EA004766B1 - Модуляция функции возбуждаемых тканей за счет периферического введения эритропоэтина - Google Patents

Abstract

Предложены способы и композиции для защиты или усиления функции возбуждаемой ткани у млекопитающих в результате системного введения модулятора активности рецептора эритропоэтина, такого как эритропоэтин, который посылает сигнал модуляции функций возбуждаемой ткани через ЕРО-активированный рецептор. Возбуждаемые ткани включают ткани центральной нервной системы, такие как ткани мозга, ткани периферической нервной системы, сетчатки и ткани сердца. Защита возбуждаемых тканей предусматривает лечение гипоксии, эпилептических припадков, нейродегенеративных заболеваний, гипогликемии и отравления нейротоксинами. Усиление функций полезно при обучении и для улучшения памяти. Изобретение относится также к композициям и способам облегчения транспорта молекул через барьеры эндотелиальных плотных соединений, таких как гематоэнцефалический барьер, за счет ассоциации молекул с модулятором активности рецептора эритропоэтина, таким как эритропоэтин.

Description

Настоящее изобретение относится к использованию периферического введения эритропоэтина и других модуляторов активности рецепторов эритропоэтина или модуляторов ЕРО-активированных рецепторов для позитивного воздействия на функции возбуждаемых тканей. Оно включает защиту возбуждаемых тканей, таких как нейрональные ткани или ткани сердца, от нейротоксинов, гипоксии и других вредных воздействий и усиление функции возбуждаемых тканей, например, для облегчения обучения и улучшения памяти. Далее, настоящее изобретение относится к способам транспорта веществ через барьеры эндотелиальных клеток за счет ассоциации с молекулами эритропоэтина, модуляторами активности рецепторов эритропоэтина или другими модуляторами ЕРО-активированных рецепторов.

2. Предпосылки изобретения

Различные острые и хронические состояния и заболевания, причинами которых являются повреждения возбуждаемых тканей и их дисфункция, вызываются в результате внешних и внутренних воздействий. Такие воздействия включают недостаток соответствующего количества кислорода или глюкозы, воздействие нейротоксинов, инфекционных агентов или являются следствием старения, инфекционных агентов или травмы. Например, возбуждаемые ткани могут быть повреждены вследствие эпилептического припадка или хронической эпилепсии, конвульсий, эпилепсии, удара, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, поражений центральной нервной системы, гипоксии, церебрального паралича, травмы головного или спинного мозга, АШ8 деменции и других форм деменции, утраты познавательной функции, связанной с возрастом, потерей памяти, бокового амиотрофического склероза, рассеянного склероза, гипертонии, остановки сердца, гибели нейронов, вдыхания дыма и отравления двуокисью углерода.

Общеизвестно, что уменьшение снабжения мозга доступными ему источниками энергии, такими как глюкоза или кислород, приводит к серьезному ухудшению функций мозга, включая познавательную функцию. Многие (но не все) нейроны центральной нервной системы легко повреждаются при функционировании в метаболически ограниченных условиях, например в условиях гипоксии, гипогликемии, стресса и/или длительного, сильного возбуждения. В этих условиях электрохимические градиенты этих клеток часто резко падают, что приводит к необратимому поражению нейронов и гибели клеток. Существующая в настоящее время точка зрения предпочитает этот общий механизм как обычную конечную схему для широкого круга общих и приводящих к дебильности неврологических заболеваний, включая удар, эпилепсию и болезнь Альцгеймера.

Хотя последствия ограничения запаса энергетических веществ на функции мозга хорошо известны, эффекты улучшения их доставки к нормальному в остальных отношениях мозгу были использованы менее интенсивно. Существующие данные дают серьезные основания предположить, что усиленная доставка как глюкозы, так и кислорода заметно улучшает комплексную познавательную функцию как в опытах на животных моделях, так и на здоровых людях (Кор£ е! а1., 1994, Вейауюта1 апб №ига1 Вю1оду 62:237-243; Ь1 е! а1., 1998, №итокс1епсе 85:785-794; Мокк е! а1., 1996, Ркусйорйагшасо1оду 124:255-260). Далее, было продемонстрировано, что растущий список нейропептидов, продуцируемых в мозге, непосредственно обеспечивает улучшение познавательной функции здорового мозга. Физиологическая основа таких улучшений в конечном счете зависит от реконструкции нейронных внутренних связей за счет синаптических изменений.

Цитоархитектура (цитоархитектоника) тканей мозга демонстрирует крайнюю пластичность и претерпевает непрерывную реконструкцию. Эти процессы, опосредствованные многими трофическими молекулами, происходят не только после поражения, но также играют заметную роль в процессах обучения, памяти и в познавательных функциях. Хотя прототипом нейротрофина является фактор роста нервов (ΝΟΕ), было установлено, что возрастающее количество цитокинов осуществляет трофические функции в мозге (Ней1 е1 а1., 1997, Аппи. Неу. Рйагтасо1. Тохюо1. 37:239-67).

В последнее время несколько независимых исследователей обнаружили, что нервные ткани экспрессируют высокие уровни как ЕРО, так и их рецепторов (ЕРО-Н; Ощ1сау1юд1и е! а1., 1998, Ргос. N311. Асаб. δοΐ. И8А 92:3717-20; 1цц1 е! а1., Реб1а1т. Нек. 43:40-9; Матй е! а1., 1997, К1бпеу 1п!. 51:416-8; Мопкййа е! а1., 1997, №итокс1епсе 76:105-16). Хотя представляется, что ЕРО и каждый из его рецепторных белков являются продуктами отдельных генов, версий ЦНС значительно меньше. Физиологическое значение этого наблюдения не было выяснено, но массовые различия, по-видимому, должны модифицировать биологическую активность. Например, при исследованиях пациентов (людей) исследователи пришли к заключению, что ЕРО не транспортируется в мозг с периферии (Матб е! а1., 1997, кирга). Однако до настоящего времени эта возможность не была оценена для ЕРО в какихлибо прямых исследованиях. Хотя ЕРО мозга примерно на 15% меньше, чем почечный ЕРО (за счет различий в сиалилировании), ЕРО мозга более активны при стимулировании эритроидной колонии низкими концентрациями лигандов (Макиба е! а1., 1994, 1. Вю1. Сйет. 269:1948893). С другой стороны, рецепторы ЦНС демонстрируют гораздо более низкую афинность в отношении дегликозилированных ЕРО, нежели более крупные на 30% периферические рецепторы (КошкЫ е! а1., 1993, Вгаш Век. 609:29-35; Макиба е! а1., 1993, 1. Вю1. Сйет. 268:11208-16).

В мозге ЕРО экспрессия была обнаружена в астроцитах, и усиленная ЕРО экспрессия и выделение могут быть вызваны гипоксией и другими метаболическими вызывающими стресс факторами (МатИ е! а1., 1996, Еиг. 1. Ыеигока. 8:666-76; Макиба е! а1., 1993, 1. Вю1. Сйет. 268:11208-16; Макиба е! а1., 1994, 1. Вю1. Сйет. 269:19488-93) или даже занятием других рецепторов, таких как семейство инсулиноподобных факторов роста (Макиба е! а1., 1997, Вгаш Век. 746:63-70). Нейроны являются одной мишенью для этих секретированных ЕРО, так как они экспрессируют ЕРО-В сильно зависящим от типа клеток образом (Мопкййа е! а1., 1997, №игокс1епсе 76:105-16). В противоположность самим ЕРО, плотность ЕРО-В, по-видимому, не модулируется во время метаболического стресса (П1д1сау1юд1и е! а1., 1995, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 92:3717-20).

Последние исследования продемонстрировали, что ЕРО существенно защищает от гипоксических нейрональных повреждений ίη νί!το, а также ίη νίνο, при введении непосредственно в церебральные желудочки (Мопкййа е! а1., 1997, Ыеигокшепсе 76:105-16; 8абато!о е! а1., 1998, Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 253:26-32; 8акапака е! а1., 1998, Ргос. №111. Асаб. 8сь И8А 95:4635-40). КошкЫ е! а1., 1993, Вгаш Век. 609:29-35) продемонстрировали, что ЕРО промотирует ίη νί\Ό выживание холинергических нейронов у взрослых крыс при инъекции непосредственно в церебральные желудочки. ЕРО, введенные центрально в церебральные желудочки, также успешно предотвращают дефицит пространственного обучения крыс, вызванный ишемическим поражением (8абашо!о е! а1., 1998, Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 253:2632). Последние публикации выдвигают предположение, что только участок из 17 аминокислот ЕРО необходим для этих нейротрофических эффектов в культивируемых нейронных клетках (Сатрапа е! а1., 1998, Ιη!. 1. Мо1. Меб. 1:235-41).

В течение многих лет считалось, что единственной четкой физиологической ролью эритропоэтина (ЕРО) являлся контроль за продуцированном красных кровяных клеток. В последнее время появились несколько направлений доказательств, которые предполагают, что ЕРО, как член суперсемейства цитокинов, выполняет другие важные физиологические функции, которые опосредствованы через взаимодействия с рецепторами эритропоэтина (ЕРО-В). Эти действия включают митогенез, модуляцию притока кальция в клетки гладкой мускулатуры и в нервные клетки, и влияют на промежуточный метаболизм. Считают, что ЕРО обеспечивает компенсаторные реакции, которые служат для улучшения гипоксического клеточного микроокружения. Хотя исследования установили, что внутричерепные инъекции ЕРО защищают нейроны от гипоксического нейронального поражения, внутричерепное введение представляет собой не используемый на практике и неприемлемый способ введения для терапевтического использования, особенно для здоровых индивидуумов. Кроме того, более ранние исследования анемичных пациентов, которым вводили ЕРО, привели к выводу, что периферически введенные ЕРО не транспортируются в мозг (Матй е! а1., 1997, кирга).

Цитирование или обсуждение приводимых здесь ссылок не следует рассматривать как признание того, что они являются известным уровнем техники для настоящего изобретения.

3. Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции и способам модулирования функций возбуждаемой ткани у млекопитающих, а также к способам и композициям для доставки лекарств к возбуждаемым тканям. Настоящее изобретение основано, в частности, на открытии заявителей, состоящем в том, что эритропоэтин (ЕРО), введенный системно и в высоких дозах, специфически захватывается мозгом. В частности, заявители обнаружили, что ЕРО, введенный в высоких дозах, может преодолевать гематоэнцефалический барьер, причем он может усилить познавательную функцию и защитить нервную ткань от повреждения в результате стрессовых ситуаций, таких как гипоксия.

Термины эритропоэтин и ЕРО, которые здесь используются взаимозаменяемо, модуляторы активности ЕРО рецепторов и модуляторы ЕРО-активированных рецепторов относятся к соединениям, которые при системном введении (вне гематоэнцефалического барьера) способны активировать ЕРО-активированные рецепторы электрически возбуждаемых тканей для усиления и/или защиты от поражения и гибели. Так, ЕРО может относиться к любой форме эритропоэтина, которая может модулировать возбуждаемые ткани, а также к ЕРО аналогам, фрагментам и имитациям. В предпочтительном варианте для использования в способах настоящего изобретения эритропоэтин обнаруживает повышенную специфичность в отношении ЕРО рецепторов мозга. В другом варианте эритропоэтин является неэритропоэтическим. Еще в одном варианте эритропоэтин вводят в дозе, которая превышает дозу, необходимую для максимальной стимуляции эритропоэза.

В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция в единичной дозировочной форме, адаптированная для модуляции возбуждаемой ткани, повышения познавательной функции или для доставки соединения через эндотелиальные плотные соединения, которая включает для единичной дозы эффективное нетоксичное количество в интервале от около 50000 до 500000 Единиц ЕРО, модулятора активности рецептора ЕРО, модулятора ЕРО активированного рецептора или их комбинаций и фармацевтически приемлемый носитель. В одном из вариантов эффективное нетоксичное количество ЕРО в указанной фармацевтической композиции составляет от 50000 до 500000 Единиц ЕРО. В другом варианте эффективное нетоксичное количество ЕРО указанного фармацевтического препарата является дозой, эффективной для достижения циркулирующего уровня ЕРО более 10000 мЕд/мл сыворотки. В другом варианте циркулирующий уровень ЕРО достигается примерно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения ЕРО. В другом варианте в настоящем изобретении предложен фармацевтический набор, включающий эффективное количество ЕРО для модулирования возбуждаемой ткани, усиления познавательной функции или доставки соединений через эндотелиальные плотные соединения, упакованное в один или более контейнеров.

В настоящем изобретении предложен способ модулирования функций возбуждаемой ткани у млекопитающих, включающий периферическое введение указанному млекопитающему эффективного количества эритропоэтина. Возбуждаемая ткань может быть нормальной тканью или имеющей патологию, больной тканью. В одном из вариантов возбуждаемая ткань является нейрональной тканью центральной нервной системы. В других вариантах возбуждаемую ткань выбирают из группы, состоящей из нейрональной ткани периферической нервной системы и ткани сердца.

В одном из вариантов предложен способ усиления функций возбуждаемой ткани у млекопитающих, в частности как нормальной, так и ненормальной возбуждаемой ткани, путем периферического введения эффективного количества ЕРО или модулятора активности рецептора ЕРО. Усиление функций возбуждаемой ткани приводит к улучшению, например, обучения, ассоциативного обучения или памяти. Нелимитирующие примеры состояний, которые можно лечить в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, включают расстройства настроения, беспокойство, депрессию, аутизм, дефицит внимания, гиперактивность, болезнь Альцгеймера, старение и нарушение познавательной функции.

