SK11899A3 - Hamster ef-1'alpha' transcriptional regulatory dna - Google Patents
Hamster ef-1'alpha' transcriptional regulatory dna Download PDFInfo
- Publication number
- SK11899A3 SK11899A3 SK118-99A SK11899A SK11899A3 SK 11899 A3 SK11899 A3 SK 11899A3 SK 11899 A SK11899 A SK 11899A SK 11899 A3 SK11899 A3 SK 11899A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- fragment
- gene
- seo
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 63
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 title claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 117
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 144
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 12
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 12
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 4
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 4
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 101710151413 Chitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037328 Chitotriosidase-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710132290 Chitotriosidase-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 101710107327 Endochitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 101000967447 Homo sapiens Elongation factor 1-beta Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- ZWAJLVLEBYIOTI-OLQVQODUSA-N (1s,6r)-7-oxabicyclo[4.1.0]heptane Chemical compound C1CCC[C@@H]2O[C@@H]21 ZWAJLVLEBYIOTI-OLQVQODUSA-N 0.000 description 1
- DCYBPMFXJCWXNB-MTSNSDSCSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolane-3-carbonitrile Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](C#N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DCYBPMFXJCWXNB-MTSNSDSCSA-N 0.000 description 1
- BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenyl)-3-methylmorpholine Chemical compound CC1NCCOC1C1=CC=CC(Cl)=C1 BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 2-O-acetyl-1-O-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC[C@@H](OC(C)=O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C HVAUUPRFYPCOCA-AREMUKBSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 101710126783 Acetyl-hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151415 Chitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710107425 Endochitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000829958 Homo sapiens N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100096342 Mus musculus Spdef gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 description 1
- 101710123428 Ribonuclease pancreatic Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Transkripčná regulačná DNA škrečacleho EF-lot
Oblasť techniky
Vynález sa týka regulačných sekvencií DNA pochádzajúcich z škrečacleho EF-lcŕ. Ďalej sa vynález týka expresných konštruktov obsahujúcich vyššie uvedenú regulačnú DNA, hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných touto regulačnou DNA a spôsobov zvyšovania transkripcie génu pri použití tejto regulačnej DNA. Vynález sa takisto týka expresných konštruktov obsahujúcich vyššie uvedenú regulačnú DNA operatívne pripojenú k špecifickým génovým sekvenciám.
Dotera jší stav techniky
Transkripcia akéhokoľvek daného eukaryotlckého génu sa uskutočňuje pomocou Jedného z troch enzýmov, RNA polymeráz, z ktorých každý účinkuje na konkrétny podsúbor génov. Zatiaľ čo transkripcia veľkých rlbozómových RNA prebieha pomocou RNA polymerázy ľ a malá ribozómová RNA a tRNA sa prepisujú RNA polymerázou III, DNA sekvencie kódujúce proteíny a väčšina malých Jadrových RNA sú transkribované RNA polymerázou II. Pre každý typ génu transkripcia vyžaduje interakciu príslušnej polymerázy s promótorovými sekvenciami génu a vznik stabilného transkripčného Iniciačného komplexu. Všeobecne Je možné uviesť, že transkripcia od ktoréhokoľvek z troch polymeráz tiež vyžaduje interakciu určitého väzbového faktora s promótorovou sekvenclou a rozoznanle väzbového faktora pomocou druhého faktora, ktorý tak umožni
Interakciu polymerázy so sekvenclou génu. Zatiaľ čo tento mechanizmus Je minimálnou požiadavkou transkripcie katalyzovanej RNA polymerázaml I a III, proces vedúci k transkripcii katalyzovanej RNA polymerázou II Je zložitejší.
Vzhľadom na rozsiahle množstvo génových sekvencií transkrlbovaných RNA polymerázou II a vzhľadom na skutočnosť, že regulačné schémy pre tieto gény sú vysoko premenlivé v rovnakej bunke a odlišujú sa tiež pre každú Jednotlivú bunku. Je transkripcia katalyzovaná RNA polymerázou II okrem iných Interakcii iných väzbových protelnov k regulačným sekvenclám DNA, iným ako Je promótor, ovplyvnená väzbou mnohých transkripčných faktorov v iniciačnom komplexe. Tieto iné väzbové proteíny môžu slúžiť na aktiváciu transkripcie nad bazálnu hladinu alebo úplne potláčajú transkripciu. Pripojenie represora Je možné takisto považovať za prostriedok ako zabrár)iť aktivácii, vzhľadom na to, že bazálna transkrlpCná hladina v prípade vyšších eukaryotov Je normálne veľmi nízka. Na druhej strane, aktivácla Je obvyklou koneCnou odpoveďou na určitý fyziologický signál a vyžaduje buď odstránenie represorového väzbového proteínu alebo alteráciu v chromatínovej Štruktúre, aby sa umožnil vznik aktívneho transkrlpčného iniciačného komplexu.
Jadrom vzniku transkrlpčného komplexu a nevyhnutnou podmienkou pre bazálnu hladinu expresle génu Je promótorová sekvencia, ktorá Je označovaná ako TATA box a ktorá Je umiestená pred transkrlpčným štartovacím miestom polymerázy II TATA box Je väzbovým miestom pre všadeprítomný transkripčný faktor označovaný ako TFIID, avšak ako už bolo uvedené, transkripcia od promótorovej sekvencle Je v prípade väčšiny génov silne ovplyvnená ďalšími regulačnými oblasťami DNA, ktoré môžu zosilňovať alebo potláčať transkripciu génu. Elementy DNA tohoto typu sú v rôznych polohách vzhľadom na kódujúcu sekvendu v géne a vzhľadom na TATA box. Tieto ďalšie transkripčné regulačné elementy často pracujú tkanivovo alebo bunkovo špecificky.
Pri expresll rekombinantných protelnov Je veľmi dôležité zvoliť regulačnú DNA, ktorá obsahuje sekvenciu promótora TATA a ďalšie regulačné elementy kompatibilné s transkrlpčným aparátom hostiteľskej bunky. Z tohoto dôvodu sa obvykle dáva prednosť regulačným DNA, ktoré sú endogénne vzhľadom na zvolenú hostiteľskú bunku. Značný úspech bol tiež dosiahnutý pri použití regulačnej DNA odvodenej od sekvencií vírusového genómu, vzhľadom na to, že rozmedzie hostiteľov Je v prípade vírusov široké a že bola dokázaná aktivita vírusových regulačných DNA v rôznych typoch bunky. Ako príklad vírusových regulačných DNA, ktoré sa bežne používajú pre expreslu rekombinantného proteínu, Je možné uviesť promótor/zosilňovač raného génu SV4O CDiJkema et al., EMBO J. 4> 761 C1985)3. koncovú dlhú repetíclu DNA vírusu Rousovho sarkómu CGorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. CUSA) 79 s 6777 C1982b)], fragmenty hovädzieho papllómavírusu CSarver et al.. Mol. Celí. Blol. 1> 486 ¢1981)] a elementy promótora/zosllňovača
I ľudského cytomegalovírusu CBoshart et al.. Celí. 41; 521 C1985)]. Napriek Širokému rozmedziu bunkových typov, na ktorých bola demonštrovaná funkčnosť vírusových regulačných DNA, Je možné, že existujú nevírusové DNA elementy promótora/zosllňovača, ktoré umožňujú zvýšiť transkripciu rekombinantného proteínu v špecifických bunkových líniách prostredníctvom účinnejšieho využitia transkrlpčného aparátu hostiteľskej bunky.
V tomto odbore teda existuje potreba Identifikovať sekvencle regulačnej DNA promótora/zosllňovača, ktoré fungujú v homológnych a heterológnych typoch buniek, pričom účelom Je zvýšenie expresie rekombinantného proteínu a vysoký výťažok požadovaného proteínového produktu. Mimoriadne dôležitou potrebou Je Identifikovať také regulačné DNA promótora/zosllňovača, ktoré môžu byť s vysokou účinnosťou využité v cicavčích bunkách, s cieľom zvýšenia produkcie rekombinantných proteínov in vitro, ktoré sú glykolyzované podobným spôsobom, ako Je to v prípade glykozylačných profilov, ktoré sú výsledkom expresie ln vivo. U prípade takto exprlmovaných proteínov pri terapeutickom alebo profylaktickom podávaní existuje menšia pravdepodobnosť, že budú antlgénne a väčšia pravdepodobnosť, že budú fyziologicky účinné. Regulačné oblasti DNA tohoto typu sú tiež ľahko lnzertovateľné do hostiteľských buniek s cieľom zvýšenia expresie génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na hostiteľské bunky alebo gény predtým zavedené do genómu hostiteľskej bunky, spôsobmi, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a rutinne využívané.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu sú purlfikované a izolované polynukleotldy odvodené od buniek chrčka, ktoré regulujú transkripciu génu. Tieto polynukleotidy zahrnujú regulačné DNA sek vene i e od 5’ konca do translátovanej oblasti gén EF-lcŕ vaječníka Čínskeho chrčka. Prednostná DNA podľa vynálezu Je označovaná ako CHEF1 regulačná DNA a obsahuje približne 3,7 kb DNA, ktorá siaha od reštrikčného miesta Spel do iniciačného metioninového kodónu CATG) proteínu EF-1cé. Predmetom vynálezu sú takisto polynukleotidy s menej ako 3,7 kb, ak sú tieto menšie fragmenty polynukleotidov schopné zvyšovať transkripciu operatívne pripojeného génu. Aktívne fragmenty DNA podľa vynálezu, definované schopnosťou regulovať < to znamená zosilňovať) transkripciu génu, sú ľahko identifikovateľné delečnými štúdiami, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a bežne využívané. Regulačná DNA podľa tohoto vynálezu zahrnuje polynukleotidy izolované z prírodných zdrojov, ako bunkových kultúr, ako aj polynukleotidy produkované enzymatickými alebo čisto chemickými syntetickými postupmi. Podľa jednej realizácie teda vynález poskytuje spOsob prípravy CHEF1 DNA z genúmovej knižnice. Alternatívne môže byť DNA pripravená enzymatickou syntézou, ktorá napríklad využíva polymerázové reťazcové reakcie CPCR), alebo čisto chemickou syntézou, pri ktorej sa postupne pridávajú Jednotlivé nukleotldy alebo sa hybrldizujú a llgujú prekrývajúce sa oligonukleotidy. Najvýhodnejšia DNA sekvencia Je popísaná v SEU ID NO: 1. Predmetom vynálezu sú ďalej DNA sekvencle, ktoré pri stringentných podmienkach hybrldizujú s DNA popísanou v SEQ ID NO: 1. Stringentné podmienky zahrnujú premytie v pufrl obsahujúcom asi 2X SSC a asi 0, IX SDS pri asi 65 °C alebo podmienky ekvivalentné.
Predmetom vynálezu Je ďalej DNA plazmid obsahujúci regulačné polynukleotidy CHEF1. Plazmidy podľa vynálezu takisto môžu obsahovať DNA sekvencle kódujúce proteín, ktorý Je predmetom záujmu, alebo RNA produkt, ktorý Je predmetom záujmu, operatívne pripojené k polynukleotidovej sekvencil CHEF1. Ďalej Je predmetom vynálezu hostiteľská bunka transformovaná, transfekovaná a/alebo elektroporovaná polynukleotidom alebo plazmidom podľa vynálezu. Plazmidová DNA podľa vynálezu môže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky alebo sa v bunke môže vyskytovať vo forme uzatvoreného kružnicového plazmldu. Ako prednostné plazmldy podľa vynálezu, ktoré sú mimoriadne prístupné pre zavedenie požadovanej DNA sekvencie. Je možné uviesť plazmldy pDEF14 a pDEF2. Bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF14 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 9. apríla 1997 pod prírastkovým Číslom 98389 a bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF2 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, ľlaryland 20852 4. marca 1997 pod prírastkovým Číslom 98343.
Predmetom vynálezu Je tiež lineárny DNA vektor obsahujúci polynukleotid CHEF1. Vektor podľa vynálezu Je možné získať z vírusového zdroja alebo ho Je možné syntetizovať in vitro. Predmetom vynálezu Je ďalej hostiteľská bunka transfekovaná alebo elektroporovaná do sekvenclí lineárneho vektora. DNA tohoto typu Je mimoriadne užitoCná pre expresiu sekvencie heterológneho génu operatívne pripojenej k DNA sekvencii CHEF1 alebo pre miestne cielenú homológnu rekombináciu, pri ktorej sekvencia CHEF1 mOže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky s cieľom modulácie expresie operatívne pripojenej sekvencie.
Ďalej Je predmetom vynálezu molekula chlmerickej rekombinantnej DNA. kde Je CHEF1 DNA operatívne pripojená Cto znamená podnecuje transkripciu) k sekvencii génu kódujúcej požadovaný proteínový produkt. Chlmerlcké molekuly sú všeobecne molekulami, ktoré obsahujú domény, ktoré sa normálne nevyskytujú v spojení s prostredím divokého typu. Chlmerická DNA podľa vynálezu môže zahrnovať Časť alebo celú regulaCnú DNA CHEF1 v asociácii s DNA sekvenclou. ktorá Je odlišná od génu pre škreCací proteín EF-Iä. Ako proteínové štruktúry kódované chimerickými molekulami Je možné uviesť fyziologicky aktívne proteíny. Časti alebo podjednotky aktívnych proteínov, ako aj markerové alebo reportérové proteíny. Polynukleotldová sekvencia kódujúca proteínový produkt môže byť odvodená od komplementárnej DNA CcDNA), genómovej DNA, syntetickej DNA alebo DNA odvodenej kombináciami molekúl týchto typov. Proteínové produkty môžu byť endogénne Cto znamená normálne sa nachádzajú u genóme CHO bez transformačného, transfekčného alebo podobného zavedenia DNA) vzhľadom na bunky vaječníka Čínskeho chrčka CCHO). Okrem toho proteínové produkty môžu byť kódované exogénnymi zdrojmi, pričom exogénnym zdrojom Je zdroj odlišný od genómu bunky CHO, ako Je napríklad syntetická DNA. Ako prednostné chlmerické molekuly podlá vynálezu Je možné uviesť molekuly, v ktorých Je DNA CHEF1 operatívne pripojená k DNA kódujúcej: Cl) ťažký reťazec anti-ICAM3 protilátky ICI*I3, C11) ľahký reťazec ICM3, Čili) ťažký reťazec anti-CDll/CD18 protilátky hu23F2G, Civ) ľahký reťazec hu23F2G, Cv) chitinázu, Cvi) acetylhydrolázu faktora aktivujúceho doštiCky CPAF-AH) a (vil) chemokín odvodený od makrofágu CNDC). Bakteriálne hostiteľské bunky transformované plazmidovou DNA, ktoré obsahujú chlmerické molekuly Cl) až (vil), boli uložené v zbierke Američan Type Culture Collectlon 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami: (1) 98381, C11) 98382, C111) 98383, Clv) 98384, (v) 98385, Cvi) 98386 a (vil) 98387.
Predmetom vynálezu Je ďalej hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná DNA CHEF1 podľa vynálezu. Prednostná hostiteľská bunka podľa vynálezu Je odvodená od bunky Čínskeho chrGka <Clrcetulus grlseus), o ktorej regulačnej DNA CHEF1 by sa predpokladalo, že poskytne vyššiu úroveň expresle proteínu. Predmetom vynálezu sú však tiež ďalšie typy buniek odvodených od iných druhov ako napríklad od buniek arménskeho chrGka C CriceÍulus mlgratorls) alebo sýrskeho C zlatého) chrGka CNesocrlcetus auratus), ako aj typy buniek odvodené od buniek iných živočíšnych rodov. Bunky mOžu byť získané z pľúc, vaJeCníka, peritonea, svalov, sleziny, obličiek, melanómu alebo somatického zdroja, ako aj z celého zárodku alebo celého embrya. Hostiteľské bunky podľa vynálezu uvedené vyššie, ako aj ďalšie typy buniek, napríklad myelomatlcké bunkové línie, o ktorých regulačnej DNA CHEF1 by sa predpokladalo, že poskytne vysokú úroveň transkripcie. Je možné získať zo zbierky Američan Type Culture Collectlon alebo Je možné ich napestovať priamo z živočíšneho zdroja.
