SK14412001A3 - Farmaceutický prostriedok, farmaceutický kit s jeho obsahom a jeho použitie - Google Patents

Description

fľ iW-ríf

-1 Farmaceutický prostriedok, farmaceutický kit s jeho obsahom a jeho použitie

Oblasť vynálezu

Predložený vynález sa týka použitia periférne podávaného erytropoetínu a iných modulátorov erytropoetínovej receptorovej aktivity alebo EPO-aktivovaných receptorových modulátorov na pozitívne ovplyvňovanie funkcie excitabilného tkaniva. To zahŕňa ochranu excitabilného tkaniva, ako napríklad nervového alebo srdcového tkaniva, pred neurotoxínmi, hypoxiou a inými škodlivými stimulmi a posilnenie funkcie excitabilného tkaniva, ako napríklad uľahčenie učenia a zapamätávania. Predložený vynález sa týka aj spôsobov transportu látok cez endoteliálne bunkové bariéry prostredníctvom spojenia s erytropoetínovou molekulou, modulátorom erytropoetínovej receptorovej aktivity alebo s inými modulátormi EPO-aktivovaných receptorov.

Doterajší stav techniky

Vonkajšími a vnútornými stimulmi sú spôsobené rôzne akútne a chronické stavy a ochorenia, ktoré sú následkom poškodenia alebo dysfunkcie excitabilného tkaniva. Takéto stimuly zahŕňajú nedostatok adekvátneho okysličovania alebo chýbanie glukózy, neurotoxíny, následok starnutia, infekčné agensy a traumu. Excitabilné tkanivo sa môže poškodiť napríklad ako následok záchvatov a chronických záchvatových ochorení, kŕčov, epilepsie, mŕtvice, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby, poranenia centrálneho nervového systému, hypoxie, mozgovej obrny, mozgovej alebo miechovej traumy, AIDS demencie a iných foriem demencie, vekom spôsobenej straty kognitívnej funkcie, straty pamäti, amyotrofnej laterálnej sklerózy, sklerózy multiplex, nízkeho tlaku, zastavenia srdca, straty neurónov, inhalácie dymu a otravy oxidom uhoľnatým.

Je všeobecne známe, že pokles v dodávaní energie prístupnej pre mozog, ako napríklad glukózy alebo kyslíka, vedie k vážnemu poškodeniu funkcie mozgu, vrátane schopnosti poznávať. Mnohé (ale nie všetky) neuróny v centrálnom nervovom systéme sa ľahko poškodia, keď pracujú v metabolický limitovaných

-2podmienkach, napr. pri hypoxii, hypoglykémii, v strese a/alebo pri dlhšie trvajúcej silnej excitácii. Za takýchto podmienok často kolapsujú elektrochemické gradienty týchto buniek, čoho výsledkom je nezvratné poranenie neurónov a bunky odumierajú. Súčasná mienka uprednostňuje tento všeobecný mechanizmus ako spoločnú finálnu dráhu širokého rozsahu bežných a oslabujúcich degeneratívnych neurologických chorôb vrátane mŕtvice, epilepsie a Alzheimerovej choroby.

Hoci sú následky limitovaného energetického substrátu na funkciu mozgu dobre známe, menej extenzívne boli skúmané účinky zlepšeného dodávania energie na inak normálny mozog. Zo súčasných údajov zjavne vyplýva, že zlepšené dodávanie buď glukózy, alebo kyslíka, značne zlepšuje komplexnú kognitívnu funkciu, tak v živočíšnych modeloch, ako aj u normálnych ľudských jedincov (Kopf a ďalší, 1994, Behavioral and Neural Biology 62:237-243; Li a ďalší, 1998, Neuroscience 85:785-794; Moss a ďalší, 1996, Psychopharmacology 124:255-260). Okrem toho bolo demonštrované, že rastúci zoznam neuropeptidov produkovaných v mozgu priamo poskytuje zlepšenie kognitívnej funkcie v normálnom mozgu. Fyziologický základ týchto zosilnení určite závisí na remodelovaní prepojení neurónov prostredníctvom synaptických zmien.

Bunková architektúra mozgu vykazuje extrémnu plasticitu a podlieha neustálemu remodelingu. Tieto procesy, sprostredkúvané mnohými trofickými molekulami, nenastávajú len po poranení, ale hrajú dôležitú úlohu aj pri učení, zapamätávaní si a kognitívnej funkcii. Hoci prototypovým neurotrofínom je nervový rastový faktor (NGF), stále sa stanovuje rastúce množstvo cytokínov, ktoré uskutočňujú trofické funkcie v mozgu (Hefti a ďalší, 1997, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37:239-67).

V súčasnosti množstvo nezávislých výskumníkov zistilo, že nervové tkanivo exprimuje vysoké hladiny tak EPO, ako aj jeho receptora (EPO-R) (Digicaylioglu a ďalší, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3717-20; Juul a ďalší, Pediatr. Res. 43:40-9; Marti a ďalší, 1997, Kidney Int. 51:416-8; Morishita a ďalší, 1997, Neuroscience 76:105-16). Hoci sa zistilo, že EPO a jeho receptorový proteín sú každý produktom samostatných génov, CNS verzie sú významne menšie. Fyziologický význam tohto objavu nebol ešte objasnený, ale zistilo sa, že rozdiely v hmotnosti modifikujú biologickú aktivitu. Napríklad v štúdiách s ľudskými pacientami

-3výskumníci stanovili, že EPO sa netransportuje do mozgu z periférie (Marti a ďalší, 1997, vyššie). Doteraz však táto možnosť nebola zhodnotená pre EPO v žiadnej priamej štúdii. Hoci je mozgové EPO približne o 15 % menšie ako obličkové EPO (kvôli rozdielom v sialylácii), mozgové EPO je aktívnejšie pri stimulácii erytroidných kolónii pri nízkych koncentráciách Ugandu (Masuda a ďalší, 1994, J. Biol. Chem. 269:19488-93). Na druhej strane, CNS receptor vykazuje oveľa nižšiu afinitu voči deglykozylovanému EPO ako o 30 % väčší periférny receptor (Konishi a ďalší, 1993, Brain Res. 609:29-35; Masuda a ďalší, 1993, J. Biol. Chem. 268:11208-16).

V mozgu sa EPO expresia zistila v astrocytoch a zvýšená expresia a vylučovanie EPO sa môže indukovať hypoxiou alebo inými metabolickými stresormi (Marti a ďalší, 1996, Eur. J. Neurosci. 8:666-76; Masuda a ďalší, 1993, J. Biol. Chem. 268:11208-16; Masuda a ďalší, 1994, J. Biol. Chem. 269:14988-93) alebo aj obsadením Iných receptorov, ako napríklad rodiny rastových faktorov podobných inzulínu (Masuda a ďalší, 1997, Brain Res. 746:63-70). Neuróny sú jedným cieľom pre tento vylučovaný EPO, keďže exprimujú EPO-R spôsobom vysoko špecifickým pre daný typ bunky (Morishita a ďalší, 1997, Neuroscience 76:105-16). Na rozdiel od samotného EPO, nezdá sa, že by hustota EPO-R bola modulovaná v priebehu metabolického stresu (Digicaylioglu a ďalší, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3717-20).

Súčasná štúdia demonštrovala, že EPO prekvapujúco chráni proti poraneniu neurónov následkom hypoxie in vitro, ako aj in vivo, keď sa injekčné podá priamo do mozgových komôr (Morishita a ďalší, 1997, Neuroscience 76:105-16; Sadamoto a ďalší, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:26-32; Sakanaka a ďalší, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4635-40). Konishi a ďalší (1993, Brain Res. 609:2935) demonštrovali, že EPO napomáha in vivo prežívaniu cholinergných neurónov u dospelých potkanov, keď sa injekčné podáva priamo do mozgových komôr. EPO podávané centrálne do mozgových komôr tiež úspešne predchádza nedostatkom v priestorovom učení u potkanov, ktoré majú súvis s ischemickým poranením (Sadamoto a ďalší, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253:26-32). Súčasná publikácia navrhuje, že len 17-aminokyselinová časť EPO je potrebná na tieto neurotrofné účinky v kultivovaných nervových bunkách (Campana a ďalší, 1998, Int. J. Mol. Med. 1:235-41).

-4Mnoho rokov bola jedinou zrejmou fyziologickou úlohou erytropoetínu (EPO) kontrola produkcie červených krviniek. V súčasnosti niekoľko línií dôkazov naznačuje, že EPO, ako člen superrodiny cytokínov, uskutočňuje iné dôležité fýziologické funkcie, ktoré sú sprostredkované cez interakciu s erytropoetínovým receptorom (EPO-R). Tieto účinky zahŕňajú mitogenézu, moduláciu prúdenia vápnika do hladkých svalových buniek a neurónových buniek a účinky na metabolizmus medziproduktov. Verí sa, že EPO poskytuje kompenzačné odpovede, ktoré slúžia na zlepšenie hypoxických bunkových mikroprostredí. Hoci štúdie ukázali, že EPO injekčné podávané intrakraniálne chráni neuróny pred hypoxickým neurónovým poranením, intrakraniálne podávanie je nepraktický a neakceptovateľný spôsob podávania na terapeutické použitie, najmä pre normálnych jedincov. Okrem toho predchádzajúce štúdie s anemickými pacientami, ktorým sa podával EPO, ukázali, že periférne podávaný EPO sa netransportuje do mozgu (Marti a ďalší, 1997, vyššie).

Citácie alebo diskusie tu uvedených publikácii nesmú byť považované za skorší stav techniky vzhľadom ku predloženému vynálezu.

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka prostriedkov a spôsobov modulácie funkcie excitabilného tkaniva u cicavcov, ako aj spôsobov a prostriedkov na dodávanie liečiva do excitabilných tkanív. Vynález je čiastočne postavený na zistení prihlasovateľov, že erytropoetín (EPO), podávaný systémovo a vo vysokej dávke, je špecificky prijímaný mozgom. Prihlasovatelia zistili najmä to, že EPO, podávaný vo vysokých dávkach, môže prejsť cez krvno-mozgovú bariéru, kde môže posilniť kognitívnu funkciu a chrániť nervové tkanivo pred poškodením následkom strasujúcich podmienok, ako napríklad hypoxie.

Erytropoetín a EPO, ktoré sa tu používajú zameniteľné, a modulátory EPO receptorovej aktivity a modulátory EPO-aktivovaných receptorov, označujú zlúčeniny, ktoré keď sa podávajú systémovo (mimo krvno-mozgovej bariéry), sú schopné aktivovať EPO-aktivované receptory elektricky excitovateľných tkanív, aby ich posilnili a/alebo chránili pred poranením a odumretím. Takže EPO môže

-5označovať akúkoľvek formu erytropoetínu, ktorý môže modulovať excitabilné tkanivo, ako aj EPO analógy, jeho fragmenty a napodobujúce zlúčeniny. Vo výhodnom uskutočnení na použitie v spôsoboch podľa predloženého vynálezu, vykazuje erytropoetín zvýšenú špecificitu pre mozgový EPO receptor. V inom uskutočnení je erytropoetín neerytropoetický. V ešte inom uskutočnení sa erytropoetín podáva v dávke vyššej ako je dávka nevyhnutná na maximálnu stimuláciu erytropoézy.

Podstatou vynálezu je farmaceutický prostriedok v dávkovej jednotkovej forme adaptovaný na moduláciu excitabilného tkaniva, na posilnenie kognitívnej funkcie alebo na dodanie zlúčenín cez endoteliálne tesné spojenia, ktorý obsahuje na jednu dávkovú jednotku účinné netoxické množstvo v rozsahu od približne 50000 do 500000 jednotiek EPO, modulátora EPO receptorovej aktivity, modulátora EPOaktivovaného receptora alebo ich kombinácie, a farmaceutický prijateľný nosič.

V jednom uskutočnení zahŕňa účinné netoxické množstvo EPO v uvedenom farmaceutickom prostriedku 50000 až 500000 jednotiek EPO. V inom uskutočnení je účinné netoxické množstvo EPO v uvedenom farmaceutickom prípravku dávka účinná na dosiahnutie hladiny EPO cirkulujúcej v sére, ktorá je vyššia ako 10000 mU/ml séra. V ďalšom uskutočnení sa cirkulujúca hladina EPO dosiahne približne po 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 hodinách po podaní EPO.

V inom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický kit obsahujúci účinné množstvo EPO na moduláciu excitabilného tkaniva, na posilnenie kognitívnej funkcie alebo na dodanie zlúčenín cez endoteliálne tesné spojenia, ktoré je zabalené v jednej alebo viacerých nádobách.

Predložený vynález poskytuje spôsob modulácie funkcie excitabilného tkaniva u cicavca, ktorý zahŕňa periférne podávanie účinného množstva erytropoetínu danému cicavcovi. Excitabilné tkanivo môže byť normálne alebo abnormálne, choré tkanivo. V jednom uskutočnení je excitabilným tkanivom nervové tkanivo centrálneho nervového systému. V iných uskutočneniach je excitabilné tkanivo vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nervového tkaniva periférneho nervového systému a srdcového tkaniva.

V jednom uskutočnení je poskytnutý spôsob na posilnenie funkcie excitabilného tkaniva u cicavca, najme tak normálneho, ako aj abnormálneho

-6excitabilného tkaniva, periférnym podávaním účinného množstva EPO alebo modulátora EPO receptorovej aktivity. Posilnenie funkcie excitabilného tkaniva poskytuje napríklad posilnenie učenia, asociatívneho učenia alebo pamäti. Neobmedzujúce príklady stavov alebo chorôb, ktoré sú liečiteľné týmto predmetom predloženého vynálezu, zahŕňajú poruchy nálady, úzkostné poruchy, depresiu, autizmus, hyperaktívnu poruchu s nedostatkom pozornosti, Alzheimerovu chorobu, starnutie a kognitívnu dysfunkciu.

V inom uskutočnení modulácia excitabilného tkaniva poskytuje ochranu pred patológiou, ktorá je výsledkom poranenia excitabilného tkaniva, napríklad neurónom centrálneho nervového systému, periférneho nervového systému alebo srdcovému tkanivu. Takáto patológia môže vyť výsledkom poranení, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na hypoxiu, záchvatové poruchy, neurodegeneratívne ochorenia, neurotoxínovú otravu, sklerózu multiplex, nízky tlak, zastavenie srdca, ožiarenie alebo hypoglykémiu. V jednom uskutočnení je patológia výsledkom hypoxie a môže predstavovať prenatálny alebo postnatálny nedostatok kyslíka, dusenie, zaklinenie, topenie, kognitívnu dysfunkciu po operačnom zákroku, otravu oxidom uhoľnatým, inhaláciu dymu, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, emfyzém, syndróm respiračnej vyčerpanosti dospelých, hypotenzívny šok, septický šok, inzulínový šok, anafylaktický šok, krízu kosáčikovitých erytrocytov, zastavenie srdca, dysrytmiu alebo dusíkovú narkózu. V prípade, že patológia je záchvatovou poruchou, jej neobmedzujúcimi príkladmi môže byť epilepsia, kŕčovitá alebo chronická záchvatová porucha. V prípade, že patológiou je neurodegeneratívne ochorenie, môže to byť napríklad mŕtvica, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, mozgová mŕtvica, mozgová alebo miechová trauma, AIDS demencia, s vekom súvisiaca strata kognitívnej funkcie, strata pamäti, amyotrofná laterálna skleróza, záchvatové poruchy, alkoholizmus, ischémia sietnice, starnutie, glaukóm alebo strata neurónov. V inom uskutočnení sa podávanie EPO môže používať na predchádzanie poraneniu alebo poškodeniu tkaniva v priebehu operačných postupov, ako napríklad pri resekcii nádoru alebo oprave aneuryzmy.