В другом варианте модуляция возбуждаемой ткани обеспечивает защиту от патологии, возникающей в результате поражения возбуждаемой ткани, например нейронов центральной нервной системы, периферической нервной системы или тканей сердца. Такая патология может возникнуть в результате поражений, включая (но ими не ограничиваясь) гипоксию, эпилептический припадок, нейродегенеративные заболевания, отравление нейротоксинами, рассеянный склероз, остановку сердца, радиацию или гипогликемию. В одном из вариантов патология является результатом гипоксии и может быть вызвана пренатальной или постнатальной нехваткой кислорода, удушением, удушьем, почти утоплением, постоперационным расстройством познавательной функции, отравлением окисью углерода, вдыханием дыма, хроническим обструктивным легочным заболеванием, эмфиземой, синдромом респираторного дистресса у взрослых, гипертоническим шоком, септическим шоком, инсулиновым шоком, анафилактическим шоком, острой симптоматикой у больных серповидно-клеточной анемией, остановкой сердца, аритмией или наркозом азотом. В тех случаях, когда патологией является припадок, она может быть (в качестве нелимитирующего примера) эпилепсией, конвульсиями или хронической эпилепсией. В том случае, когда патологией является нейродегенеративное заболевание, она может быть, например, ударом, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, церебральным параличом, травмой головного мозга или спинного мозга, АШ8 деменцией, возрастной утратой познавательной функции, потерей памяти, боковым амиотрофическим склерозом, эпилептическим припадком, алкоголизмом, ишемией сетчатки глаза, старением, глаукомой или гибелью нервов. В другом варианте введение ЕРО можно использовать для предотвращения поражения или повреждения тканей во время хирургического вмешательства, как, например, при удалении опухоли или операции аневризмы.

Еще в одном варианте предложены способы для облегчения трансцитоза молекул через барьер эндотелиальных клеток у млекопитающих путем введения композиции молекул в ассоциации с эритропоэтином. Ассоциация между подлежащей транспорту молекулой и ЕРО может быть, например, лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией с сайтом связывания для данной молекулы. В одном варианте эндотелиальными клеточными барьерами могут быть гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, барьер между кровеносной системой и семенниками, барьер между кровеносной системой и яичниками или плацентарный барьер.

Далее в настоящем изобретении предложена композиция для транспортировки молекул за счет трансцитоза через эндотелиальный клеточный барьер, включающая указанную молекулу в ассоциации с ЕРО, модулятором активности рецептора ЕРО или модулятором ЕРОактивированного рецептора. В одном из вариантов ЕРО является эритропоэтином, аналогом эритропоэтина, имитатором эритропоэтина и фрагментом эритропоэтина, гибридной молекулой эритропоэтина, молекулой, связывающей рецептор эритропоэтина, агонистом эритропоэтина, почечным эритропоэтином, эритропоэтином мозга, их олигомерами, их полимерами, их мутантами, представителями того же рода, их

Ί природной формой, их рекомбинантной формой или их комбинациями. В другом варианте молекулой указанной композиции является гормон, нейротрофический фактор, противомикробный агент, радиофармацевтический агент, антисмысловое соединение, антитело, иммуносуппрессор, токсин или противораковый агент. Подходящие молекулы для транспорта по способу настоящего изобретения включают (но ими не ограничиваются) гормоны, такие как гормон роста, антибиотики, противораковые агенты и токсины.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут более понятны со ссылкой на следующие рисунки и подробное описание.

4. Краткое описание фигур

Фиг. 1А-В. Тест водного лабиринта Морриса. А. Результаты теста водного лабиринта Морриса, проведенного на мышах, которым периферически вводили ежедневно либо ЕРО, либо физиологический раствор (8НАМ). В. Животные, которым вводили ЕРО, действовали значительно лучше тех, которым вводили 8НАМ. Линия регрессии (В²=0,88) показывает наклон (0,68), что значительно отличается от наклона 1, явно в пользу ЕРО группы.

Фиг. 2А-С. Стандартный тест вкусового отвращения. А. Сравнение периферического введения 8НАМ и ЕРО в отношении потребления воды мышами, которых тестируют в соответствии со стандартным тестом вкусового отвращения. Потребление воды выражают как процент от объема, потребляемого контрольной группой мышей, у которых не вызывали болезненного состояния введением хлорида лития. В и С иллюстрируют значительное повышение обучаемости за счет введения ЕРО, так как животные, которым вводили ЕРО, испытывали гораздо большую жажду, нежели контрольные животные, избегая воду, содержащую вызывающую болезненное состояние добавку, хотя проводили больше времени в поисках воды.

Фиг. 3А-С. А. Результаты эксперимента, который демонстрирует, что предварительное периферическое введение ЕРО уменьшает тяжесть эпилептического припадка и защищает мышей от конвульсий и гибели под действием нейротоксина каината. Цифры в скобках под каждой колонкой указывают число животных, каждому из которых вводили дозу каината. В показывает, что защитный эффект периферически введенного ЕРО возрастает при ежедневном введении ЕРО. С иллюстрирует задержку наступления действия ЕРО, что является характеристикой программы индуцирования генной экспрессии.

Фиг. 4А-В изображают защитный эффект 1Ί1ΕΡΘ против ишемического поражения мозга (фокальный удар). А. Системное введение ЕРО в различные моменты времени после индуцирования ишемии мозга уменьшает размеры инфаркта. В. Сравнение двух форм ЕРО в защите мозга от поражения в этой модели; рекомбинантный человеческий ЕРО (гйЕРО) и содержащее 17 аминокислот производное ЕРО (17-мер) иллюстрируют, что некоторые ЕРО аналоги оказываются не эффективными для нейрозащиты.

Фиг. 5 представляет защитное действие гЕЕРО против тупой травмы, нанесенной на кору головного мозга.

Фиг. 6А-В представляет защитное действие ЕРО от ишемического поражения сердца. А. Активность креатинкиназы (СК) является индикатором повреждения клеток миокарда. В. Активность миелопероксидазы (МРО) является мерой воспаления.

Фиг. 7 демонстрирует, что обработка мышей ЕРО замедляет и уменьшает нейрологические симптомы, сопутствующие экспериментально вызванному аллергическому энцефалиту в модели рассеянного склероза.

Фиг. 8А-В. А. Минимальная эффективная доза ЕРО для обеспечения нейрозащиты в модели фокального удара в эксперименте на крысах. В. Уровни ЕРО в сыворотке в различные моменты времени после внутрибрюшинного введения 5000 Единиц гйЕРО самкам мышей штамма Ва1Ь/с.

Фиг. 9А-С. А. Иммунолокализация ЕРО-В на капиллярах и вокруг них. В. Биотинилированный ЕРО, введенный мышам внутрибрюшинно, обнаруживается через 5 ч в мозге, в непосредственном окружении капилляров. С. Через 17 ч метки биотина можно обнаружить внутри специфических нейронов.

5. Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложены композиции и способы для использования эритропоэтина (ЕРО) для модуляции функций возбуждаемых тканей, таких как, например, усиление познавательных функций и защита возбуждаемых клеток от воздействия токсинов. В частности, в настоящем изобретении предложены композиции, включающие ЕРО, а также способы их использования для профилактики и лечения, включая доставку лекарств. В том смысле, как здесь использован термин возбуждаемая ткань, он включает (но этим не ограничивается) нейрональные ткани центральной и периферической нервных систем и ткани сердца.

В раскрытом здесь изобретении предложены способы модулирования функций возбуждаемой ткани путем периферического введения ЕРО, или молекул, активирующих рецептор ЕРО, или молекул, демонстрирующих активность ЕРО-активированного рецептора, а также молекул, имитирующих активность ЕРО, воздействуя через другие, не классические ЕРО рецепторы. Не будучи связаны с каким-либо конкретным механизмом действия, такие молекулы могут посылать сигнал через ЕРО рецептор, например инициировать сигнальный каскад трансдукции, в конечном счете активируя программу генной экспрессии, что приводит к за щите или усилению функций возбуждаемой ткани. Молекулы, способные взаимодействовать с ЕРО рецепторами и модулировать активность рецептора, здесь именуемые как ЕРО или модуляторы активности рецепторов ЕРО, полезны в контексте настоящего изобретения для защиты или усиления функций возбуждаемых тканей. Эти молекулы могут быть, например, природными, синтетическими или рекомбинантными формами ЕРО молекул, раскрытыми выше, или другими молекулами, которые могут вовсе не обязательно напоминать ЕРО какимлибо образом, за исключением того, что они модулируют активность ЕРО рецепторов, как здесь раскрыто. Эти молекулы можно использовать в комбинации для различных, раскрытых здесь целей.

Раскрытые здесь композиции и способы можно использовать для лечения и/или защиты как нормальных тканей, так и тканей, имеющих патологию, например нейронов центральной нервной системы, нейронов периферической нервной системы или тканей сердца. В частности, в разделе 5.1 далее раскрыты способы использования таких ЕРО композиций, пригодных для использования в практике настоящего изобретения. В разделе 5.2.1 раскрыты способы использования таких ЕРО композиций для усиления функций возбуждаемых тканей, таких как обучение, память, и других аспектов познавательной функции, и в разделе 5.2.2 раскрыты способы защиты возбуждаемых тканей от повреждений и травм. В разделе 5.2.3 далее раскрыто обнаружение того факта, что неожиданная способность ЕРО преодолевать плотные соединения капиллярных эндотелиальных клеток обеспечивает способы доставки соединений через такие барьеры. И, наконец, в разделе 5.3 описаны состояния, к которым может относиться использование способов настоящего изобретения и в разделе 5.4 раскрыты способы введения и эффективные дозы таких ЕРО композиций.

5.1. Композиции, включающие эритропоэтин

ЕРО композиции, пригодные для использования в способе настоящего изобретения, включают любые соединения эритропоэтина, которые при периферическом введении способны активировать модуляцию ЕРО-активированных рецепторов, т.е. усиливать функцию возбуждаемых тканей, или защищать их от повреждений и травм, или доставлять соединения к возбуждаемым тканям. Эритропоэтин является гликопротеиновым гормоном, который у человека имеет молекулярную массу от 34 до 38 КО. Зрелый протеин содержит 166 аминокислот, и гликозильный остаток составляет около 40% массы молекулы. Формы ЕРО, пригодные для использования в практике настоящего изобретения, включают природные, синтетические и рекомбинантные формы следующих молекул: эритропоэтина, аналогов эритропоэтина, миметиков эритропоэтина, фрагментов эритропоэти на, гибридных молекул эритропоэтина, молекул, связывающих рецепторы эритропоэтина, агонистов эритропоэтина, почечного эритропоэтина, эритропоэтина мозга, их олигомеры и полимеры, их мутанты и представители его рода. Термины эритропоэтин и ЕРО можно использовать взаимозаменяемо или совместно.

В настоящем изобретении предложены синтетические и рекомбинантные молекулы, такие как ЕРО мозга и почечный ЕРО, рекомбинантные формы ЕРО млекопитающих, а также их природные, полученные из опухолей и рекомбинантные изоформы, такие как рекомбинантно-экспрессируемые молекулы и молекулы, полученные в результате гомологических рекомбинаций. Кроме того, настоящее изобретение включает молекулы, включая пептиды, которые связывают ЕРО рецепторы, а также рекомбинантные конструкции или другие молекулы, которые обладают частью или всеми структурными и/или биологическими свойствами ЕРО, включая фрагменты и полимеры ЕРО или их фрагментов. Здесь ЕРО охватывает молекулы с измененными активностями связывания с ЕРО рецепторами, предпочтительно с повышенным сродством к рецептору, особенно если они подходят для усиления транспорта через барьеры эндотелиальных клеток. Включены сюда и мутанты, включающие молекулы, которые обладают дополнительным или уменьшенным числом сайтов гликозилирования. Как было указано выше, термины эритропоэтин, ЕРО и миметик, а также другие термины используются здесь взаимозаменяемо для обозначения молекул, защищающих или усиливающих возбуждаемые ткани, которые способны преодолевать эндотелиальные плотные соединения, и, как таковые, полезны для использования в качестве средства доставки других молекул. Кроме того, в объем изобретения входят также молекулы, продуцируемые трансгенными животными. Следует отметить, что молекулы ЕРО, как включенные сюда, вовсе не обязательно напоминают ЕРО по строению или каким-либо другим образом, за исключением способности взаимодействовать с ЕРО рецептором, или модулировать активность ЕРО рецепторов, или активировать ЕРО-активированные сигнальные каскады, как здесь раскрыто.

В качестве нелимитирующего примера формы ЕРО, пригодные для целей настоящего изобретения, включают ЕРО мутанты, такие как те, у которых изменены аминокислоты по карбоксильному концу и которые раскрыты в патентах США 5457089 и 4835260; ЕРО изоформы с различным числом остатков сиаловой кислоты в молекуле, такие как те, которые раскрыты в патенте США 5856292; полипептиды, раскрытые в патенте США 4703008; агонисты, раскрытые в патенте США 5767078; пептиды, которые связываются с ЕРО рецептором, как раскрыто в патентах США 5773569 и 5830851; миметики, имеющие небольшие молекулы, которые активируют ЕРО рецептор, как раскрыто в патенте США 5835382; и ЕРО аналоги, раскрытые в МО 9505465, МО 9718318 и МО 9818926. Все вышеуказанные материалы включены сюда по ссылке, до такой степени, до какой эти раскрытия относятся к различным альтернативным формам или способам получения таких форм эритропоэтинов настоящего изобретения.