Rekombinantné molekuly podlá vynálezu. ktoré obsahujú regulačnú DNA CHEF1. umožnia zvýšenú úroveň expresle mRNA operatívne pripojených heterológnych polynukleotldov (to znamená tých, ktoré sa bez transfekčného, transformačného alebo podobného zavedenia v hostiteľskom genóme normálne nenachádzajú). V závislosti od povahy polynukleotldy pripojeného k sekvenclám polynukleotldov CHEF1. by zvýšená transkripcia viedla k zvýšeným úrovniam polypeptldov alebo zvýšeným úrovniam rôznych druhov RNA v prípadoch, kedy pripojený polynukleotld kúduje napríklad transferovú RNA, rlbozomálnu RNA, malú Jadrovú RNA a pod. Takýmto druhom RNA tiež môže byť kódujúca RNA komplementárna k mRNA získanej transkripciou endogénnej alebo exogénnej génovej sekvencie. Zvýšená translácla polypeptldu bude nevyhnutne závisieť od prítomnosti vhodných translačných signálov prítomných v mRNA.
Predmetom vynálezu Je ďalej spôsob zavádzania DNA CHEF1 do špecifických miest genómovej DNA hostiteľských buniek s cieľom zvýšenia úrovne transkripcie endogénnej génovej sekvencie. Na zavedenie celej alebo časti DNA CHEF1 Je možné použiť homológu rekombináciu. V hostiteľských bunkách, ktoré sú modifikované týmto spôsobom. Je DNA CHEF1 operatívne pripojená ku kódujúcim sekvenclám DNA (pozri napríklad medzinárodné prihlášky PCT UI0/94/12650, UO 92/20808 a NO 91/09955. Predmetom vynálezu sú teda nevyhnutne tiež sekvencie alterovanej genómovej DNA so zavedenou regulačnou DNA CHEF1.
Alternatívne Je predmetom vynálezu hostiteľská bunka, v ktorej Je exogénna ONA Inzertovaná v susedstve a v operatívnej polohe vzhľadom na DNA CHEF1 prítomnej v genóme. Hostiteľské bunky tohoto typu zahrnujú CHO buky a Inzertovaná sekvencia buď nahrádza DNA kódujúcu EF-lcŕ, alebo Je táto sekvencia vložená medzi regulačnú DNA CHEF1 a ONA kódujúcu EF-lcŕ. Do rozsahu vynálezu tiež patria aj Iné hostiteľské bunky než CHO, do ktorých genómu bola predtým inzertovaná DNA CHEF1 a potom do operatívne pripojenej polohy inzertovaná ďalšia DNA.
Predmetom vynálezu Je ďalej spôsob zvyšovania transkripcie ktorého podstata spočíva v tom, že sa do zavedie polynukleotld zahrnujúci škrečaciu požadovaného génu, hostiteľskej bunky
EF-1cé tak, že sa táto regulačná sekvencla DNA hostiteľa v operatívne pripojenej polohe na požadovaný gén. Ďalej do rozsahu vynálezu patrí zvyšovania transkripcie spočíva v tom, že sa do regulačnú sekvenclu začlení do genómovej vzhľadom spôsob podstata požadovaného génu, hostiteľskej bunky ktorého zavedie polynukleotld a zameriavaciu zahrnujúci škrečaciu oblasť, regulačnú oblasť pričom táto zameriavacia oblasť Je zostavená tak.
operatívne odlišnému zvyšovania že umožňuje integrovať pripojenom k požadovanému génu kódujúcemu proteín □d EF-lcŕ. Do rozsahu vynálezu tiež patrí spôsob transkripcie génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na CHO bunky, ako aj spôsob zvyšovania exogénne vzhľadom na CHO bunky.
regulačnú oblasť v mieste transkripcie génov, ktoré sú
Rekomblnantné molekuly podľa produkciu transgénnych živočíchov, sa zárodku alebo vynálezu Je možné využívať na rekombinantná DNA sekvencii DNA, pri ktorej somatlckej bunky živočícha obsahujúca DNA CHEF1 ktorá sa do vyvíjajúceho zavedie chlmerická operatívne Je predmetom záujmu.
pripojenú k
Chimérlcké rekomblnantné molekuly
Je možné zavádzať napríklad mlkrolnjekclami a ak sa môžu všetky použijú zárodočné bunky, bunky výsledného živočícha obsahovať rekombinantnú DNA podľa vynálezu. zavádzať
Alternatívne Je možné chimerickú do buniek embrya a môže byť obsiahnutá vo veľkom
DNA podľa vynálezu v tomto prípade DNA podľa vynálezu počte buniek výsledného živočícha.
DNA
CHEF1 Je takisto užitočná príbuzných regulačných oblastí DNA, pri Identifikácii blízko ktoré môžu poskytovať ako akú umožňuje CHEF1.
expresiu génu vyššiu a dlhodobejšiu.
Podobne, znalosť sekvencii DNA CHEF1 umožní zostrojiť syntetické DNA buď syntézou de novo alebo Jednoduchou alebo niekoľkonásobnou modifikáciou sekvencii CHEF1, pričom mať sekvencie podobné sekvencii výsledné syntetické DNA budú CHEF1. avšak budú schopné poskytnúť vyššie úrovne transkripcie génu.
Nasleduje podrobnejší popis vynálezu.
Vynález Je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. V príklade 1 Je popísané klonovanie škrečacleho génu EF-lcŕ a príbuznej regulačnej DNA CHEF1. Príklad 2 sa týka subklonovanla a sekvenčnej analýzy regulačnej* oblasti CHEF1. V príklade 3 Je charakterizovaný polynukleotld promótora CHEF1 a v príklade 4 Je popísaný spôsob zostrojenia rôznych expresných vektorov obsahujúcich DNA CHEF1. V príklade 5 Je popísané transfekčné stanovenie na zistenie účinnosti regulačnej DNA CHEF1. V príklade 6 Je podrobne popísané porovnanie úrovní expresle rekomblnantného proteínu pri použití buď regulačnej DNA CHEF1 alebo promótora cytomegalovírusu CCI*IV) . V príklade 7 sú skúmané rozdiely v regulačnej kapacite DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami.
Príklady realizácie vynálezu
Príklad 1
Klonovanie CHEF1
Pri pokuse Izolovať škrečací homológ ľudského génu EF-lcŕ sa DNA genómová knižnica buniek vaječníka čínskeho chrčka (CHO-K1) (Stratagene, La Jolla. CA, USA), podrobí screenlngu s cDNA pre ľudský EF-lcŕ.
Knižnica CHO-K1, čiastočne štlepená Sau3A v klonovacom vektore Lambda FIX<R’II, bola získaná od firmy Stratagene (La Jolla, CA, USA) v hostiteľskej bunke kmeňov XL-l-Blue NRA a XLl-Blue l*IRA CP2). Hostiteľské bunky sa pripravia podľa protokolu doporučeného výrobcom s modifikáciami, ktoré sú stručne popísané ďalej.
Bunky z glycerolového zásobného roztoku sa v prúžkoch nanesú na LB misky, ktoré neobsahujú žiadne antibiotikum. Pre Inokulačné kvapalné LB médium sa vyberú Jednotlivé kolónie a nechajú sa rásť do neskorej logaritmickej fázy a optickej hustoty OD^oo asi 0,9. Potom sa bunky skladujú podlá protokolu navrhnutého výrobcom alebo a bezprostredne použijú spOsobom popísaným ďalej.
Pri príprave kultúr pre ďalšiu kultiváciu sa Jednotlivé kolónie zoberjl z misiek pripravených vyššie popísaným spôsobom a použijú sa pre lnokuláciu. Bunky sa pestujú v 50 ml LB média doplneného 0,5 ml lľl síranu horeCnatého a 1 ml 10% maltózy v deionizovanej vode. Bunky sa pestujú cez noc pri 30 eC a zozbierajú centrlfugáciou v stolnej centrifúge C2000 min-1 poCas 5 minút pri teplote miestnosti) a resuspendujú v lOmM sírane horeGnatom pri OD^oo 0, 5.
Fág lambda dodaný výrobcom sa zriedi v SM puf r i C1 liter zásobného roztoku obsahuje 5, B g chloridu sodného, 2, 0 g hydrátu síranu horeCnatého, 50 ml 11*1 Tris-HCl, pH 7,5 a 5 ml 2% Chmotnosť/objem) želatíny) na 10- až 10s-násobné zriedenie. 2ul roztoku s každou koncentráciou sa pridajú k 400 ul hostiteľských buniek v ΙΟτηΙΊ síranu horeCnatom C 0DAOo asi 0.5) .' Výsledná zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám a pridá sa k nej vrchný agar CO. 75% ĽBM agaróza s teplotou 4Θ °C) . Každá zmes sa dvojmo nanesie na LBI*I agarózové misky. Z výsledkov Je zrejmý tlter3 x 10A Jednotiek tvoriacich plak Cpfu)/ul fágového zásobného roztoku.
Pripravia sa Čerstvo hostiteľské bunky pri použití vyššie popísaného postupu pred prehľadávaním knižnice. Približne 50 000 fágových pfu sa pridá k 600 ul hostiteľských buniek C s 0DÄOo približne 0,5) s 6, 5 ml 0,75% LBM agarózy s teplotou 48 °C. Zmes sa rozprestrie na agarózové misky, ktoré sa potom inkubujú približne 8 hodín pri 37 °C. Misky sa potom 5 hodín chladia pri 4 °C, aby sa zabránilo prilepeniu vrchnej agarózy ku krycej vrstve nitrocelulózy. Na misky sa umiestia membrány BA-85 s veľkosťou pórov 0, 45 um CS+S. Keene, NH) a v prenose sa pokraGuje poCas 2 minút. Membrány sa z misiek odstránia a prenesená DNA sa denaturuje 2 minúty v 1, 5M chloride sodnom/0, 5M hydroxlde sodnom. Fllt— re sa neutralizujú 5 minút v 1* 51*1 chloride sodnom/1, 01*1 Trls-HCl (pH 8,0) a blotujú na papier Whatman 3-1*11*1 a zahrievajú sa pri zníženom tlaku pri 80 °C poCas asi 1,5 až 2 hodín.
Ako sonda na prehľadávanie knižnice sa použije sekvencla cDNA ľudského EF-lct CUetsukl et al., J. Biol. Chem. 264« 5791 až 5798 C1989)J, v prípade ktorej sa dokázalo, že vykazuje 95% zhodu s kódujúcou oblasťou EF-lcŕ CHayashi et al.« J. Blochem. 106: 506 až 563, 1989], ktorá sa pripraví nasledujúcim postupom. 1,4kb sonda ľudského EF-ltí sa získa z plazmldu 1*10107, pRc/CI*IV CInvitrogen, San Dlego, CA, USA) vektora obsahujúceho cDNA ľudského EF-lcť Inzertovaného v mieste EcoRl. S cieľom prvého potvrdenia, že plazmld 1*10107 obsahuje predpokladanú ľudskú cDNA, sa lnzert DNA sekvencuje s 3' a 5' vektorovými primérmi.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC C SEČI ID NO: 2)
94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA C SEČI ID NO: 3)
Prvých 263 párov báz lnzertu vykazuje viac ako 90% zhodu s publikovanou sekvenclou kódujúcou ľudský EF-l<ť a zatiaľ Co pri 3‘ konci Je presné stanovenie obtlažne, malé úseky by mohli byť zhodné s predpokladanou sekvenclou. Súhrne táto zhoda ukazuje, že plazmld kóduje požadovanú sekvenclu.
Celý humánny lnzert sa odstráni z plazmldu štiepením EcoRl a pás cDNA s 1,4 kb sa dvakrát podrobí gélovej purlfikácii pri použití súpravy QIAGEN QIAqulck Gel Extraction Klt podľa pokynov výrobcu. DNA sa eluuje 50 ul TE. výsledný roztok sa skoncentruje v zariadení Nicrocon-10 (Amlcon, Beverly, l*IA, USA) na 25 ul, allkvót sa oznaóí 3aP-cŕ-dTTP a saP-cí-dCTP pri použití súpravy na znaCenle Boehrlnger Mannhelm Random Prlmed DNA podľa pokynov výrobcu. ZnaCená sonda s purlfikuje pri použití rotujúcej kolóny G50, aby sa odstránili nezaClenené nukleotldy. Pri porovnaní purlflkovaná sonda vzhľadom na nepurlflkovaný allkvót vykazuje 46% zavedenie rádioaktívnej znaCky a 5 x 103 cpm/min/ul Ccpm = poCet Impulzov za minútu).
Nitrocelulózovú membrány pripravené vyššie popísaným spOsoboín sa skúšajú nasledujúcim postupom. Priprav! sa zásobný roztok prehybridizačného/hybridizačného pufra, ktorý obsahuje 22» 5 ml 20X SSC, 30,0 ml 50X Denhardtovho roztoku, 3,0 ml lľl fosfátového puf ra C pH 6, 8) C 69 ml lľl dlhydr ogenf osf orečnanu sodného, 31 ml lľl hydrogenfosforečnanu sodného), 0,75 ml 20% SDS a 78, 75 ml destilovanej vody. S cieľom prehybridlzácie sa 1,4 ml 10 mg/ml DNA lososej spermy CStratagene) vari 5 minút s 0,6 ml destilovanej vody a potom pridá k 7 ml destilovanej vody a 72 ml zásobného roztoku pufra. Filtre sa inkubujú v prehybridizačnom pufri minimálne 2 hodiny pri 65 °C.
S cieľom prehybridlzácie sa spoja 30 yl sondy, 200 yl 10 mg/ml DNA z lososej spermy a 770 yl destilovanej vody. Vzniknutá zmes sa 5 minút var! a pridá sa k 3E! ml zásobného pufra s 3 ml. destilovanej vody. Z filtrov sa odstráni prehybrldizačný roztok a nahradí sa hybridizačným pufrom. Filtre sa Inkubujú cez noc pr:i 65°C, po hybridizácii sa filtre 3 hodiny premývajú pri 65 °C s tromi výmenami pufra obsahujúceho 2X SSC a 0, IX SDS a potom na 48 hodín podrobia autorádiografli.
kolónií identifikovaných ako pozitívne sa zachytia do 1 ml Sľl pufra obsahujúceho 211 yl chloroformu. S cieľom vyradenia možných pseudogénov, ktorým chýba Jeden alebo viac lntrónov, sa vytvoria páry PCR prlmérov tak, aby lemovali vždy dva intróny. priméry 95-136 C SED ID NO s 4) a 95-137 CSEO ID Nth 5) lemujúce Intróny 2 a 3; priméry 95-138 CSEO ID NOs 6) a 95-139 CSEO ID NO. 7) lemujúce intróny 3 a 4; priméry 95-140 CSEO ID NO. 8) a 95-141 CSEO ID NO. 9) lemujúce intróny 4 a 5s a priméry 95-142 CSEO ID NO. 10) a 95-143 CSEO ID NO. 11) lemujúce intróny 6 a 7.