V ešte inom uskutočnení sú poskytnuté spôsoby na uľahčenie transcytózy molekúl cez endoteliálnu bunkovú bariéru u cicavca prostredníctvom podania prostriedku obsahujúceho danú molekulu spojenú s erytropoetínom. Spojením

-7medzi molekulou, ktorá sa má transportovať, a EPO môže byť napríklad labilná kovalentná väzba, stabilná kovalentná väzba alebo nekovalentné spojenie s väzobným miestom molekuly. V jednom uskutočnení môže byť endoteliálnou bunkovou bariérou krvno-mozgová bariéra, krvno-očná bariéra, krvno-semeníková bariéra, krvno-vaječníková bariéra alebo krvno-placentová bariéra.

Vynález ďalej poskytuje prostriedok na transport molekuly prostredníctvom transcytózy cez endoteliálnu bunkovú bariéru, ktorý obsahuje uvedenú molekulu spojenú s EPO, modulátorom EPO receptorovej aktivity alebo modulátorom EPOaktivovaného receptora. V jednom uskutočnení je EPO erytropoetín, erytropoetínový analóg, zlúčenina napodobujúca erytropoetín, fragment erytropoetínu, hybridná erytropoetínová molekula, molekula viažuca sa na erytropoetínový receptor, erytropoetínový agonista, obličkový erytropoetín, mozgový erytropoetín, ich oligomér, ich multimér, ich muteínová forma, ich obdoba, ich prirodzene sa vyskytujúca forma, ich syntetická forma, ich rekombinantné forma alebo ich kombinácia. V inom uskutočnení je molekulou nachádzajúcou sa v uvedenom prostriedku hormón, neurotrofný faktor, antimikrobiálne činidlo, rádiofarmaceutická látka, antisense zlúčenina, protilátka, imunosupresant, toxín alebo protinádorové činidlo. Vhodné molekuly na transport spôsobom podľa predloženého vynálezu zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na hormóny, ako napríklad rastový hormón, antibiotiká, protinádorové činidlá a toxíny.

Tieto a iné predmety predloženého vynálezu budú zrejmejšie z nasledujúceho podrobného opisu s odvolaním sa na obrázky.

Predložený vynález poskytuje prostriedky a spôsoby na použitie erytropoetínu (EPO) na moduláciu funkcie excitabilného tkaniva, ako napríklad na posilnenie kognitívnej funkcie a na ochranu excitabilných buniek pred toxickými stimulmi. Vynález poskytuje najmä prostriedky obsahujúce EPO, ako aj spôsoby na ich použitie na profýlaktické a terapeutické ošetrenie, vrátanie dodávania liečiv. Tak ako sa používa tu, zahŕňa termín excitabilné tkanivo, ale bez obmedzenia, nervové tkanivo centrálneho nervového systému a periférneho nervového systému a srdcové tkanivo.

Tu opísaný vynález poskytuje spôsoby na moduláciu funkcie excitabilného tkaniva periférnym podávaním EPO alebo molekuly aktivujúcej EPO receptor alebo

-8molekuly vykazujúcej EPO-aktivovanú receptorovú aktivitu, ako aj akejkoľvek molekuly, ktorá napodobuje aktivitu EPO účinkujúc cez iné, neklasické EPO receptory. Bez toho, aby bola viazaná akýmkoľvek konkrétnym mechanizmom účinku, môže takáto molekula signalizovať prostredníctvom EPO receptora, môže napríklad iniciovať kaskádu prenosu signálu, ktorou sa nakoniec aktivuje program génovej expresie, ktorého výsledkom je ochrana alebo posilnenie funkcie excitabilného tkaniva. Molekuly schopné interagovať s EPO receptorom a modulovať aktivitu EPO receptora, tu označované ako EPO alebo modulátory EPO receptorovej aktivity, sú užitočné v kontexte predloženého vynálezu na ochranu alebo posilnenie funkcie excitabilného tkaniva. Týmito molekulami môžu byť napríklad prirodzene sa vyskytujúce, syntetické alebo rekombinantné formy EPO molekúl opísané vyššie, alebo iné molekuly, ktoré sa v žiadnom ohľade nemusia nevyhnutne podobať na EPO, okrem toho, že modulujú aktivitu EPO receptora, ako je tu opísané. Tieto molekuly sa môžu použiť v kombinácii na rôzne tu opísané účely.

Tu opísané prostriedky a spôsoby sa môžu použiť na liečbu a/alebo ochranu tak normálneho tkaniva, ako aj abnormálneho tkaniva, napríklad neurónov centrálneho nervového systému, neurónov periférneho nervového systému alebo srdcového tkaniva. Konkrétne, v časti 1, nižšie, sú opísané EPO prostriedky užitočné na uskutočnenie vynálezu. V časti 2.1 sú opísané spôsoby na použitie takýchto EPO prostriedkov na posilnenie funkcie excitabilného tkaniva, ako napríklad učenia, pamäte a iných aspektov kognitívnej funkcie a v časti 2.2 sú opísané spôsoby ochrany excitabilného tkaniva pred poškodením a poranením. V časti 2.3, nižšie, je opísané aj zistenie neočakávanej schopnosti EPO prechádzať tesnými spojeniami medzi kapilárnymi endoteliálnymi bunkami, a tým spôsob dodávania zlúčenín cez takéto bariéry. Nakoniec sú v časti 3 opísané stavy, ktoré môžu byť cieľom spôsobov podľa vynálezu a v časti 4 sú opísané spôsoby podávania a účinné dávky takýchto EPO prostriedkov.

1. Prostriedky obsahujúce erytropoetín

EPO prostriedky vhodné na použitie podľa vynálezu zahŕňajú akúkoľvek erytropoetínovú zlúčeninu, ktorá, keď sa podáva periférne, je schopná aktivovať

-9EPO-aktivované receptory, a tým modulovať funkciu excitabilného tkaniva, tzn. posilniť jeho funkciu, chrániť ho pred poškodením alebo poranením alebo dodať doň zlúčeniny. Erytropoetín je glykoproteínový hormón, ktorý má u ľudí molekulovú hmotnosť 34 až 38 kD. Zrelý proteín obsahuje 166 aminokyselín a glykozylové zvyšky predstavujú 40 % hmotnosti molekuly. Formy EPO užitočné na uskutočňovanie predloženého vynálezu zahŕňajú prirodzene sa vyskytujúce, syntetické a rekombinantné formy nasledujúcich molekúl: erytropoetínu, erytropoetínových analógov, napodobenín erytropoetínu, fragmentov erytropoetínu, hybridných erytropoetínových molekúl, molekúl viažucich sa na erytropoetínový receptor, erytropoetínových agonistov, obličkového erytropoetínu, mozgového erytropoetínu, ich oligomérov a multimérov, ich muteínov a ich obdôb. Výrazy erytropoetín a EPO sa môžu používať zameniteľné alebo spoločne.

Sú tu poskytnuté syntetické a rekombinantné molekuly, ako napríklad mozgové EPO a obličkové EPO, rekombinantné cicavčie formy EPO, ako aj jeho prirodzene sa vyskytujúce izoformy, izoformy odvodené od nádorov a rekombinantné izoformy, ako napríklad rekombinantne exprimované molekuly a izoformy pripravené homologickou rekombináciou. Okrem toho predložený vynález zahŕňa molekuly zahŕňajúce peptidy, ktoré sa viažu na EPO receptor, ako aj rekombinantné konštrukty alebo iné molekuly, ktoré majú časť alebo všetky štrukturálne a/alebo biologické vlastnosti EPO vrátane fragmentov a multimérov EPO alebo jeho fragmentov. EPO tu zahŕňa molekuly zo zmenenými účinkami viazania sa na EPO receptor, výhodne zo zvýšenou receptorovou afinitou, najmä čo sa týka posilnenia transportu cez endoteliálne bunkové bariéry. Muteíny zahŕňajú molekuly, ktoré majú väčší alebo menší počet glykozylačných miest. Ako je uvedené vyššie, výrazy erytropoetín, EPO a napodobeniny, ako aj iné výrazy, sa tu používajú zameniteľné, a označujú molekuly chrániace a posilňujúce excitabilné tkanivo, ktoré majú vzťah k EPO, ako aj molekuly, ktoré sú schopné prechádzať cez tesné endoteliálne bunkové spojenia, a tak sú užitočné ako dodávací prostriedok pre iné molekuly. Okrem toho sú tu zahrnuté aj molekuly produkované transgénnymi zvieratami. Treba poznamenať, že EPO molekuly, tak ako sú tu zahrnuté, sa nemusia nevyhnutne štruktúrou alebo iným spôsobom podobať na EPO, s výnimkou toho, že musia mať schopnosť interagovať s EPO

-10receptorom alebo modulovať EPO receptorovú aktivitu alebo aktivovať EPOaktivovanú signalizačnú kaskádu, ako je tu opísané.

Ako neobmedzujúce príklady zahŕňajú formy EPO užitočné na uskutočňovanie predloženého vynálezu EPO muteíny, ako napríklad muteíny so zmenenými aminokyselinami na karboxy konci opísané v US patente 5457089 a US patente 4835260; EPO izoformy s rôznym počtom zvyškov kyseliny sialovej na molekulu, ako napríklad izoformy opísané v US patente 5856292; polypeptidy opísané v US patente 4703008; agonisty opísané v US patente 5767078; peptidy, ktoré sa viažu na EPO receptor, ako sú opísané v US patentoch 5773569 a 5830851; malé molekulové napodobeniny, ktoré aktivujú EPO receptor, ako sú opísané v US patente 5835382; a EPO analógy opísané vo WO 9505465, WO 9718318 a WO 9818926. Všetky vyššie uvedené citácie sú tu zahrnuté v takom rozsahu, v akom sa tento opis odvoláva na rôzne alternatívne formy alebo spôsoby prípravy takýchto foriem erytropoetínu podľa predloženého vynálezu.

EPO je možné získať komerčne (pod ochrannými známkami PROCRIT, dostupné od OrtoBiotech, a EPOGEN, dostupné od Amgen. Inc., Thousand Oaks, CA).

V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu EPO molekuly zahŕňajú hybridné EPO molekuly, ktoré môžu byť pripravené, a ktoré majú EPO receptorovú modulačnú aktivitu, ako aj inú aktivitu, napríklad aktivitu rastového hormónu. Takéto hybridné molekuly s viacerými doménami tak majú schopnosť interagovať s EPO receptorom, a majú tiež účinok inej molekuly, ako napríklad hormónu. Spôsoby prípravy takýchto molekúl s dvoma doménami sú pre priemerného odborníka v oblasti známe. Ako bude podrobnejšie opísané v časti 2.3 nižšie, jedným znakom takýchto molekúl je transport cez endoteliálne bunkové bariéry, zabezpečovaný doménou modulujúcou aktivitu EPO receptora, a aktivita inej molekuly v cieľovom mieste.

Môže sa testovať ktorákoľvek z vyššie opísaných zlúčenín, aby sa identifikovali EPO zlúčeniny schopné modulovať excitabilné tkanivo, tzn. posilňovať jeho funkciu, chrániť ho pred poškodením alebo poranením alebo dodať doň zlúčeniny, použitím tu opísaných testov. EPO zlúčeniny môžu byť testované napríklad z hľadiska ich schopnosti posilniť funkciu excitabilného tkaniva, ako r e

-11 napríklad učenie, pamäť a iné aspekty kognitívnej funkcie, použitím spôsobov opísaných v časti 2.1. Príklady in vivo testov kognitívnej funkcie zahŕňajú Morrisov vodný bludiskový test, ktorého príklad je opísaný v príklade 1, a test podmienenej chuťovej averzie, ktorého príklad je podrobne opísaný v príklade 2. Okrem toho môžu byť vyššie opísané EPO zlúčeniny testované použitím experimentov opísaných v časti 2.2, aby sa identifikovali EPO zlúčeniny schopné chrániť excitabilné tkanivo pred poškodením a poranením. Príklady opísané v príkladoch 3, 4, 5, 6 a 7 poskytujú špecifické príklady takýchto testov. EPO zlúčeniny sa môžu testovať aj z hľadiska ich schopnosti dodávať zlúčeniny cez tesné epiteliálne spojenia, ako napríklad cez krvno-mozgovú bariéru, použitím testov, ktoré sú opísané napríklad v časti 2.3 a príklade 4 nižšie. Takže EPO prostriedky vhodné na použitie podľa vynálezu zahŕňajú akúkoľvek a všetky zlúčeniny, ktoré, keď sa podávajú periférne, sú schopné signalizovať prostredníctvom EPO-aktivovaných receptorov, a tým modulovať excitabilné tkanivo, tzn. posilniť jeho funkciu, chrániť ho pred poškodením alebo poranením alebo doň dodať zlúčeniny.

2. Spôsoby profylaktického a terapeutického použitia vynálezu

V rôznych uskutočneniach vynálezu môžu byť EPO prostriedky používané na ochranu excitabilného tkaniva pred poranením alebo hypoxickým stresom, na posilnenie funkcie excitabilného tkaniva alebo na dodanie zlúčenín cez tesné endoteliálne spojenia excitabilného tkaniva. Ako bolo opísané vyššie, vynález je čiastočne založený na zistení, že EPO molekuly môžu byť transportované z luminálneho povrchu na základňový membránový povrch endoteliálnych buniek kapilár v orgánoch s tesnými endoteliálnymi bunkovými spojeniami, vrátane napríklad mozgu, sietnice a semenníkov. Bez toho, aby sme to chceli spájať s nejakou konkrétnou teóriou, po transcytóze EPO môže EPO interagovať s EPO receptorom excitabilného tkaniva, ako napríklad EPO receptorom neurónov centrálneho nervového systému, periférneho nervového systému alebo srdcového tkaniva, a viazanie sa na receptor môže iniciovať kaskádový prenos signálu, ktorého výsledkom je aktivovanie programu génovej expresie vo vnútri excitabilného tkaniva, čo vedie k ochrane bunky pred poškodením, napríklad prostredníctvom neurotoxínov, hypoxie, atď. Takže nižšie sú podrobnejšie opísané spôsoby ochrany

-12excitabilného tkaniva pred poranením alebo hypoxickým stresom, spôsoby posilnenia funkcie excitabilného tkaniva a dodania zlúčenín cez tesné spojenia excitabilného tkaniva.

2.1 Spôsoby posilnenia funkcie excitabilného tkaniva

Jeden predmet predloženého vynálezu sa týka spôsobu posilnenia funkcie excitabilného tkaniva podávaním EPO molekuly, ktorá je schopná aktivovať program génovej expresie, ktorý posilňuje funkciu excitabilného tkaniva. Posilnenie funkcie excitabilného tkaniva poskytuje posilnenie učenia, asociatívneho učenia a pamäti. Rôzne ochorenia a stavy je možné zmeniť liečbou použitím tohto spôsobu a okrem toho je tento spôsob užitočný na posilnenie kognitívnej funkcie aj pri absencii akéhokoľvek stavu alebo ochorenia. Tieto použitia predloženého vynálezu sú podrobnejšie opísané nižšie a zahŕňajú posilnenie učenia a natrénovania tak u ľudí, ako aj u nehumánnych cicavcov.