ЕРО можно получить коммерческим путем (под торговой маркой РК.ОСЯГГ они доступны от Ог11ю Вю1се11. и под торговой маркой ЕРОСЕЫ они доступны от Атдеп, Гпс., Тйоикапб Оакк, СА).

В следующем варианте настоящего изобретения включенные сюда ЕРО молекулы включают гибридные ЕРО молекулы, которые можно получить и которые обладают активностью модулирования рецепторов ЕРО, а также другой активностью, например активностью гормона роста. Такие гибридные молекулы с множеством доменов обладают способностью взаимодействовать с ЕРО рецептором, а также обладают активностью других молекул, таких как гормоны. Способы получения таких молекул с двумя доменами известны специалистам. Как будет более подробно раскрыто в разделе 5.2.3 далее, одной особенностью таких молекул является транспорт через барьеры эндотелиальных клеток, обеспечиваемый доменом, модулирующим активность ЕРО рецептора, и активностью других молекул по нужному сайту.

Любые из раскрытых выше соединений можно тестировать для идентификации ЕРО соединений, способных модулировать возбуждаемые ткани, т.е. усиливать функции, защищать от поражения и травмы или доставлять к ним соединения, используя раскрытые здесь анализы. Например, ЕРО соединения можно тестировать по их способности усиливать функции возбуждаемой ткани, такие как обучение, память и другие аспекты познавательной функции, используя способы, раскрытые в разделе

5.2.1. Примеры ίη νίνο анализов познавательной функции включают тест водяной лабиринт Морриса, пример которого приведен в разделе 6, и стандартный тест вкусового отвращения, пример которого подробно раскрыт в разделе 7. Кроме того, описанные выше ЕРО соединения можно тестировать, используя анализы, раскрытые в разделе 5.2.2, для идентификации ЕРО соединений, способных защищать возбуждаемые ткани от повреждений и травм. Примеры, раскрытые в разделах 8, 9, 10, 11 и 12, представляют конкретные примеры таких анализов. ЕРО соединения можно также анализировать по их способности доставлять соединения через эпителиальные плотные соединения, такие как гемато-энцефалический барьер, используя анализы, такие как те, которые раскрыты в разделе 5.2.3 и в разделе 9 далее. Таким образом, ЕРО соединения, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают каждое и все соединения, которые при периферическом введении способны посылать сигнал через ЕРОактивированные рецепторы для модулирования возбуждаемой ткани, т.е. усилить функцию этой ткани, защитить ее от повреждения или травмы или доставить к ней соединение.

5.2. Способы профилактического и терапевтического использования настоящего изобретения

В различных вариантах настоящего изобретения ЕРО композиции можно использовать для защиты возбуждаемой ткани от повреждений и травм или гипоксического стресса, усиления функций возбуждаемой ткани или для доставки соединений через эндотелиальные плотные соединения возбуждаемой ткани. Как было раскрыто выше, настоящее изобретение основано, в частности, на обнаружении того факта, что ЕРО молекулы можно транспортировать с люминальной поверхности на поверхность оснований мембран эндотелиальных клеток капилляров органов с плотными соединениями эндотелиальных клеток, например, мозга, сетчатой оболочки и яичек. Хотя и не желая быть ограниченными какой-либо конкретной теорией, предполагают, что после трансцитоза ЕРО ЕРО могут взаимодействовать с ЕРО рецепторами возбуждаемой ткани, такими, например, как нейроны центральной нервной системы, периферической нервной системы, тканей сердца, и связывание с рецептором может инициировать каскад сигнальной трансдукции, что приводит к активации программы генной экспрессии внутри возбуждаемой ткани, обеспечивая защиту клеток от поражений, таких как поражения от нейротоксинов, в результате гипоксии и т. д. Способы защиты возбуждаемой ткани от поражений или гипоксического стресса, усиления функций возбуждаемой ткани и способы доставки соединений через плотные соединения возбуждаемой ткани раскрыты далее более подробно.

5.2.1. Способы усиления функций возбуждаемой ткани

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу усиления функций возбуждаемой ткани в результате введения ЕРО молекул, способных активировать программу генной экспрессии, которая усиливает функции возбуждаемой ткани. Усиление функций возбуждаемой ткани обеспечивает улучшение обучения, ассоциативного обучения и памяти. Различные заболевания и состояния поддаются лечению этим способом, и, кроме того, этот способ полезен для усиления познавательной функции в отсутствие каких-либо болезней или болезненных состояний. Способы использования настоящего изобретения раскрыты далее более подробно и включают улучшение обучения и тренировок как у людей, так и у других млекопитающих.

Состояния и заболевания, которые можно лечить способами этого аспекта настоящего изобретения, включают любые состояния или заболевания, для которых благоприятно усиление нейрональных функций. Примеры таких заболеваний включают заболевания центральной нервной системы, включая (но ими не ограничиваясь) расстройства настроения, беспокойство, депрессию, аутизм, дефицит внимания, гиперактивность и нарушения познавательной функции. Другие, нелимитирующие примеры познавательных функций, которые можно улучшить, используя способы настоящего изобретения, раскрыты в разделе 5.3.

В одном из вариантов, например, ЕРО молекулы можно вводить субъекту или пациенту, страдающему нарушениями, вызванными утратой познавательных функций, такими как, например, болезнь Альцгеймера.

Способность ЕРО усиливать познавательную функцию можно протестировать на экспериментальных животных, используя любые описанные здесь способы или любые другие принятые модели для исследования обучаемости или познавательных функций. Как раскрыто в примерах, представленных в разделах 6 и 7, было обнаружено, что периферически введенный эритропоэтин усиливает обучаемость и познавательные функции, что продемонстрировано на нескольких хорошо известных моделях изучения обучаемости на здоровых экспериментальных животных. Примерами таких моделей обучения являются тест водного бассейна Морриса, пример которого приведен в разделе 6, и стандартный тест вкусового отвращения (СТА), пример которого приведен в разделе 7. Например, в одном из вариантов используют стандартный тест вкусового отвращения, очень чувствительный, хорошо известный стандартный тест для тестирования познавательной функции у животных после введения ЕРО. СТА используют для тестирования способности животных запоминать связь болезненных ощущений с новым стимулом, таким как вкус, таким образом, чтобы животные избегали этот новый вкус после повторного воздействия этим стимулом. СТА включает мозг на различных корковых и подкорковых уровнях. Ассоциацию, которая связывает восходящую и нисходящую информацию вместе, вырабатывая отвращение, можно либо ослабить, либо усилить, изменяя воздействие любой из взаимосвязанных единиц. Как форма ассоциативного обучения, сила СТА определяется большим числом переменных, включая новизну оральных стимулов (например, не новый стимул не может быть вызывающим отвращение), степень вырабатываемой болезненности (токсичности), число повторов (тренинг), физиологические потребности (такие как жажда). Хотя СТА в дозозависимой форме может вырабатывать широкий круг химических и физических агентов, хлорид лития надежно вырабатывает беспокойство и анорексию. Подобно природным заболеваниям литий вызывает СТА, стимулируя описанную ранее схему, включая выделение цитокинов. Усиление функций возбуждаемых клеток, например познавательной функции, предоставляет ряд преимуществ индивидуумам в области обучения и работы и для усиления способности к тренировке и обучению других млекопитающих (помимо человека).

5.2.2. Способы защиты возбуждаемых тканей от поражений

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу защиты млекопитающих от патологий, возникающих в результате поражения возбуждаемых тканей. Такая защита обеспечивается путем периферического введения млекопитающему такого количества эритропоэтина, которое эффективно защищает возбуждаемые ткани от поражения. Как подробно показано в примере в разделе 8 далее, ЕРО, введенный до введения токсина каинита, оказывает заметное нейрозащитное действие на мышей, повышая порог наступления приступа и предотвращая гибель. Нейрозащитное действие ЕРО значительно и длительно. Следует отметить, что положительные эффекты, которые здесь наблюдались, происходили за слишком короткий промежуток времени относительно введения ЕРО, чтобы привести к повышению гематокрита как следствия эритропоэтической активности ЕРО. Более того, как было отмечено ранее, настоящее изобретение включает ЕРО, который не обладает способностью усиливать гематокрит.

В одном из вариантов настоящее изобретение можно с успехом использовать как в острых случаях, так и для профилактики и лечения неврологических нарушений, как здесь раскрыто, и для усиления познавательных функций здорового или больного мозга. Как было указано выше, повреждение и гибель нейронов центральной нервной системы является серьезным фактом и часто приводит к летальному исходу, что ответственно за высокую степень заболеваемости и смертности популяции. Острые неврологические поражения могут происходить во время или в результате эпилептических припадков, конвульсий, эпилепсии, удара, кровотечения, повреждений центральной нервной системы, гипоксии, гипогликемии, гипертонии и травмы головного или спинного мозга. Настоящее изобретение предлагает быстрое введение для лечения в острых случаях.

Например, в одном варианте способы настоящего изобретения можно использовать для защиты млекопитающего от повреждений, причиной которых является радиационное повреждение мозга.

В другом варианте возможны лечение или предотвращение серьезных состояний в соответствии со способом настоящего изобретения, а именно профилактика и лечение в матке пренатальных гипоксических состояний, лечение после рождения для защиты мозга от гипоксических повреждений при длительных родах, а также при удушении, утоплении и других состояниях, при которых центральная нервная система испытывает риск нейротоксического поражения в результате нехватки кислорода или в результате подверженности другим нейротоксическим стимулам. Как хорошо известно, индивидуумы, которые пострадали от гипоксии во время родов или в результате нефатальных гипотоксических несчастных случаев или инцидентов, могут испытывать пожизненный нейрологический дефицит. Гипоксия и/или прекращение церебрального притока крови, которая может возникнуть после травмы или во время хирургических операций, также угрожает возможностью вызвать пожизненный нейрологический дефицит.

Постоперативную познавательную дисфункцию, включая дефицит после использования аппарата искусственное сердце-легкие, также можно лечить предлагаемыми здесь способами. Кроме того, способы настоящего изобретения можно использовать для лечения гипоксии в результате отравления окисью углерода или вдыхания дыма.

В другом варианте ЕРО используют для защиты сердечной ткани от длительных поражений, связанных с ишемией, инфарктом, воспалением или травмой.

Это нелимитирующие примеры повреждений возбуждаемой ткани, которые можно лечить способами настоящего изобретения. Интенсивное и раннее лечение этих нарушений могут осуществить профессионалы скорой медицинской помощи, так что лечение может начаться сразу после того, как установлено подозрение на возможное нейрологическое повреждение. Риск нейрологического повреждения, связанный с родами, можно снизить путем профилактического лечения плода до начала родов или во время родов. Специалистам будут понятны эти и другие ситуации и возможности применения способа настоящего изобретения.

5.2.3. Способы доставки соединений

Далее настоящее изобретение направлено на способ облегчения транспорта молекул через барьер эндотелиальных клеток у млекопитающих, путем введения композиции, которая включает конкретные молекулы, ассоциированные с эритропоэтином. Как было указано выше, авторы обнаружили до сих пор неожиданную и удивительную активность периферически введенных ЕРО в отношении возбуждаемых тканей, таких как нервные ткани центральной нервной системы, периферической нервной системы или ткани сердца, идентифицируя ЕРО как молекулы, способные проникать сквозь плотные соединения таких возбуждаемых тканей, как гематоэнцефалический барьер. Как таковые, ЕРО можно использовать в качестве носителей для доставки других молекул через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) и другие аналогичные барьеры.

В одном из вариантов молекулы, связывающие ЕРО рецепторы, включающие молекулы, конъюгированные с ЕРО молекулами, можно использовать для транспорта таких молекул через гематоэнцефалический барьер. Тем самым можно осуществить совместную доставку таких молекул на ЕРО для преодоления ВВВ. В другом варианте антитело или другой связывающий с молекулой партнер могут быть ассоциированы с ЕРО или с модулятором активности рецептора ЕРО, таким образом ассоциируя подлежащую транспорту молекулу за счет нековалентного связывания со связывающим партнером, который далее ассоциирован с транспортабельной молекулой ЕРО. В другом варианте молекулы, связывающие ЕРО рецептор, включающие антитела к ЕРО рецептору, можно использовать в описанном выше способе. Такие антитела обеспечивают транспортный носитель, на котором могут путешествовать другие молекулы, главным образом, таким же образом, как были использованы антитела к трансферриновому рецептору для преодоления гематоэнцефалического барьера (Рагбпбде с1 а1., 1991, 8с1сс11ус (гапкроП о! ап апШгапкГегпп гееерШг апИЬобу ΙΙιΐΌΐίβΙι 1Ие Ыооб-Ьгаш Ьатег ίη νίνο. 1. РИагшаеоГ Ехр. ТИегар. 27:66).