95-136 (SEQ ID NO: 4) GCCACCTGATCTACAAATGT 95-137 (SEQ ID NO: 5) GAGATACCAGCCTCAAATTC 95-138 (SEQ ID NO: 6) ATGTGACCATCATTGATGCC 95-140 (SEQ ID NO: 8) GTTGGAATGGTGACAACATG 95-141 (SEQ ID NO: 9) CAGGTnTAAAACACCAGTC 95-142 (SEQ ID NO: 10) AATGACCCACCAATGGAAGC 95-143 (SEQ ID NO: 11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT
Predpokladaná veľkosť PCR produktov pri použití CHtJ EF-lcŕ DNA templátu Je založená na veľkosti a umiestení lntrónov v publikovanej sek venčil ľudského EF-1cí. Každá PCR reakcia zahrnuje 2 ul fágu, 2,5 ul každého vhodného páru prlmérov C100 ug/ml). 2 ul 2 ml*l zmesi dNTP, 2,5 ul 10X PCR puf ra C Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), 1,5 ul 25ml*l chloridu horečnatého,
0,125 ul Taq polymerázy (5 Jednotiek/ul) (Perkln Elmer) a 11,8 ul destilovanej vody. Ampliflkácia sa uskutočňuje 4 minúty pri 94 °C a potom nasleduje 30 cyklov zahrnujúcich 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 °C a 4 minúty pri 72 °C. Amplifikačné produkty sa rozdelia na 1,22 agarúzovom géle pri použití IX TAE. V prípade troch zo 47 pozitívnych plakov bolo zistené, že kúdujú pravé gény (č. 2, 7 a 40) obsahujúce všetky intróny. Tieto tri pozitívne vzorky sa podrohla tretiemu prehľadávaniu pri použití nasledujúceho postupu. Vyššie popísaným postupom sa pripravia mlskové kultúry a pre každý z troch pozitívnych plakov sa pripravia zásobné roztoky v zriedeniach 10 až 10s. 20 až 50 Izolovaných plakov z každého zásobného roztoku sa podrobí prehľadávaniu pomocou PCR s nasledujúcimi výsledkami. Kloň C. 2 vykazuje 2 pozitívne plaky Coznačené ako 2.12 a 2.17) z celkovo 22 plakov podrobených screenlngu, kloň C. 7 vykazuje 1 pozitívny plak (označený ako 7.44) z 50 prehľadávaných plakov a kloň 40 vykazuje Jeden pozitívny plak (označený ako 40.24) zo 40 plakov podrobených screenlngu. Z každej z týchto štyroch vzoriek sa ďalej popísaným spôsobom izoluje fágová DNA.
Hostiteľské bunky XL-1 Blue HRA (P2) sa v prúžkoch navzorkujú na LB agarózové misky a nechajú sa rásť cez noc pri 47 °C. Vyberie sa Jediná kolónia, ktorou- sa zaočkuje 50 ml LB média
4- Cobsahujúceho 0,22 maltózu a lOmN síran horečnatý). Kultúra sa nechá rásť cez noc pri 30 °C. Bunky a zozbierajú päťminútovou * centrifugáciou pri teplote miestnosti pri 2000 min-x na stolnej centrifúge a resuspendujú sa v 50 ml lOmN síranu horečnatého. Resuspendované hostiteľské bunky (50 ul) sa zmiešajú so 100 ul zásobného roztoku každého z pozitívnych fágov a vzniknutá zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám. K zmesi trepanej 2 hodiny pri 37 °C sa pridá asi 500 ul
LBM média a potom ďalších 200 ul hostiteľských buniek. Vzniknutá zmes sa lnkubuje ďalších 15 minút pri 37 °C. Pridá sa vrchný agar (8 ml 0,75% LBM agarózy s 48 °C) a potom sa zmes nanesie na misky a nechá rásť cez noc pri 37 °C.
Potom sa ku každej miske pridá 12 ml zrieďovacieho roztoku lambda ClOmM Trls-HCl, pH 7,5, lOmM síran horečnatý) a miskami sa mierne kýve počas 2 hodín. Zrieďovací roztok sa odstráni a 10 minút centrifúguJe pri 400 x g v stolnej centrifúge. K supernatantu sa pridá vždy 1 ul RNázy A s koncentráciou 1 mg/ml a DNázy I s koncentráciou 1 mg/ml. Vzniknutá zmes sa lnkubuje 15 minút pri 37 °C a pridá sa k nej rovnaký objem zrážacieho pufra (20% polyetylénglykol 8000, 2M chlorid sodný, '20mM Trls-HCl, lOmM síran horeCnatý) a výsledná zmes sa 1 hodinu lnkubuje na ľade a potom 20 minút centrifúguJe pri 8000 x g. Supernatant sa odstráni, peleta sa 10 minút suš! na vzduchu pri teplote miestnosti, resuspenduje v 500 ul TE, krátko centrifuguje, aby sa odstránili Častice a supernatant sa prevedie do Čistej 1,65ml skúmavky apltube. Do skúmavky sa pridá asi 2, 5u 20% SDS (zmes sa 5 minút lnkubuje pri 65 °C) á pridá sa k nej 2,5 ul proteinázy K s koncentráciou 10 mg/ml (Inkubácia 1 hodinu pri 65 °C) a 10 ul 5M chloridu sodného. Zmes sa extrahuje raz rovnakým objemom zmesi fenolu a chloroformu a raz rovnakým objemom chloroformu. Po prídavku rovnakého objemu Izopropylalkoholu a následnej trojhodinovej inkubácii pri -70 °C sa zmes 15 minút centrifuguje v eplfúge pri najvyššej rýchlosti. Získaná peleta sa premyje 70% etanolom, vysuší na vzduchu a resuspenduje v 100 ul TE.
Príklad 2
Subklonovanle regulaCného úseku EF-lcc
S cieľom stanovenia veľkosti inzertu DNA EF-1<* fágová DNA pripravená spôsobom popísaným v príklade 1 štiepi Nôti a výsledné reštrikCné fragmenty sa rozdelia na 0,6% IX TAE agarózovom géle. Okrem predpokladaných lemujúcich fragmentov lambda s dĺžkou 19 kb a 10 kb, klony 2.12 a 2.17 vykazujú identické profily štiepenia s pásmi s 11 kb a 4,5 kb. Takisto klony 7.44 a 40.24 vykazujú profily štiepenia zhodné s pásmi inzertu s 12 kb a 7 kb, Co spolu s údajmi o štiepení klonov 2.12 a 2.17 dokazuje prítomnosť vnútorného reštrikčného miesta Nôti v DNA EF-lcŕ. Fragmenty inzertu z klonov 2.12 a 7.44 sa subklonujú nasledujúcim postupom.
I
Fágová DNA (60 ul) pripravená spôsobom popísaným v príklade
I sa štiepi NotT a štiepená DNA sa vyzráža prídavkom 20 ul 31*1 octanu sodného a 400 ul 100% etanolu. Vyzrážaná DNA sa zhromaždí centrifugáciou, premyje sa 200 ul 703í etanolu, suší 15 minút na vzduchu a resuspenduje v 20 ul TE. Suspenzia sa 10 minút zahrieva na 65 °C a pridajú sa k nej 2 ul puf r a pre elektroforézu. DNA sa rozdelí elektroforézou na agarózovom géle a pásy s 4, 5 kb, 7 kb,
II kb a 12 kb sa odrežú vo forme agarózových rezov. Z každého agarózového rezu sa pri použití súpravy na extrakciu OIAGEN OlAquick podlá pokynov výrobcu extrahuje DNA. Čistota pásov a koncentrácia sa overí oddelením 5ul alikvótu z každého Izolovaného fragmentu na 0, 6% IX TEA agarúzovom géle.
Jednotlivé fragmenty sa oddelene ligujú k pBluescriptSU* štiepenému Nôti. Pri ligáciách 11 a 12kb fragmentov sa pred zavedením inzertu fragmentu llnearizovaný vektor ošetrí teľacou alkalickou fosfatázou. 2 ul každého llgátu sa použijú pre elektroporáciu 40 ul elektrokompetentných buniek XL-1 Blue. Transformované bunky a nanesú na misky s LBľl/carb agarózou so 40 ul 5% X-gal v dimetylformamlde (DľlF) a 20 ul 0,11*1 IPTG na misku. Bunky sa inkubujú cez noc pri 37 °C a ráno ochladia na 4 °C, aby sa zvýšila intenzita modrej farby.
Pri druhom výbere sa biele kolónie naprúžkujú na misky s agarúzou LBľl/carb s obsahom X-gal a IPTG vyššie popísaným spôsobom a kolónie, ktoré sú nasledujúci deň biele, sa nechajú rásť v 3 ml LBľl/carb cez noc pri 37 °C. Plazmldová DNA z bielych kolónií pestovaných cez noc sa pripraví pri použití UIZARD Plus ľlinlpreps DNA Purification Systém (Promega, ľladison, Ul, USA) podľa protokolu navrhnutého výrobcom.
ReštrlkCná analýza Izolovanej plazmidovej DNA ukáže, že 4,5kb, 7kb a 12kb fragment sa úspešne llgoval k vektoru pBluescrlpt SU* a výsledné plazmidy sa oznaCla ako pSK/EF.1.4.5., PSK/EF1.7 a pSK/EF1.12.
Každý z plazmidov sa pripraví pri použití súpravy OIAGEN midi prep kit podlá protokolu navrhnutého výrobcom. PCR sa podrobí každý z nových vektorov. vytitruje sa templátová DNA a použijú sa priméry kódujúce oblasti CSEO ID NO: 4 až 11, ktoré sa používajú v pároch spôsobom popísaným vyššie pre selekciu pseudogénov. ktorým chýbam Jeden alebo väčší poCet rôznych intrónov). Titrácia sa uskutočňuje po tom, ako sa pri vysokých koncentráciách zisti, že všetky tri fragmenty obsahujú úplnú oblasť pre EF-lac, čo naznačuje možnú krížovú kontamináciu troch plazmidových prípravkov. Pri titrácii sa PCR uskutočňuje v reakčnej zmesi obsahujúcej 2, 5 jjI templátovej DNA s koncentráciou 0, 001, 0, 01, 0,1, 1 alebo 10 ng/ul a zahrnujúcej 2, 5 jal 10X PCR pufra CPerkin Elmer), 2,0 ul 2ml*l zmesi dNTP, 1,5 ul 25mN chloridu horečnatého, 0,125 ul Taq polymerázy CPerkin Elmer) a 11,4 ul destilovanej vody. Ampliflkácia sa uskutočňuje pri nasledujúcich podmienkach: 4 minúty pr 94 °C a potom 30 cyklov, z ktorých každý zahrnuje 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 °C a 4 minúty pri 72 °C. Výsledky ukazujú, že úplná oblasť pre EF-lcŕ Je umiestená v 4» 5kb a 7kb fragmente.
Pre každý inzert sa pri použití súpravy Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Napping Kit určenej pre použitie s vektorom Lambda FIX II<R> zostrojí reštrikčná mapa. Namiesto fágovej DNA sa však použije plazmidová DNA vyštiepená Notl z vektorov pSK vyššie popísaným spôsobom. Na zostrojenie mapy sa v podstate použije protokol navrhnutý výrobcom. Tento postup Je možné stručne popísať takto: plazmidy sa sekvencujú pri použití prlméru 1*113 C SED ID NO: 12) a reverzného priméru 1*113 CSEO ID NO: 13) Ckomplementárneho k oblastiam v mnohočetnej klonovacej oblasti pBluescrlpt SW*·), aby sa lokalizovali sekvencie primérov T3 CSEO ID NO: 14) a T7 CSEO ID NO: 15) vnútorných vzhľadom na miesto Notl pre každý inzert.
| M13 | GTAAAACGACGGCCAGT | (SEQ ID NO: 12)· |
| M13rev | GGAAACAGCTATGACCATG | (SEQ ID NO: 13) |
| T3 | AATTAACCCTCACTAAAGGG | (SEQ ID NO: 14) |
| T7 | GTTAATACGACTCACTATAGGGC | (SEQ ID NO: 15) |
Prlméry T7 a T3 sa použijú ako sondy pre protokol zostavenia
I génovej mapy. Keďže sa ukázalo, že lnzert EF-lrf obsahuje vnútorné miesto Notl, predpokladá sa, že páry fragmentov C4,5kb/llkb,a 7kb/12kb) zahrnujú Jednu alebo druhú sekvenclu primárov a teda sa stanovilo, že 4,5 a 12kb lnzert obsahuje sekvenclu priméru T7, zatiaľ čo 7kb lnzert iná sekvenclu T3.
4, 5 a 7kb inzerty obsahujúce oblasť pre EF-lcí sa vyštiepla z vektora štiepením Notl. Štlepená DNA sa oddelí na agarózovom géle a oddelené fragmenty sa z gélu odrežú. 7. každého agarúzového rezu sa pri použití súpravy na extrakciu O1AGEN UľAquick podľa pokynov výrobcu Izoluje DNA. Mapovanie sá uskutočňuje pri použití siedmi ch rôznych enzýmov pri ClastoCriom reštrikčnom štiepení. Reakčné produkty sa rozdelia na agarózovom géle, DNA sa prevedie na nylénovú membránu Duralori-UV a skúša sa ' pri použití ol:lgonukleotidov T3 a T7 ako sondy. Stanoví sa veľkosť pásov a zostroja sa reštrikčné mapy.
Plazmid pSK/EF1.7 sa sekvencuJe s vnútornými parametrami pôvodne skonštruovanými pre PCR prehľadávanie (SEU ID NO s 4 až 11 Cpredtým popísané prlméry 95-136 až 95-143)), čím sa overí, že sekvenclou génu Je sekvericla predtým Identifikovaného proteínu. Stanoví sa orientácia kódujúcej oblasti a zostroja sa ďalšie prlméry, ktoré umožňujú sekvencovanie k vnútornému miestu Nôti. Stanoví sa sekvencla celej kódujúcej oblasti, ktorá sa potom porovnáva s predpokladanou sekvenclou cDNA popísanou v Hayashl et al. (pozri vyššie). Analýza sekvencle potvrdí, že izolovaná DNA skutoCne kóduje rovnakú sekvenclu EF-Ια, ako DNA popísaná Hayashim (pozri vyššie). Okrem toho Je oblasť prvého exónu Identická s predtým publikovanou oblasťou sekvencle škrečacleho cDNA EF-leŕ pri 5' konci (Hayashl, pozri vyššie) a bolo
Identifikovaných sedem intrónov, z Čoho Je zrejmé, že štruktúra sa podobá štruktúre známej pre ľudské homológ.
Sekvencla a reštrikčná mapa získaná zo 7kb fragmentu ukazuje, že časť 5* lemujúceho lntrónu a promótor sú umiestené v 12kb fragmente od 5' do vnútorného miesta Nôti. Z 12kb lnzertu sa vyštlepl Spel/NotI 3kb fragment od 5* do vnútorného miesta Nôti a subklonuje do pBluescriptSK* dopredu štlepeného rovnakými enzýmami. Výsledný plazmid sa označí ako pSK/EF1.3. 3kb fragment sa mapuje vyššie popísaným spôsobom pri použití KpnI a Clal, čím sa potvrdia reštrikčné miesta a sekvencuje sa pri použití súpravy Erase-a-Base CPromega, Madison, SI, USA) pri použití Clal a KpnI miest na vytvorenie predĺženie 5* a 3*. Sekvenčná analýza ukáže oblasti obsahujúce promótor, TATA box a 0,9kb intrón v 5' netranslátovanej lemujúcej oblasti s rovnakou dĺžkou, ako má prvý intrón v ľudskom géne CUetsuki, 1989, pozri vyššie]. Sekvencla CHEF1 promótora a 5' lntrónu Je uvedená v SEO ID NO* 1, pričom intrón zahrnuje nukleotldy 2699 až 3641.