Stavy a ochorenia liečiteľné spôsobmi podľa tohto predmetu predloženého vynálezu zahŕňajú akýkoľvek stav alebo chorobu, ktoré môžu mať úžitok z posilnenia funkcie neurónov. Príklady takýchto porúch zahŕňajú poruchy centrálneho nervového systému vrátane, ale bez obmedzenia na poruchy nálady, úzkostné poruchy, depresiu, autizmus, hyperaktívnu poruchu s nedostatkom pozornosti a kognitívnu dysfunkciu. Iné, neobmedzujúce príklady kognitívnych funkcií, ktoré môžu byť posilnené spôsobmi podľa vynálezu, sú opísané v časti 3.

V jednom uskutočnení môže byť EPO molekula podávaná napríklad subjektu alebo pacientovi, ktorý trpí poruchou vedúcou k strate kognitívnych funkcií, napríklad Alzheimerovou chorobou.

Schopnosť EPO posilňovať kognitívne funkcie je možné testovať na experimentálnych zvieratách použitím ktorejkoľvek z tu opísaných metód alebo použitím ktoréhokoľvek modelu učenia alebo kognitívnej funkcie, ktorý je akceptovaný v oblasti. Ako je opísané v príkladoch prezentovaných v príkladoch 1 a 2, zistilo sa, že periférne podávanie erytropoetínu posilňuje učenie a kognitívnu funkciu, čo sa demonštrovalo prostredníctvom niekoľkých dobre zavedených modelov učenia na normálnych experimentálnych zvieratách. Príkladmi takýchto modelov učenia sú Morrisov vodný bludiskový test, ktorého príklad je uvedený v

-13príklade 1, a test podmienenej chuťovej averzie (CTA), ktorého príklad je uvedený v príklade 2. V jednom uskutočnení sa napríklad používa test podmienenej chuťovej averzie (CTA), čo je citlivý, dobre známy, štandardný test, na testovanie kognitívnej funkcie zvierat po podaní EPO. CTA sa používa na testovanie schopnosti zvierat učiť sa asociovať chorobu s novým stimulom, ako napríklad chuťou, tak aby sa zvieratá vyhýbali novej chuti pri následnom opätovnom vystavení novému stimulu. CTA zahŕňa mozog v rôznych kortikálnych a subkortikálnych úrovniach. Asociácia, ktorá spája vzostupnú a zostupnú informáciu, produkujúca averzívne správanie, sa môže buď oslabiť, alebo posilniť prostredníctvom zmien ovplyvňovania ktorejkoľvek z prepájacích jednotiek. Ako forma asociatívneho učenia sa sila CTA determinuje veľkým množstvom premenných zahŕňajúc novosť orálnych stimulov (napr. stimul, ktorý nie je nový, nemôže byť averzívne podmienený), stupeň indukovanej choroby (toxicita), počet opakovaní (natrénovanie), počítanie nutkaní (ako napríklad smäd), aby sme vymenovali len niekoľko. Hoci veľké množstvo chemických a fyzikálnych činidiel môže produkovať CTA na dávke závislým spôsobom, chlorid lítny spoľahlivo spôsobuje nepokoj a anorexiu. Podobne ako prirodzene sa vyskytujúce ochorenie, spôsobuje lítium CTA prostredníctvom stimulovania vyššie opísaných dráh, vrátane vylučovania cytokínov.

Posilnenie excitabilnej bunkovej funkcie, napríklad kognitívnej funkcie, ponúka množstvo využití pre jedincov vo výchovnom a pracovnom prostredí a posilnenie schopnosti trénovať a učiť nehumánne cicavce.

2.2 Spôsoby ochrany excitabilného tkaniva pred poranením

V inom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu ochrany cicavca pred patológiou, ktorá je výsledkom poranenia excitabilného tkaniva. Ochrana sa poskytuje podávaním erytropoetínu, ktorý je účinný na ochranu excitabilného tkaniva pred poranením, cicavcovi periférnym spôsobom. Ako je podrobne uvedené v príklade 3 nižšie, EPO podávané pred toxínom kainátom pôsobí značne neuroprotektívne u myší, tým že zvyšuje prah záchvatov a predchádza smrti. Neuroprotektívny účinok EPO je rozsiahly a pretrvávajúci. Je pozoruhodné, že tu pozorované pozitívne účinky nastávajú príliš skoro po podaní EPO nato, aby boli výsledkom zvýšenia hematokrytu následkom erytropoetickej aktivity EPO. Okrem

-14toho, ako bolo uvedené vyššie, uskutočnenie vynálezu zahŕňa aj EPO bez schopnosti zvyšovať hematokryt.

V jednom uskutočnení môže byť predložený vynález výhodne používaný tak na akútnu, ako aj na chronickú profylaxiu a liečbu neurologických porúch, ako sú tu opísané, a na posilnenie kognitívnej funkcie normálneho alebo chorého mozgu. Ako bolo poznamenané vyššie, poškodenie a smrť neurónov v centrálnom nervovom systéme je vážnou a často letálnou udalosťou zodpovednou za vysoký stupeň morbidity a mortality v populácii. Akútne neurologické poškodenie môže nastať počas alebo ako následok záchvatov, kŕčov, epilepsie, mŕtvice, krvácania, poranenia centrálneho nervového systému, hypoxie, hypoglykémie, hypotenzie a mozgovej alebo miechovej traumy. Predložený vynález poskytuje akútne podanie na liečbu akútnych udalostí.

V jednom uskutočnení sa spôsoby podľa vynálezu môžu použiť napríklad na ochranu cicavca pred poranením, ktoré je výsledkom poškodenia mozgu ožiarením.

V inom uskutočnení je vážnym stavom, ktorý je možné liečiť alebo ktorému je možné predchádzať podľa predloženého vynálezu, profylaxia a liečba prenatálnych hypoxických stavov v maternici, popôrodná liečba na ochranu mozgu pred hypoxickým poranením pretrvávajúcim počas rodenia, ako aj dusenia, zaklinenia a iných stavov, pri ktorých je riziko neurotoxického poškodenia centrálneho nervového systému následkom nedostatku kyslíka alebo následkom vystavenia inému neurotoxickému stimulu. Ako je dobre známe, jedinci, ktorý trpia hypoxiou počas pôrodu alebo ako následok nefatálnych hypoxických udalostí alebo incidentov, môžu trpieť neurologickým deficitom po celý život. Hypoxia a/alebo zníženie cerebrálneho prietoku krvi, ktoré môžu nastať po traume alebo počas operačných zákrokov, tiež nesú riziko spôsobenia celoživotného neurologického deficitu.

Tu poskytnutými spôsobmi je liečiteľná aj pooperačná kognitívna dysfunkcia vrátane deficitov po použití srdcovo-pľúcneho prístroja. Okrem toho sa predložené spôsoby môžu aplikovať na liečbu hypoxie, ktorá je výsledkom otravy oxidom uhoľnatým alebo inhalácie dymu.

V inom uskutočnení sa EPO používa na ochranu srdcového tkaniva pred poranením spôsobeným počas ischémie, infarktu, zápalu alebo traumy.

-15Toto sú neobmedzujúce príklady poškodenia excitabilného tkaniva, ktoré je možné liečiť podľa predloženého vynálezu. Akútna a skorá liečba týchto porúch sa môže uskutočniť mobilnými pohotovostnými zdravotníkmi tak, aby liečba mohla začať hneď, keď sa zistí podozrenie na potenciálne neurologické poškodenie. Riziko neurologického poškodenia indukovaného pôrodom sa môže znížiť profylaktickou liečbou plodu pred alebo počas pôrodu. Priemernému odborníkovi v oblasti budú známe tieto a iné využitia a situácie.

2.3 Spôsoby dodávania zlúčenín

Predložený vynález sa ďalej týka spôsobu uľahčenia transportu molekuly cez endoteliálnu bunkovú bariéru u cicavca podávaním prostriedku, ktorý obsahuje danú molekulu spojenú s erytropoetínom. Ako bolo poznamenané vyššie, pôvodcovia tu zistili dovtedy neočakávaný a prekvapujúci účinok periférne podávaného EPO na excitabilné tkanivo, ako napríklad nervové tkanivo v centrálnom nervovom systéme, periférnom nervovom systéme alebo na srdcové tkanivo, tým že identifikovali EPO ako molekulu schopnú prechádzať cez tesné spojenia takéhoto excitabilného tkaniva, ako napríklad cez krvno-mozgovú bariéru. Ako taký, EPO je užitočný ako nosič na dodávanie iných molekúl cez krvno-mozgovú bariéru a podobné bariéry.

V jednom uskutočnení môžu byť molekuly viažuce EPO receptor zahŕňajúce molekulu konjugované s EPO molekulou, použité na transport týchto molekúl cez krvno-mozgovú bariéru. Takéto molekuly tým môžu byť nesené na EPO, aby boli dodané cez krvno-mozgovú bariéru. V inom uskutočnení môže byť protilátka alebo iný väzobný partner molekuly spojený s EPO alebo modulátorom EPO receptorovej aktivity, a tým sa molekula, ktorá sa má transportovať asociuje nekovalentným viazaním s väzobným partnerom, ktorý je ešte spojený s transportovateľnou EPO molekulou. V inom uskutočnení sú v tu opísanom spôsobe užitočné molekuly viažuce sa na EPO receptor, ktoré obsahujú protilátky proti EPO receptoru. Takéto protilátky poskytujú transportný nosič, na ktorom sa môžu prevážať iné molekuly, zväčša rovnakým spôsobom, ako boli protilátky proti transferínovému receptoru použité na získanie prístupu cez krvno-mozgovú bariéru (Pardridge a ďalší, 1991, Selective Transport of an antitransferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J. Pharmacol. Exp. Therap. 27: 66).

-16Priemerný odborník v oblasti bude informovaný o rôznych prostriedkoch na spojenie molekúl s EPO a vyššie opísanými inými činidlami kovalentne, nekovalentne a iným spôsobom. Okrem toho sa môže zhodnotenie účinnosti prostriedku jednoducho determinovať v experimentálnom systéme. Spojenie molekúl s EPO a analógmi sa môže dosiahnuť akýmkoľvek z množstva prostriedkov, vrátane labilnej, kovalentnej väzby, krížového prepojenia atď. V jednom uskutočnení sa spojenie medzi molekulou, ktorá sa má transportovať cez bariéru, a erytropoetínom môže uskutočniť napríklad labilnou kovalentnou väzbou, pričom v takom prípade sa molekula uvoľní zo spojenia s EPO po prejdení bariéry. V jednom uskutočnení môžu byť využité biotín/avidínové interakcie. V inom uskutočnení, ako bolo uvedené vyššie, je možné pripraviť hybridnú molekulu rekombinantnými alebo syntetickými prostriedkami, ktorá napríklad zahŕňa tak doménu molekuly s požadovaným farmakologickým účinkom, ako aj doménu zodpovednú za moduláciu EPO receptorovej aktivity.

Molekula môže byť konjugovaná s EPO alebo modulátorom aktivity EPO receptora prostredníctvom polyfunkčnej molekuly, tzn. polyfunkčného krížového spojovníka. Tak ako je používanú tu, zahŕňa výraz poiyfunkčná molekula molekuly s jednou funkčnou skupinou, ktorá môže reagovať viac ako raz po sebe, ako napríklad formaldehyd, ako aj molekuly s viac ako jednou reaktívnou skupinou. Tak ako je používaný tu, znamená výraz reaktívna skupina funkčnú skupinu na krížovom spojovníku, ktoré reaguje s funkčnou skupinou na molekule (napr. peptide, proteíne, uhľovodíku, nukleovej kyseline, najmä hormóne, antibiotiku alebo protinádorovom činidle, ktoré sa majú dodať cez endoteliálnu bunkovú bariéru), tak aby sa vytvorila kovalentná väzba medzi krížovým spojovníkom a touto molekulou. Výraz funkčná skupina si zachováva svoj význam štandardný v organickej chémii. Polyfunkčné molekuly, ktoré môžu byť použité, sú výhodne biokompatibilné spojovníky, tzn. sú nekarcinogénne, netoxické a v podstate neimunogénne in vivo. Polyfunkčné krížové spojovníky, ako napríklad tie ktoré sú známe v oblasti, a tu opísané, môžu byť jednoducho testované na zvieracích modeloch, aby sa stanovila ich biokompatibilita. Poiyfunkčná molekula je výhodne bifunkčná. Tak ako je používaný tu, označuje výraz bifunkčná molekula molekulu s dvoma reaktívnymi skupinami. Bifunkčná molekula môže byť heterobifunkčná alebo homobifunkčná.

-17Heterobifunkčný krížový spojovník umožňuje vektorovú konjugáciu. Je výnimočne výhodné, aby bola polyfunkčná molekula dostatočne rozpustná vo vode, aby sa krížové prepájacie reakcie uskutočňovali vo vodných roztokoch, ako napríklad vo vodných roztokoch tlmených na pH 6 až 8, a aby výsledný konjugát ostal rozpustný vo vode, kvôli účinnejšej bio-distribúcii. Typicky sa polyfunkčná molekula kovalentne viaže s amino alebo sulfhydrylovou funkčnou skupinou. Avšak predložený vynález zahŕňa aj polyfunkčné molekuly reaktívne s inými funkčnými skupinami, ako napríklad s karboxylovými kyselinami alebo s hydroxylovými skupinami.

Homobifunkčné molekuly majú najmenej dve reaktívne funkčné skupiny, ktoré sú rovnaké. Reaktívne funkčné skupiny homobifunkčnej molekuly zahŕňajú napríklad aldehydové skupiny a aktívne esterové skupiny. Homobifunkčné skupiny majúce aldehydové skupiny zahŕňajú napríklad glutaraldehyd a subaraldehyd. Použitie glutaraldehydu ako krížového spojovníkového činidla je opísané v publikácii Poznansky a ďalší, Science 223, 1304-1306 (1984). Homobifunkčné molekuly majúce najmenej dve aktívne esterové jednotky zahŕňajú estery dikarboxylových kyselín a N-hydroxysukcinimidu. Niektoré príklady takýchto /V-sukcinimidylových esterov zahŕňajú disukcinimidylsuberát a ditio-b/s-(sukcinimidylpropionát) a ich rozpustnú ô/'s-sulfónovú kyselinu a ô/s-sulfonátové soli, ako napríklad ich sodné a draselné soli. Tieto homobifunkčné reakčné činidlá sú dostupné od firmy Pierce, Rockford, Illinois.

Heterobifunkčné molekuly majú najmenej dve odlišné reaktívne skupiny. Reaktívne skupiny reagujú s odlišnými funkčnými skupinami, ktoré sa napr. nachádzajú na EPO a na danej molekule. Týmito dvomi odlišnými funkčnými skupinami, ktoré reagujú s heterobifunkčným krížovým spojovníkom, sú zvyčajne aminoskupina, napr. epsilon aminoskupina lyzínu; sulfhydrylová skupina, napr. tiolová skupina cysteínu; karboxylová kyselina, napr. karboxylát na kyseline asparágovej; alebo hydroxylová skupina, napr. hydroxylová skupina na seríne.