Специалистам должны быть известны различные способы ассоциации молекул с ЕРО и другими описанными выше агентами за счет ковалентных, нековалентных и других взаимодействий; кроме того, можно легко определить оценку эффективности композиции в экспериментальной системе. Ассоциирование молекул с ЕРО и аналогами можно обеспечить любым числом способов, включая лабильное, ковалентное связывание, сшивку и т.д. В одном из вариантов, например, ассоциация между подлежащей транспорту через барьер молекулой и эритропоэтином может быть лабильной ковалентной связью, причем в этом случае молекула выделяется из ассоциации с ЕРО после преодоления барьера. В одном из вариантов можно использовать взаимодействие биотин/авидин. В другом варианте, как было указано выше, можно получить гибридную рекомбинантную или синтетическую молекулу, например такую, которая включает как домен молекулы, обладающей необходимой фармакологической активностью, так и домен, ответственный за модуляцию активности ЕРО рецептора. Молекула может быть конъюгирована с ЕРО или модулятором активности ЕРО рецептора через полифункциональную молекулу, например полифункциональный сшивающий агент. В том смысле, как здесь использован, термин полифункциональная молекула охватывает молекулы, содержащие одну функциональную группу, которая может реагировать более 1 раза последовательно, такие как формальдегид, а также молекулы, содержащие более одной реакционноспособной группы. В том смысле, как здесь использован, термин реакционноспособная группа относится к функциональной группе на сшивающем агенте, которая реагирует с функциональной группой молекулы (например, пептида, белка, углевода, нуклеиновой кислоты, в частности гормона, антибиотика или противоракового агента, которые необходимо доставить через эндотелиальный клеточный барьер), с образованием ковалентной связи между сшивающим агентом и этой молекулой. Термин функциональная группа сохраняет свое стандартное значение, принятое в органической химии. Полифункциональные молекулы, которые можно использовать, являются предпочтительно биосовместимыми линкерами, т.е. они не являются канцерогенными, они не токсичны и практически не иммуногенны ίη νίνο. Полифункциональные сшивающие агенты, которые известны специалистам и здесь раскрыты, можно легко протестировать в моделях на животных для определения их биосовместимости. Полифункциональные молекулы предпочтительно бифункциональны. В том смысле, как здесь использован, термин бифункциональная молекула относится к молекуле с двумя реакционноспособными группами. Бифункциональные молекулы могут быть гетеробифункциональными или гомобифункциональными. Гетеробифункциональный сшивающий агент позволяет обеспечить вертикальную конъюгацию. Он особенно предпочтителен для того, чтобы полифункциональные молекулы были достаточно растворимы в воде, для обеспечения протекания реакций сшивки в водных растворах, таких как водные растворы, буферированные при рН 6-8, и для получения конъюгата, который остается водорастворимым для более эффективного биораспределения. Обычно полифункциональная молекула ковалентно связывается с амино- или сульфгидрильной функциональной группой. Однако полифункциональные молекулы, реакционноспособные в отношении других функциональных групп, таких как группы карбоновых кислот или гидроксильные группы, также рассматриваются в объеме настоящего изобретения.

Гомобифункциональные молекулы содержат, по крайней мере, две одинаковые реакционноспособные функциональные группы. Реакционноспособные функциональные группы гомобифункциональной молекулы включают, например, альдегидные группы и активные сложноэфирные группы. Гомобифункциональные молекулы, содержащие альдегидные группы, включают, например, глутаральдегид и субаральдегид. Использование глутаральдегида в качестве сшивающего агента раскрыто Рохпапкку с1 а1., 8с1епсе 223, 1304-1306 (1984). Гомобифункциональные молекулы, содержащие, по крайней мере, два активных сложноэфирных фрагмента, включают сложные эфиры дикарбоновых кислот и Ν-гидроксисукцинимида. Некоторые примеры таких Ν-сукцинимидильных сложных эфиров включают дисукцинимидилсуберат и дитио-бис-сукцинимидилпропионат и их растворимые соединения с бис-сульфоновой кислотой и бис-сульфонаты, такие как их натриевые и калиевые соли. Эти гомобифункциональные реагенты доступны от Р1егсе, РоскГогб. ΙΙΙίηοίκ.

Гетеробифункциональные молекулы содержат, по крайней мере, две различные реакционноспособные группы. Реакционноспособные группы реагируют с различными функциональными группами, например, присутствующими в ЕРО и в молекуле. Эти две различные функциональные группы, которые реагируют с реакционноспособной группой гетеробифункционального сшивающего агента, обычно являются аминогруппой, например эпсилон-аминогруппой лизина; сульфгидрильной группой, например тиольной группой цистеина; карбоновой кислотой, например карбоксилатом аспарагиновой кислоты; или гидроксильной группой, например гидроксильной группой серина.

Если реакционноспособная группа гетеробифункциональной молекулы образует ковалентную связь с аминогруппой, такая ковалентная связь обычно бывает амидо или имидо связью. Реакционноспособная группа, которая образует ковалентную связь с аминогруппой, может быть, например, активированной карбоксилатной группой, галогенкарбонильной группой или сложноэфирной группой. Предпочтительной галогенкарбонильной группой является хлоркарбонильная группа. Сложноэфирные группы являются, предпочтительно реакционноспособными сложноэфирными группами, такими как, например, Ν-гидроксисукцинимидная сложноэфирная группа.

Другой функциональной группой обычно является либо тиольная группа, либо группа, способная превращаться в тиольную группу, либо группа, которая образует ковалентную связь с тиольной группой. Ковалентная связь обычно является тиоэфирной связью или дисульфидной связью. Реакционноспособная группа, которая образует ковалентную связь с тиольной группой, может быть, например, двойной связью, которая реагирует с тиольными группами или активированными дисульфидами. Реакционноспособная группа, содержащая двойную связь, способную взаимодействовать с тиольной группой, является малеимидогруппой, хотя возможны и другие, такие как акрилонитрил. Реакционноспособная дисульфидная группа может быть, например 2-пиридилдитиогруппой или группой 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты). Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, содержащих реакционноспособные дисульфидные связи, включают Ν-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (СагИкоп е1 а1., 1978, Вюсйет 1., 173:723737), натрий 5-4-сукцинимидилоксикарбонилальфа-метилбензилтиосульфат и 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил(2-пиридилдитио) толуол. Ν-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионат предпочтителен. Некоторые примеры гетеробифункциональных реагентов, включающих реакционноспособные группы, содержащие двойную связь, которая взаимодействует с тиольной группой, включают сукцинимидил 4-(Кмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат и сукцинимидил м-малеимидобензоат.

Другие гетеробифункциональные молекулы включают сукцинимидил 3-(малеимидо)пропионат, сульфосукцинимидил 4-(п-малеимидофенил) бутират, сульфосукцинимидил 4-(Кмалеимидометилциклогексан)-1-карбоксилат, сложный эфир малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимида. Предпочтительна натрийсульфонатная соль сукцинимидил м-малеимидобензоата. Многие из вышеуказанных гетеробифункциональных реагентов и их сульфонатные соли доступны от Р1егсе.

Специалисты могут легко определить, являются ли вышеуказанные конъюгаты обратимыми или лабильными. Конъюгаты можно тестировать ίη νίίτο как на модуляторную активность в отношении ЕРО рецепторной активности, так и на необходимую фармакологическую активность. Если конъюгат сохраняет оба эти свойства, его соответственно можно тестировать ίη νίνο. Если для активности молекулы конъюгата необходимо его отделение от ЕРО, предпочтительна лабильная связь или обратимая ассоциация с ЕРО. Характеристики лабильности можно также протестировать, используя стандартные ίη νίίτο процедуры перед тестированием ίη νίνο.

Дополнительную информацию относительно того, как получить и использовать эти и другие полифункциональные реагенты, можно получить из следующих публикаций или других доступных специалистам: ί’αιΊδδοη е! а1., 1978, Вюсйет. I 173:723-737; СишЬег е! а1., 1985, Ме11юб5 ίη Еηζутο1οду 112:207-224; 1ие е! а1., 1978, Вюсйет. 17:5399-5405; 8υη е! а1., 1974, Вюсйет. 13:2334-2340; В1ай1ег е! а1., 1985, Βίοсйеш. 24:1517-152; Ьш е! а1., 1979, Вюсйет. 18:690-697; ΥουΚ аиб ΝνίΙΚ, 1980, Ргос. №111. Асаб. 8сг и.8.А. 77:5483-5486; Ьетег е! а1., 1981, Ргос. Ка!1. Асаб. 8сг И.8.А. 78:3403-3407; .йшд аиб Μοτοί, 1983, Вюсйет. Вюрйуз. Ас!а 761:162; Саи1йе1б а! а1., 1984, Вюсйет. 81:77727776; 8!аго§, IV., 1982, Вюсйет. 21:3950-3955; Υο8й^!аке е! а1., 1979, Еиг. 1 Вюсйет. 101:395399; Υο8й^ίаке е! а1., 1982, 1 Вюсйет. 92:14131424; Р11сй аиб С’/еск 1979, 1 Вю1. Сйет. 254:3375-3381; Νονΐ(± а! а1., 1987, I Вю1. Сйет. 262:8483-8487; й-ο та η! аиб Ρа^^Ьаηк8, 1976, 1 Μο1. Вю1. 104:243-261; Натаба аиб Τκυτυο, 1987, Атй Вюсйет. 160:483-488; аиб НазЫба, 1984, 1 Аррйеб Вюсйет. 6:56-63. Дополнительно способы осуществления сшивок можно найти в обзоре Меащ аиб Реег1еу. 1990, Β^οсοи^υда!е Сйет. 1:2-12. Барьеры, которые можно преодолеть, используя вышеописанные способы и композиции настоящего изобретения, включают (но ими не ограничиваются) гематоэнцефалический барьер, гематоофтальмический барьер, барьер между кровеносной системой и семенниками, барьер между кровеносной системой и яичниками и плацентарный барьер.

Подходящие молекулы для транспорта через барьер эндотелиальных клеток включают, например, гормоны, такие как гормоны роста, нейротрофический фактор, антибиотики или противогрибковые агенты, такие как те, которые обычно исключены из мозга и других огражденных барьерами органов, пептидные радиофармацевтические агенты, антисмысловые лекарства, антитела против биологически активных агентов, фармацевтические и противораковые агенты. Нелимитирующие примеры таких молекул включают гормон роста, фактор роста нервов (ΝΟΡ), полученный из мозга нейротрофический фактор (ВКР), цилиарный нейротрофический фактор (СТР), основной фактор роста фибробластов (ЬРСР), трансформирующий фактор роста β1 (Τ0Ρβ1), трансформирующий фактор роста β2 (Τ0Ρβ2), трансформирующий фактор роста β3 (Τ0Ρβ3), интерлейкин 1, интерлейкин 2, интерлейкин 3 и интерлейкин 6, А2К антитела против фактора некроза опухоли и иммуносупрессоры, такие как циклоспорин.

В другом варианте для терапевтической доставки токсинов для лечения вирусных заболеваний или пролиферативных заболеваний, таких как рак, можно использовать рекомбинантные химерические молекулы токсинов, включающие ЕРО. Соединения, которые можно объединять с ЕРО для создания химерического токсина, который можно использовать в таком варианте, включают (но ими не ограничиваются) токсичные вещества, такие как экзотоксин р8еυбοтοηа8, токсин дифтерии и рицин, наряду с другими.

5.3. Необходимые условия

Как было раскрыто ранее, предложенные здесь ЕРО композиции и способы их применения можно использовать для лечения и профилактики состояний, причиной которых являются условия гипоксии, которые вредно воздействуют на возбуждаемые ткани, такие как возбуждаемые ткани центральной нервной системы, возбуждаемые ткани периферической нервной системы, или кардиальные ткани, такие как, например, ткани мозга, сердца или сетчатой оболочки. Поэтому настоящее изобретение можно использовать для лечения или профилактики повреждений возбуждаемой ткани, которые возникают в результате гипоксии в различных состояниях и при различных обстоятельствах. Нелимитирующие примеры таких состояний и обстоятельств приводятся далее.

Пример защиты нейрональных тканей патологии, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включает такие патологии, которые являются результатом пони21 женного снабжения кислородом нейрональных тканей. Любые состояния, которые приводят к снижению доступа кислорода к нейрональным тканям, приводящие в результате к стрессу, повреждению, и, в конечном счете, к гибели нейрональных клеток, можно лечить способами настоящего изобретения. Обычно называемые гипоксией или ишемией, такие состояния возникают из-за или включают (но ими не ограничиваются) удар, закупорку сосудов, пренатальную или постнатальную нехватку кислорода, удушение, удушье, почти утопление, отравление окисью углерода, вдыхание дыма, травму, включая хирургическое вмешательство и радиотерапию, асфикцию, эпилепсию, гипогликемию, хронические обструктивные легочные заболевания, эмфизему, синдром дыхательной недостаточности у взрослых, гипертонический шок, септический шок, анафилактический шок, серповидно-клеточную анемию, остановку сердца и азотный наркоз.

В одном из вариантов, например, ЕРО можно вводить для предотвращения поражений или повреждений тканей, которые могут возникнуть в результате риска поражения или повреждения тканей во время хирургических процедур, таких как, например, удаление опухоли или удаление аневризмы.

Другие патологии, вызванные гипогликемией или являющиеся ее результатом, которые можно лечить описанными здесь способами, включают передозировку инсулина, называемую также ятрогенной гиперинсулемией, инсулиномой, дефицитом гормона роста, гиперкортизолизмом, передозировкой лекарств и некоторыми опухолями.