Príklad 3
Charakterizácia regulačnej DNA CHEF
Sekvencla pred ATG štart kodónom Cvrátane) škrečacieho génu EF-lflt Je popísaná v SEQ ID NOt 1. Väčšina identifikovateľných väzbových miest transkrlpčného faktora sa pravdepodobne vyskytuje od 3* do Cprotlsmerovo) Sací miesta umiesteného 1,56 kb do 5* do iniciačného ATG kodónu génu EF-lcŕ. Každý z expresných vektorov obsahuje sekvencle CHEF1 popísané ďalej, avšak obsahuje tiež 2 kb CHEF1 sekvencle od 5' k miestu Sací.
Sekvencovanie ukáže prítomnosť dokonale konsenzuálneho TAT boxu umiesteného asi 1 kb od 5' smerom k iniciačnému ATG štart kodónu a oblasť medzi protlsmerovo umiesteným miestom Sací a TATA boxom obsahuje vždy mnoho možných väzbových miest pre transkripčný faktor CBoulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4« 117 až 321 C1994)], ako sú miesta Spi CSEQ ID N0> 16 alebo 17), miesta ATF (SEO ID NO. 19) a miesta NF-1 (SEO ID NO. 19).
| GGCGGG | SEO ID NOs | 16 | ||
| GGGCGG | SEO | ID | NO. | 17 |
| TGACGY(C/A)R | SEO | ID | NO. | 18 |
| TTGGCNS_Ä( T/G)CCR | SEO | ID | NO t | 19 |
Podobne ako v prípade ľudského génu EF-lct CUetsuki et al., pozri vyššie) sa tu vyskytuje 943bp intrén v 5' netranslátovanej oblasti (UTR) škrečacleho génu EF-lcŕ, čo Je zrejmé z umiestenia zostrihov donorovej a akceptorovej sekvencie. Avšak pri použití analytického programu Geneworks DNA bolo zistené, že sekvencla lntrónu v 5' UTR Je len zo 62 X Identická so sekvenclou v ľudskom géne. Intrén 5' zahrnuje mnoho možných väzbových miest pre transkrlpčné faktory, čo zhruba zodpovedá počtu väzbových miest medzi miestom Sací a TATA boxom, čo ukazuje, že Intrén 5' by mohol byť dôležitá pre optimálnu transkripciu riadenú promótorom EF—lcŕ.
Pri použití analytického programu Geneuorks DNA bolo zistené, že sekvencla CHEF1 od reštrikčného miesta Scal C v protismere) až do (ale nie vrátane) intrónu 5' (v smere) Je zo 64 X zhodná so sekvenclou ľudského EF-lc*. Porovnanie umiestení väzbových miest transkrlpčného faktora Spi ľudskej a škrečacej regulačnej sekvencie Je uvedené v tabuľke 1. Úplná sekvencla ľudského génu EF-1« CUetsski et al., pozri vyššie) Je uvedená v SED ID NOs 29.
Tabuľka 1
Vzdialenosť miest Spi od TATA boxu
| Chrček Poloha nukleotidu | Človek Poloha nukleotidu |
| -424 | -335 |
| -304 | -220 |
| -183 | -208 |
| -171 | 432 |
| -151 | 476 |
| -135 | 573 |
| -26 | 581 |
| 63 | 690 |
| 156 | |
| 168 | |
| 257 | |
| 261 | |
| 425 | |
| 485 | |
| 589 | |
| 594 | |
| 688 |
Príklad 4
Konštrukcia expresných plazmldov
Mnohé plazmidy, ktoré sa používajú v nasledujúcich príkladoch, boli získané ďalej popísanými postupmi.
Plazmid pSV2-dhfr (prírastkové číslo ATCC 37146) sa rozštiepi Sphl/BamHI a 1,8kb fragment kúdujúci dihydrofolát reduktázu (DHFR) sa prečistí (fragment 1). Fragment kódujúci DHFR tiež obsahuje sekvenclu proinótora/operátora SV40 umiestenú smerom k 5* a polyadenylačnú sek venci u umiestenú smerom 3' vzhľadom na dhfr gén. Plazmid pSL1190 (Pharmacia) sa rozštiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenowom a tupo zakončená DNA sa opäť llguje, aby sa eliminovalo miesto HindlII, za vzniku plazmldu PSL1190H, ktorý sa potom štiepi Sphl/BamHI a 3,4kb fragment sa k
prečistí (fragment 2). 1,8kb fragment pSV2-dhfr (fragment 1)
I sa llguje k 3, 4kb fragmentu pSLUSOH (fragmentu 2), čím sa získa Plazmid pSL1190H-dhfr.
Plazmid pSL1190H-dhfr sa modifikuje nasledujúcim postupom, aby sa z neho odstránilo niekoľko reštrikčných miest. Plazmid sa najprv štiepi Xbal/NheI (čím sa získajú komplementárne posunuté konce) a lineárny plazmid sa opäť llguje, čím sa odstránia obidve miesta Xbal a Nhel. Pri druhom postupe sa pSL1190H-dhfr štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenovovým fragmentom a lineárny plazmid sa opäť llguje, čím sa eliminuje HindlII miesto. Pri treťom postupe sa pSL:l.l90H-dhfr štiepi Oglll, posunuté konce sa doplnia Klenouom a lineárny plazmid sa opäť llguje, čím sa odstráni miesto BglII. Výsledkom týchto troch stupňov Je plazmid pSL1190H-dhfr/NXHB, z ktorého boli odstránené miesta Xbal, NheI, HindlII a Bglll. Plazmid pSL119QH-dhfr/NXHB sa štiepi EcoRl/BamHl, irizertuje sa do neho linkér NPB1/NPB2 (získaný aneláclou oligonukleotidov NPB1 a NPB2 CSEO ID N(h 20 a 21] za vzniku plazmldu pSL/dhfr/Notl, ktorý má jedinečné reštrikčné miesto Nôti.
NPB1 GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20) NPB2 AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)
Tento plazmid pSL/dhfr/Notl sa štiepi Asp71B/BamHI a 1,8kb fragment kúdujúcl DHFR sa prečistí (fragment 3). Plazmid pRc/CI*IV (Invltrogen, San Diego, CA, USA) sa štiepi Asp718/BglII, čím dôjde k odstráneniu promótora CI*IV a polyadenylačnej DNA hovädzieho rastového hormónu (BGH) a 3,7kb fragment sa prečistí (fragment 4). 1,8kb fragment pSL/dhfr/Notl kódujúci DHFE s obsahom sekvencie promútora/operátora SV4C1 a polyaderiylačnej sekvencie (fragment 3) sa liguJe k 3, 7kb fragmentu pRc/CMU (fragmentu 4) za vzniku plazmldu pRc/DHFR/Notl.
Plazmid pRc/CMV sa štiepi Asp718/Xbal a 0,8kb fragment kódujúci polyadenylačnú DNA BGH sa prečistí (fragment 5). Plazmid pRc/DHFR/Notl sa rozštiepi BamHI/Asp718 a 4kb fragment obsahujúci sekvencie DHFR, promútora/operátora SV40 a polyadenylačnú sekvenciu sa prečisti (fragment 6). Plazmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) sa štiepi BglII/SacI a 0,71kb fragment kódujúci promótor CI*IV sa prečistí (fragment 7). 0, Bkb fragment pRc/CľlV (fragment 5), 4kb fragment pRc/DHFR/Notl (fragment 6), D»7kb fragment pCEP4 (fragment 7) a fragment syntetického adaptoru Sacl/Xbal sa spoja štvorcestnou llgáclou, čím sa získa plazmid pDCl. Adaptor sa vytvorí aneláciou oligonukleotidov SXPJ a SXP2.
SXP1 (SEQIDNO:22) 5'-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3 ‘
SXP (SEQIDNO:23) 5'-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAG GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3'
Plazmid pDCl teda obsahuje promótor CMV, oblasť polylinkéra, polyadenylačné miesto z BGH a gén DHFR riadený promótorom SV40 a sekvenciu SV40 zostrlhu/polyadenylačného miesta.
Plazmid pDCl sa štiepi Xhol a izoluje sa 4,5kb fragment, ktorý neobsahuje promótor CI*IV a polyadenylačnú DNA BGH, ktorý sa liguJe k plazmldu pDCll. Plazmid pDCil sa potom štiepi BamHl/Xhol a 4,5kb fragment sa prečistí (fragment 8). 4, 5kb fragment pDCll (fragment 8) a liguJe k PCR fragmentu štlepenému BamHI/SalI kódujúcemu čiastočnú sekvenciu promótora CľlV získanú pri použití primárov 96-13 a 96-14 (plazmid pDCl, ako templát). čim sa získa plazmld pDC12.
Primár 96-13 (SEQID NO: 24)
5'-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3'
Primár 96-14 (SEQ ID NO: 25)
ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
Plazmid pDC12 sa štiepi Asp718/Spel a 4,2kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyaderiylačnej sekvencie sa puriflkuje (fragment 9) a pDCl sa štiepi Asp718/Spel a 1,5kb fragment obsahujúci čiastočnú DNA promótora CľlV s BGH polyadenylačnýini signálmi sa puriflkuje (fragment 10). 4, 2kb fragment pDC12 (fragment 9) sa llguje k 1, Skb fragmentu pDCl (fragmentu 10), čím sa získa plazinld pDC31. Plazmld pDC31 sa od pDCl odlišuje tým, že obsahuje niekoľko nových reštrikčných miest, ako Smal a Ascl pri 5’ konci promótor CMV, ktoré boli vytvorené. Plazmld pDC31 sa štiepi Nôti, posunutá DNA sa riLupí pri použití polymerázy T4 a plazmid sa opäť ligu Je, aby sa vylúčilo miesto Nôti, čím sa získa plazmid pDC36. Plazmid PDC36 Je rovnaký ' ako pDC31 s výnimkou miesta Nôti, ktoré bolo zničené.
Plazmid pDC36 sa štiepi Apal/BamHT, posunuté konce sa doplnia a plazmid sa opäť liguJe za vzniku pDC38. pDC38 Je rovnaký ako pDC36, až na fragment Apal/BamHI obsahujúci polyadenylačnú sekvenclu hovädzieho rastového hormónu, ktorá z neho bola odstránená. Plazmid pDC38 sa štiepi Smal/HindlII a 4, 6kb fragment, ktorý neobsahuje DNA promótora CMV, sa puriflkuje (fragment 11).
Plazmld pSK/EF1.3 sa štiepi EcoRV/Notl/PvuI a 2, 9kb fragment kódujúci sekvenclu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenclu DNA sa purifikuje (fragment 12). Bluescript SU*II (pSK*) sa štiepi Nôti a 2,9kb fragment sa purifikuje (fragment 13). 7kb Nôti fragment z fágu lambda 7, 4 sa ligu Je k 2,9 pSK* fragmentu (fragmentu 13), čím sa získa plazmid pSK/EF1.7.
Plazmid pSK* sa štiepi Hirídľll/Notl a 2,9kb fragment sa purifikuje (fragment 14). Plazmid pSK/EF1.7 sa štiepi Notl/Ncol a 620bp fragment kódujúci časť 5' netranslátovaného intrónu CHEF1 sa purifikuje (fragment 15). 123bp PCR fragment štiepený HindlII/Ncol kódujúci zvyšný 5’ intrón vytvorený pri použití primérov 96-36 a 96-45 a pSK/EF1.12 ako templátu sa prečistí (fragment 16).
Primár 96-36 (SEQĽDNO:26)
GGCTTAGCTCCGAGGAGGG
I
Primár 96-45 (SEQID NO: 27) CGTGACAAGCTTGGTTTTCACAACAC
2,9kb fragment pSK* (fragment
14). 620bp fragment pSK/EFl (fragment 15) a 123bp fragment
HindlII/Ncol (fragment 16) sa ligujú, čím sa získa plazmid pSK/5*EF-l obsahujúci úplnú sekvenciu 5' intrónu CHEF1.
Plazmid pSK/5‘EF-l sa štiepi HindlII/Notl a 0, 7kb fragment kódujúci 5’ intrón sa purifikuje (fragment 17). 4,6kb fragment pDC38 neobsahujúci promótor CMV (fragment 11), 2,9kb fragment pSK/EFl.3 obsahujúci sekvenciu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenciu (fragment 12) a 0,7kb pSK/5'EF-l fragment kódujúci úplný 5' intrón (fragment 17) sa spoja pri trojcestnej ligácii, čím sa získa plazmid pDEFl, ktorý teda obsahuje kompletnú 5'regulačnú DNA CHEF1, gén dhfr a začiatok replikácie SV40, ktorý umožní repllkáclu za vzniku veľmi vysokého počtu kópií v bunkách transformovaných antigénom SV40 T.
Plazmid pDEFl sa štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia a plazmld sa štiepi Nôti. 2,6kb fragment obsahujúci okrem Čiastočnej sekvencle 5’ intrúnu sekvenclu promótora CHEF1 a protlsmerovú sekvenciu DNA sa purifikuje Cfragment 18). Plazmld pDEFl sa štiepi Notl/Asp718 a 1,3kb fragment kódujúci zvyšok ť lntrónu sa purifikuje Cfragment 19). Plazmld pDC38 sa štiepi Smal/Asp718 a 4kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyadenylačneJ DNA sa purifikuje Cfragment 20). 2. 6kb fragment pDEFl (fragment 18), 1, 3kb fragment pDEFl (fragment 19) a 4kb fragment pDC38 (fragment 20) sa spoja trojcestnou ligáclou, čim sa získa plazmld pDEF2. Plazmld pDEF2 v E. coli kmeňa XL-1 Blue bol uložený 4. marca 1997 v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklaun Drlve, Rockville, I*1D 20852, USA pod prírastkovým číslom 98343. Plazmld PDEF2 sa od pDEFl líši v tom, že z neho bol odstránený 0,3kb fragment HindllI/Spel umiestený 2. 3 kb proti smeru do TATA boxu CHEF1 a že obsahuje len Jedno miesto HlndlII umiestené v oblasti polylinkéra. pDEF2 sa použije v prípadoch, kedy gén, ktorý má byť exprimovaný, obsahuje vlastné polyadenylačné miesto.
S cieľom linearizácie sa plazmld pDEF2 štiepi Asp718/Xbal, pričom sa však tiež odstráni začiatok repllkačných sekvencií a 7,4kb fragment sa purifikuje (fragment 21). Plazmld pDCl sa štiepi Asp718/Xbal a 0, 8kb fragment, ktorý okrem polyadenylačných sekvencií BGH sa vyznačuje tým, že má obsah zámeny začiatku alebo replikačnej DNA, sa purifikuje (fragment 22). 7,4kb fragment PDEF2 (fragment 21) a 0,8 kb fragment pDC21 (Fragment 22) sa spoja za vzniku plazmidu pDEFlO, ktorý sa líši od pDEFl rovnakým spôsobom ako pDEF2. Plazmld pDEFlO sa od pDEF2 odlišuje v tom, že v pDEFlO pri 3' konci oblasti polylinkéra Je polyadenylačné miesto z génu hovädzieho rastového hormónu.
Plazmld pDEFlO sa štiepi Hindlľľ/Xbal s cieľom linearizácie a 8, 2kb fragment sa purifikuje (fragment 23). Plazmld pDCl/ľlDC, plazmld kódujúci chemokín odvodené od chemokínu ľudského makrofágu (l*IDC) sa štiepi Hlndľľľ/Xbaľ a 0, 4kb fragment kódujúci ľlDC sa purifikuje (fragment 24). Ligáclou 8, 2kb fragmentu pDEFlO (fragment 23) s O, 4kb fragmentom pDCl/l*IDC (fragmentom 24) sa vyrobí plazmid pDEFlO/MDC.1.