Keď reaktívna skupina heterobifunkčnej molekuly vytvorí kovalentnú väzbu s aminoskupinou, bude kovalentná väzba zvyčajne amido alebo imido väzba. Reaktívnou skupinou, ktorá vytvára kovalentnú väzbu s aminoskupinou, môže byť napríklad aktivovaná karboxylátová skupina, halogénkarbonylová skupina alebo esterová skupina. Výhodnou halogénkarbonylovou skupinou je chlórkarbonylová

-18skupina. Esterovými skupinami sú výhodne reaktívne esterové skupiny, ako napríklad /V-hydroxy-sukcinimidová esterová skupina.

Inou funkčnou skupinou je typicky buď tiolová skupina, alebo skupina, ktorú je možné konvertovať na tiolovú skupinu, alebo skupina, ktorá vytvára kovalentnú väzbu s tiolovou skupinou. Kovalentná väzba bude zvyčajne tioéterová väzba alebo disulfidová väzba. Reaktívnou skupinou, ktorá vytvára kovalentnú väzbu s tiolovou skupinou, môže byť napríklad dvojitá väzba, ktorá reaguje s tiolovými skupinami alebo aktivovaným disulfidom. Reaktívnou skupinou obsahujúcou dvojitú väzbu, ktorá je schopná reagovať s tiolovou skupinou, je maleinidová skupina, hoci možné sú aj iné, napríklad akrylonitril. Reaktívnou disulfidovou skupinou môže byť napríklad 2-pyridylditio skupina alebo kyselina 5,5’-ditio-b/s-(2-nitrobenzoová). Niektoré príklady heterobifunkčných reakčných činidiel obsahujúcich reaktívne disulfidové väzby zahŕňajú /V-sukcinimidyl-3-(2-pyridyl-ditio)propionát (Carlsson a ďalší, 1978, Biochem J., 173:723-737), 5-4-sukcinimidyloxykarbonyl-a-metylbenzyltiosulfát sodný a 4-sukcinimidyloxykarbonyl-a-metyl-(2-pyridylditio)toluén. Výhodný je A/-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát. Niektoré príklady heterobifunkčných reakčných činidiel, ktoré obsahujú reaktívne skupiny majúce dvojitú väzbu, ktorá reaguje s tiolovou skupinou, zahŕňajú sukcinimidyl 4-(/V-maleimidometyl)cyklohexán1-karboxylát a sukcinimidyl m-maleimidobenzoát.

Iné heterobifunkčné molekuly zahŕňajú sukcinimidyl 3-(maleimido)propionát, sulfosukcinimidyl 4-(p-maleimidofenyl)butyrát, sulfosukcinimidyl-4-(/V-maleimidometylcyklohexán)-1 -karboxylát, maleimidobenzoyl-/V-hydroxy-sukcinimidový ester. Výhodná je sodná sulfonátová soľ sukcinimidyl m-maleimidobenzoátu. Mnohé vyššie uvedené heterobifunkčné reakčné činidlá a ich sulfonátové soli sú dostupné od firmy Pierce.

Vyššie opísaná potreba, aby bol konjugát reverzibilný alebo labilný, je jednoducho determinovateľná priemerným odborníkom v oblasti. Konjugát môže byť testovaný in vitro, tak z hľadiska modulačného účinku na EPO receptorovú aktivitu, ako aj z hľadiska požadovanej farmakologickej aktivity. Ak si konjugát zachováva obe vlastnosti, môže byť jeho vhodnosť potom testovaná in vivo. Ak si konjugovaná molekula vyžaduje oddelenie od EPO nato, aby bola účinná, výhodná bude labilná

-19väzba alebo reverzibilné spojenie s EPO. Pred in vivo testovaním je možné testovať aj charakteristiky lability použitím štandardných in vitro postupov.

Ďalšie informácie týkajúce sa toho ako vyrábať a používať tieto, ako aj iné polyfunkčné reakčné činidlá, je možné získať z nasledujúcich publikácií alebo z iných publikácií dostupných v oblasti: Carlsson a ďalší, 1978, Biochem. J. 173:723737; Cumber a ďalší, 1985, Methods in Enzymology 112:207-224; Jue a ďalší,

1978, Biochem. 17:5399-5405; Sun a ďalší, 1974, Biochem. 13:2334-2340; Blattler a ďalší, 1985, Biochem. 24:1517-152; Liu a ďalší, 1979, Biochem. 18:690-697; Youle a Neville, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486; Lerner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407; Jung a Moroi, 1983, Biochem. Biophys. Acta 761:162; Caulfield a ďalší, 1984, Biochem. 81:7772-7776; Staros, J.V., 1982, Biochem. 21:3950-3955; Yoshitake a ďalší, 1979, Eur. J. Biochem. 101:395-399; Yoshitake a ďalší, 1982, J. Biochem. 92:1413-1424; Pilch a Czech,

1979, J. Biol. Chem. 254:3375-3381; Novick a ďalší, 1987, J. Biol. Chem. 262:84838487; Lomant a Fairbanks, 1976, J. Mol. Biol. 104:243-261; Hamada a Tsuruo, 1987, Anál. Biochem. 160:483-488; a Hashida, 1984, J. Applied Biochem. 6:56-63. Prehľad ďalších metód krížového prepájania je uvedený v Means a Feeney, 1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12. Bariéry, ktorými sa dá prejsť prostredníctvom vyššie opísaných metód a prostriedkov podľa predloženého vynálezu, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na krvno-mozgovú bariéru, krvno-očnú bariéru, krvno-semenníkovú bariéru, krvno-vaječníkovú bariéru a krvno-placentárnu bariéru.

Kandidátske molekuly na transport cez endoteliálnu bunkovú bariéru zahŕňajú napríklad hormóny, ako napríklad rastový hormón, neurotrofné faktory, antibiotiká alebo antifungálne činidlá, ktoré sú normálne neprístupné pre mozog alebo iné bariérované orgány, peptidy, rádiofarmaceutiká, antisense liečivá, protilátky proti biologicky aktívnym činidlám, farmaceutiká a protinádorové činidlá. Neobmedzujúce príklady takýchto molekúl zahŕňajú rastový hormón, nervový rastový faktor (NGF), mozgový neurotrofný faktor (BNF), riasinkový neurotrofný faktor (CTF), základný fibroblastový rastový faktor (bFGF), transformujúci rastový faktor β1 (ΤΘΡβΙ), transformujúci rastový faktor β2 (ΤΘΡβ2), transformujúci rastový faktor β3 (ΤΘΡβ3), interleukín 1, interleukín 2, interleukín 3 a interleukín 6, AZT, ·

-20protilátky proti nádorovému nekrotickému faktoru a imunosupresívne činidlá, ako napríklad cyklosporín.

V inom uskutočnení môžu byť rekombinantné chimérne toxínové molekuly obsahujúce EPO použité na terapeutické dodávanie toxínov na liečbu vírusovej poruchy alebo proliferatívnej poruchy, ako napríklad rakoviny. Zlúčeniny, ktoré by mohli byť fúzované s EPO na konštrukciu chimérneho toxínu vhodného na toto uskutočnenie, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na toxínové látky, ako napríklad pseudomonas exotoxín, diftéria toxín a ricín, okrem iných.

3. Cieľové stavy

Ako je opísané vyššie, tu poskytnuté EPO prostriedky a spôsoby ich použitia, môžu byť použité na liečbu a prevenciu stavov vyplývajúcich z hypoxických stavov, ktoré negatívne ovplyvňujú excitabilné tkanivá, ako napríklad excitabilné tkanivá v centrálnom nervovom systéme, periférnom nervovom systéme alebo srdcové tkanivo, ako napríklad mozog, srdce alebo sietnicu. Takže vynález môže byť použitý na liečbu alebo prevenciu poškodenia excitabilného tkaniva vyplývajúceho z hypoxických stavov v rôznych podmienkach a za rôznych okolností. Neobmedzujúce príklady takýchto podmienok a okolností sú poskytnuté nižšie.

V príklade ochrany neurónových tkanivových patológií liečiteľných podľa predloženého vynálezu, takéto patológie zahŕňajú také stavy, ktoré sú výsledkom zníženého okysličovania neurónových tkanív. Akýkoľvek stav, ktorý redukuje dostupnosť kyslíka pre neurónové tkanivo, a vedie k stresu, poškodeniu a nakoniec k smrti neuronálnych buniek, je možné liečiť spôsobmi podľa predloženého vynálezu. Všeobecne sa ako hypoxia a/alebo ischémia označujú tie stavy, ktoré vyplývajú z alebo zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na mŕtvicu, upchatie cievy, prenatálny alebo postnatálny nedostatok kyslíka, dusenie, zaklinenie, topenie, otravu oxidom uhoľnatým, inhaláciu dymu, traumu, vrátane operácie a rádioterapie, asfyxiu, epilepsiu, hypoglykémiu, chronickú obštrukčnú pľúcnu chorobu, emfyzém, syndróm respiračnej vyčerpanosti dospelých, hypotenzívny šok, septický šok, anafylaktický šok, inzulínový šok, krízu kosáčikovitých krviniek, zástavu srdca, dysrytmiu a dusíkovú narkózu.

r r

-21 V jednom uskutočnení môže byť EPO podávané napríklad ako prevencia poranenia alebo poškodenia tkaniva pri riziku poranenia alebo poškodenia tkaniva v priebehu chirurgických zákrokov, ako napríklad pri resekcii nádoru alebo oprave aneuryzmy.

Iné patológie spôsobené alebo vyplývajúce z hypoglykémie, ktoré sú liečiteľné tu opísanými spôsobmi, zahŕňajú predávkovanie inzulínom, tiež označované ako iatrogénna hyperinzulinémia, inzulinóm, nedostatok rastového faktora, hypokortizolizmus, predávkovanie sa liekmi a niektoré nádory.

Iné patológie vyplývajúce z poškodenia excitabilného neuronálneho tkaniva zahŕňajú záchvatové poruchy, ako napríklad epilepsiu, kŕče alebo chronické záchvatové poruchy. Iné liečiteľné stavy a choroby zahŕňajú ochorenia, akými sú napríklad mŕtvica, skleróza multiplex, hypotenzia, zástava srdca, Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, mozgová obrna, mozgová alebo miechová trauma, AIDS demencia, s vekom súvisiaca strata kognitívnej funkcie, strata pamäti, amyotrofná laterálna skleróza, záchvatové poruchy, alkoholizmus, ischémia sietnice, poškodenie očného nervu následkom glaukómu a strata neurónov.

Spôsoby podľa vynálezu môžu byť použité na liečbu stavov a poškodenia sietnicového tkaniva. Takéto poruchy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na degeneráciu škvrny, odpojenie sietnice, retinis pigmentosa, arteriosklerotickú retinopatiu, hypertenzívnu retinopatiu, blokádu sietnicovej artérie, blokádu sietnicovej cievy, hypotenziu a diabetickú retinopatiu.

V inom uskutočnení môžu byť spôsoby podlá vynálezu použité na ochranu alebo liečbu poranenia následkom poškodenia excitabilného tkaniva ožiarením.

Ďalším využitím spôsobov podľa predloženého vynálezu je liečba neurotoxínovej otravy, ako napríklad otravy mäkkýšovou kyselinou domoovou, neurolatyrizmu a Guamovej choroby, liečba amyotrofnej laterálnej sklerózy a Parkinsonovej choroby.

Ako bolo uvedené vyššie, predložený vynález sa týka aj spôsobu posilnenia funkcie excitabilného tkaniva u cicavca periférnym podávaním erytropoetínu. Rôzne choroby a stavy je možné zmeniť liečbou použitím tohto spôsobu, a okrem toho je tento spôsob užitočný na posilnenie kognitívnej funkcie aj pri absencii nejakého stavu alebo ochorenia. Tieto použitia predloženého vynálezu sú podrobnejšie

-22opísané nižšie a zahŕňajú posilnenie učenia a trénovania tak u človeka, ako aj u nehumánnych cicavcov.

Stavy a ochorenia liečiteľné spôsobmi podľa tohto predmetu predloženého vynálezu sa týkajú centrálneho nervového systému a zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na poruchy nálady, úzkostné poruchy, depresiu, autizmus, hyperaktívnu poruchu s nedostatkom pozornosti a kognitívnu dysfunkciu. Týmto stavom prospieva posilnenie neuronálnej funkcie.

Iné poruchy liečiteľné podľa predloženého vynálezu zahŕňajú prerušovanie spánku, napríklad zástavu dýchania v spánku, a poruchy súvisiace s cestovaním; subarachnoidálne a aneuryzmové krvácanie, hypotenzívny šok, otrasové poranenie, septický šok, anafylaktický šok a ochorenia nasledujúce po rôznych encefalitídach a meningitídach, napríklad cerebrititídy súvisiace s ochorením spojivového tkaniva, ako napríklad lupus. Iné použitia zahŕňajú prevenciu alebo ochranu pred otravou neurotoxínmi, ako napríklad otravou mäkkýšovou kyselinou domoovou, neurolatyrizmom a Guamovou chorobou, amyotrofnou laterálnou sklerózou, Parkinsonovou chorobou; pooperačnú liečbu embolického alebo ischemického poranenia; prevenciu alebo ochranu pred ožiarením celého mozgu; krízou kosáčikovitých krviniek; a eklampsiou.

Ďalšia skupina stavov liečiteľných spôsobmi podľa predloženého vynálezu zahŕňa mitochondriálnu dysfunkciu, buď vrodenej, alebo získanej povahy, ktorá je príčinou rôznych neurologických chorôb, pre ktoré je typické poranenie a smrť neurónov. Napríklad Leighova choroba (subakútna nekrotizujúca encefalopatia) je charakteristická progresívnou stratou zraku a encefalopatiou, v dôsledku zníženia počtu neurónov a myopatie. V týchto prípadoch defektný mitochondriálny metabolizmus nie je schopný dodať dostatok vysoko energetických substrátov na pohon metabolizmu excitabilných buniek. Modulátor EPO receptorovej aktivity optimalizuje zlyhávajúcu funkciu pri rôznych mitochondriálnych ochoreniach.

Ako bolo uvedené vyššie, hypoxické stavy nežiadúco ovplyvňujú excitabilné tkanivá. Excitabilné tkanivá zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na tkanivo centrálneho nervového systému, tkanivo periférneho nervového systému a srdcové tkanivo. Okrem vyššie opísaných stavov sú spôsoby podľa predloženého vynálezu užitočné na liečbu inhalačnej otravy, ako napríklad otravy oxidom uhoľnatým a otravy

-23inhaláciou dymu, ťažkej astmy, syndrómu respiračnej vyčerpanosti dospelých a dusenia a topenia. Ďalšie stavy, ktoré vytvárajú hypoxické podmienky, alebo ktoré akýmkoľvek iným spôsobom indukujú poškodenie excitabilného tkaniva, zahŕňajú hypoglykémiu, ktorá môže nastať pri nesprávnom dávkovaní inzulínu, alebo inzulínom produkované neoplazmy (inzulinómy).

