD w/o MCS w/o Coli.
14. 16. Spôsob produkcie kvasinkového kmeňa vyznačujúci sa transformáciou kvasinkového kmeňa vektorom podľa nárokov 1, 4 alebo 6.
15. 17. Spôsob produkcie kvasinkového kmeňa vyznačujúci sa tým, že zahrňuje produkciu vektora spôsobom podľa nároku 15 a transformáciu kmeňa Saccharomyces cerevisiae s vektorom.
16. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že kmeňom je GRF 18.
17. 19. Spôsob produkcie polypeptidu v kvasinkovom kmeni, vyznačujúci sa kultiváciou kvasinkového kmeňa s vektorom podľa nárokov 1, 4 alebo 6 vo vhodnom médiu a izoláciou polypeptidu.

    -3020. Spôsob produkcie enzýmu Cu/Zn superoxid dismutáza v kvasinkovom kmeni, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje prípravu kvasinkového kmeňa podľa spôsobov nárokov 14, 15 alebo 18, kultiváciu kmeňa vo vhodnom médiu a izoláciu enzýmu.