Plazmid pRc/CI*IV sa štiepi BamHI, posunuté konce sa doplnia Klenouom, plazmid sa štiepi Asp718 a 1,5kb fragment sa purifikuje C fragment 15). Plazmid pDCl sa štiepi Nôti, posunuté konce sa doplnia Klenouom, plazmid sa štiepi Asp718 a 3,9kb fragment sa purifIkuJe (fragment 26). 1, 5kb fragment pRc/CľlV (fragment 25) sa ligu Je s 3,9kb fragmentom pDCl (fragmentom 26), čím sa získa plazmíd pNCX.
Plazmíd pNCX sa podobá pDCl s tou výnimkou, že dhfr gén Je nahradený génom rezistencie voči neomycínu (NeoR). Plazmíd pNCX sa štiepi Asp718/Pvul a 2, lkb fragment sa purifikuJe (fragment 27). Plazmid pDEFl sa štiepi Asp718/Pvul a 5,9kb fragment sa purifikuJe (fragment 28). 2, lkb fragment pNCX (fragment 27) sa llguje do 5,9kb fragmentu pDEFl (fragmentu 28) za vzniku plazmldu pNEFl. pNEFl sa líši od pDEFl tým, že nesie bakteriálny gén rezistencie voči neomycínu (NeoR), ktorý kóduje rezistenciu voči neomycínu alebo G418. Gény, ktoré majú byť lnzertované do pNEFl, sú všeobecne fragmenty HlndlII/Xbal, ktoré sa Inzertujú po začiatočnom štiepení HindlII alebo trojcestnej llgácli, keďže plazmid obsahuje dve miesta HindlII.
Príklad 5
Transfekcla buniek DG44 a skúška produktivity
S cieľom transfekcie hostiteľských buniek DG44 Jediným plazmldom sa obvykle llnearlzuje 50 až 100 ug plazmldu štiepením reštrikčným enzýmom Pvul alebo AscI. Pri transfekcii, kedy sa majú do buniek CHO zavádzať dva plazmidy, sa plazmldy nechajú neštiepené. Pred transformáciou sa plazmidy vyzrážajú etanolom a premyjú dvakrát 70% etanolom. DNA pelety sa krátko sušia a resuspenduJú v 400 ul sterilnej destilovanej vody. K resuspendovanej DNA sa pridá 400 ul sterilného 2X HeBS (40ml*l HEPES-hydroxid sodný, pH 7, Os 274ml*l chlorid sodný; lOmN chlorid draselný; 1, 4ml*l hydrogenfosforečnan sodný; 12mN dextróza) .
Netransfekované bunky DG44 sa kultivujú v médiu DľlEI*l/F-12 doplnenom hypoxantínom C na konečnú koncentráciu 0» 01m 1*1) a tymidínom C na konečnú koncentráciu 0, 0016ml*l), tiež označovaným ako HT. S delom pestovania netransfekovaných aj transfekovaných buniek DG44 sa k médiu pridá dlalyzované FBS do konečnej koncentrácie 5 až 10 % objemových. Bunky DG44 sa pripravia na tränsfekciu tak, že sa kultúry nechajú rásť do asi 50% alebo nižšej konfluencie v 150cma ošetrených polystyrénových nádobách pre tkanivovú kultiváciu (Corning). Bunky sa z plastu odstránia tak, že sa najprv odsaje médium a prilipnuté bunky sa premyjú raz soľným fosfátovým pufrovacím roztokom bez vápnika a horčíka CCI*IF-PBSí 2,7mľl chlorid draselný; 1,5mľ1 dihydrogenfosforečnan draselný; 137ml*l chlorid sodný a 8, lml*l hydrogenfosforečnan sodný), pridajú sa k nim 4 ml roztoku obsahujúceho 0,0125% ožiarený trypsín (Uorthington Biochemical Corporation) v CňF-PBS a lnkubujú sa niekoľko minút pri 37 °C. K bunkám sa pridá médium (4 ml) obsahujúce hovädzie fetálne sérum (FBS), stanoví sa koncentrácia buniek a allkvóty 2 x 107 buniek sa peletlzujú centrifugáclou. Každá bunková peleta sa premyje raz v CľlF-PBS a resuspenduje v 0, B ml roztoku obsahujúceho HeBS s požadovanou plazmldovou DNA. Resuspendované bunky sa pri teplote miestnosti prevedú do 0,4cm kyvety Gene Pulser (Blo-Rad) a umiestia sa do elektroporačného zariadenia Blo-Rad GenePulzer. Bunky sa elektroporujú pri teplote miestnosti s vybíjaním kondenzátora 290 V a 960 uF (pulz 9 až 11,5 ms). Bunky sa asi 10 minút ponechajú v kyvete a potom pridajú do 10 ml DľlEľl/F-12 doplneného 5 až 10% dlalyzovaným FBS a HT. Potom sa stanoví úmrtnosť (vylúčenie trypánovej modrej), ktorá Je obvykle asi 50%. Bunky sa peletlzujú centrifugáclou, pelety sa resuspendujú v 2 ml DI*IEI*I/F-12 doplnenom 5 až 10% dlalyzovaným FBS a HT (neselektívne médium) a zaočkujú sa na lOcm polystyrénové misky pre tkanivovú kultiváciu. Po dvojdennom raste sa bunky. ten čas obvykle konfluentné, z misiek odstránia pri použití trypsínu, ako Je popísané vyššie a v rôznych zriedeniach v DI*IEI*l/F-lľ doplnenom 5 až 10% dlalyzovaným FBS a bez HT (selektívne médium) zaočkujú na 10cma misky. Päť a deväť dní potom sa k bunkám pridá selektívne médium. Po asi 2 týždňoch sa kolónie transfektatnu (obvykle viac ako 1000 na každú transfekciu) z misiek odstránia pri použití trypsínu, vyššie popísaným spôsobom a po prídavku selektívneho média sa stanoví koncentrácia buniek. Aspoň dva alikvóty 2 x 10ώ buniek na každú transfekclu sa pridajú k lOcm miskám obsahujúcim 10 ml selektívneho média. Bunky sa nechajú rásť až do zániku, kedy Je väčšina buniek odpojená od dosky vplyvom preplnenia. Supernatant zo zaniknutých kultúr sa skúša metódou ELISA, čím sa stanoví priemerný titer produktu.
Príklad 6
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití CHEF1
Bunky DG44 popísané v príklade 5 sa transfekujú plazmldy nesúcimi gény uvedenými v tabuľke 3 operatívne pripojenými k regulačnej DNA CHEF1. Bakteriálne kmene transformované plazmidmi kódujúcimi každý z génov, ktoré boli použité pri skúške, boli uložené v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklaun Drlve, Rockville, Naryland 20Θ52, USA, 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami uvedenými v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Prírastkové čísla plazmidov
Kódovaný gén
Označenie plazmidu
Prírastkové číslo
Ťažkého reťazca
PDEF1/ICN3H.2
99381 protilátky TCI*I3
Ľahkého reťazca
PNEF1/ICN3L.3
99392 protilátky ICI*I3
Ťažkého reťazca
PDEF1/F2GH.1
99393 protilátky 23F2G
| Ľahkého reťazca protilátky 23F2G | PNEF1/F2GL.1 | 98384 |
| Chitinázy | pDEFl/CTN.l | 98385 |
| Acetylhydrolázy aktivačného faktora doštičiek CPAF-AH) | PDEF2/HPH.4 | 98386 |
| Chemoklnu odvodeného od makrofágu CľlDC) | pDEFlO/MDC.1 | 98387 |
Po selekcii na transfektanty sa spojené kolónie Cviac ako 200) z každej transfekcle odstránia z misiek pri použití trypsínu a rovnaký počet buniek z každej transfekcle sa nanesie na misky a nechá sa rásť do uhynutia. Supernatanty sa odstránia a expresla protelnu sa stanovuje pri použití metódy ELISA alebo enzýmového stanovenia. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Expresla protelnu pri použití regulačných sekvencil CHEF1 a CMV
Transfekovaný gén Titer protelnu
| CMV | CHEF1 | |
| ICM3 H+L | 554 | 1862 |
| 10*13 H+L | 288 | 2153 |
| HU23F2G H+L | 337 | 1848 |
| MDC | 360 | 2100 |
| PAF-AH | 590 | 6574 |
| Chitinázy-1 | 3200 | 2300 |
| Chitlnázy-2 | 8900 | 12850 |
S výnimkou prvej skúšky na expreslu chltlnázy (v tabuľke 3 označená ako chitináza-1) sa pri použití regulačnej DNA CHEF1 dosiahnu významne vyššie úrovne produkcie proteínu, ktoré sú trikrát až Jedenásťkrát vyššie ako pri expresii s promótorom CľlV.
S cieľom stanovenia, čl v prípade zníženej expresie, ktorá bola zistená v prípade skúšky na chitinázu, ide o abnormálny alebo opakovateľný výsledok, ktorý by bol charakteristický a/alebo Jedinečný pre chitinázu, sa skúška zopakuje, avšak pri použití dvoch oddelených transfekclí, na rozdiel od jedinej transfekcie použitej pri prvej skúške, kde výsledkom bol neobvykle nízky počet získaných transfektantov. Okrem toho sa použije Iné skúška na aktivitu chltlnázy, v prípade ktorej sa ukázalo, že Je presnejšia ako postupy použité pri prvej skúške.
Výsledkom transfekclí pri druhej skúške Je počet transfektantov.
ktorý Je výsledkami dosiahnutými pri ďalších skúškach produkuje dosiahnutého plazmldom (označeného tabuľke konzistentné.
čo konzistentneJší s predchádzajúcimi použití plazmidu pDEF2, ktorý pri viac ako 150 2 počtu transfektantov
CNV. Výsledky z druhého pokusu 3 ako chitináza-2) zvyšuje dôveryhodnosť výsledkov.
sú vnútorne napriek tomu v porovnaní s nižšie ako zvýšenia že zistené zvýšenie expresie proteínu (asi 1,4x) expresiou pri použití promótora CI*IV, Je zistené v prípade ostatných proteínov skúšaných skôr
Príklad 7
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití regulačnej DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami
Skonštruuje sa expresný vektor obsahujúci ďalších 8 kb 5' lemujúcej DNA z génu EF-lce a označí sa ako pDEF14. Plazmid PDEF14 sa od pDEF2 odlišuje v tom, že pDEF14 obsahuje približne
11,7 kb DNA lemujúcej 5' škrečacleho EF-lcí, zatiaľ čo pDEF2 obsahuje len 3,3 kb tejto sekvencle. Plazmid pDEF14 tiež obsahuje kb škrečacej 3* lemujúcej DNA priliehajúcej k 3* koncu DHFR expresnej kazety. Väčší plazmld pDEF14 sa skonštruuje spôsobom, ktorý Je stručne popísaný ďalej.
Z pDEF2 sa odstráni 2. 6kb AscI/NotI fragment CHEF1 a na Jeho miesto sa inzertuje llkb dlhšej sekvencle najprv umiesteného 11,7 kb od 5*
AscI/NotI fragment CHEF1. Inzercia vyžaduje modifikáciu Xbal miesta smerom k iniciačnému ATG EF-1cí na miesto AscI. Okrem toho sa inzertuje 4kb NslI/Sall fragment s tupými koncami, ktorý Je tvorený lemujúcou sekvenciou CHEF1 začínajúcou pri Nsil mieste 118 párov báz od 3* konca k stop kodónu EF-lcc, do Pmel/Sall miesta 3' k DHFR expresnej kazete umiestenej na 3* konci oblasti polylinkéra, do ktorej sú inzertované gény, ktoré majú byť exprimované. Úplná 3’ DNA sekvencia so začiatkom pri stop kodóne génu EF-lce Je uvedená v SEll ID NO: 28. Baktéria transformovaná týmto plazmidom bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collectlon, 12301 Parklaun Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, 9. apríla 1997 pod prírastkovým číslam 98398. Výsledný plazmld pDEF14 obsahuje Jedinečné Xbal a Nôti miesta spolu s mnohočetnými HindITI miestami a Inzercia génu do tohoto plazmldu s cieľom expresle teda vyžaduje trojcestnú llgáclu. Tak napríklad gén môže byť inzertovaný do plazmldu ligáciou HindlII/Xbal fragmentu obsahujúceho požadovaný gén so 737bp Notl/HindlII fragmentom z PDEF14 a 19, 7kb Xbal/NotI fragmentom z pDEF14.
Expresia proteínu pri použití tohoto vektora sa porovná s expresiou pri použití vektora pDEF2, ktorý obsahuje menšiu časť 5' lemujúcej oblasti EF-lcc. Pri predchádzajúcich skúškach bola DNA kódujúca ťažký aj ľahký reťazec protilátky 23F2G subklonovaná do vektorov pDEF2 a pDEF14 a úrovne expresle stanovené po transfekcii do buniek DG44 sú popísané vyššie v príklade 5. GOny kódujúce obidva reťazce protilátky sa vo vektoroch umiestia lineárne a expresia obidvoch génov sa poháňa sekvenciou CHEF1 v Jednotlivých plazmidoch. Kódujúce oblasti pre dva reťazce v každom plazmlde sa rozdelia identickou 4,3bk DNA odvodenou od 3' netranslátovanej oblasti ľudského IgG4.
Výsledky ukazujú, že expresia 23F2G z väčšej CHEF1 sekvencie Je v pDEF14 štvornásobne väčšia ako expresia protilátky z menšej sekvencie pDEF2. Tento výsledok Je prekvapujúci vzhľadom na to, že väčšina Identifikovateľných väzbových miest transkrlpčného faktora pDEF14 Je tiež v sekvencll DNA v pDEF2. Je teda možné, že v DNA CHEF1 v plazmlde pDEF14 Je umiestené Jedno alebo viac ďalších a neidentifikovaných väzbových miest transkrlpčného faktora alebo sekvencll zosilňovačov. Inak povedané, väčšia DNA CHEF1 mOže poskytovať výhodu zvýšenej transkripcie vďaka určitej vlastnosti 3* DNA sekvencie.
Odborníkom v tomto odbore určite zrejmé mnohé modifikácie vynálezu, ako Je popísaný a Ilustrovaný v predchádzajúcom texte. Takéto modifikácie a zmeny nepredstavujú únik z rozsahu vynálezu, ktorý Je daný len patentovým nárokmi.
SEKVENČNÝ PROTOKOL
Cl) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE.
(í) PRIHLASOVATEĽ. Allison, Daniel S.
Cii) NÁZOV VYNÁLEZU. Transkripčná regulačná DNA škrečacieho
EF-1D
Ciii) POČET SEKVENCIÍ. 29
Civ) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU.
CA) ADRESÁT. Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray &
Borun
CB) ULICA. 233 South Nacker Drive. 6300 Sears Touer
CC) MESTO. Chicago
CD) ŠTÁT. Illinois
CE) KRAJINA. USA
CF) ZIP. 60606
Cv) POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ FORMA.
CA) TYP MÉDIA. Floppy disk
CB) POČÍTAČ. IBM PC compatible
CC) OPERAČNÍ SYSTÉM. PC-DOS/MS-DOS
CD) SOFTWARE. Patentln Release #1.0, Version #1.30
C vi) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE.
C A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY.
CB) DÁTUM PODANIA.
CC) ZATRIEDENIE.
Cviii) INFORMÁCIE O ZÁSTUPCOVI.
CA) MENO. KAREL ČERMÁK, AKP ČERMÁK-HOŔEJŠ-VRBA,
NÁRODNÍ 32, 110 01 PRAHA 1
CC) ČÍSLO SPISU. 01-11-99-ČE
Cix) TELEKOMUNIKAČNÉ SPOJENIE.