Predloženými spôsobmi sú liečiteľné rôzne neuropsychologické poruchy, ktoré sa považujú za poruchy spôsobené poškodením excitabilného tkaniva. Chronické poruchy, na ktorých sa môže podieľať poškodenie neurónov, a ktoré je možné liečiť predloženým vynálezom, zahŕňajú poruchy týkajúce sa centrálneho nervového systému a/alebo periférneho nervového systému vrátane s vekom súvisiacej straty kognitívnej funkcie a senilnej demencie, chronických záchvatových porúch, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby, demencie, straty pamäte, amyotrofnej laterálnej sklerózy, sklerózy multiplex, tuberóznej sklerózy, Wilsonovej choroby, mozgovej a progresívnej supranukleárnej obrny, Guamovej choroby, Lewy telieskovej demencie, priónových chorôb, ako napríklad spongiformných encefalopatií, napr., Croutzfeldt-Jakobovej choroby, Huntingtonovej choroby, myotonickej dystrofie, Freidrichovej ataxie a iných ataxií, ako aj Gilles de la Tourette syndrómu, záchvatových porúch, ako napríklad epilepsie a chronickej záchvatovej poruchy, mŕtvice, mozgovej alebo miechovej traumy, AIDS demencie, alkoholizmu, autizmu, sietnicovej ischémie, glaukómu, autonómnych funkčných porúch, ako napríklad hypertenzie a spánkových porúch, a neuropsychiatrických porúch, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na schizofréniu, schizoafektívnu poruchu, poruchu nedostatku pozornosti, poruchu vyplývajúcu z nesprávnej funkcie týmusu, hlavnú depresívnu poruchu, mániu, obsesívnu-kompulzívnu poruchu, poruchy súvisiace s používaním psychoaktívnych látok, úzkosť, panickú poruchu, ako aj unipoláme a bipolárne afektívne poruchy. Ďalšie neuropsychiatrické a neurodegeneratívne poruchy zahŕňajú napríklad poruchy uvedené v American Psychiatrie Association’s Diagnostic and Statistical manual of Mental Disorders (DSM), ktorého najsúčastnejšia verzia je tu komplet zahrnutá jeho citáciou.

V inom uskutočnení sa rekombinantné chimérne toxínové molekuly obsahujúce EPO môžu používať na terapeutické dodávanie toxínov na liečbu • ·

-24proliferatívnej poruchy, ako napríklad rakoviny, alebo vírusovej poruchy, ako napríklad subakútnej sklerotizujúcej panencefalopatie.

4. Farmaceutické prípravky a podávanie

V súlade s vynálezom sa EPO, jeho analógy, napodobeniny, erytropoetínové fragmenty, hybridné erytropoetínové molekuly, molekuly viažuce sa na erytropoetinový receptor, erytropoetínové agonisty, obličkový erytropoetín, mozgový erytropoetín, ich muteíny a ich obdoby môžu zavádzať parenterálne, transmukózne, napr. orálne, nazálne, rektálne, intravaginálne, sublinguálne, submukózne alebo transdermálne. Výhodne je podávanie parenterálne, napr. prostredníctvom intravenóznej alebo intraperitoneálnej injekcie a zahŕňa aj, ale nie je obmedzené na intraarteriálne, intramuskulárne, intradermálne a subkutánne podanie. Výhodným spôsobom podávania malých molekulových EPO napodobenín je orálny spôsob.

Subjektom, pre ktorý môže byť periférne podávanie EPO účinným terapeutickým režimom, je výhodne človek, ale môže to byť akékoľvek zviera, výhodne cicavec. Takže, ako je zrejmé pre priemerného odborníka v oblasti, spôsoby a farmaceutické prostriedky podľa predloženého vynálezu sú vhodné najmä na podávanie akémukoľvek zvieraťu, najmä cicavcovi zahŕňajúc, ale bez obmedzenia na domáce zvieratá, ako napríklad mačky alebo psy, hospodárske zvieratá, ako napríklad, ale bez obmedzenia na hovädzí dobytok, kone, kozy, ovce a ošípané, divé zvieratá (či už vo voľnej prírode alebo v zoologickej záhrade), pokusné zvieratá, ako napríklad myši, potkany, králiky, kozy, ovce, ošípané, psy, mačky, atď. Ako bolo uvedené vyššie, domestifikované zvieratá, vrátane doma chovaných zvierat a pracovných zvierat, sú kandidátmi tak na využitie neuroprotektívnych výhod podľa predloženého vynálezu, ako aj na posilnenie kognitívnej funkcie. Medzi takýmito zvieratami je bežné neurologické poškodenie následkom hypoxie, ako aj akútne a chronické poruchy vrátane epilepsie, a tak sú kandidátmi na liečbu. Ako bolo uvedené aj vyššie, kognitívne posilnenie u nehumánnych zvierat je výhodné podľa predloženého vynálezu v tom, že učenie, trénovanie a udržanie naučeného správania môže byť posilnené, znovu upevňované a udržiavané použitím techník podľa predloženého vynálezu. Takže sa znižujú náklady a psychologická záťaž vlastníka zvieraťa. Skracuje sa napríklad čas potrebný na

P P

-25trénovanie psov a iných domácich zvierat. Okrem toho, divo žijúce zvieratá, ktoré sú typicky ťažko trénovateľné, môžu byť lepšími kandidátmi na tréning prostredníctvom spôsobov podľa predloženého vynálezu.

4.1 Formulácia a účinná dávka

Predložený vynález poskytuje aj farmaceutické prostriedky. Farmaceutické prostriedky obsahujúce EPO a modulátory EPO receptorovej aktivity sa môžu podávať pacientovi v terapeuticky účinných dávkach na ochranu excitabilného tkaniva pred poškodením, na posilnenie funkcie excitabilného tkaniva alebo na dodanie zlúčeniny do excitabilného tkaniva. Pôvodcovia zistili, že zvýšená dávka EPO je výhodná na moduláciu excitabilného tkaniva a na ochranu excitabilného tkaniva pred poranením.

Výber výhodnej účinnej dávky bude stanovený odborníkom v oblasti na základe zváženia niekoľkých faktorov, ktoré budú pre priemerného odborníka v oblasti známe. Takéto faktory zahŕňajú konkrétnu formu erytropoetínu a jeho farmakokinetické parametre, ako biologickú dostupnosť, metabolizmus, polčas rozpadu, atd’., ktoré sa stanovia počas zvyčajných vývojových postupov, ktoré sa typicky využívajú v priebehu získavania regulačného povolenia pre farmaceutickú zlúčeninu. Ďalšie faktory pri zvažovaní dávky zahŕňajú stav alebo chorobu, ktorá sa má liečiť, alebo úžitok, ktorý sa má dosiahnuť pri normálnom jedincovi, telesnú hmotnosť pacienta, spôsob podávania, či je podávanie akútne alebo chronické, súbežne podávané medikamenty a iné faktory, o ktorých je dobre známe, že ovplyvňujú účinnosť podávaných farmaceutických činidiel. Takže presná dávka musí byť určená v súlade s posúdením ošetrujúceho lekára a okolností každého pacienta, napr. v závislosti na stave a imunitnom statuse jednotlivého pacienta, v súlade so štandardnými klinickými technikami.

V jednom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutický prostriedok v dávkovej jednotkovej forme adaptovanej na moduláciu excitabilného tkaniva, posilnenie kognitívnej funkcie alebo dodanie zlúčenín cez tesné endoteliálne spojenia, ktorý obsahuje, na dávkovú jednotku, účinné netoxické množstvo v rozsahu od 50000 do 500000 jednotiek, od 60000 do 50000 jednotiek, od 70000 do 500000 jednotiek, od 80000 do 500000 jednotiek, od 90000 do 500000 jednotiek, od

-26100000 do 500000 jednotiek, od 150000 do 500000 jednotiek, od 200000 do 500000 jednotiek, od 250000 do 500000 jednotiek, od 300000 do 500000 jednotiek, od 350000 do 500000 jednotiek, od 400000 do 500000 jednotiek alebo od 450000 do 500000 jednotiek EPO, modulátora EPO receptorovej aktivity alebo modulátora EPO-aktivovaného receptora a farmaceutický prijateľný nosič. Vo výhodnom uskutočnení je účinné, netoxické množstvo EPO v rozsahu od približne 50000 do 500000 jednotiek.

V jednom uskutočnení môže byť takýto EPO farmaceutický prostriedok podávaný systémovo, aby sa chránilo excitabilné tkanivo pred poškodením, aby sa posilnila funkcia excitabilného tkaniva, alebo aby sa dodala do excitabilného tkaniva zlúčenina. Takéto podanie môže byť parenterálne, transmukózne, napr. orálne, nazálne, rektálne, intravaginálne, sublinguálne, submukózne alebo transdermálne. Výhodne je podanie parenterálne, napr. prostredníctvom intravenóznej alebo intraperitoneálnej injekcie, a vrátane, ale bez obmedzenia na intraarteriálne, intramuskulárne, intradermálne a subkutánne podanie.

Vo výhodnom uskutočnení sa EPO môže podávať systémovo v dávke medzi 2000 a 10000 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, výhodne medzi približne 2000 a 5000 jednotiek/kg telesnej hmotnosti, najvýhodnejšie 5000 jednotiek/kg telesnej hmotnosti na podanie. Táto účinná dávka by mala byť dostatočná na to, aby sa po podaní EPO dosiahli sérové hladiny EPO vyššie ako približne 10000, 15000 alebo 20000 mll/ml séra. Takéto sérové hladiny sa môžu dosiahnuť približne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 hodín po podaní. Ak je to nevyhnutné, môžu sa takéto dávky opakovať. Podanie sa môže napríklad opakovať denne, pokiaľ to je klinicky nevyhnutné, alebo po príslušnom intervale, napr. každých 1 až 12 týždňov, výhodne každých 3 až 8 týždňov. V jednom uskutočnení môže byť účinné množstvo EPO a farmaceutický prijateľný nosič zbalené v jednotkovej dávkovej liekovke alebo v inej nádobe. V jednom uskutočnení je EPO neerytropoetické, tzn. je schopné uskutočňovať tu opísané aktivity, ale nespôsobuje zvýšenie koncentrácie hemoglobínu alebo hematokrytu. V inom uskutočnení sa EPO podáva v dávke, ktorá je vyššia ako dávka nevyhnutná na maximálnu stimuláciu erytropoézy.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu môžu obsahovať terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny a farmaceutický prijateľný nosič. V konkrétnom

-27uskutočnení znamená výraz farmaceutický prijateľný schválený regulačnou agentúrou federálnej alebo štátnej vlády alebo uvedený v U.S. Pharmacopeia alebo inej všeobecne uznávanej farmakopei na použitie pre zvieratá a najmä ľudí. Výraz nosič označuje riedidlo, adjuvans, excipient alebo vehikulum, s ktorým sa podáva terapeutikum. Takýmito farmaceutickými nosičmi môžu byť sterilné kvapaliny, ako napríklad soľné roztoky vo vode a olejoch, vrátane olejov naftového, živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, ako napríklad v arašidovom oleji, sójovom oleji, minerálnom oleji, sezamovom oleji a podobne. Keď sa farmaceutický prostriedok podáva intravenózne, výhodným nosičom je soľný roztok. Ako kvapalné nosiče môžu byť využité aj soľné roztoky a vodné dextrózové a glycerolové roztoky, najmä pre injektabilné roztoky. Vhodné farmaceutické excipienty zahŕňajú škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatínu, slad, ryžu, múku, kriedu, silikagél, stearan sodný, monostearan glycerolu, mastenec, chlorid sodný, sušené odstredené mlieko, glycerol, propylén, glykol, vodu, etanol a podobne. Ak je to želateľné, obsahuje prostriedok aj minoritné množstvá zmáčacích alebo emulzifikačných činidiel alebo činidiel udržiavajúcich pH. Tieto prostriedky môžu byť vo forme roztokov, suspenzií, emulzií, tabletiek, piluliek, kapsúl, práškov, formulácií s nepretržitým uvoľňovaním a podobne. Prostriedok môže byť formulovaný ako čípok s tradičnými spojivami a nosičmi, ako napríklad triglyceridmi. Prostriedky podľa vynálezu môžu byť formulované v neutrálnej forme alebo vo forme solí. Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú soli vytvorené s voľnými aminoskupinami, napríklad soli odvodené od kyseliny chlorovodíkovej, fosforečnej, octovej, oxálovej, vínnej, atď., a soli tvorené s voľnými karboxylovými skupinami, ako napríklad soli odvodené od hydroxidu sodného, draselného, amónneho, vápenatého, železitého, od izopropylamínu, trietylamínu, 2-etylaminoetanolu, histidínu, prokaínu, atď. Príklady vhodných farmaceutických nosičov sú opísané v Remington’s Pharmaceutical Sciences od E.W. Martina. Takéto prostriedky budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny, výhodne v purifikovanej forme, spolu s vhodným množstvom nosiča, aby sa poskytla forma na správne podávanie pacientovi. Formulácia by mala byť v zhode so spôsobom podávania.

Farmaceutické prostriedky adaptované na orálne podávanie môžu byť poskytnuté vo forme kapsúl alebo tabletiek; ako prášky alebo granuly; ako roztoky,

-28sirupy alebo suspenzie (vo vodných alebo nevodných kvapalinách); ako jedlé peny alebo šľahačky; alebo ako emulzie. Tabletky alebo tvrdé želatínové kapsuly môžu obsahovať laktózu, škrob alebo ich deriváty, stearan horečnatý, sodný sacharín, celulózu, uhličitan horečnatý, kyselinu stearovú alebo jej soli. Mäkké želatínové kapsuly môžu obsahovať rastlinné oleje, vosky, tuky, polotuhé alebo kvapalné polyoly, atď. Roztoky a sirupy môžu obsahovať vodu, polyoly a sacharidy.

Účinné činidlo určené na orálne podávanie môže byť pokryté alebo zmiešané s materiálom, ktorý odďaľuje dezintegráciu a/alebo absorpciu účinného činidla v gastrointestinálnom trakte (napr. môže byť použitý glycerylmonostearan alebo glyceryldistearan). Tak je možné dosiahnuť kontinuálne vylučovanie účinného činidla v priebehu mnohých hodín a, ak je to nevyhnutné, účinné činidlo môže byť chránené pred degradáciou v žalúdku. Farmaceutické prostriedky na orálne podávanie môžu byť formulované tak, aby bolo uľahčené vylučovanie účinného činidla v konkrétnej gastrointestinálnej lokalite vďaka špecifickým pH alebo enzymatickým podmienkam.

Farmaceutické prostriedky adaptované na transdermálne podávanie môžu byť poskytnuté vo forme diskrétnych náplastí určených na to, aby ostali v tesnom kontakte s epidermou recipienta v priebehu dlhšej časovej periódy. Farmaceutické prostriedky adaptované na topické podávanie môžu byť poskytnuté ako masti, krémy, suspenzie, pleťové vody, prášky, roztoky, pasty, gély, spreje, aerosóly alebo oleje. Topická masť alebo krém sa výhodne používajú na topické podávanie na kožu, do ústnej dutiny, do oka alebo na iné externé tkanivá. Keď je účinná zložka vo forme masti, môže byť využitá buď s parafínovou alebo s vodou miešateľnou mastnou bázou. Alternatívne môže byť účinná zložka formulovaná v kréme s bázou olej-vo-vode alebo bázou voda-v-oleji. Farmaceutické prostriedky adaptované na topické podávanie do oka zahŕňajú očné kvapky. V takýchto prostriedkoch môže byť účinná zložka rozpustená alebo rozsuspendovaná vo vhodnom nosiči, napr. vo vodnom rozpúšťadle. Farmaceutické prostriedky adaptované na topické podávanie do úst, zahŕňajú zdravotnícke cukríky, pastilky a ústne vody.