Другие патологии, возникающие в результате повреждения возбуждаемых нейрональных тканей, включают такие припадки, как эпилепсия, судороги или хронические припадки. Другие состояния и заболевания, которые можно лечить, включают такие заболевания, как удар, рассеянный склероз, гипертония, остановка сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травма головного или спинного мозга, АШ8 деменция, возрастная утрата познавательной функции, потеря памяти, боковой амиотрофический склероз, припадки, алкоголизм, ишемия сетчатки, повреждение глазного нерва в результате глаукомы и гибель нервов.

Способы настоящего изобретения можно использовать для лечения болезненных состояний и повреждений тканей сетчатки. Такие заболевания включают (но ими не ограничиваются) желтые пятна на сетчатке, отслаивание сетчатки, пигментный ретинит, атеросклеротическую ретинопатию, гипертоническую ретинопатию, блокаду артерии сетчатки, блокаду вен сетчатки, гипотензию и диабетическую ретинопатию.

В другом варианте способы настоящего изобретения можно использовать для защиты или лечения поражений, вызванных радиационными поражениями возбуждаемых тканей.

Дальнейшее применение способов настоящего изобретения состоит в лечении отравлений нейротоксинами, таких как отравление домоевой кислотой моллюсков, нейролатиризм, гуамская (Оиаш) болезнь, боковой амиотрофический склероз и болезнь Паркинсона.

Как было указано ранее, настоящее изобретение относится также к способу усиления функций возбуждаемых тканей у млекопитающих за счет периферического введения эритропоэтина. Различные состояния и заболевания поддаются лечению с использованием этого способа, и, кроме того, этот способ можно использовать для усиления познавательной функции в отсутствии каких-либо болезненных состояний или заболеваний. Эти применения настоящего изобретения раскрыты далее более подробно, и они включают улучшение обучения и тренировки как у людей, так и у других млекопитающих.

Болезненные состояния и заболевания, поддающиеся лечению способами этого аспекта настоящего изобретения, относящиеся к центральной нервной системе, включают (но ими не ограничиваются) расстройства настроения, беспокойство, депрессию, аутизм, дефицит внимания, гиперактивность и познавательную дисфункцию. На эти состояния благоприятно влияет повышение нейрональных функций.

Другие заболевания, которые поддаются лечению способами настоящего изобретения, включают нарушения сна, например остановку дыхания во время сна, и расстройства, связанные с путешествиями; субарахноидальное и аневризмальное кровотечение, гипертонический шок, контузии, септический шок, анафилактический шок и последствия различных энцефалитов и менингитов, например воспаления мозговых тканей, связанные с заболеваниями соединительной ткани, такими как волчанка. Другие применения включают профилактику или защиту от нейротоксинов, таких как отравление домоевой кислотой моллюсков, нейролатиризм и гуамская болезнь, боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона; послеоперационное лечение эмболических или ишемических поражений; облучение всего мозга; анемию серповидных клеток и эклампсию.

Следующая группа состояний, поддающихся лечению способами настоящего изобретения, включает митохондриальные дисфункции, как наследственные, так и приобретенные, которые являются причиной различных нейрологических заболеваний, примерами которых являются поражения и гибель нейронов. Например, болезнь Лея (ЫедН) (субострая некротирующая энцефалопатия) характеризуется прогрессирующей потерей зрения и энцефалопати ей, в результате утраты нейронов, и миопатией. В этих случаях дефективный митохондриальный метаболизм оказывается не в состоянии доставить достаточное количество высокоэнергетических веществ для обеспечения метаболизма возбуждаемых клеток. Модуляторы активности ЕРО рецепторов оптимизируют недостаточные функции при различных митохондриальных заболеваниях.

Как было указано выше, состояния гипоксии вредно влияют на возбуждаемые ткани. Возбуждаемые ткани включают (но ими не ограничиваются) ткани центральной нервной системы, ткани периферической нервной системы и ткани сердца. В дополнение к указанным выше состояниям, способы настоящего изобретения применимы для лечения отравлений дыхательных путей, таких как вдыхание окиси углерода и дыма, приступы астмы, респираторный дистресс-синдром взрослых, удушение и почти утопление. Другие состояния, которые создают состояние гипоксии или другими способами вызывают повреждение возбуждаемых тканей, включают гипогликемию, которая может быть вызвана неправильными дозами инсулина или продуцирующими инсулин неоплазмами (инсулиномами).

Способами настоящего изобретения можно лечить различные нейрофизиологические нарушения, которые, как считают, возникают в результате повреждения возбуждаемых тканей. Хронические заболевания, которые могут быть связаны с повреждениями нейронов и которые можно лечить способами настоящего изобретения, включают заболевания, связанные с центральной нервной системой и/или периферической нервной системой, включая возрастную потерю познавательной функции и старческую деменцию, хронические приступы, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию, потерю памяти, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вилсона, церебральный и прогрессирующий супрануклеарный паралич, гуамскую болезнь, Ьеету деменцию, болезни, вызываемые прионами, такие как губчатые энцефалопатии, например болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Хантингтона, миотоническая дистрофия, атаксия Фридриха и другие атаксии, а также синдром СШс5 бе 1а ТоигсПс'5. заболевания, связанные с припадками, такие как эпилепсия и хронические припадки, удар, травмы головного и спинного мозга, ЛШ8 деменцию, алкоголизм, аутизм, ретинальную ишемию, глаукому, нарушения автономных функций, такие как гипертония и нарушения сна, которые включают (но ими не ограничиваются) шизофрению, шизоаффективные расстройства, дефицит внимания, дистимическое расстройство, основное депрессивное расстройство, мании, обсессивнокомпульсивное расстройство, расстройства, связанные с использованием психоактивных веществ, беспокойство, панику, а также однопо лярные или биполярные аффективные расстройства. Дополнительные нейропсихиатрические и нейродегенеративные расстройства включают, например, те, которые перечислены в Атепсаи Р8усЫа1пс ΑδδοοίαΙίοη'δ Οίαβηοδίίο апб §1аЙ8!1са1 тапиа1 о£ Меи1а1 ОЦогбеге (Ό8Μ), самая последняя версия которого включена сюда в качестве ссылки.

В другом варианте рекомбинантные химерические молекулы токсинов, включающие ЕРО, можно использовать для терапевтической доставки токсинов для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак, или вирусных заболеваний, таких как подострый склерозирующий панэнцефалит.

5.4. Фармацевтические препараты и их введение

В соответствии с настоящим изобретением ЕРО, его аналоги, миметики, фрагменты эритропоэтина, гибридные молекулы эритропоэтина, молекулы, связывающие рецепторы эритропоэтина, агонисты эритропоэтина, почечный эритропоэтин, эритропоэтины мозга, их мутанты и относящиеся к этому классу, можно вводить парентерально, через слизистую, например перорально, назально, ректально, внутривагинально, под язык, под слизистую или чрескожно. Предпочтительным способом введения является парентеральное введение, например, с помощью внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, включая также (но этим не ограничиваясь) внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное или подкожное введение. Предпочтительным способом введения небольших молекул имитаторов ЕРО является пероральное введение.

Субъектом, для которого периферическое введение ЕРО является эффективным терапевтическим режимом, предпочтительно является человек, но это может быть и любое животное, предпочтительно млекопитающее. Таким образом, как легко понять специалистам, способы и фармацевтические композиции настоящего изобретения особенно пригодны для введения любым животным, особенно млекопитающим, включая (но ими не ограничиваясь) домашних животных, таких как кошки и собаки, сельскохозяйственных животных, таких как (но ими не ограничиваясь) коровы, лошади, козы, овцы и свиньи; диких животных (независимо от того, встречаются они в дикой природе или в зоологическом саду), животных, используемых для научных исследований, таких как мыши, крысы, кролики, козы, овцы, свиньи, собаки, кошки и т.д. Как было указано выше, одомашненные животные, включая домашних животных и рабочий скот, являются кандидатами как для выяснения нейрозащитных преимуществ настоящего изобретения, так и для оценки усиления познавательных функций. Нейрологические поражения, обусловленные гипоксией, а также острые и хронические расстройства, включая эпилепсию, являются обычным явлением среди таких животных, и, таким образом, они являются кандидатами для лечения. Кроме того, как указано выше, усиление познавательных функций у животных (не людей) является преимуществом настоящего изобретения в том, что обучение, тренировки и сохранение выученного поведения можно улучшить, укрепить и сохранить, используя наставления настоящего изобретения. В результате расходы и психологические усилия владельца домашних любимцев снижаются. Например, уменьшается время, необходимое для тренировки собак и других домашних животных. Кроме того, дикие животные, которых обычно бывает трудно тренировать, могут оказаться лучшими кандидатами для тренировок по способу настоящего изобретения.

5.4.1. Композиция и эффективная доза

В настоящем изобретении предложены также фармацевтические композиции. Фармацевтические композиции, включающие ЕРО и модулятор активности ЕРО рецепторов, можно вводить пациенту в терапевтически эффективных дозах для защиты возбуждаемой ткани от повреждений, для усиления функций возбуждаемой ткани или для доставки соединения к возбуждаемой ткани. Заявители обнаружили, что повышенная доза ЕРО предпочтительна для модулирования возбуждаемой ткани и для защиты ее от поражения.

Выбор предпочтительной эффективной дозы определяет специалист с учетом нескольких факторов, которые должны быть известны специалисту. Такие факторы включают конкретную форму эритропоэтина и ее фармакокинетические параметры, такие как биодоступность, метаболизм, срок полураспада и т.д., которые должны быть установлены во время обычных процедур, которые обычно используют для получения регулирующих разрешений для фармацевтических соединений. Другие рассматриваемые для установления дозы факторы включают болезненное состояние или заболевание, подлежащие лечению, или преимущества, которых необходимо достичь для здорового индивидуума, массу тела пациента, способ введения, производится ли введение в острый или в хронический период, сопутствующее лечение и другие факторы, которые, как хорошо известно, влияют на эффективность вводимых фармацевтических агентов. Таким образом, точные размеры дозы должны определяться в соответствии с суждением практикующего врача и сопутствующих каждому пациенту обстоятельств, например в зависимости от состояния и иммунного статуса каждого пациента, в соответствии со стандартной клинической практикой.

В одном варианте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция в единичной дозировочной форме, адаптированная для модуляции возбуждаемой ткани, усиления познавательной функции или для доставки соединений через эндотелиальные плот ные соединения, которая включает в единичной дозе эффективное нетоксичное количество в интервале от около 50000 до 500000 Единиц, от 60000 до 500000 Единиц, от 70000 до 500000 Единиц, от 80000 до 500000 Единиц, от 90000 до 500000 Единиц, от 100000 до 500000 Единиц, от 150000 до 500000 Единиц, от 200000 до 500000 Единиц, от 250000 до 500000 Единиц, от 300000 до 500000 Единиц, от 350000 до 500000 Единиц, от 400000 до 500000 Единиц или от 450000 до 500000 Единиц ЕРО, модулятора активности рецепторов ЕРО или модулятора ЕРОактивированного рецептора и фармацевтически приемлемый носитель. В предпочтительном варианте эффективное нетоксичное количество ЕРО находится в интервале от около 50000 до 5000000 Единиц.

В одном варианте такую фармацевтическую композицию ЕРО можно вводить систематически для защиты возбуждаемых тканей от поражений, усиления функций повреждаемых тканей или для доставки соединений к возбуждаемым тканям. Такое введение можно осуществлять парентерально, через слизистую, например, перорально, через нос, ректально, внутривагинально, под язык, под слизистую или чрескожно. Предпочтительным способом введения является парентеральное, например, с помощью внутривенных или внутрибрюшинных инъекций, и также включая (но ими не ограничиваясь) внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение.

В предпочтительном варианте ЕРО можно вводить систематически в дозах от 2000 до 10000 Единиц/кг массы тела, предпочтительно около 2000-5000 Единиц/кг массы тела и наиболее предпочтительно 5000 Единиц/кг массы тела за 1 раз. Этой эффективной дозы должно быть достаточно для достижения уровней ЕРО в сыворотке более чем около 10000, 15000 или 20000 мЕд/мл сыворотки после введения ЕРО. Такие уровни содержания ЕРО в сыворотке могут быть достигнуты примерно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения. При необходимости такие дозы можно повторять. Например, введение можно повторять ежедневно до тех пор, пока существует клиническая необходимость, или после соответствующих интервалов, например каждые 1-12 недель, предпочтительно каждые 3-8 недель. В одном из вариантов эффективное количество ЕРО и фармацевтически приемлемого носителя можно поместить в одну дозовую ампулу или другой контейнер. В одном из вариантов ЕРО является неэритропоэтичным, т.е. он способен проявлять указанные выше активности, но не вызывать при этом повышения концентрации гемоглобина или не вызывать гематокрит. В другом варианте ЕРО вводят в дозе, которая превышает дозу, необходимую для максимальной стимуляции эритропоэза.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте термин фармацевтически приемлемый означает утвержденный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в фармакопее США или других общеизвестных фармакопеях для использования для животных, и более конкретно для людей. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которыми вводят лекарство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как солевые растворы в воде или маслах, включая минеральные, животные, растительные или синтетические масла, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Солевой физиологический раствор является предпочтительным носителем, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Физиологические солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно также использовать в качестве жидких носителей, особенно для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. п. При желании композиция может также содержать небольшие количества смачивающих и эмульгирующих агентов или агентов, буферирующих величину рН. Такие композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным выделением активного вещества и т.п. Композиции могут быть приготовлены в форме суппозиториев с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Соединения настоящего изобретения могут быть в нейтральной форме или в форме солей. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, как те, которые получены с хлористо-водородной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотами и т.п., и те, которые образованы со свободной карбоксильной группой, такие, которые получены с гидроксидами натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т. д. Примеры подходящих фармацевтических носителей раскрыты в РетшдЮпД Рйагтасеийса1 Заепсек Ьу Е.^. Матбп. Такие композиции должны содержать терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в чистом виде, вместе с соответствующим количеством носителя, с тем чтобы обеспечить нужную форму для соответствующего введения пациенту. Композиция должна соответствовать способу введения.