CA) TELEFÓN. 312-474-6300
C B) TELEFAX. 312-474-0448
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO.l.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
C A) DĹŽKA. 3678 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
Cli) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.l
ACTAGTTCCA AAGCAGAGAG
ATTAGTTCTA
TTGTTACAAA
TAGGCACTAG
AAATCTCTGT
GAAAAAGGGA
GGCTTTTGTG
TGCCTTGCAT
CAGAAAAAGC
TTCTGTGGAT
TCTGGATTCT
TTGGTTACAA
TAAATGAGAA
AACCTGCTTG AAGAAACCTG
TGTGGTGGGG
TTAGAAATCA
AAGGCCAGCC
AGGTTCTGTC
TCCTTTCTTT
GTTTTGGAGC
CTATCCTGGC
AGCCAGCCTC
TGCTGGGATT
AAACAAAAAT
AACATCAGGA
AGCCTGACTC
TGAGTTGGAT
GGAAGGTGTC
CTCTGGTCCC.
AATAATGCTA
TTTTTAAAAA TAGATAATAG
GTAAGAATCA TTTTATATTT
CAGTTTTTTT
AAGATGAATT
TTGCTAGTGT 120
GGTATCAAGA
180
TTTGTGAAAT 240
GCATAGACCC 300
AGAAAATGAT
360
TTAACAGAAT 420
TAGAAGGTTG 480
CACGTCTGTA 540
TCAGCAACAC 600
TTTTTTTTTT 660
ACTAGCTCTG 720
AAAGGTATGC 780
GGTGGTGAGA 840
CCTTTAGAGC 900
CACACATAGC 960
AATTAAAAAC 1020
AGTATCATGT 1080
CCTTCCTAGC
ACTAACCAGT TTCATTTTCG TAATTTTAAC GAGAGAGGGT TGTGTTTGAT TAGTTATATA TAAGTGCAAA TAAGGCTCTG ATCCCAGCAT AGTGAGTTTG TTTCTTTTCT AAGAGCAGGC ACCACCAACG GGGCTCAGTG TACATGGTTG TATACACAGC AACAACAGTT AAATTTGCTT TTGACTGTGG
GTTTCCAAGG TATATTTCTT GACTGGCTGA AATGTGGCCA CTCTTAACAC TACTTTTAGG CAAAGCCAGA TAATATAGGA TGGGAAGTAG AGGCCACCCT TTTTTTGGTT TGGCCTCGAA CCCCAGGTTT GTCACAGGCA AGGGAAGAGA ATGTGCATTC TGGGTTGTGA TCAACTCATC AGTCTTGTCC
AAATAAATGA ACAATTTCTC GAACCCTAGA TTATAGAAAA CCTCCTTGAC GAAACGTAGT AACCTCCTGA ATTAGGAGAA AGGTAGAAGA GAACTACATC TCTCTGTGTA CTCAGAGATC TGTCTCAAAC TTCTCTGCAA ACTGACTCCT ACACACACTA AAACTAGAAC CCAAAATTTG GGAAGCAAAT
| AGTTCCTTTG | 1140 | |||
| CAGATCCCAC AGGTTGGTTC | ATGTGGACAC 1200 | CGGACAGTAG | GTCCTCAAAT | GCTCCTTATT |
| AATAATATCA GATCTCTTGA | ATTGTTTGTT 1260 | ACTAGGCAGT | GATGTTGTAC | ATCTGGAGGA |
| GCCCATAATC TTAGTGATAA | AGGTTATTAG 1320 | GAATAAATAC | TCTAAGGCTA | AAAATGTAGC |
| GAGTGCTTGC TATTCCATTA | CTGGTGTGCT 1380 | GAGACCCTCG | GTTCCATCTC | CACAACCCCA |
| CAAAATACCT GTTTTTCTTT | TTTCACCGTC 1440 | CCTAGCATTA | AGAAACAAAA | CAACAAAGAA |
| CTTCTGAGAT AAAAAAAAAA | CCTGCCCGGA 1500 | GAGGCATTTA | AAACTGGCCA | GGGCCAAAAA |
| AAAAGAAAAA GCCTTTAATC | AAAGAAAAGA 1560 | AAACAGGCTA | GGGCCGGCAT | GGTGGCGCAC |
| CCAGCACGCA GCCTGGTCTA | GGAGGCAGAG 1620 | GCAGGGCGGA | TCTCTGTGAG | TTTGAGGTCA |
| CCTAGTGAGT AACAGCCACA | TTCAGGGCAC 1680 | CCAGGGCTAA | AGAGACTGTC | TCAAAAACAA |
| CAATCAGAAC GACAAGCATT | CACAGCAAAA 1740. | CGCAGTTATG | ATCCTTGGAA | CTGTAGGAAT |
| TAAATAATAG GGGATGGGCT | GACGAGCCAT 1800 | TTTTGAGAAG | CTCTGATTTC | ACAAGTGTCA |
| CTGGGCGAGT TTGATTAGAT | AAGATTGCTA 1860 | ATGCTGGCCT | CTAAATGAGA | CCACGTGGAG |
| TCTTTTCATG ACACACACAC | TTCCTCGTGC 1920 | TCTATCAAAT | AACTGTACCC | AAATACACAC |
| ACACACACAA AGAATCAGAA | TGCGCGCACA 1980 | CACAAAATCC | TTTTTTAGCT | TAAGAAGCCC |
| GTAAAGCTAA CGTGAAGCGC | CTGTGGGACT 2040 | TAAGTATTAT | TCTGAACGGA | ACTCCCAGGG |
| GCTTCAGGCT GCCAGCACAG | TCCAGAGAAG 2100 | CAGCTGGCGC | TGGATGGAAT | GAACCAAGAG |
| GGGCAGATCC GGCTGGGAAG | GTCGAGCTCT 2160 | CGGCCACCGA | GCTGAGCCCT | TAGGTTCTGG |
GGTCCCTAGG ATTGTGCACC TCTCCCGCGG GGGACAAGCA GGGGATGGCG GGGCTGACGT 2220
| CGGGAGGTGG CCTCCACGGG AAGGGACACC CGGATCTCGA CACAGCCTTG | |
| GCAGTGGAGT | 2280 |
| CAGGAAGGGT | AGGACAGATT CTGGACGCCC TCTTGGCCAG TCCTCACCGC |
| CCCACCCCCG | 2340 |
| ATGGAGCCGA | GAGTAATTCA TACAAAAGGA GGGATCGCCT TCGCCCCTGG |
| GAATCCCAGG | 2400 |
| GACCGTCGCT | AAATTCTGGC CGGCCTCCCA GCCCGGAACC GCTGTGCCCG |
| CCCAGCGCGG | 2460 |
| CGGGAGGAGC | CTGCGCCTAG GGCGGATCGC GGGTCGGCGG GAGAGCACAA |
| GCCCACAGTC | 2520 |
| CCCGGCGGTG | GGGGAGGGGC GCGCTGAGCG GGGGCCCGGG AGCCAGCGCG |
| GGGCAAACTG | 2580 |
| GGAAAGTGGT | GTCGTGTGCT GGCTCCGCCC TCTTCCCGAG GGTGGGGGAG |
| AACGGTATAA | 2640 |
| ÄAGTGCGGTA | GTCGCGTTGG ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGTCA |
| GAACGCAGGT | 2700 |
| GAGTGGCGGG | TGTGGCCTCC GCGGGCCCGG GCTCCCTCCT TTGAGCGGGG |
| TCGGACCGCC | . 2760 |
| GTGCGGGTGT | CGTCGGCCGG GCTTCTCTGC GAGCGTTCCC GCCCTGGATG |
| GCGGGCTGTG | 2820 |
| CGGGAGGGCG | AGGGGGGGAG GCCTGGCGGC GGCCCCGGAG CCTCGCCTCG |
| TGTCGGGCGT | 2880 |
| GAGGCCTAGC | GTGGCTTCCG CCCCGCCGCG TGCCACCGCG GCCGCGCTTT |
| GCTGTCTGCC | 2940 |
| CGGCTGCCCT | CGATTGCCTG CCCGCGGCCC GGGCCAACAA AGGGAGGGCG |
| TGGAGCTGGC | 3000 |
| TGGTAGGGAG | CCCCGTAGTC CGCATGTCGG GCAGGGAGAG CGGCAGCAGT |
| CGGGGGGGGG | 3060 |
| ACCGGGCCCG | CCCGTCCCGC AGCACATGTC CGACGCCGCC TGGACGGGTA |
| GCGGCCTGTG | 3120 |
| TCCTGATAAG | GCGGCCGGGC GGTGGGTTTT AGATGCCGGG TTCAGGTGGC |
| CCCGGGTCCC | 3180 |
| GGCCCGGTCT | GGCCAGTACC CCGTAGTGGC TTAGCTCCGA GGAGGGCGAG |
| CCCGCCCGCC | 3240 |
| CGGCACCAGT | TGCGTGCGCG GAAAGATGGC CGCTCCCGGG CCCTGTAGCA |
| AGGAGCTCAA | 3300 |
I »
| AATGGAGGAC AAAGGAAGAG | GCGGCAGCCC 3360 | GGCGGAGCGG | GGCGGGTGAG | TCACCCACAC |
| GGCCTTGCCC CCGCACTTCA | CTCGCCGGCC 3420 | GCTGCTTCCT | GTGACCCCGT | GGTGTACCGG |
| GTCACCCCGG GATCTGTCTA | GCGCTCTTTC 3480 | GGAGCACCGC | TGGCCTCCGC | TGGGGGAGGG |
| ATGGCGTTGG AGCCTGGCCA | AGTTTGCTCA 3540 | CATTTGGTGG | GTGGAGACTG | TAGCCAGGCC |
| TGGAAGTAAT TGACAAAGCT | TCTTGGAATT 3600 | TGCCCATTTT | GAGTTTGGAG | CGAAGCTGAT |
| GCTTAGCCGT AAACCACCGC | TCAAAGGTAT 3660 | TCTTCGAACT | TTTTTTTTAA | GGTGTTGTGA |
TAATTCAAAT CCAACATG
C 2) ÚDAJE O SEQ ID NO:2:
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA: 20 párov báz C B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
C11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:
AGGCACAGTC GAGGCTGATC
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO:3:
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 20 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
C11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:
TTCCAGGGTC AAGGAAGGCA
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO:4:
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA: 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
3678
C11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.4.
GCCACCTGAT CTACAAATGT 20
C 2) ÚDAJE O SEO ID NO.5.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
C11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.5.
GAGATACCAG CCTCAAATTC 20
C2) ÚDAJE O SEO ID N0>6>
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
C11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.6.
ATGTGACCAT CATTGATGCC 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.7.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
C11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.7.
GTGACTTTCC ATCCCTTGAA 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.8.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NOsB.
GTTGGAATGG TGACAACATG 20
C2) ÚDAJE O SEO ID N0.9>
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová »
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.9.
CAGGTTTTAA AACACCAGTC 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO>10.
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP* nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.10.
AATGACCCAC CAATGGAAGC 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.11.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 20 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY-· DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.11.
ACAGCAACTG TCTGCCTCAT 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.12.
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 17 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.12.
GTAAAACGAC GGCCAGT 17
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.13:
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 19 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO:13:
GGAAACAGCT ATGACCATG 19
C2) ÚDAJE O SEO ID NO:14:
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 20 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO«14:
AATTAACCCT CACTAAAGGG 20
C2) ÚDAJE O SEO ID NO:15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 23 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.15.
GTTAATACGA CTCACTATAG GGC 23
C2) ÚDAJE O SEO ID NO>16.
Ci) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 6 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA* Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna (11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO.16:
GGCGGG 6
C 2) ÚDAJE O SED ID NO:17.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA. 6 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (11) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.17.
GGGCGG 6
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO :18.- (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 8 párov báz
CB) TYP: nukleová kyseliná
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
C11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE. SEO ID N0.18.
TGACGYMR 8
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.19.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 13 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna (11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO>19:
TGGCNNNNNKCCR 13
C2) ÚDAJE O SEQ 10 NO:20.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE
I t (A) DĹŽKA> 26 párov báz
CB) TYPx nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCAt Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA* lineárna (11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO*20s
GATCGCGGCC GCGTTTAAAC GGATCC
C 2) ÚDAJE 0 SEO ID NO>21:
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIAt lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO.21:
AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO>22*
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE* (A) DĹŽKA: 77 párov báz (B) TYP* nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO>22:
CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CTACATAACA ACATTCCTCC TCTAAAGAAG
CCCCAAGCTT 60
GATATCTGCA GAATTCT (2) ÚDAJE O SEQ ID NO>23:
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 85 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SED ID N0.23.
CTAGAGAATT CTGCAGATAT CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG
TTGTTATGTA 60
GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT
C 2) ÚDAJE O SEQ ID NO«24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA> 66 párov báz
C B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA» Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
C11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO.24.
AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGGG ATCTATACAT
TGAATCAATA 60
TTGGCA
C2) ÚDAJE O SEO ID NO:25:
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 42 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
C11) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEO ID NO.25:
ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT (2) ÚDAJE O SEO ID NO.26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
C A) DĹŽKA: 19 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA: lineárna
Cli) DRUH MOLEKULY: DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:26:
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG
C2) ÚDAJE O SEQ ID NO:27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
CA) DĹŽKA: 26 párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
Θ5
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.27.
CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC
C2) ÚDAJE O SEO ID NO.28.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 4263 párov báz
CB) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
Cii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.28.