Farmaceutické prostriedky adaptované na nazálne podávanie môžu obsahovať tuhé nosiče, ako napríklad prášky (výhodne majúce veľkosť častíc v rozsahu od 20 do 500 pm). Prášky môžu byť podávané spôsobom, pri ktorom sa * C r

-29šnupe, tzn. rýchlou inhaláciou cez nos z nádoby, v ktorej je uložený prášok, blízko pri nose. Alternatívne môžu prostriedky adaptované na nazálne podávanie obsahovať kvapalné nosiče, napr. nazálne spreje alebo nazálne kvapky. Tieto prostriedky môžu obsahovať vodné alebo olejové roztoky účinnej zložky. Prostriedky na podávanie inhaláciou môžu byť dodávané v špeciálne upravených zariadeniach, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na stlačené aerosóly, rozprašovače alebo insuflátory, ktoré môžu byť skonštruované tak, aby poskytovali vopred stanovené dávky účinnej zložky. Vo výhodnom uskutočnení sú farmaceutické prostriedky podľa vynálezu podávané prostredníctvom nosnej dutiny do pľúc.

Farmaceutické prostriedky adaptované na rektálne podávanie môžu byť poskytnuté ako čipky alebo klystír. Farmaceutické prostriedky adaptované na vaginálne podávanie môžu byť poskytnuté ako pesary, tampóny, krémy, gély, pasty, penové alebo sprejové formulácie.

Farmaceutické prostriedky adaptované na parenterálne podávanie zahŕňajú vodné a nevodné sterilné injektovateľné roztoky alebo suspenzie, ktoré môžu obsahovať antioxidanty, tlmivé roztoky, bakteriostatické látky a v roztoku rozpustené látky, ktoré zabezpečujú, aby boli prostriedky v podstate izotonické s krvou plánovaného recipienta. V takýchto prostriedkoch môžu byť prítomné aj iné zložky vrátane napríklad vody, alkoholov, polyolov, glycerínu a rastlinných olejov. Prostriedky adaptované na parenterálne podávanie môžu byť v jednotkovej dávkovej nádobe alebo v multi-dávkovej nádobe, napríklad v nepriepustné uzavretých ampulkách a liekovkách, a môžu sa uskladňovať v stave po vysušení vymrazením (lyofilizované), ktorý vyžaduje tesne pred použitím len pridanie sterilného kvapalného nosiča, napr. sterilného soľného roztoku pre injekcie. Podľa receptu môže magister pripraviť injekčné roztoky a suspenzie zo sterilných práškov, granúl a tabletiek.

Vo výhodnom uskutočnení môže byť prostriedok formulovaný v súlade s rutinnými postupmi, tak ako farmaceutický prostriedok adaptovaný na intravenózne podávanie ľuďom. Typicky sú prostriedkami na intravenózne podávanie roztoky v sterilnom izotonickom vodnom tlmivom roztoku. Kde je to potrebné, môže prostriedok obsahovať aj solubilizačné činidlo a lokálne anestetikum, ako lidokaín,

-30aby sa zmenšila bolesť v mieste injekcie. Vo všeobecnosti sa zložky dodávajú buď oddelene, alebo zmiešané v jednotkovej dávkovej forme, napríklad ako suchý lyofilizovaný prášok alebo bezvodný koncentrát v hermeticky utesnenej nádobe, ako napríklad v ampulke alebo vrecúšku s označením množstva účinného činidla. Tam, kde sa má prostriedok podávať infúziou, môže byť dodávaný spolu s infúznou fľašou obsahujúcou vodu alebo fyziologický roztok vysterilizovaný do farmaceutického stupňa. Tam, kde sa prostriedok má podávať injekciou, môže byť poskytnutá ampulka sterilnej vody na injekciu alebo fyziologického roztoku, aby sa zložky mohli zmiešať pred podaním.

Čipky vo všeobecnosti obsahujú účinnú zložku v rozsahu od 0,5 % do 10 % hmotn.; orálne formulácie výhodne obsahujú 10 % až 95 % účinnej zložky.

Vynález poskytuje aj farmaceutické balenie alebo kit obsahujúci jednu alebo viac nádob naplnených jednou alebo viacerými zložkami farmaceutických prostriedkov podľa vynálezu. Voliteľne môže byť spolu s touto nádobou (nádobami) spojený oznam vo forme predpísanej vládnym úradom regulujúcim výrobu, používanie a predaj farmaceutických látok alebo biologických produktov, ktorý reflektuje povolenie vyrábať, používať a predávať tento produkt na podávanie ľuďom.

4.2 Spôsoby podávania

Predložený vynález poskytuje prostriedky a spôsoby na periférne podávanie EPO na posilnenie funkcie alebo na ochranu excitabilných tkanív a na dodávanie zlúčenín do takýchto tkanív. Ako bolo uvedené vyššie, predložený vynález je čiastočne založený na zistení, že periférne podávané EPO má priame neuroprotektívne alebo neuroposilňujúce vlastnosti v excitabilnom tkanive, ako napríklad tkanive centrálneho nervového systému, periférneho nervového systému alebo v srdcovom tkanive. Excitabilné tkanivo, tak ako je používané tu, zahŕňa, ale nie je obmedzené na neuronálne tkanivo centrálneho a periférneho nervového systému a srdcové tkanivo. Táto časť opisuje takéto zlúčeniny a spôsoby ich podávania.

Predložený vynález poskytuje podávanie EPO a modulátorov EPO receptorovej aktivity spôsobmi, ktoré sa líšia od priameho podávania do centrálneho nervového systému, a výrazy periférny a systémový zastrešujú tieto rôzne

-31 spôsoby. Periférne podávanie zahŕňa orálne alebo parenterálne podávanie, ako napríklad intravenózne, intraarteriálne, subkutánne, intramuskulárne, intraperitoneálne, rektálne, submukózne alebo intradermálne podanie. Na podávanie tu písaných činidiel sú užitočné aj iné spôsoby. Poskytnuté tu je tak akútne, ako aj chronické podávanie.

V jednom uskutočnení sa napríklad EPO dodáva systémom s riadeným uvoľňovaním. Polypeptid môže byť podávaný napríklad intravenóznou infúziou, implantovanou osmotickou pumpou, transdermálnou náplasťou, lipozómami alebo inými spôsobmi podávania. V jednom uskutočnení môže byť použitá pumpa (pozri Langer, vyššie; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald a ďalší, 1980, Surgery 88:507; Saudek a ďalší, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). V inom uskutočnení môže byť zlúčenina dodávaná vo vezikuie, najmä v lipozóme (pozri Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat a ďalší, v Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (vyd.), Liss, New York, str. 353-365 (1989); WO 91/04014; U.S patent č. 4704355; LopezBerestein, ibid., str. 317-327; pozri vo všeobecnosti ibid.). V inom uskutočnení môžu byť použité polymérne materiály (pozri Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (vyd.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Balí (vys.), Wiley: New York (1984); Ranger a Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; pozri aj Levy a ďalší, 1985, Science 228:190; During a ďalší, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard a ďalší, 1989, J. Neurosurg. 71:105).

V ešte inom uskutočnení môže byť systém na riadené uvoľňovanie umiestnený v blízkosti terapeutického cieľa, tzn. mozgu, a tým je potrebná len časť systémovej dávky (pozri napr. Goodson, str. 115-138 v Medical Applications of Controlled Release, zv. 2, vyššie, 1984). Ďalšie systémy na riadené uvoľňovanie sú diskutované v Langerovom zhrnutí (1990, Science 249:1527-1533).

V inom uskutočnení môže byť EPO, ak je vhodne formulované, podávané nazálne, orálne, rektálne, vaginálne alebo sublinguálne.

V konkrétnom uskutočnení môže byť želateľné podávať EPO prostriedky podľa vynálezu lokálne, do oblasti, kde je potrebná liečba. To je možné dosiahnuť napríklad, ale bez obmedzenia, lokálnou infúziou v priebehu operácie, injekciou,

-32katetrom, čípkom alebo prostredníctvom implantátu, ktorým je porózny, neporózny alebo želatínový materiál, vrátane membrán, ako napríklad sialastických membrán, a vlákien.

Predložený vynález môže byť lepšie pochopený s odvolaním sa na nasledujúce neobmedzujúce príklady, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia vynálezu. Nasledujúce príklady sú poskytnuté na to, aby sa podrobnejšie ilustrovali výhodné uskutočnenia vynálezu. Avšak nemajú byť považované za obmedzujúce rozsah vynálezu.

Ako je tu nižšie opísané, štúdie, ktoré tu pôvodcovia uskutočňovali, sú univerzálne akceptovanými testami na zvieracích modeloch, na základe ktorých je možné predpokladať profylaktický a terapeutický úžitok.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1A a 1B. Morrisov vodný bludiskový test

A. Výsledky Morrisovho vodného bludiskového testu uskutočňovaného na myšiach, ktorým sa podával periférne, každý deň, buď EPO, alebo fyziologický roztok (SHAM).

B. Subjekty, ktorým sa podával EPO sa správali významne lepšie ako subjekty ošetrované so SHAM. Regresná línia (R² = 0,88) vykazuje sklon (0,68), ktorý sa významne líši od sklonu 1, značne v prospech EPO skupiny.

Obrázky 2A až 2C. Test podmienenej chuťovej averzie A. Porovnanie konzumácie vody myšami, ktoré sa podrobili testu podmienenej chuťovej averzie, pričom boli periférne ošetrené so SHAM a EPO. Konzumácia vody je vyjadrená ako percento objemu skonzumovaného kontrolnými myšami, u ktorých sa neindukovalo ochorenie chloridom lítnym.

B a C ilustrujú, že posilnenie učenia prostredníctvom EPO je obrovské, keďže EPO subjekty oveľa viac kontrolovali smäd ako kontrolné subjekty, keď sa vyhýbali vode obsahujúcej podnet asociovaný s chorobou a trávili viac času hľadaním vody.

Obrázky 3A a 3B.

A. Výsledky experimentu, ktorý demonštruje, že predbežné ošetrenie periférnym podaním EPO redukuje vážnosť záchvatov a chráni myši pred kŕčmi a smrťou, ktoré

-33sú spôsobené neurotoxínom kainátom. Čísla v zátvorke pod každým stĺpcom označujú počet zvierat, ktoré obdržali dávku kainátu.

B. znázorňuje, že ochranné účinky periférne podávaného EPO sa zvyšujú denným podávaním EPO.

C. ilustruje, že nástup účinku EPO je posunutý, čo je charakteristické pre program indukcie génovej expresie.

Obrázky 4A a 4B znázorňujú ochranný účinok rhEPO proti ischemickému poraneniu mozgu (fekálnou mŕtvicou).

A. Systémová aplikácia EPO podávaného v rôznych časoch po indukciu mozgovej ischémie redukuje rozsah infarktu.

B. Porovnanie dvoch foriem EPO pri ochrane mozgu pred poranením v tomto modeli, rekombinantnej humánnej formy (rhEPO) a 17-aminokyselinového EPO derivátu (17-mér), ilustruje, že niektoré EPO analógy nie sú účinné na ochranu neurónov.

Obrázok 5 znázorňuje ochranný účinok rhEPO voči útlmovej traume prenesenej do mozgovej kôry.

Obrázky 6A a 6B znázorňujú ochranný účinok EPO voči ischemickému poraneniu srdca.

A. Aktivita kreatín kinázy (CK), indikátora poškodenia myokardických buniek.

B. Aktivita myeloperoxidázy (MPO), miery zápalu.

Obrázok 7 znázorňuje, že ošetrenie myší s EPO posúva a redukuje neurologické symptómy produkované experimentálnou alergickou encefalitídou, čo je model sklerózy multiplex.

Obrázky 8A a 8B

A. Minimálna účinná dávka EPO na poskytnutie neurologickej ochrany v modeli fekálnej mŕtvice u potkanov.

B. Sérové hladiny EPO v rôznych časových bodoch potom ako bolo samičkám Balb/c myší intraperitoneálne podaných 5000 U rhEPO.

Obrázky 9A až 9C.

A. Imunologická lokalizácia EPO-R na kapilárach a okolo kapilár.

B. Biotinylované EPO podané IP myšiam sa nachádza po 5 hodinách vo vnútri mozgu tesne obklopujúc kapiláry.

-34C. Po 17 hodinách sa biotínová značka môže nájsť vo vnútri špecifických neurónov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Periférne podávaný EPO posilňuje kognitívnu funkciu

V tomto príklade priestorový navigačný experiment, známy ako Morrisov vodný bludiskový test, demonštruje EPO-indukované posilnenie kognitívnej funkcie u myší. V tomto teste je malá priesvitná platforma umiestnená v jednom kvadrante plaveckého bazénu s nepriehľadnou vodou. Myši umiestnené v tomto plaveckom bazéne musia plávať, až kým nedosiahnu odpočívadlovú platformu pod hladinou, ktorá je pre plávajúce myši neviditeľná. Test pozostáva z merania času, za ktorý sa zvieratá dostanú na platformu (tzn. času, ktorý strávia plávaním). V následných pokusoch sa čas, ktorý potrebuje každá myš na to, aby dosiahla platformu, bude znižovať ako funkcia ich poznania prostredia. Tento typ učebného experimentu zahŕňa hipokampus, keďže hipokampálne lézie zabraňujú učeniu pri tomto teste.

Experimenty sa uskutočňovali v kruhovom čiernom bazéne s priemerom 150 cm. Štyri body sa zvolením označili: sever, juh, východ a západ. Do každého zo štyroch kvadrantov sa umiestnili odlišné vizuálne kľúče: napr. odrazové svetlá, svetlá páska aplikovaná vo štvorcoch atď., aby sa myši zorientovali v bazéne. Platforma sa umiestnila ľubovoľne do jedného kvadrantu. Pokus pozostával z umiestnenia zvieraťa do jedného kvadrantu bazénu hlavou dopredu a jeho vypustenia. Pokus trval celkovo 90 sekúnd. Ak zviera nedosiahlo platformu, dalo sa na ňu na ďalších 15 sekúnd. Subjekty hodinu oddychovali a potom sa umiestnili do iného kvadrantu na testovanie. V pokusoch v priebehu jedného dňa boli použité všetky štyri kvadranty a zvieratá sa testovali 12 po sebe idúcich dní (tzn. celkovo 48 pokusov).

Samotný experiment pozostával z podania injekcie obsahujúcej 5000 U/kg rekombinantného ľudského EPO (podávaný pod obchodným názvom PROCRIT, Ortho-Biotech, Inc.) každej myši, intraperitoneálnou injekciou 4 hodiny pred

-35začiatkom denného testovania v každom z 12 pokusných dní. Kontrolným zvieratám sa injekčné podával fyziologický roztok.

Učenie sa meralo meraním času, ktorý potrebovala každá myš na to, aby dosiahla platformu. Ako je znázornené na obrázku 1A, výsledky sú zanesené do grafu ako čas strávený na platforme skupinou ošetrenou s EPO a sham skupinou. Ako vyplýva z výsledkov, obe skupiny zvierat strávili viac času na platforme, tzn. naučili sa dosiahnuť platformu rýchlejšie v každom nasledujúcom pokusnom dni, ale EPO-ošetrené zvieratá to robili rýchlejšie ako sham skupina. Takže EPO-ošetrené zvieratá majú rýchlejšiu krivku učenia ako sham skupina. Keď sa výsledky vyjadrili ako rozdiel medzi EPO-ošetrenou a sham-ošetrenou skupinou, a keď sa výsledky EPO-ošetrenej a sham-ošetrenej skupiny porovnali, vykázala regresná línia (R²=0,88) významne odlišný sklon (0,68) ako sklon 1, čo je značne v prospech EPO skupiny (obrázok 1 B).