Фармацевтические композиции, адаптированные для перорального введения, могут быть представлены в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или не водных жидкостях); в виде съедобных пен или кремов; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные; стеарат магния, натрийсахарин, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или их соли. Мягкие желатиновые капсулы могут включать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара.

Активный агент, предназначенный для перорального введения, может быть покрыт (или может быть в смеси с) материалом, который замедляет разрушение и/или абсорбцию активного агента в желудочно-кишечном тракте (например, глицерил моностеарат или глицерил дистеарат). Так, можно достичь замедленного выделения активного агента в течение многих часов и, при необходимости, активный агент можно защитить от разложения внутри желудка. Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть созданы так, чтобы облегчить выделение активного агента в конкретном месте желудочно-кишечного тракта за счет специфических значений рН или условий ферментирования.

Фармацевтические композиции, адаптированные для чрескожного введения, могут быть представлены в виде отдельных пластырей, которые должны оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного промежутка времени. Фармацевтические композиции, адаптированные для наружного применения, могут быть представлены в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для поверхностного нанесения на кожу, рот, глаза или другие внешние ткани обычно используют мазь для наружного применения или крем. Если композиция приготовлена в виде мази, активный ингредиент может быть использован либо с парафиновой, либо со смешивающейся с водой мазевой основой. В другом варианте активный ингредиент может быть введен в крем на основе масла-в-воде или воды-в-масле. Фармацевтические композиции, адаптированные для наружного введения для глаз, включают глазные капли. В этих композициях активный ингредиент может быть растворен или суспендирован в подходящем носителе, например в водном растворителе. Фармацевтические композиции, адаптированные для поверхностного введения в рот, включают лепешки, пастилки и полоскания для рта.

Фармацевтические композиции, адаптированные для введения через нос, могут включать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно с размером частиц в интервале от 20 до 500 мкм). Порошки можно вводить путем вдыхания через нос, т. е. быстрой ингаляцией через нос из контейнера с порошком, который держат близко к носу. В другом варианте композиции, адаптированные для введения через нос, могут содержать жидкий носитель, например спреи для носа или капли для носа. Эти композиции могут включать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения путем ингаляций могут поставляться в специальных устройствах, включая (но ими не ограничиваясь) аэрозоли под давлением, распылители или устройства для вдувания, которые могут быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечить определенную дозу активного ингредиента. В предпочтительном варианте фармацевтические композиции настоящего изобретения вводят через носовую полость в легкие.

Фармацевтические композиции, адаптированные для ректального введения, могут быть представлены в виде суппозиториев или клизм. Фармацевтические композиции, адаптированные для вагинального введения, могут быть представлены композициями в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев.

Фармацевтические композиции, адаптированные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы или суспензии для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композиции практически изотоничными с кровью предполагаемого реципиента. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции, адаптированные для парентерального введения, могут быть представлены в контейнерах, содержащих единичную или множественные дозы, например в запаянных ампулах и пробирках, и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, и при этом непосредственно перед использованием необходимо всего лишь добавить стерильный жидкий носитель, например стерильный физиологический солевой раствор для инъекций. Растворы и суспензии для немедленного введения можно приготовить из стерильных порошков, гранул или таблеток.

В предпочтительном варианте композиции приготавливают в соответствии с рутинными процедурами приготовления фармацевтических композиций, адаптированных для внутривенного введения людям. Обычно композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильных изотонических водных буферах. При необходимости композиции могут также включать способствующие растворению агенты и локальные анестезирующие агенты, такие как лидокаин, для облегчения боли на участке инъекции. Обычно ингредиенты поставляют либо отдельно, либо смешанными вместе в единичной дозовой форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметизированных контейнерах, таких как ампулы или саше, с указанием количества активного агента. Если композиции вводят с помощью вдуваний, они могут быть распределены во флаконы для вдуваний, содержащие стерильной степени чистоты воду или физиологический солевой раствор. Если композицию вводят с помощью инъекции, ампула со стерильной водой или физиологическим раствором для инъекций может быть представлена такой, чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

Суппозитории обычно содержат активный ингредиент в интервале от 0,5 до 10 вес.%; композиции для перорального введения предпочтительно содержат от 10 до 95 вес.% активного ингредиента.

В настоящем изобретении предложены также фармацевтическая упаковка или набор, включающие один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтической композиции настоящего изобретения. Необязательно такой контейнер (контейнеры) сопровождаются аннотацией в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение и продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем в этой аннотации отражено утверждение агентством изготовления, применения или продажи для введения людям.

5.4.2. Способы введения

В настоящем изобретении предложены композиции и способы периферического введения ЕРО для усиления функций или защиты возбуждаемых тканей и для доставки соединений к таким тканям. Как было указано выше, настоящее изобретение основано частично на обнаружении того факта, что периферически введенные ЕРО обладают непосредственными нейрозащитными или нейроусиливающими свойствами в возбуждаемых тканях, таких как ткани центральной нервной системы, ткани периферической нервной системы или ткани сердца. Возбуждаемые ткани, в том смысле, как здесь использован этот термин, включают (но ими не ограничиваются) нейрональные ткани центральной и периферической нервных систем и ткани сердца. В этом разделе раскрыты такие соединения и способы их введения.

Настоящее изобретение предлагает введение ЕРО и модуляторов активности ЕРО способом введения, который отличается от непосредственного введения в центральную нервную систему, и термины периферическая и системная включают эти различные способы. Пе31 риферическое введение включает пероральное или парентеральное введение, такое как внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, ректальное, под слизистую или внутрикожное. Другие способы пригодны для введения описанных выше агентов. Здесь предложено введение как в острых случаях, так и при хронических заболеваниях.

В одном из вариантов, например, ЕРО можно доставлять в системе с контролируемым выделением. Например, полипептид можно вводить, используя внутривенные вливания, имплантируемые осмотические насосы, чрескожные пластыри, липосомы или другие способы введения. В одном из вариантов можно использовать насос (см. Бапдег, кирга; 8ейои, 1987, СКС Си1. КеГ. Бюшей. Епд. 14:201; Вие11\\'а16 е! а1., 1980, 8итдету 88:507; 8аийек е! а1., 1989, N. Епд1. 1. Мей. 321:574). В другом варианте соединение можно доставить в носителе, в частности в липосоме (см. Бапдет, δείепсе 249:1527-1533 (1990); Тгеа! е! а1., ίη Б1рокошек ίη !ке Ткегару οί 1пГесйоик Бкеаке апй Сапсег, Борех-Вегек1еш апй Е1й1ет (ейк.), Б1кк, №\\ Уотк, рр.353-365 (1989); №0 91/04014; патент США. №. 4704355; Борех-Вегек!еш, 1Ь1й., рр.317-327; кее депега11у 1Ь1й.). В другом варианте можно использовать полимерные материалы (см. Мей1са1 Аррйсайопк оГ Соп!го11ей Ке1еаке, Бапдет апй №1ке (ейк.), СКС Ргекк: Воса Ка!оп, Е1от1йа, 1974; Соп!го11ей Бтид ВюауайаЬййу, Бтид Ргойис! Беыдп апй РегГогтапсе, 8шо1еп апй Ва11 (ейк.), №11еу: №\ν Уотк (1984); Капдег апй Реррак, 1. Масгошо1. 8ск Кеу. Масгошо1. Сйет. 23:61, 1953; см. также Беуу е! а1., 1985, 8аепсе 228:190; Битшд е! а1., 1989, Апп. №ито1. 25:351; Ноъагй е! а1., 1989, 1. №игокшд. 71:105).

Еще в одном варианте систему с контролируемой системой выделения можно поместить вблизи от терапевтической цели, т.е. вблизи мозга, что потребует лишь части системной дозы (см., например, Соойкоп, рр. 115-138 ш Мей1са1 Аррйсайопк оГ Соп!го11ей Ке1еаке, уо1.2, кирга, 1984). Другие системы с контролируемым выделением раскрыты в обзоре Бапдет (1990, 8аепсе 249:1527-1533).

В другом варианте ЕРО в соответствующей форме можно вводить через нос, перорально, ректально, вагинально или сублингвально.

В специфическом варианте может оказаться желательным вводить ЕРО композиции настоящего изобретения локально в участок, нуждающийся в лечении; этого можно достичь, например (но не в качестве ограничения) локальным вливанием во время хирургического вмешательства, поверхностным нанесением, например вместе с повязкой на рану после операции, путем инъекции с помощью катетера, с помощью суппозиториев или используя имплантаты, причем указанные имплантаты являются пористым или непористым материалом, включая сиаластиковые мембраны или волокна.

Настоящее изобретение можно лучше понять, обратившись к следующим, нелимитирующим примерам, которые представлены в качестве примеров изобретения. Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты изобретения. Однако их никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие широту объема изобретения.

Как здесь будет раскрыто далее, исследования, которые были предприняты изобретателями, являются стандартными, общепринятыми тестами в моделях на животных, которые позволяют предсказать профилактические и лечебные преимущества.

6. Пример 1. Периферическое введение ЕР0 повышает познавательную функцию.

В этом примере эксперимент по пространственной ориентации, известный как тест водного лабиринта Морриса, демонстрирует ЕРОиндуцированное усиление познавательной функции у мышей. В этом тесте небольшую прозрачную платформу помещают в один сектор плавательного бассейна с непрозрачной водой. Мыши, помещенные в плавательный бассейн, должны плыть до тех пор, пока они не достигнут платформы для отдыха, находящейся ниже поверхности, которая невидима для плывущих мышей. Тест сводится к определению времени, которое требуется животным, чтобы достичь платформы (т.е. промежутка времени, которое они проводят плавая). В последовательных опытах время, необходимое для каждой мыши для достижения платформы, будет уменьшаться как функция узнавания ими местоположения. Этот тип эксперимента по обучению включает гиппокамп, так как поражения гиппокампа мешают обучению в этом тесте.

Эксперименты проводят в круглом черном бассейне диаметром 150 см. Произвольно определяют четыре точки: север, юг, запад и восток. Отчетливые визуальные метки располагают у каждого из четырех секторов: например, вспышки света, яркая лента, помещенная в сектор, и т. д. для ориентировки мышей в бассейне. Платформу произвольно помещают в один из секторов. Опыт состоит в том, что животное помещают вперед головой в один из секторов бассейна и отпускают. Длительность опыта составляет всего 90 с. Если животное само не достигает платформы, его помещают на платформу еще на 15 с. Испытуемые отдыхают в течение часа, затем их помещают для тестирования в другой сектор. В течение дневного опыта используют все четыре сектора, и животных тестируют в течение 12 последовательных дней (т.е. всего 48 опытов).

Сам эксперимент состоит во введении мышам с помощью внутрибрюшинной инъекции 5000 Единиц/кг рекомбинантного человеческого ЕРО (в продаже под торговой маркой

РКОСШТ, 0т1йо-Вю!есй, 1пс.) за 4 ч до ежеднев33 ного тестирования, каждый день в течение 12 дней опытов. Контрольным животным инъецируют солевой физиологический раствор (имитатор).

Степень обучаемости определяют, измеряя продолжительность времени, которое каждая из мышей проводит на платформе. На фиг. 1А полученные результаты представлены как диаграмма времени, проведенного на платформе ЕРО-обработанной группой и группой с инъекцией имитатора. Полученные результаты показывают, что обе группы животных проводят на платформе больше времени, т. е. они обучаются более быстрому достижению платформы с каждым последовательным днем обучения, но животные, которым вводили ЕРО, делают это быстрее группы с инъекцией имитатора. Т. е. у обработанных ЕРО животных наблюдается гораздо более быстрая кривая обучаемости, нежели для группы с инъекцией имитатора. Если выразить результаты как разницу между ЕРОобработанной группой и группой с инъекцией имитатора и сравнить результаты для этих двух групп, линия регрессии (К²=0,88) показывает наклон (0,68), заметно отличающийся от наклона 1, что явно свидетельствует в пользу ЕРО группы (фиг. 1В).

7. Пример 2. Периферическое введение ЕРО усиливает обучение в стандартном тесте вкусового отвращения.

Стандартный тест вкусового отвращения (СТА), осуществленный в этом примере, демонстрирует, что ЕРО резко влияет на способность мышей к запоминанию и обучению избегать ощущений неприятного вкуса, в данном случае вещества, вызывающего болезненное чувство. В этом примере хлорид лития используют для того, чтобы вызвать СТА, так как хлорид лития надежно вызывает недомогание и анорексию дозозависимым образом. Подобно природному болезненному состоянию, литий вызывает СТА, стимулируя описанную выше схему, включая выделение цитокинов.