| TGAATATTAC ÁACGGTCTCA | CCCTAACACC 60 | TGCCACCCCA | GTCTTAATCA | GTGGTGGAAG |
| GAACTGTTTG AATGATAACA | TCTCAATTGG 120 | CCATTTAAGT | TTAATAGTGA | AAGACTGGTT |
| ATGCATCGGA TTGTGTGTGT | AAACCTTCAG 180 | GAGGAAAGGA | GAATGTTTTG | TGGAACATTT |
| GGCAGTTTTA ACTTGACCAA | AGTTATTAGT 240 | TTTCAAAATC | AGTACTTTTT | AATGGAAACA |
| AAATCTGTCA GTCTGTCTCT | CAGAATTTTG 300 | AGACCCATTA | AAATACAAGT | TTAATGAGAA |
| GTTAATGCTG GCCCATTTGT | AAGTCATTAC 360 | TAAGTGCTTA | GCTTAGCAAG | GTATGTGGAT |
| GTTCCAAGGG CTCAAGAGAT | ATTGGACTGT 420 | TCATCAGGAC | CCAGAGCTGA | GTTTCAAGGG |
| GGCTTATTAC ATGTTTTTGG | CTGTGGGTGT 480 | CTTGAAGGTT | CTGGTTGGGA | CAAATTAGGA |
| CAGACATGGT GCCTTTGGGG | GACTACCTTC 540 | ATCTGGGTGA | GTTCAGTTGA | TTTGTCTTGA |
| TTTACACAAG AATATATGAG | TAAATGACAT 600 | CATACAGTTA | GTGTATTGTT | AGTGAATATT |
| GCAGGCTTTG CTTGTGCATT | CTCTAGCAAT 660 | TTTAGAACTA | GTTTTCAGGA | AAGGGTTCAT |
GGATGTTTGA TTCTATCACT TAGAGTTTAA ACTGAAAGTG CTCAAGAGGT
| TTTATTTAGG | 720 | |||
| CTGGGATATA AAAGGCCATC | AATAAGCCTT 780 | TCTGTAGCTT | GTAATGGTAT | CAGGAATTTA |
| TGGGGCACAA TGAGTACTTC | AGATTAAGCA 840 | GAAAAGGTAG | AAGGTGAGAT | TGGGGGACTT |
| ACACACTTTA AAGGGCATCC | ATGTGTGAGT 900 | GCTTTAGTGC | ATATAGTACA | ACTGCCAGAT |
| ACATCTGATT GGAGAAAAAT | GTTTGGAAGG 960 | CACCTTGTGG | TTTCTGGGAA | TTCAGAATTG |
| GCTCCCAACC GAGATAAGGA | GCTGAAGCCC 1020 | TTGGTAATCT | GCAGGGTGTT | TATTTAGCAG |
| CAAAAAGTTA GGTGGTCTTA | TAGTGTGGAG 1080 | TTGGTTGAGT | TGGTAGATGT | CATTACAACA |
| AATTGGGTTA TTTTCACCTT | GGAGTCACTT 1140 | TGAAATACCT | GGGCCATAAG | CAAAGTGGCA |
| TCAGGAGAAA TGGGCTGATG | CTGGTACACT 1200 | TATCCATTCT | ATAGTGCATG | CTTGTTČAAT |
| ACTAAACCGG AGACGGTGAG | TGACTAAAGG 1260 | TTTGTCAGTA | TAAATGGATG | GGTTGTAGGC |
| GAATTACTAT AGGATTGAGT | ACCTGCAAGG 1320 | AGTCATTGCC | TGATCTGCCT | GGAAAGGGGC |
| CTCAGAACGT TCAACTTAGT | GTACACCATA 1380 | GGATATGGAA | AAATTTGTCA | CGCCTAGCAT |
| GGTGTAGCGC TGTGTTAGGA | CACCTACTGG 1440 | CACTTTAAAA | GCTTAGCATA | GAGGAGCATG |
| GCTCGGATGG TACCAAATTA | GATCCAGGGC 1500 | CTCAAGGTTT | GCATGTAAAT | AAAAGCCCTT |
| ACTACATACC AGCTAATATA | AGCATACATC 1560 | AGTCCTTTAG | TGTTGAAAAA | CAGAAGGGAA |
| TATAGTGCTT TGTGACTAGT | GCTTTATTTA 1620 | AGTCTAGCTG | ATTACGTGTT | TGGTTGCCAG |
| CTGGAGTTGA ACACTCTAGT | ATTTGTCCTC 1680 | AGACACGTAA | AATGGAATTT | GGGATTCACA |
| ATGAGGGACC CAAAACGAAG | TAATGGCCTG 1740 | TACCAGGCAC | AAACGTGTCT | ATAAACTACA |
| GAATTTACAG TTTTAAAAAA | GAATTAGGAA 1800 | GGTATTCTTA | ACATTAAAAC | ATTATGGGCA |
| AGCTTTGACA ACCAGGCTGG | GGATTTCTTT 1860 | GTCATGGCTG | TCCTGGAGCT | AGTTGTGTAG | |
| GCTGAAATCT CAACATTCTG | TGTCTGCCTG 1920 | CCTGGCTTGG | ACACTTTTTT | ATTATGTATA | |
| CTTCCATGTA TGGTTGTGAG | TATCTGCACA 1980 | TTAGAAGACG | GCACCAGATC | TCCTAATGGA | |
| CCACCATGTG CTCTTAACCT | GTTGCTGGGA 2040 | ATTGAACTCA | GGACCTCTGG | AAGAGCAGTG | |
| CTGAGCCATC CAAACCCCCT | TCCAGCCCCA 2100 | GCTTGGGCAC | ATTTTTAATG | GCTGGGAAAT | Λ |
| AGGCCTTCTG AGGTTATTCG | TCAGTAATGA 2160 | AGGGCTTTTG | GCTACCGAGA | GTAGGATTTA | |
| GAGCTGCAGG ATGCAGTGAA | TCTGCCTCAG 2220 | TGCAGGTTTG | GGAGTCCAGC | ATCTTAGAAA | |
| GCCAAGCTGA TGCTGAGCCT | GCTATATTTT 2280 | GTTTAAAAAA | AAAATAAGTG | GGTAAAGTGC | |
| GATGACCAAG TAAAAGCATG | CTGGGACACA 2340 | AGTAGAAGAA | CATAGGCCAA | TGCTCTATAT | |
| GGTCATTTTT CCGCAGCGTG | AATGCTCTTG 2400 | AGAAGGCTAT | GCCTACACTA | CTCTCAGCCA | |
| TTTAAATTAA TAGTGCCTTG | ACTAGTTTGG 2460 | AAATTTTCTT | TGGGGGTAAG | CTATTTAACC | |
| GCAGGTATAC TTTCAGTCAG | TACTGAACTC 2520 | TCCTCCTCAT | TCCTTTTTGT | TTTTTAAGAA | |
| GCTCAGGCAG TGAGCCTATT | CCCTTAAACT 2580 | TGTGATTAAG | CCTGAGAACA | GTTACGATTA | |
| AGTATACCGA TGCCTCCCAA | TCAATATGTG 2640 | AATTTTTTTG | GGATGGGGGT | CAGGCCTCCC | |
| ATACTGGGAC TCTACATTTT | TAAAGGCTGC 2700 | ACCACCACAA | CCTGGCTCTT | GAAATACTTT | • - |
| TTGGGGGGCA TCCTGGAACT | TGGGTGGGAG 2760 | AGCAGGGTTT | CTCTGTATTA | GCCCTGGCTC | - |
| CTGTAGACCA AATTCTGGGA | GGCTATTCTT 2820 | GAGCTCAGAT | TAGCCTGTCT | CTGCCTCCTA |
TTAAAGGTGT GTGCTACTGC TGCCTGGCTA CAAAGACATT TTTTTTTTTC
TTAAATTTAA 2880
I |
| AAACAAAAGT AGCACTCAGG | GGTTCTTTTA 2940 | GAAGGGTGGT | TGGTGTTGGC | |
| TTTTGAGTTT GTAAGGGCTA | GTCCCAGGAA 3000 | TGAAGACTGC | ATTACTGCCG | |
| CACAGAGAAA AGGCTGGCCT | TCCTATTTGG 3060 | AGCCTATCCT | GGTAACTCGC | |
| CGAACTCAAG CCACCAACAC | AGAACCACCT 3120 | GCCTCTGAAT | GCTGGTATTA | |
| CCAGCCTAAA GAATAAACAT | AAATGTCTTT 3180 | TTTTTAAAGA | TTTTTTTTTT | |
| Λ M • | TCTGTTTACA ACCCGATCTC | ATATTCTGCT 3240 | TCTATGTATA | TCTGCACACT |
| k | ATAATGGATG ACCTCTGGAA | GTTGTGAGCC 3300 | ACCAAGTGGT | TGCTGGGAAT |
| GAGCAGTCAG GGCTCTTGAG | TGCTCTTAAC 3360 | CTCTGAGCCA | TCTCTCCAGC | |
| ATAGGGTCTC CACATAGCAC | AAGTAGTTTG 3420 | AGACTGAGTT | GGCTATATAA | |
| CATGTACAGC GGAGGATCAT | TGGGTTTAGT 3480 | TTACATGGGG | TGTTTTTGTC | |
| TTGAGCATAG TTGAGAACTA | GGAGTTAATA 3540 | GTGAGGTCAT | GTTTTATCTA | |
| AGCTGATGCA GGTGGAAACT | AAGCAAGTTT 3600 | GACTGAAGAA | GTCCAGTTTA | |
| AATGTGTCAA TGGGAATTAC | AGATGGCCTT 3660 | GCATGTGTTT | TAGATGATGA | |
| TGGATGTGTA CCTATATGAA | AGACCTATAT 3720 | CTTGACAGGA | GTGAACAGTG | |
| *« | AGAAATGAGA CCTGGTTCAT | CATACCCATT 3780 | TTGTTTCCCC | TAAGAATTCA |
| 4. | GCTATTTAGG TTGCTTATGT | TTATTTTACT 3840 | TGCAAATCCT | AGGTGCTCCC |
| GGCACCAAAG TGACAACCTA | TCACTCACTC 3900 | CCATGATTTG | CAAGTCTCTG | |
| GAATAGCAAC TTTTGCAAAA | TCAAATACAT 3960 | TTTCTCAGTA | CCAATTTTGA |
ACATACTCCA CCCCTCCCTG TCTGTAGACC AGGGCAGGCA TTTTTTTACA AGAAGAGGGC TGAACTCAGA CCCTAAAAAT ACAAGGCTGG TCTGGAGGCA CTCTTCTGAA TGAGAACAAG CCCAGTCACT TCTTATAGGT CTTTTCCTAA TTACCCAGTA GGAACTTCCA AGAAAAAATA
TAGCTGTATG GATGGGTACT AAATAGTGAG GTTATCTCCA GAAGGCCTAT f I
GAAGAATTAA
GGTTGAGTTC
TACAGTGTTT
TCCTATTACG
GCCTGGTACC
TATATCGGCC
GGTATTAGCC
ACCATTTAGG
TGATCGAGTC
GAC
4020 AGTTGAGTTC
4080
GTAAGTGTTT
4140
AGAAGAGGGC
4200 TGCTGGGAAT
4260
AGCAGCAAGT
TGCCTGCAGG
TTTGGATCCT
TGAAACCAAG
TTAAGGTTCA AATATCTGTA CTGGACTTGA TCCTCTGGAA
TCCATTTTTG
CCACATGCTT ATTACAGATG GAACAGCAAG
4263
C 2) ÚDAJE O SEO ID NO.29.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 4695 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna
C11) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NO.29.
| CCCGGGCTGG GGACTAGCGA | GCTGAGACCC 60 | GCAGAGGAAG | ACGCTCTAGG | GATTTGTCCC | |
| GATGGCAAGG AATCTCAATA | CTGAGGACGG 120 | GAGGCTGATT | GAGAGGCGAA | GGTACACCCT | |
| CAACCTTTGG CTTCCAGGCG | AGCTAAGCCA 180 | GCAATGGTAG | AGGGAAGATT | CTGCACGTCC | |
| GCCTCCCCGT ATTCATACAA | CACCACCCCC 240 | CCCAACCCGC | CCCGACCGGA | GCTGAGAGTA | |
| AAGGACTCGC AC.TAACGTAG | CCCTGCCTTG 300 | GGGAATCCCA | GGGACCGTCG | TTAAACTCCC | |
| AACCCAGAGA CACTGAGGTG | TCGCTGCGTT 360 | CCCGCCCCCT | CACCCGCCCG | CTCTCGTCAT | • - |
| GAGAAGAGCA TCGCCCACAG | TGCGTGAGGC 420 | TCCGGTGCCC | GTCAGTGGGC | AGAGCGCACA | |
| TCCCCGAGAA AGGTGGCGCG | GTTGGGGGGA 480 | GGGGTCGGCA | ATTGAACCGG | TGCCTAGAGA |
GGGTAAACTG GGAAAGTGAT GTCGTGTACT GGCTCCGCCT TTTTCCCGAG GGTGGGGGAG 540
| AACCGTATAT TTTGCCGCCA | AAGTGCAGTA 600 | GTCGCCGTGA | ACGTTCTTTT | TCGCAACGGG |
| GAACACAGGT GGTTATGGCC | AAGTGCCGTG 660 | TGTGGTTCCC | GCGGGCCTGG | CCTCTTTACG |
| CTTGCGTGCC TGATCCCGAG | TTGAATTACT 720 | TCCACGCCCC | TGGCTGCAGT | ACGTGATTCT |
| CTTCGGGTTG CCCTTCGCCT | GAAGTGGGTG 780 | GGAGAGTTCG | AGGCCTTGCG | CTTAAGGAGC |
| CGTGCTTGAG CTGGTGGCAC | TTGAGGCCTG 840 | GCCTGGGCGC | TGGGGCCGCC | GCGTGCGAAT |
| CTTCGCGCCT TTGATGACCT | GTCTCGCTGC 900 | TTTCGATAAG | TCTCTAGCCA | TTTAAAATTT |
| GCTGCGACGC TCTGCACACT | TTTTTTTCTG 960 | GC.AAGATAGT | CTTGTAAATG | CGGGCCAAGA |
| GGTATTTCGG GCGCACATGT | TTTTTGGGGC 1020 | CGCGGGCGGC | GACGGGGCCC | GTGCGTCCCA |
| TCGGCGAGGC GTCTCAAGCT | GGGGCCTGCG 1080 | AGCGCGGCCA | CCGAGAATCG | GACGGGGGTA |
| GGCCGGCCTG CTGGGCGGCA | CTCTGGTGCC 1140 | TGGCCTCGCG | CCGCCGTGTA | TCGCCCCGCC |
| AGGCTGGCCC CGGCCCTGCT | GGTCGGCACC 1200 | AGTTGCGTGA | GCGGAAAGAT | GGCCGCTTCC |
| GCAGGGAGCT GTCACCCACA | CAAAATGGAG 1260 | GACGCGGCGC | TCGGGAGAGC | GGGCGGGTGA |
| CAAAGGAAAA GGAGTACCGG | GGGCCTTTCC 1320 | GTCCTCAGCC | GTCGCTTCAT | GTGACTCCAC |
| GCGCCGTCCA TTTAGGTTGG | GGCACCTCGA 1380 | TTAGTTCTCG | AGCTTTTGGA | GTACGTCGTC |
| GGGGAGGGGT TGAAGTTAGG | TTTATGCGAT 1440 | GGAGTTTCCC | CACACTGAGT | GGGTGGAGAC |
| CCAGCTTGGC TGGATCTTGG | ACTTGATGTA 1500 | ATTCTCCTTG | GAATTTGCCC | TTTTTGAGTT |
| TTCATTCTCA GGTGTCGTGA | AGCCTCAGAC 1560 | AGTGGTTCAA | AGTTTTTTTC | TTCCATTTCA |
| AAACTACCCC TGTCGTCATT | TAAAAGCCAA 1620 | AATGGGAAAG | GAAAAGACTC | ATATCAACAT |
I I
| GGACACGTAG ATTCGGGCAA GTCCACCACT ACTGGCCATC TGATCTATAA | |
| ATGCGGTGGC | 1680 |
| ATCGACAAAA | GAACCATTGA AAAATTTGAG AAGGAGGCTG CTGAGGTATG |
| TTTAATACCA | 1740 |
| GAAAGGGAAA | GATCAACTAA AATGAGTTTT ACCAGCAGAA TCATTAGGTG |
| ATTTCCCCAG | 1800 |
| AACTAGTGAG | TGGTTTAGAT CTGAATGCTA ATAGTTAAGA CCTTACTTAT |
| GAAATAATTT | 1860 |
| TGCTTTTGGT | GACTTCTGTA ATCGTATTGC TAGTGAGTAG ATTTGGATGT |
| TAATAGTTAA | 1920 |
| GATCCTACTT | ATAAAAGTTT GATTTTTGGT TGCTTCTGTA ACCCAAAGTG |
| ACCAAAATCA | 1980 |
| CTTTGGACTT | GGAGTTGTAA AGTGGAAACT GCCAATTAAG GGCTGGGGAC |
| AAGGAAATTG | 2040 |
| AAGCTGGAGT | TTGTGTTTTA GTAACCAAGT AACGACTCTT AATCCTTACA |
| GATGGGAAAG | 2100 |
| GGCTCCTTCA | AGTATGCCTG GGTCTTGGAT AAACTGAAAG CTGAGCGTGA |
| ACGTGGTATC | 2160 |
| ACCATTGATA | TCTCCTTGTG GAAATTTGAG ACCAGCAAGT ACTATGTGAC |
| TATCATTGAT | 2220 |
| GCCCCAGGAC | ACAGAGACTT TATCAAAAAC ATGATTACAG GGACATCTCA |
| GGTTGGGATT | 2280 |
| AATAATTCTA | GGTTTCTTTA TCCCAAAAGG CTTGCTTTGT ACACTGGTTT |
| TGTCATTTGG | 2340 |
| AGAGTTGACA | GGGATATGTC TTTGCTTTCT TTAAAGGCTG ACTGTGCTGT |
| CCTGATTGTT | 2400 |
| GCTGCTGGTG | TTGGTGAATT TGAAGCTGGT ATCTCCAAGA ATGGGCAGAC |
| CCGAGAGCAT | 2460 |
| GCCCTTCTGG | CTTACACACT GGGTGTGAAA CAACTAATTG TCGGTGTTAA |
| CAAAATGGAT | 2520 |
| TCCACTGAGC | CACCCTACAG CCAGAAGAGA TATGAGGAAA TTGTTAAGGA |
| AGTCAGCACT | 2580 |
| TACATTAAGA | AAATTGGCTA CAACCCCGAC ACAGTAGCAT TTGTGCCAAT |
| TTCTGGTTGG | 2640 |
| AATGGTGACA | ACATGCTGGA GCCAAGTGCT AACGTAAGTG GCTTTCAAGA |
| CCATTGTTAA | 2700 |
| AAAGCTCTGG | GAATGGCGAT TTCATGCTTA CACAAATTGG CATGCTTGTG |
I
| TTTCAGATGC | 2760 | |||
| CTTGGTTCAA ACCACGCTGC | GGGATGGAAA 2820 | GTCACCCGTA | AGGATGGCAA | TGCCAGTGGA |
| TTGAGGCTCT TTGCGCCTGC | GGACTGCATC 2880 | CTACCACCAA | CTCGTCCAAC | TGACAAGCCC |
| CTCTCCAGGA GAATTTGAGT | TGTCTACAAA 2940 | ATTGGTGGTA | AGTTGGCTGT | AAACAAAGTT |
| TGATAGAGTA TTAGGTATTG | CTGTCTGCCT 3000 | TCATAGGTAT | TTAGTATGCT | GTAAATATTT |
| GTACTGTTCC GTGGTCACCT | TGTTGGCCGA 3060 | GTGGAGACTG | GTGTTCTCAA | ACCCGGTATG |
| TTGCTCCAGT GAAGCTTTGA | CAACGTTACA 3120 | ACGGAAGTAA | AATCTGTCGA | AATGCACCAT |
| GTGAAGCTCT GTCAAGGATG | TCCTGGGGAC 3180 | AATGTGGGCT | TCAATGTCAA | GAATGTGTCT |
| TTCGTCGTGG GCAGCTGGCT | CAACGTTGCT 3240 | GGTGACAGCA | AAAATGACCC | ACCAATGGAA |
| TCACTGCTCA AAGTCATTTG | GGTAACAATT 3300 | TAAAGTAACA | TTAACTTATT | GCAGAGGCTA |
| AGACTTTGGA TGAACCATCC | TTTGCACTGA 3360 | ATGCAAATCT | TTTTTCCAAG | GTGATTATCC |
| AGGCCAAATA ACATTGCATG | AGCGCCGGCT 3420 | ATGCCCCTGT | ATTGGATTGC | CACACGGCTC |
| CAAGTTTGCT TGGAAGATGG | GAGCTGAAGG 3480 | AAAAGATTGA | TCGCCGTTCT | GGTAAAAAGC |
| CCCTAAATTC GCAAGCCCAT | TTGAAGTCTG 3540 | GTGATGCTGC | CATTGTTGAT | ATGGTTCCTG |