Príklad 2

Periférne podávanie EPO posilňuje učením podmienenú chuťovú averziu

Test podmienenej chuťovej averzie (CTA) uskutočňovaný v tomto príklade demonštruje, že EPO dramaticky ovplyvňuje schopnosť myší pamätať si a učiť sa vylúčiť nepríjemný chuťový vnem, v prípade chorobu provokujúcej látky. V tomto príklade je na produkciu CTA použitý chlorid lítny, pretože chlorid lítny spoľahlivo spôsobuje nepokoj a anorexiu na dávke závislým spôsobom. Podobne ako prirodzene sa vyskytujúca choroba, spôsobuje lítium CTA prostredníctvom stimulovania vyššie opísaných dráh, vrátane vylučovania cytokínov.

Samičky Balb/c myší sa trénovali, aby obmedzili svoj celkový denný príjem vody na jednu 5 minútovú pitnú periódu za deň, a aby sa naučili piť dostatok vody v priebehu tejto periódy, aby ostali v rovnováhe. Zvieratá sa rozdelili do skupín a podávala sa im buď sham kontrola (fyziologický roztok), alebo EPO (5000 U/kg), intraperitoneálnou injekciou (IP), 4 hodiny pred prezentáciou novej tekutiny obs* hujúcej sacharín a vanilku. Okamžite po ukončení pitia sladkej vody dostali zvieratá buď fyziologický roztok, alebo ochorenie spôsobujúcu dávku lítia (20 mg/kg 0,15M LÍCI, podané IP). Potom sa sledovali tri skupiny zvierat. Prvá skupina • ·

-36(kontrolná) nedostala po pití lítium. Druhá skupina dostala aj lítium aj EPO. Tretia skupina (sham) dostala fyziologický roztok (bez EPO) a lítium.

Podmienená chuťová averzia sa merala meraním redukcie pitia v priebehu následného vystavenia roztoku spôsobujúceho ochorenie, novej sacharín-vanilkovej kvapaline. Po 5 dňoch zotavovania sa z ošetrovania lítiom alebo sham, sa zvieratám, ktorým sa nepodávala voda, dala rovnaká nová sacharín-vanilková tekutina. Na obrázku 2A sú znázornené výsledky pre skupinu 2 a 3 v porovnaní so skupinou 1 (kontrola). Deň 2 predstavuje základnú úroveň konzumácie vody po zvyknutí si na testovaciu klietku. Na tretí deň sa zvieratám podala intraperitoneálna injekcia buď fyziologického roztoku, alebo EPO (5000 U/kg), 4 hodiny pred ponúknutím novej sacharín-vanilkovej tekutiny a nasledovalo ošetrenie s lítiom alebo sham (šípka). Výsledkom tohto ošetrenia bolo malé zníženie konzumácie tekutiny vo všetkých skupinách na tretí deň, pričom predtým bol dokumentovaný nežiaduci účinok injekcie a novosť tekutiny. Po zotavení, nevykázal prvý test na stanovenie CTA žiadny pokles konzumácie pre kontroly. Avšak zvieratá, ktoré obdržali lítium, demonštrovali v skutočnosti úplnú averziu voči tekutine, napriek tomu, že im chýbala voda (deň 4). Pokračujúci nedostatok vody eventuálne spôsoboval vyhasnutie CTA (dni 5 až 9), ale vyznačoval sa značným zdržaním zotavenia sa zvierat, ktoré dostali EPO, ako je znázornené plnými krúžkami na obrázku 2A.

Mohutnosť tu stanovenej CTA je možné lepšie zhodnotiť posúdením stupňa vodného deficitu v každom testovacom dni, keďže EPO-ošetrené zvieratá tolerovali vodný deficit približne dvakrát viac ako subjekty, ktorým bola podaná injekcia sham (obrázok 2B). Napriek značne posilnenej CTA demonštrovanej EPO skupinou, zvieratá v tejto skupine sa častejšie dostávali k rúrke na pitie ako zvieratá v sham skupine, ako je znázornené na obrázku 2C. Sila CTA sa demonštrovala opakovanou injekciou samotného lítia (bez EPO), čo spôsobilo oslabenie CTA, ktorá bola vyššia v EPO skupine (obrázok 2A, deň 10). Tieto údaje ukazujú, že predošetrenie s EPO je spojené so značným posilnením CTA následkom podávania lítia.

-37Príklad 3

Periférne podané EPO chráni mozog pred excitotoxínom

Tento príklad demonštruje, že EPO prechádza cez krvno-mozgovú bariéru a má neuroprotektívny účinok u myší ošetrených s neurotoxínom kainátom. V prírode existujú mnohé zlúčeniny, ktoré sú toxické špeciálne voči neurónom. Tieto molekuly typicky interagujú s endogénnymi receptormi pre aminokyselinový transmiter glutamát, následne spôsobujú nadmernú stimuláciu a poranenie neurónov. Jedna z nich, kainát, látka všeobecne používaná na štúdium neuronálneho poranenia v dôsledku excitotoxicity, je analógom glutamátu. Kainát je účinný neurotoxín, ktorý špecificky ničí neuróny, najmä tie, ktoré sú umiestnené v oblastiach s vysokou hustotou kainátových receptorov, ako napríklad v hipokampe, a indukuje záchvaty, poranenie mozgu a smrť.

Nasledujúce neurotoxické štúdie sa uskutočňovali s myšami použitím kainátu. Tento model sa používa na stanovenie ochranného úžitku liečby stavov, ako napríklad epilepsie súvisiacej so spánkovým lalokom. Parenterálne injekcie vyvolávajú u experimentálnych zvierat, ako napríklad potkanov a myší, čiastočné (končatinové) záchvaty na dávke závislým spôsobom, ktoré sa potom môžu generalizovať a spôsobiť smrť. Experimenty prezentované v tomto príklade sa uskutočňovali na to, aby sa otestovalo, či periférne podávané EPO prechádza cez krvno-mozgovú membránu, a ak áno, či EPO vplýva na neurónovú energetickú rovnováhu, a najmä či má neuroprotektívne účinky voči kainátu.

Za týmto účelom sa predtestovali samičky Balb/c myší (vážiace priemerne 15 až 20 g) s 5000 U/kg rekombinantného ľudského erytropoetínu (rhEPO; predávaný pod obchodným názvom PROCRIT, Ortho-Biotech, Inc.) alebo s fyziologickým roztokom (sham), ktoré sa podávali intraperitoneálne v konkrétnych časových bodoch pred, spolu s alebo po podaní kainátu (Sigma Chemical), tiež IP, v špecifických koncentráciách (hmotnosť/kg telesnej hmotnosti). Subjekty sa potom monitorovali a odstupňovali z hľadiska vykazovania záchvatovej aktivity v priebehu 20 minút po podaní kainátu. Každý pokus sa ukončil 60 minút po kainátovej dávke. Ako je znázornené na obrázku 3A, predošetrenie s EPO dramaticky redukuje vážnosť záchvatov a posúva nástup epileptického stavu u myší ošetrených

-38kainátom. Porovnanie medzi EPO- a sham-ošetrenými zvieratami demonštruje významne nižšiu úmrtnosť zvierat, ktoré dostali kainátové dávky v rozsahu od 20 do 30 mg/kg, z čoho vyplýva ochrana neurónov poskytnutá prostredníctvom predošetrenia s EPO. Čísla v zátvorkách pod každým stĺpcom označujú počet zvierat vystavených danej kainátovej dávke.

Na obrázku 3B je znázornená EPO dávková závislosť pri poskytovaní neurologickej ochrany pred kainátom. Myšiam sa podávalo EPO (5000 U/kg, IP denne až do 5 dní). Neuroprotektívny účinok každej dávky EPO sa stanovoval determináciou prežívania po podaní kainátu (20 mg/kg), ktorý spôsoboval približne 50% mortalitu pri kontrolných zvieratách (bez EPO, pozri obrázok 3A). Zo stĺpcov vyplýva zlepšenie prežívania EPO-ošetrovaných subjektov v porovnaní so zvieratami, ktorým sa injektoval sham. Ako je znázornené na obrázku 3B, ochrana neurónov sa zvyšuje s ďalšími dávkami EPO v množstve 5000 U/kg.

Neurologická ochrana poskytnutá prostredníctvom EPO sa vyznačuje odkladom nástupu, ktorý je charakteristický pre aktiváciu programu génovej expresie. Obrázok 3C znázorňuje, že jedna dávka EPO podaná v čase podania kainátu (20 mg/kg) neposkytuje žiadnu okamžitú ochranu v podobe odkladu smrti následkom záchvatov súvisiacich s EPO (v minútach), zatiaľ čo EPO podané 24 hodín pred kainátom zlepšuje latenciu a vážnosť záchvatov a čas smrti. Účinok trvá do 7 dní.

Príklad 4

Periférne podávané EPO chráni mozog pred poškodením v dôsledku ischémie

Z predchádzajúcich in vivo štúdií použitím globálneho reperfúzneho modelu u gerbil vyplýva, že výsledkom zastavenia prietoku krvi mozgom je smrť buniek v mozgu, a že priama injekcia EPO do mozgových komôr chráni mozog pred takouto smrťou buniek (Sakanaka a ďalší, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4635). Experimenty prezentované v tomto príklade po prvý krát ukazujú, že EPO podávané periférne chráni neurónové bunky pred smrťou in vivo na živočíšnom modeli ischémie.

-39Nasledujúci experiment sa uskutočňoval použitím modelu uzavretia strednej mozgovej artérie, čo je model ischemickej fokálnej mŕtvice akceptovaný v oblasti techniky. Podľa daného protokolu sa samčeky potkanov (250 mg telesná hmotnosť) anestetikovali fenobarbitalom a udržiavali sa pri 37 °C. Vizualizovali sa srdcové cievy a trvalo sa uzavrela ispalaterálne srdcová cieva. Ipsalaterálna stredná mozgová cieva (MCA) sa vizualizovala a na začiatku sa naleptala. Kontralaterálna cieva sa uzavrela zacviknutím na 1 hodinu. O 24 hodín sa zvieratá usmrtili a vybral sa mozog a rozrezal sa na 1mm seriálne rezy. Živé tkanivo sa vizualizovalo in situ redukciou trifenyltetrazóliom, aby sa dalo vizuálne rozoznať živé tkanivo od nekrotických oblastí. Ischemické jadro a okolitá penumbra podľahli bunkovej smrti.

Použitím tohto MCA modelu sa EPO podávalo parenterálnymi injekciami v rôznych časoch pred a okamžite po poranení, a kvantifikoval sa objem poranenia prostredníctvom počítačovej obrazovej analýzy. Z výsledkov tejto analýzy znázornených na obrázku 4A vyplýva účinok liečby s EPO v nasledujúcich časoch vo vzťahu k mŕtvici: 24 hodín pred mŕtvicou, v čase mŕtvice, a 3, 6 a 9 hodín po mŕtvici. Ako vyplýva z obrázku 4A, EPO chráni tkanivo pred nekrotickým poranením, keď sa podá do 6 hodín po mŕtvici.

Naopak je zaujímavé, že 17-mér odvodený od EPO, o ktorom bolo predtým publikované, že má neurotrofnú aktivitu, podporuje rast neuritov in vitro a myelináciu nervových buniek ex vivo (Campana a ďalší, 1998, Int. J. Mol. Med. 1:235-41; US patent 5700909 vydaný 23. decembra 1997), nemal žiadny účinok pri ochrane proti poraneniu v tomto systéme (obrázok 4B, 17-mér). Takže tento model, ako aj iné spôsoby testovania účinku EPO na funkciu excitabilného tkaniva poskytnuté predloženým vynálezom, môžu byť použité na identifikáciu EPO a modulátorov EPO receptorovej aktivity, ktoré môžu byť používané na moduláciu funkcie excitabilného tkaniva, ako napríklad na ochranu pred poranením alebo na posilnenie učenia a kognitívnej funkcie.

Príklad 5

Periférne podávané EPO chráni mozog pred útlmovou traumou r r

-40V modeli mechanickej traumy, kortikálnom impaktnom modeli, chráni predošetrenie systémovo podávaným EPO myšací mozog pred útlmovou traumou. Na indukovanie traumy sa využil pneumaticky poháňaný piest (Clippard Valves) s priemerom 3 mm, ktorým možné zaviesť ranu do lebky presne. Každá myš bola anestetizovaná a bezpečne sa umiestnila do sterotaxického zariadenia, aby sa predišlo pohybovaniu hlavy. Uskutočnilo sa odrezanie skalpu, aby sa determinovala lokalizácia bregma, ktoré je referenčným bodom, do ktorého sa najprv umiestnil piest. Piest sa potom nastavil jeho pohybom 2 mm kaudálne a 2 mm ventrálne voči bregmu a náraz sa uskutočnil použitím presného pulzu dusíka. Toto zariadenie umožňuje presnú selekciu pohyblivosti piestu (4 m/s) a posunu piestu (2 mm).

Myši sa ošetrili s EPO (5000 U/kg) 24 hodín pred poranením, v čase poranenia, 3, 6 alebo 9 hodín po poranení a ošetrovanie pokračovalo vo forme denných dávok. Myši sa usmrtili 10 dní po procedúre a následne sa skúmal mozog a stanovoval sa objem mozgovej nekrózy. U sham-ošetrených myší bola pozorovaná veľká nekrotická oblasť (obrázok 5) a to s nadmernou infiltráciou monocytov. Naopak, zvieratá boli chránené pred takýmto poškodením a len málo mononukleárnych buniek sa detegovalo v oblasti poranenia, keď sa predošetrili s EPO, alebo keď sa EPO podalo do 3 hodín po poranení.

Príklad 6

Periférne podávané EPO chráni myokardium pred ischemickým poranením

Tento príklad demonštruje účinok EPO pri ochrane srdcového tkaniva pred hypoxickým poranením. Potkany sa predtestovali s EPO (5000 U/kg) 24 hodín pred procedúrou uskutočňovanou podľa Latini a ďalší (1999, J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:601-8). Následne sa subjekty anestetizovali, napojili sa na umelé dýchanie a uskutočnila sa torakotómia. Identifikovalo sa srdce a srdcový obeh a okolo najproximálnejšej časti ľavej anteriórnej zostupujúcej koronárnej cievy sa umiestnila odstrániteľná niť a potom sa podviazala. Potom sa pridala ďalšia dávka EPO (5000 U/kg) a uzavretie sa udržiavalo ďalších 30 minút. V tom čase sa ligatúra uvoľnila a zviera sa nechalo v hlbokej anestéze ďalších 6 hodín a následne sa usmrtilo. Okamžite po usmrtení sa vybralo srdce a oddelila sa časť postihnutej oblasti (AAR), r r

-41 ako aj nepostihnutej oblasti (septum) a pripravili sa na biochemické analýzy. Hodnotili sa dva parametre, kreatín kináza (CK) ako miera prežívania myokardia (čím nižšia CK, tým menej životaschopné tkanivo) a myeloperoxidáza, ktorá je produktom infiltrátu mononukleárnych buniek. Výsledky sú uvedené na obrázku 6A a obrázku 6B. Ako vyplýva z týchto obrázkov, liečba s EPO vedie k stabilnej CK aktivite, čo je v súlade so zlepšením životaschopnosti tkaniva a poklesom MPO aktivity v porovnaní s kontrolou, tak v infarktovej oblasti (AAR), ako aj vo voľnej stene perfúznej ľavej komory, z čoho vyplýva, že nastáva významne nižšia infiltrácia zápalovými bunkami.