Самок мышей штамма Ва1Ь/с тренировали на ограничение их полного дневного потребления воды до одного 5-минутного периода питья в день и обучали выпивать в этот промежуток времени достаточное количество воды, чтобы сохранять равновесие. Животных делят на две группы и вводят им внутрибрюшинно (ΙΡ) либо инъекцию имитатора (физиологический раствор), либо ЕРО (5000 Единиц/кг) за 4 ч перед тем, как им дают новую сахарино-ванильную жидкость. Сразу после того, как окончено питье этой сладкой жидкости, животным вводят либо физиологический раствор, либо вызывающую болезненные ощущения дозу лития (20 мг/кг 0,15 М Ь1С1, внутрибрюшинно). После этого животных разбивают на три группы. Первой группе (контрольной) не вводят литий после питья. Второй группе вводят и литий, и ЕРО. Третьей группе (имитатор) вводят физиологический раствор (без ЕРО) и литий.

Условный рефлекс отвращения (стандартный тест вкусового отвращения) определяют, измеряя уменьшение потребления воды после последующего предоставления вызывающего болезненность раствора, новой сахарино-ванильной жидкости. После 5 дней восстановления от приема лития или имитатора испытывающим жажду животным снова предоставляют новую сахарино-ванильную жидкость. Сравнение результатов, полученных для групп 2 и 3 по сравнению с группой 1 (контроль), представлено на фиг. 2А. День 2 соответствует базовой линии потребления воды после обитания в клетке для тестирования. На 3 день животным вводят внутрибрюшинно инъекцию либо физиологического раствора, либо ЕРО (5000 Единиц/кг) за 4 ч до предоставления новой сахарино-ванильной жидкости, с последующей обработкой литием или имитирующим физиологическим раствором (стрелка). Такая обработка приводит к небольшому снижению потребления жидкости всеми группами на 3 день, что соответствует ранее документированному вредному воздействию инъекций и новизны жидкости. После выздоровления первый тест на установление СТА не показывает какого-либо уменьшения потребления жидкости у контрольной группы. Однако животные, которым вводили литий, демонстрируют практически полное отвращение к жидкости, несмотря на ощущение жажды (день 4). Продолжение лишения воды в конце концов вызывает угасание СТА (дни 5-9), но характеризуются заметно замедленным восстановлением животных, которым вводили ЕРО, что показывает кривая черных кружков на фиг. 2А.

Установленную здесь устойчивость СТА можно лучше оценить, учитывая степень водного дефицита, наблюдаемого в каждый день тестирования, так как ЕРО-обработанные животные переносят дефицит воды примерно в 2 раза лучше, чем животные, которым вводили имитатор (фиг. 2В). Несмотря на заметно акцентированные СТА, продемонстрированные ЕРО группой, животные в этой группе с большей готовностью достигали поилки по сравнению с группой с инъекцией имитатора, как видно на фиг. 2С. Устойчивость СТА была продемонстрирована при повторных инъекциях одного только лития (без ЕРО), что приводило к ослабленному СТА, величина которого была больше для ЕРО группы (фиг. 2 А, день 10). Эти результаты показывают, что предварительная обработка ЕРО связана с заметным потенциированием СТА, вызываемого литием.

8. Пример 3. Периферически введенные

ЕРО защищают мозг от экситоксина.

Этот пример демонстрирует, что ЕРО преодолевает гематоэнцефалический барьер и обладает нейрозащитным действием для мышей, обработанных нейротоксином каинатом. В природе существует множество соединений, кото35 рые демонстрируют специфическую токсичность в отношении нейронов. Эти молекулы обычно взаимодействуют с эндогенными рецепторами для аминокислотного трансмиттера, глутамата, вызывая затем избыточную стимуляцию и нейрональное поражение. Одно из них, каинат, вещество, которое широко используется для изучения нейрональных поражений, связанных с экцитотоксичностью, является аналогом глутамата. Каинат является эффективным нейротоксином, который специфически разрушает нейроны, особенно те, которые расположены в участках с высокой плотностью каинатных рецепторов, таких как гиппокамп, и вызывает судороги, поражения мозга и смерть.

Приводимые ниже исследования нейротоксичности проводили на мышах, используя каинат. Эту модель используют для оценки защитного действия для таких состояний, как височная эпилепсия. Парентеральные инъекции экспериментальным животным, таким как крысы и мыши, вызывают частичные (лимбические) судороги дозозависимым образом, которые могут затем распространиться и привести к смерти. Эксперименты, представленные в этом разделе, осуществляют для выяснения того, может ли периферически введенный ЕРО преодолеть гематоэнцефалический барьер, и если да, то воздействует ли ЕРО на нейрональное энергетическое равновесие, и конкретно, обладает ли он нейрозащитным действием в отношении каината.

Итак, самок мышей штамма Ва1Ь/с (весом в среднем 15-20 г) предварительно обрабатывают дозой в 5000 Единиц/кг рекомбинантного человеческого эритропоэтина (гНЕРО; в продаже под торговой маркой РЯОСКТТ, Ог11ю-Вю1ес11, Гпс.) или физиологическим раствором (имитация), которые вводят внутрибрюшинной инъекцией в конкретные моменты времени до, во время или после введения каината (81дта СНет1са1), также внутрибрюшинно, в определенных концентрациях (масса/кг веса тела). Затем за животными наблюдают и оценивают по развитию активности конвульсий через 20 мин после введения каината. Каждый опыт заканчивают через 60 мин после введения дозы каината. Как представлено на фиг. 3А, предварительная обработка ЕРО резко снижает степень судорог и задерживает наступление к!а!ик ерйерйсик у мышей, обработанных каинатом. Сравнение животных, обработанных ЕРО и имитатором, демонстрирует значительно меньшее количество смертей животных, которым ввели дозы каината в интервале 20-30 мг/кг, что указывает на нейрозащиту, обеспеченную предварительной обработкой ЕРО. Цифры в скобках под каждым столбиком указывают число животных, которым ввели каждую из доз каината. Дозозависимая нейрозащита от каината вследствие введения ЕРО представлена на фиг. 3В. Мышам вводили ЕРО (5000 Единиц/кг; внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней). Нейрозащитный эффект каждой дозы ЕРО оценивают, определяя выживание после введения каината (20 мг/кг), что приводит примерно к 50% смертности для контрольных животных (без ЕРО; см. фиг. 3А). Столбики указывают на увеличение выживаемости ЕРО-обработанных животных по сравнению с симуляторно-обработанными животными. Как видно на фиг. 3В, нейрозащита возрастает с дополнительными ЕРО дозами по 5000 Единиц/кг.

Нейрозащита, обеспечиваемая ЕРО, характеризуется замедленным наступлением, что характерно для активации программы генной экспрессии. Фиг. 3С показывает, что связанная с ЕРО задержка (в минутах) гибели от судорог, вызванных одной дозой ЕРО, введенной одновременно с введением каината (20 мг/кг), не обеспечивает какой-либо немедленной защиты, тогда как введение ЕРО за 24 ч до введения каината повышает латентность и снижает тяжесть судорог и увеличивает промежуток времени до смерти. Этот эффект длится вплоть до 7 дней.

9. Пример 4. Периферическое введение ЕРО защищает мозг от повреждений, связанных с ишемией.

Предшествовавшие исследования ш νίνο с использованием модели общей реперфузии на песчанках показали, что прекращение притока крови к мозгу приводит к гибели клеток и что ЕРО, введенный непосредственно в церебральные желудочки, защищает мозг от такой гибели клеток (8акапака е1 а1., 1998, Ргос. Νηΐΐ. Асаб. 8сЕ И.8.А. 95:4635). Описанные в примере эксперименты впервые показывают, что ЕРО, введенный периферически, защищает нервные клетки от гибели ш νίνο в модели ишемии на животных.

Описываемый далее эксперимент был осуществлен с использованием модели окклюзии средней церебральной артерии, принятой модели локального ишемического удара. По протоколу, самцов крыс (весом 250 г) анестезируют фенобарбиталом и выдерживают при 37°С. Обнажают сонные артерии и перманентно перекрывают ипсалатеральную сонную артерию. Ипсалатеральную среднюю сонную артерию (МСА) обнажают и вводят в ее начало катетер. Контралатеральную артерию перекрывают зажимом на 1 ч. Животных умерщвляют через 24 ч, мозг извлекают и разрезают на последовательные слои толщиной 1 мм. Живые ткани визуализируют ш κίΐιι восстановлением трифенилтетразолием для того, чтобы отличить живые ткани от некротических участков. В ишемической корке и окружающей полутени клетки погибли.

Используя эту МСА модель, ЕРО вводили с помощью парентеральных инъекций в различное время до и сразу после поражения и объем поражения количественно определяли с помо37 щью анализа компьютерного изображения. Результаты этого анализа, представленные на фиг. 4А, указывают на влияние обработки ЕРО в следующие моменты времени после удара: за 24 ч до удара, во время удара и через 3, 6 и 9 ч после удара.

Как видно на фиг. 4А, ЕРО защищает ткани от некротического поражения при введении вплоть до 6 ч после удара.

Интересно и противоречиво то, что 17-мер, полученный из ЕРО, который, как сообщалось ранее, обладает нейрозащитной активностью, промотирует рост нейритов ίη νίΐτο и миелинизацию нервных клеток ех νίνο (Сатрапа с1 а1., 1998, Σηΐ. ί. Мо1. Меб. 1:235-41; патент США 5700909, выданный 23 декабря 1997), не оказывает влияния на защиту против поражения в этой системе (фиг. 4В, 17-мер). Таким образом, эту модель, а также другие способы оценки влияния ЕРО на функции возбуждаемой ткани, представленные настоящим изобретением, можно использовать для идентификации ЕРО и модуляторов активности ЕРО рецепторов, которые можно использовать для модулирования функций возбуждаемой ткани, например для защиты их от поражений или для усиления обучаемости и познавательной функции.

10. Пример 5. Периферическое введение ЕРО защищает мозг от острой травмы.

В модели механической травмы (модель кортикального удара) предварительная обработка систематически вводимым ЕРО защищает мышиный мозг от тупой травмы. Для создания травмы используют пневматический пистон (Сйрратб Уаке5). 3 мм диаметром, которым можно нанести точный удар в череп. Каждую из мышей анестезируют и помещают, жестко закрепив, в стереотаксическом устройстве так, чтобы предотвратить движения головы. Скальп рассекают для определения положения темени, что является сравнительной точкой, с помощью которой осуществляют исходную установку пистона. Затем пистон устанавливают, перемещая его на 2 мм назад и 2 мм вниз относительно темени, и осуществляют удар, используя точный импульс азота. Такое устройство позволяет точно выбрать скорость пистона (4 м/с) и ударное смещение (2 мм).

Мышей обрабатывают ЕРО (5000 Единиц/кг) за 24 ч до, во время поражения, через 3, 6 и 9 ч после и продолжают далее как дневные дозы. Через 10 дней после процедуры мышей умерщвляют, затем исследуют мозг и определяют объем некроза мозга. У мышей, обработанных инъекцией имитатора, наблюдается обширная площадь некроза (фиг. 5), сопровождаемая обильной инфильтрацией моноцитов. Напротив, у животных, которых защитили от такого поражения, определялось немного одноядерных клеток на участке поражения, если животных предварительно обрабатывали ЕРО или ЕРО вводили вплоть до 3 ч после поражения.

11. Пример 6. Периферическое введение ЕРО защищает миокард от ишемического поражения.

Этот пример демонстрирует эффект ЕРО в отношении защиты тканей сердца от гипоксического поражения. Для его проведения крыс до тестирования предварительно обрабатывают ЕРО (5000 Единиц/кг) за 24 ч до процедуры, которую осуществляют по способу Байт е1 а1., (1999, 1. Сагбюуахе. Рйаттасо1. 31:601-8). Затем животных анестезируют, подключают к аппарату искусственного дыхания и осуществляют торактомию. Определяют сердце и его внутреннюю циркуляцию, и удаляемый кетгут помещают вокруг ближайшего участка нисходящей левой коронарной артерии, и затем его перевязывают. Затем вводят дополнительную дозу ЕРО (5000 Единиц/кг) и окклюзию сохраняют в течение 30 мин. В это время лигатуру ослабляют и животных выдерживают в состоянии глубокого наркоза еще 6 ч, а затем умерщвляют. Сразу после смерти сердце извлекают и часть пораженного участка (ААЯ), а также не пораженного участка (перегородка) удаляют и препарируют для биохимического анализа. Определяют два параметра: креатинкиназу (СК) как показатель выживаемости миокарда (чем ниже СК, тем меньше выживаемость ткани) и миелопероксидазу, которая является продуктом инфильтрата моноядерных клеток. Результаты представлены на фиг. 6А и 6В. Как видно на этих фигурах, обработка ЕРО приводит к сохранению СК активности, что соответствует повышению жизнеспособности ткани и снижению МРО активности по сравнению с контролем, как в площади инфаркта (ААЯ), так и свободной стенки перфузированного левого желудочка (ЬУ), что указывает на значительно меньшую инфильтрацию воспалительными клетками.

12. Пример 7. Периферическое введение ЕРО ослабляет экспериментальный аллергический энцефалит.