Príklad 7

Periférne podávané EPO oslabuje experimentálnu alergickú encefalitídu

Experimentálna alergická (alebo autoimunitná) encefalomyelitída (EAR) u potkanov, je v oblasti techniky akceptovaný živočíšny model sklerózy multiplex (MS). Na pochopenie znakov MS boli vyvinuté rôzne živočíšne modely EAE aplikovaním imunologických, virologických, toxických a traumatologických parametrov.

Nasledujúci experiment sa uskutočnil na testovanie toho, či EPO chráni pred symptómami EAE. Samičky Lewis potkanov, 6 až 8 týždňové (Charles River, Calco, Taliansko) sa imunizovali v miernej anestézii injekciou do oboch zadných labiek 50 pg myelínového bázického proteínu z morského prasaťa (MBP; Sigma, St. Louis, MO) vo vode, emulzifikovanom v rovnakom objeme kompletného Freundovho adjuvans (CFA, Sigma) s 7 mg/ml teplom usmrteného Mycobacterium tuberculosis, ktorý bol pridaný do H37Ra (Difco, Detroit, Ml) do konečného objemu 100 μΐ.

Po ošetrení sa u potkanov denne hodnotili známky experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy (EAE) a sa skóre sa určovalo nasledovne: 0, žiadne ochorenie; 1, ochabnutý chvost; 2, ataxia; 3, úplná paralýza zadných končatín spolu s inkontinenciou moču. Monitorovala sa aj telesná hmotnosť. Potkanom sa podávalo EPO (5000 U/kg, IP, raz denne) so začiatkom na 3 deň po imunizácií a pokračovalo sa až do 18 dňa. Kontrolné potkany dostali len vehikulá. Ako je znázornené na obrázku 7, potkany ošetrené s EPO demonštrovali zlepšenie v skóre (tzn. nižšie

-42číslo) a trvaní ochorenia. Okrem toho bol u potkanov ošetrených s EPO pozorovaný značný odklad nástupu symptómov.

Príklad 8

Minimálna účinná dávka a farmakokinetiky EPO potrebné na ochranu excitabilného tkaniva

Optimálne a účinné dávky EPO sa stanovovali použitím vyššie opísaného živočíšneho modelu fokálnej ischemickej mŕtvice. Ako je znázornené na obrázku 8A, EPO dávka nižšia ako 450 jednotiek/kg telesnej hmotnosti nebola spoľahlivo účinná pri ochrane excitabilného tkaniva pred nekrotickým poranením. Ako je znázornené na obrázku 8B, v štúdiách so zvieratami viedla dávka približne 5000 jednotiek/kg telesnej hmotnosti podávaná IP štyrom samičkám myší k hladine EPO v obehu, ktorá bola vyššia ako 20000 mjednotiek/ml séra do 5 hodín po podaní, vyššia ako 10000 mjednotiek po 10 hodinách po podaní, ale nižšia ako 5 jednotiek/ml 24 hodín po podaní.

Príklad 9

Dodávanie do CNS sprostredkované erytropoetínom

Z nižšie prezentovaných experimentov vyplýva úspešný transport molekuly konjugovanej s EPO cez krvno-mozgovú bariéru a jej lokalizácia vo vnútri základňovej membrány. Ako je znázornené na obrázku 9A, rezy mozgu sa farbili protilátkami proti EPO receptoru (EPO-R), ktoré ukázali, že mozgové kapiláry exprimujú vysoké hladiny EPO-R. Aby sa zistilo, či môže byť EPO transportované cez krvno-mozgovú bariéru, značilo sa EPO s biotínom nasledovne. Objem obsahujúci rhEPO sa zakoncentroval použitím Centricon-10 filtra (Millipore) a výťažok sa zmeral odčítaním absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm. Potom sa 0,2 mg biotínu s dlhým ramenom (Vector Labs) rozpustilo v 100 μΙ DMSO, pridalo sa do zakoncentrovaného roztoku rhEPO a okamžite sa vortexovalo. Táto zmes sa potom inkubovala pri laboratórnej teplote štyri hodiny, pričom sa mierne miešala a bola chránená pred svetlom. Nenaviazaný biotín sa z roztoku odstránil použitím r r

-43Centricon-10 kolóny. Biotinylované EPO sa potom podávalo zvieratám IP a o 5 hodín sa zvieratá usmrtili. Rezy mozgu sa označili s avidínom spárovaným s peroxidázou a pridával sa diaminobenzidín, až kým sa nevyvinul dostatočný reakčný produkt na pozorovanie svetelnou mikroskopiou. Zistilo sa, že EPO sa nachádza pozdĺž rovnakých kapilár, ako boli tie, ktoré boli pozitívne farbené pre EPO-R (obrázok 9B). Ukázalo sa, že neskoršie je biotínová značka lokalizovaná v konkrétnych neurónoch (napr. po 17 hodinách, obrázok 9C). Naopak, keď sa pridal studený EPO v 1000-násobnom nadbytku voči značenému EPO, všetko špecifické farbenie sa eliminovalo. Výsledky demonštrujú úspešné dodanie systémovo podanej zlúčeniny konjugovanej s EPO cez krvno-mozgovú bariéru.

Úspešné dodanie systémovo podávaného EPO-biotínového konjugátu cez krvno-mozgovú bariéru do mozgu demonštruje, že iné terapeutické zlúčeniny môžu byť dodávané cez krvno-mozgovú bariéru podobným spôsobom, prostredníctvom vytvorenia komplexu cieľovej zlúčeniny s EPO. Ako jeden príklad môže byť mozgový neurotrofný faktor (BNF) kovalentne spojený s EPO karbodiimidovým párovaním použitím štandardných procedúr. Po purifikácii sa konjugát môže podávať zvieratám intraperitoneálnou injekciou. Pozitívne účinky BNF na centrálny nervový systém sa môžu merať vo vzťahu ku kontrolným zvieratám, aby sa zmeral úspešný transport tejto molekuly spojenej s EPO, na rozdiel od chýbania aktivity centrálneho nervového systému pri nekonjugovanom BNF.

Rozsah vynálezu nie je obmedzený opísanými špecifickými uskutočneniami, ktoré sú mienené ako ilustrácie jednotlivých predmetov vynálezu, a do rozsahu vynálezu spadajú funkčne ekvivalentné spôsoby a komponenty. V skutočnosti budú pre priemerných odborníkov v oblasti zrejmé rôzne modifikácie vynálezu, okrem tých, ktoré tu boli znázornené a opísané, na základe predchádzajúceho opisu a sprievodných výkresov. Takéto modifikácie sú mienené ako také, ktoré spadajú do rozsahu priložených nárokov.

Všetky tu uvedené publikácie sú tu kompletne zahrnuté ich citáciou na všetky účely.

Claims (30)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický prostriedok v dávkovej jednotkovej forme adaptovaný na moduláciu excitabilného tkaniva, posilnenie kognitívnej funkcie alebo na dodanie zlúčenín cez tesné endoteliálne spojenia, vyznačujúci sa tým, že obsahuje, na dávkovú jednotku, účinné, netoxické množstvo EPO, modulátora EPO receptorovej aktivity, modulátora EPO-aktivovaného receptora alebo ich kombinácie v rozsahu približne 50000 až 50000 jednotiek, a farmaceutický prijateľný nosič.
2. 2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že účinné, netoxické množstvo EPO zahŕňa 50000 až 500000 jednotiek EPO.
3. 3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že účinné, netoxické množstvo EPO je dávka účinná na dosiahnutie cirkulujúcej hladiny EPO, ktorá je vyššia ako 10000 mll/ml séra.
4. 4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že cirkulujúca hladina EPO sa meria približne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 alebo 10 hodín po podaní EPO.
5. 5. Farmaceutický kit, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednu alebo viac nádob obsahujúcich farmaceutický prostriedok podľa nároku 2.
6. 6. Spôsob ochrany cicavca pred patológiou spôsobenou poranením excitabilného tkaniva, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa periférne podávanie účinného množstva EPO, modulátora EPO receptorovej aktivity alebo modulátora EPO-aktivovaného receptora na ochranu excitabilného tkaniva v množstve a dávkovým režimom dostatočným na dosiahnutie uvedeného ochranného účinku bez významného zvýšenia hematokrytu, cicavcovi.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že poranenie je následkom záchvatovej poruchy, sklerózy multiplex, mŕtvice, hypotenzie, zástavy

   -45srdca, ischémie, infarktu myokardu, zápalu, s vekom súvisiacej straty kognitívnej funkcie, radiačného poškodenia, mozgovej obrny, neurodegeneratívnej choroby, Alzheimerovej choroby, Parkinsonovej choroby, Leighovej choroby, AIDS demencie, straty pamäti, amyotrofnej laterálnej sklerózy, alkoholizmu, poruchy nálady, úzkostnej poruchy, poruchy nedostatku pozornosti, autizmu, Creutzfeld-Jakobovej choroby, mozgovej alebo miechovej traumy, srdco-pľúcneho bypassu, glaukómu, sietnicovej ischémie alebo sietnicovej traumy.
8. 8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že poranenie je následkom hypoxie.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že hypoxia je prenatálny alebo postnatálny nedostatok kyslíka, dusenie, zaklinenie, topenie, pooperačná kognitívna dysfunkcia, otrava oxidom uhoľnatým, inhalácia dymu, chronická obštrukčná pľúcna choroba, emfyzém, syndróm respiračnej vyčerpanosti dospelých, hypotenzívny šok, septický šok, anafylaktický šok, inzulínový šok, kríza kosáčikovitých buniek, zástava srdca, dysrytmia, dusíková narkóza alebo lokalizovaná tkanivová hypoxia.
10. 10. Spôsob posilnenia funkcie normálneho alebo abnormálneho excitabilného tkaniva u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa periférne podávanie takého množstva EPO, modulátora EPO receptorovej aktivity, modulátora EPOaktivovaného receptora alebo ich kombinácie, ktoré je účinné na posilnenie excitabilného tkaniva, v množstve a dávkovým režimom dostatočným na dosiahnutie uvedeného posilňujúceho účinku bez významného zvýšenia hematokrytu, cicavcovi.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že výsledkom posilnenia funkcie excitabilného tkaniva je posilnenie asociatívneho učenia a pamäte.

    -4612. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že posilnenie funkcie excitabilného tkaniva sa používa na liečbu porúch nálady, úzkostných porúch, depresie, autizmu, hyperaktívnej poruchy s nedostatkom pozornosti, Alzheimerovej choroby, starobnej alebo kognitívnej dysfunkcie.
12. 13. Spôsob podľa nároku 6 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že excitabilným tkanivom je tkanivo centrálneho nervového systému, tkanivo periférneho nervového systému alebo srdcové tkanivo.
13. 14. Spôsob podľa nároku 6 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že podanie zahŕňa orálne, topické, intraluminálne podanie alebo inhaláciu alebo parenterálne podanie.
14. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že parenterálne podanie je intravenózne, intraarteriálne, subkutánne, intramuskulárne, intraperitoneálne, submukózne alebo intradermálne.
15. 16. Spôsob podľa nároku 6 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že podanie je akútne alebo chronické.
16. 17. Spôsob podľa nároku 6 alebo 10, vyznačujúci sa tým, že EPO je neerytropoetické.
17. 18. Spôsob podľa nároku 6 alebo 10, vy z n a č u j ú c i sa tým.žeEPO sa podáva vo vyššej dávke ako je dávka nevyhnutná na maximálnu stimuláciu erytropoézy.
18. 19. Spôsob uľahčenia transcytózy molekuly cez endoteliálnu bunkovú bariéru u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie prostriedku obsahujúceho uvedenú molekulu spojenú s EPO, modulátorom EPO receptorovej aktivity, modulátorom EPO aktivovaného receptora alebo s ich kombináciou v

    -47množstve a dávkovým režimom postačujúcim na dosiahnutie transcytózneho účinku bez významného zvýšenia hematokrytu, cicavcovi.
19. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že spojením je labilná kovalentná väzba, stabilná kovalentná väzba alebo nekovalentné spojenie s väzobným miestom uvedenej molekuly.
20. 21. Spôsob podľa nároku 19, vy z n a č u j ú c i sa t ý m , že endoteliálnou bunkovou bariérou je krvno-mozgová bariéra, krvno-očná bariéra, krvnosemeníková bariéra, krvno-vaječníková bariéra alebo krvno-placentová bariéra.
21. 22. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa t ý m , že molekulou je receptorový agonistický alebo antagonistický hormón, neurotrofný faktor, antimikrobiálne činidlo, rádiofarmaceutická látka, antisense zlúčenina, protilátka, imunosupresant, toxín alebo protinádorové činidlo.
22. 23. Spôsob podľa nárokov 6, 10 alebo 19, vyznačujúci sa tým, že EPO je erytropoetín, analóg erytropoetínu, napodobenina erytropoetínu, fragment erytropoetínu, hybridná erytropoetínová molekula, molekula viažuca sa na erytropoetínový receptor, erytropoetínový agonista, obličkový erytropoetín, mozgový erytropoetín, ich oligomér, ich multimér, ich muteín, ich obdoba, ich prirodzene sa vyskytujúca forma, ich syntetická forma, ich rekombinantná forma alebo ich kombinácia.
23. 24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že molekulou viažucou sa na EPO receptor je protilátka proti erytropoetínovému receptoru.
24. 25. Prostriedok na prenos molekuly prostredníctvom transcytózy cez endoteliálnu bunkovú bariéru, vyznačujúci sa tým, že obsahuje uvedenú molekulu spojenú s EPO, modulátorom EPO receptorovej aktivity alebo s modulátorom EPO-aktivovaného receptora.

    -4826. Prostriedok podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že EPO je erytropoetín, analóg erytropoetínu, napodobenina erytropoetínu, fragment erytropoetínu, hybridná erytropoetínová molekula, molekula viažuca sa na erytropoetínový receptor, erytropoetínový agonista, obličkový erytropoetín, mozgový erytropoetín, ich oligomér, ich multimér, ich muteín, ich obdoba, ich prirodzene sa vyskytujúca forma, ich syntetická forma, ich rekombinantná forma alebo ich kombinácia.
25. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že molekulou je receptorový agonistický alebo antagonistický hormón, neurotrofný faktor, antimikrobiálne činidlo, rádiofarmaceutická látka, antisense zlúčenina, protilátka, imunosupresant, toxín alebo protinádorové činidlo.
26. 28. Farmaceutický prípravok formulovaný na podanie na získanie neuroprotektívneho účinku, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeutické množstvo neerytropoetického EPO derivátu a farmaceutický prijateľný nosič.
27. 29. Farmaceutický prípravok formulovaný na podanie na získanie neuroposilňujúceho účinku, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeutické množstvo neerytropoetického EPO derivátu a farmaceutický prijateľný nosič.
28. 30. Farmaceutický prípravok formulovaný na dodanie zlúčenín cez tesné endoteliálne spojenia, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeutické množstvo neerytropoetického EPO derivátu a farmaceutický prijateľný nosič.
29. 31. Farmaceutický prípravok podľa nároku 28, 29 alebo 30, vyznačujúci sa tým, že neerytropoetický EPO derivát je modulátor EPO receptorovej aktivity, modulátor EPO-aktivovaného receptora.
30. 32. Farmaceutický kit, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa jednu alebo viac nádob obsahujúcich farmaceutický prípravok podľa nároku 28, 29 alebo 30.