Экспериментальный аллергический (или аутоиммунный) энцефаломиелит (ЕАЕ) у крыс является принятой моделью на животных для изучения рассеянного склероза (М8). Были разработаны различные модели с ЕАЕ на животных с использованием различных иммунологических, вирусологических, токсических и травматических параметров для выяснения особенностей М8.

Для выяснения того, защищает ли ЕРО против симптомов ЕАЕ, осуществляют следующий эксперимент. Самок крыс штамма Льюис в возрасте 6-8 недель (Сйаг1е§ Ктует, Са1со, Йа1у) иммунизируют под легкой анестезией, вводя с помощью инъекций в подушечки стоп обеих задних лап по 50 мкг миелинового основного белка морских свинок (МВР; 81дта, 8ΐ. Бошк, МО) в воде, эмульгированного в равных объемах полного адъюванта Фрейнда (СЕА, 8щта) с 7 мг/мл термически убитых МусоЬас1е39 пит !иЬегси1ок1к, добавленных к Н37Ва (Ийсо, Ое1гой. М1) в конечном объеме 100 мкл.

После обработки крыс ежедневно оценивают по признакам экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) и оценивают результаты следующим образом: 0, нет заболевания; 1, вялый хвост; 2, атаксия; 3, полный паралич задних конечностей с недержанием мочи. Контролируют также вес тела. Крысам вводят ЕРО (5000 Единиц/кг, внутрибрюшинно, раз в день), начиная на 3 день после 5 иммунизации, и продолжают до 18 дня. Контрольным крысам вводят один только носитель. Как видно на фиг. 7, крысы, обработанные ЕРО, демонстрируют повышенную оценку (т.е. меньший номер) и в отношении длительности заболевания. Кроме того, для крыс, которым вводили ЕРО, отмечается заметная задержка в наступлении симптомов.

13. Пример 8. Минимальная эффективная доза и фармакокинетика ЕРО, необходимого для защиты возбуждаемых тканей.

Оптимальную и эффективную дозы ЕРО оценивают, используя описанную выше модель ишемического шока на животных. Как видно на фиг. 8А, доза ЕРО меньше, чем 450 Единиц/кг массы тела, ненадежно защищает возбуждаемые ткани от некротических поражений. Как видно на фиг. 8В, для исследованных животных доза в примерно 5000 Единиц/кг массы тела, введенная внутрибрюшинно четырем самкам мышей, приводит к циркулирующему уровню ЕРО более чем 20000 мЕдиниц/мл сыворотки через 5 ч после его введения, более чем 10000 мЕдиниц через 10 ч после его введения, но менее чем 3 мЕдиниц через 24 ч после его введения.

14. Пример 9. Доставка в ЦНС с помощью эритропоэтина.

Представленные далее примеры демонстрируют успешный транспорт конъюгированных с ЕРО молекул через гематоэнцефалический барьер и их локализацию внутри базальной мембраны. Как видно на фиг. 9А, срезы мозга были окрашены антителами к ЕРО рецептору (ЕРО-В), что показывает, что капилляры мозга экспрессируют высокие уровни ЕРО-В. Для выяснения того, может ли ЕРО преодолевать гематоэнцефалический барьер, ЕРО метят биотином следующим образом. Объем, содержащий гйЕРО, концентрируют, используя фильтр С.’еп1псоп-10 (М1Шроге), и полученное измеряют, считывая значения поглощения при длине волны 280 нм. Затем 0,2 мг биотина с длинной цепочкой (Уес!ог ЬаЬк) растворяют в 100 мкл ДМСО, добавляют к концентрированному раствору гйЕРО и немедленно вращают. Затем эту смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 4 ч при осторожном перемешивании в темноте. Несвязанный биотин удаляют из раствора, используя колонку Сеп!псоп-10. Затем биотинилированный ЕРО вводят внутрибрюшинно животным и 5 ч спустя животных умерщвляют. В срезы моз га вводят авидин, соединенный с пероксидазой, и добавляют диаминобензидин до тех пор, пока достаточное количество продукта реакции не проявляется для наблюдения с помощью светового микроскопа. ЕРО обнаруживаются вдоль тех же самых капилляров, которые окрашены позитивно для ЕРО-В (фиг. 9В). Для более поздних промежутков времени метки биотина появляются с локализацией внутри специфических нейронов (например, 17 ч, фиг. 9С). Напротив, если холодный ЕРО добавляют в 1000кратном избытке по отношению к меченому ЕРО, все специфическое окрашивание исчезает. Полученные результаты демонстрируют успешную доставку системно введенного конъюгированного с ЕРО соединения через гематоэнцефалический барьер.

Успешная доставка системно введенного конъюгата ЕРО-биотин через гематоэнцефалический барьер в мозг демонстрирует, что аналогичным способом можно доставлять через гематоэнцефалический барьер другие терапевтические соединения, создавая комплексы ЕРО с представляющим интерес соединением. В качестве одного из примеров полученный из мозга нейротрофический фактор (ВИР) можно ковалентно связать с ЕРО в результате карбодиимидного присоединения, используя стандартные способы. После очистки этот конъюгат можно вводить животным с помощью внутрибрюшинных инъекций. Позитивное влияние ВИР на центральную нервную систему можно измерить по отношению к контрольным животным, для измерения успешного транспорта этой молекулы в ассоциации с ЕРО, в противоположность недостатку активности центральной нервной системы при введении неконъюгированного ВИР.

Настоящее изобретение не должно быть ограничено объемом раскрытых здесь конкретных вариантов, которые должны служить лишь иллюстрацией отдельных аспектов изобретения, и функциональность эквивалентных методов и компонентов включены в объем изобретения. Действительно, специалистам будут понятны различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, которые здесь представлены и раскрыты в предшествующем описании и в сопровождающих рисунках. Такие модификации должны быть включены в объем прилагаемой формулы изобретения. Все приведенные ссылочные материалы включены сюда по ссылке в своей полноте для всех целей.

Claims (32)

1. Фармацевтическая композиция в единичной дозировочной форме, адаптированная для модуляции возбуждаемой ткани, усиления познавательной функции или доставки соединений через эндотелиальные плотные соединения, которая включает на единичную дозу эффективное нетоксичное количество в интервале от около 50000 до 500000 Единиц ЕРО, модулятора активности рецепторов ЕРО, модулятора ЕРОактивированного рецептора или их комбинаций и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где эффективное нетоксичное количество ЕРО составляет от 50000 до 500000 Единиц ЕРО.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где эффективное нетоксичное количество ЕРО составляет дозу, эффективную для достижения циркулирующего уровня ЕРО, который выше, чем 10000 мЕд/мл сыворотки.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где циркулирующий уровень ЕРО определяют примерно через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения ЕРО.

5. Фармацевтический набор, содержащий один или более из контейнеров, включающих композицию по п.2.

6. Способ защиты млекопитающих от патологии, вызванной поражением возбуждаемой ткани, включающий периферическое введение указанному млекопитающему эффективного количества ЕРО, модулятора активности рецепторов ЕРО или модулятора ЕРО-активированного рецептора для защиты возбуждаемой ткани в количестве и в режиме введения доз, достаточном для достижения указанного защитного эффекта без заметного увеличения гематокрита.

7. Способ по п.6, где указанное поражение является результатом эпилептического приступа, рассеянного склероза, удара, гипертонии, остановки сердца, ишемии, инфаркта миокарда, воспаления, возрастной утраты познавательной функции, радиационного поражения, церебрального паралича, нейродегенеративного заболевания, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Лея, АШ8 деменции, потери памяти, бокового амиотрофического склероза, алкоголизма, эмоционального расстройства, беспокойства, дефицита внимания, аутизма, болезни Крейтцфельда-Якоба, травмы головного или спинного мозга, шунтирования сердцалегких, глаукомы, почечной ишемии или травмы сетчатки.

8. Способ по п.6, где указанное поражение является следствием гипоксии.

9. Способ по п.8, где указанная гипоксия является пренатальной или постнатальной нехваткой кислорода, удушьем, удушением, почти утоплением, постоперационным расстройством познавательной функции, отравлением окисью углерода, вдыханием дыма, хроническим обструктивным легочным заболеванием, эмфиземой, синдромом респираторного дистресса у взрослых, гипертоническим шоком, септическим шоком, анафилактическим шоком, инсулиновым шоком, серповидно-клеточной анемией, остановкой сердца, аритмией, азотным наркозом или локализованной гипоксией тканей.

10. Способ усиления функции здоровой или патологической возбуждаемой ткани у мле копитающих, включающий периферическое введение указанному млекопитающему периферически эффективного усиливающего функции возбуждаемой ткани количества ЕРО, модулятора активности рецептора ЕРО, модулятора ЕРО-активированного рецептора или их комбинации в количестве и в режиме введения доз, достаточном для достижения указанного усиливающего эффекта без заметного увеличения гематокрита.

11. Способ по п.10, где указанное усиление функции возбуждаемой ткани приводит к улучшению ассоциативной обучаемости или памяти.

12. Способ по п.10, где указанное усиление функции возбуждаемой ткани используют для лечения эмоциональных расстройств, беспокойства, депрессии, аутизма, дефицита внимания, болезни Альцгеймера, старения или нарушения познавательной функции.

13. Способ по п.6 или 10, где указанной возбуждаемой тканью являются ткани центральной нервной системы, периферической нервной системы или ткани сердца.

14. Способ по п.6 или 10, где указанное введение включает пероральное, наружное, внутриполостное введение, или введение путем ингаляции, или парентеральное введение.

15. Способ по п.14, где указанное парентеральное введение является внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, под слизистую или внутрикожным.

16. Способ по п.6 или 10, где указанное введение осуществляют в остром или хроническом периоде.

17. Способ по п.6 или 10, где указанный ЕРО является неэритропоэтическим.

18. Способ по п.6 или 10, где указанный ЕРО вводят в дозе, которая превышает дозу, необходимую для максимальной стимуляции эритропоэза.

19. Способ облегчения трансцитоза молекул через эндотелиальный клеточный барьер у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему композиции, включающей указанную молекулу в ассоциации с ЕРО, модулятором активности ЕРО, модулятором ЕРО-активированного рецептора или их комбинации в количестве и в режиме введения доз, достаточном для достижения указанного эффекта трансцитоза без заметного увеличения гематокрита.

20. Способ по п.19, где указанная ассоциация является лабильной ковалентной связью, стабильной ковалентной связью или нековалентной ассоциацией со связывающим сайтом для указанной молекулы.

21. Способ по п.19, где указанный эндотелиальный клеточный барьер является гематоэнцефалическим барьером, гематоофтальмическим барьером, барьером между кровеносной системой и семенниками, барьером между кровенос43 ной системой и яичниками или плацентарным барьером.

22. Способ по п.19, где указанная молекула является агонистом рецептора или антагонистом-гормоном, нейротрофическим фактором, противомикробным агентом, радиофармацевтическим агентом, антисмысловым соединением, антителом, иммуносупрессором, токсином или противораковым агентом.

23. Способ по пп.6, 10 или 19, где указанный ЕРО является эритропоэтином, аналогом эритропоэтина, миметиком эритропоэтина, фрагментом эритропоэтина, гибридной молекулой эритропоэтина, молекулой, связывающей рецептор эритропоэтина, агонистом эритропоэтина, почечным эритропоэтином, эритропоэтином мозга, их олигомером, их полимером, их мутантом, их родственным соединением, их природной формой, их синтетической формой, их рекомбинантной формой или их комбинацией.

24. Способ по п.23, где указанная связывающая рецептор ЕРО молекула является антителом к рецептору эритропоэтина.

25. Композиция для транспортировки молекулы за счет трансцитоза через эндотелиальный клеточный барьер, включающая указанную молекулу в ассоциации с ЕРО, модулятором активности рецептора ЕРО или модулятором ЕРО-активированного рецептора.

26. Композиция по п.25, где указанный ЕРО является эритропоэтином, аналогом эритропоэтина, миметиком эритропоэтина, фрагментом эритропоэтина, гибридной молекулой эритропоэтина, молекулой, связывающей рецептор эритропоэтина, агонистом эритропоэтина, почечным эритропоэтином, эритропоэтином мозга, их олигомером, их полимером, их мутантом, их родственным соединением, их природной формой, их синтетической формой, их рекомбинантной формой или их комбинацией.

27. Композиция по п.25, где указанной молекулой является агонист рецептора или антагонист-гормон, нейротрофический фактор, антимикробный агент, радиофармацевтический агент, антисмысловое соединение, антитело, иммуносупрессор, токсин или противораковый агент.

28. Фармацевтический препарат, приготовленный для введения для достижения нейрозащитного эффекта, включающий терапевтическое количество производного неэритропоэтического ЕРО и фармацевтически приемлемый носитель.

29. Фармацевтический препарат, приготовленный для введения, для достижения нейроусиливающего эффекта, включающий терапевтическое количество производного неэритропоэтического ЕРО и фармацевтически приемлемый носитель.

30. Фармацевтический препарат, приготовленный для введения, для доставки соединений через эндотелиальные плотные соединения, включающий терапевтическое количество производного неэритропоэтического ЕРО и фармацевтически приемлемый носитель.

31. Фармацевтический препарат по пп.28, 29 или 30, где производное неэритропоэтического ЕРО является модулятором активности рецептора ЕРО.

32. Фармацевтический набор, включающий один или более из контейнеров, содержащих препарат по пп.28, 29 или 30.