| GTGTGTTGAG TAAATGTAAA | AGCTTCTCAG 3600 | ACTATCCACC | TTTGGGTAAG | GATGACTACT |
| AAAGTTGTGT ATTAACTTTT | TAAAGATGAA 3660 | AAATACAACT | GAACAGTACT | TTGGGTAATA |
| TTTTTAATAG GGGTGTCATC | GTCGCTTTGC 3720 | TGTTCGTGAT | ATGAGACAGA | CAGTTGCGGT |
| AAAGCAGTGG CCAGAAAGCT | ACAAGAAGGC 3780 | TGCTGGAGCT | GGCAAGGTCA | CCAAGTCTGC |
| CAGAAGGCTA CAGTGGTGGA | AATGAATATT 3840 | ATCCCTAATA | CCTGCCACCC | CACTCTTAAT |
I I
| AGAACGGTCT CAGAACTGTT TGTTTCAATT GGCCATTTAA GTTTAGTAGT | |
| AAAAGACTGG | 3900 |
| TTAATGATAA | CAATGCATCG TAAAACCTTC AGAAGGAAAG GAGAATGTTT |
| TGTGGACCAC | 3960 |
| TTTGGTTTTC | TTTTTTGCGT GTGGCAGTTT TAAGTTATTA GTTTTTAAAA |
| TCAGTACTTT | 4020 |
| TTAATGGAAA | CAACTTGACC AAAAATTTGT CACAGAATTT TGAGAC.CCAT |
| TAAAAAAGTT | 4080 |
| AAATGAGAAA | CCTGTGTGTT CCTTTGGTCA ACACCGAGAC ATTTAGGTGA |
| AAGACATCTA | 4140 |
| ATTCTGGTTT | TACGAATCTG GAAACTTCTT GAAAATGTAA TTCTTGAGTT |
| AACACTTCTG | 4200 |
| GGTGGAGAAT | AGGGTTGTTT TCCCCCCACA TAATTGGAAG GGGAAGGAAT |
| ATCATTTAAA | 4260 |
| GCTATGGGAG | GGTTTCTTTG ATTACAACAC TGGAGAGAAA TGCAGCATGT |
| TGCTGATTGC | 4320 |
| CTGTCACTAA | AACAGGCCAA AAACTGAGTC CTTGGGTTGC ATAGAAAGCT |
| TCATGTTGCT | 4380 |
| AAACCAATGT | TAAGTGAATC TTTGGAAACA AAATGTTTCC AAATTACTGG |
| GATGTGCATG | 4440 |
| TTGAAACGTG | GGTTAAAATG ACTGGGCAGT GAAAGTTGAC TATTTGCCAT |
| GACATAAGAA | 4500 |
| ATAAGTGTAG | TGGCTAGTGT ACACCCTATG AGTGGAAGGG TCCATTTTGA |
| AGTCAGTGGA | 4560 |
| GTAAGCTTTA | TGCCATTTTG ATGGTTTCAC AAGTTCTATT GAGTGCTATT |
| CAGAATAGGA | 4620 |
| ACAAGGTTCT | AATAGAAAAA GATGGCAATT TGAAGTAGCT ATAAAATTAG |
| ACTAATTACA | 4680 |
TTGCTTTTCT CCGAC
Claims (30)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Purifikovaná a izolovaná DNA obsahujúca transkrlpčnú regulačnú DNA škrečacieho EF-lcŕ.
- 2. DNA podľa nároku 1, kde uvedená regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEO ID NO:1.
- 3. DNA podľa nároku 1, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEO ID ΝΩ.1, ktorá Je schopná podporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
- 4. DNA podľa nároku 3, kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotidu približne 2114 do nukleotidu približne 3656 sekvencie uvedenej v SEO ID NO>1.
- 5. Hostiteľská bunka obsahujúca DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde uvedená DNA nie Je operatívne pripojená k EF-lcd kódujúcim sekvenclám.
- 6. Vektor obsahujúci DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde uvedená DNA nie Je operatívne pripojená k EF-lct kódujúcim sekvenclám.
7. Hostiteľská vektorom podľa nároku bunka transformovaná alebo transfekovaná 6. 8. Chlmerlcký polynukleotld zahrnujúci regulačnú DNA škrečacieho EF-1cí operatívne pripojenú k DNA sekvencii kódujúcej proteín, kde táto sekvencia kóduje proteín odlišný od škrečacieho EF-lcŕ. - 9. Chlmerlcký polynukleotld podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEO I NO>1.
- 10. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEO ID NOil, kde táto časť Je schopná podporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
- 11. Chimerický polynukleotid podľa nároku 10. kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotldu približne 2114 do nukleotidu približne 3656 sekvencie nukleotldov uvedenej v SEO ID NOil.
- 12. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde uvedená sekvencia DNA kódujúca proteín kóduje proteín endogénny vzhľadom na škrečacle bunky, ktorý Je odlišný od EF-lcŕ.
- 13. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8. kde sekvencia DNA kóduje proteín heterológny vzhľadom na škrečacle bunky.
- 14. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná chimerickým polynukleotidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až13.
- 15. Expresný plazmid obsahujúci chimerický. polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13.
- 16. Expresný plazmid podľa nároku 15, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SED ID NO:28.
- 17. Expresný plazmid podľa nároku 16, kde sekvencia nukleovej kyseliny uvedená v SEO ID NO:28 Je umiestená 3* vzhľadom na chimerický polynukleotid.
- 18. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 15.
- 19. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 16 alebo 17.
- 20. Plazmid pDEF2.
- 21. Plazmid pDEF14.
- 22. Plazmid pDEFl./ICM3H.2.
- 23. Plazmid pNEFl/ICM3L.3.
- 24. Plazmid pDEFl/F2GH.1.
- 25. Plazmid pNEFl/F2GI_. 1.
- 26. Plazmid pDEFl/CTN.l.
- 27. Plazmid PDEF2/HPH.4.
- 28. Plazmid pDEF10/l»IDC. 1.
- 29. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmldom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 28.
- 30. Spôsob zvyšovania transkripcie génu, ktorý Je predmetom záujmu, v hostiteľskej bunke, vyznačujúci sa tým, že sa DNA obsahujúca škrečaciu EF-loe regulačnú DNA integruje do
genómovej DNA uvedenej pripojenej ku génu, ktorý hostiteľskej bunky v polohe Je predmetom záujmu. operatívne 31. Spôsob podľa nároku 30. v y z n a č u J ú c i sa tým, že DNA, ktorá má byť integrovaná. ďalej zahrnuje * A zameriavaciu sekvenciu. v 32. Spôsob podľa nároku 30. v y z n a č u J ú c i sa tým. že hostiteľskou bunkou Je bunka vaječníka čínskeho chrčka. - 33. Spôsob podľa nároku 32. vyznačujúci sa tým. že gén, ktorý Je predmetom záujmu. Je endogénny vzhľadom na hostiteľskú bunku vaječníka čínskeho chrčka.r
- 34. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že požadovaný gén Je heterolúgny vzhľadom na bunky vaječníka čínskeho chrčka a Je stabilne integrovaná do genómovej DNA buniek vaječníka čínskeho chrčka.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/847,218 US5888809A (en) | 1997-05-01 | 1997-05-01 | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
| PCT/US1998/008906 WO1998049289A1 (en) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | HAMSTER EF-1α TRANSCRIPTIONAL REGULATORY DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK11899A3 true SK11899A3 (en) | 2000-05-16 |
| SK285664B6 SK285664B6 (sk) | 2007-05-03 |
Family
ID=25300098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK118-99A SK285664B6 (sk) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888809A (sk) |
| EP (2) | EP0920498B1 (sk) |
| JP (1) | JP2000513948A (sk) |
| CN (2) | CN100430477C (sk) |
| AT (1) | ATE318900T1 (sk) |
| AU (1) | AU742561B2 (sk) |
| BR (1) | BR9804896B1 (sk) |
| CZ (1) | CZ296544B6 (sk) |
| DE (1) | DE69833649T2 (sk) |
| DK (1) | DK0920498T3 (sk) |
| ES (1) | ES2263206T3 (sk) |
| HK (1) | HK1022719A1 (sk) |
| HU (1) | HU225764B1 (sk) |
| IL (1) | IL127897A (sk) |
| NO (1) | NO323853B1 (sk) |
| PL (1) | PL195604B1 (sk) |
| PT (1) | PT920498E (sk) |
| RU (2) | RU2249617C2 (sk) |
| SK (1) | SK285664B6 (sk) |
| WO (1) | WO1998049289A1 (sk) |
Families Citing this family (120)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183344B2 (en) * | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US6479256B1 (en) | 1998-03-04 | 2002-11-12 | Icos Corporation | Lectomedin materials and methods |
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| EP1325341A2 (en) * | 2000-10-12 | 2003-07-09 | Icos Corporation | Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins |
| AU2002230773A1 (en) * | 2000-12-18 | 2002-07-01 | Wyeth | Promoters and recombinant expression constructs |
| DE60236331D1 (de) * | 2001-07-04 | 2010-06-17 | Chromagenics Bv | DNS-Sequenzen mit Anti-Repressor-Aktivität |
| CA2489475C (en) * | 2002-06-14 | 2011-03-29 | Chromagenics B.V. | A method for simultaneous production of multiple proteins; vectors and cells for use therein |
| WO2003106674A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Chromagenics B.V. | Means and methods for regulating gene expression |
| ATE524559T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-09-15 | Chromagenics Bv | Methode zur verbesserung der proteinproduktion |
| DE60312039T2 (de) * | 2002-12-20 | 2007-11-08 | Chromagenics B.V. | Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können |
| CA2539434C (en) | 2003-09-23 | 2014-03-18 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for the correlation of single nucleotide polymorphisms in the vitamin k epoxide reductase gene and warfarin dosage |
| ES2384391T3 (es) | 2004-11-08 | 2012-07-04 | Chromagenics B.V. | Selección de células hospedantes que expresan proteína a altos niveles |
| EA010863B1 (ru) * | 2004-11-08 | 2008-12-30 | Хромагеникс Б.В. | Отбор клеток-хозяев, экспрессирующих белок на высоких уровнях |
| US20060195935A1 (en) * | 2004-11-08 | 2006-08-31 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US8999667B2 (en) * | 2004-11-08 | 2015-04-07 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US8039230B2 (en) * | 2004-11-08 | 2011-10-18 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| EP1819829A1 (en) * | 2004-12-08 | 2007-08-22 | ICOS Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| CA2601574C (en) | 2005-03-15 | 2014-12-02 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins |
| JP5171621B2 (ja) | 2005-07-07 | 2013-03-27 | シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド | フェニルアラニン側鎖修飾をｃ末端に有するモノメチルバリン化合物 |
| US8871720B2 (en) * | 2005-07-07 | 2014-10-28 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus |
| BRPI0617688A2 (pt) | 2005-10-21 | 2011-06-07 | Hoffmann La Roche | método para expressão recombinante de um polipeptìdeo |
| WO2007048601A1 (en) | 2005-10-28 | 2007-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Protein expression in rodent cells |
| PT1969127E (pt) * | 2005-12-21 | 2014-09-23 | Univ North Carolina | Processo de produção de proteínas dependentes da vitamina k biologicamente activos por métodos recombinantes |
| WO2007081336A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| WO2007131774A1 (en) | 2006-05-17 | 2007-11-22 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polypeptide producing cells |
| CA2656558A1 (en) | 2006-06-30 | 2008-01-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| US20090203077A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| CL2008000707A1 (es) | 2007-03-13 | 2008-09-22 | Hoffmann La Roche | Conjugado de polipeptidos antifusogenicos y polipeptidos derivados de la cabeza globular del factor del complemento c1q; composicion farmaceutica que lo comprende; su uso para tratar infecciones viricas; y metodo de produccion. |
| EP1975228A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-01 | Fachhochschule Mannheim | Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest |
| US20100081187A1 (en) | 2007-04-26 | 2010-04-01 | Griffith Michael J | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| MX2009013340A (es) * | 2007-06-29 | 2010-01-18 | Hoffmann La Roche | Mutante de cadena pesada que lleva a produccion de inmunoglobulina mejorada. |
| EP2592148B1 (en) | 2007-10-12 | 2018-09-12 | F. Hoffmann-La Roche AG | Protein expression from multiple nucleic acids |
| EP2227556B1 (en) | 2007-11-19 | 2014-08-27 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
| KR20110016440A (ko) | 2008-04-24 | 2011-02-17 | 셀틱 파르마 피이지 엘티디. | 연장된 반감기를 가진 제 ⅰⅹ 인자 접합체 |
| AU2009242453B2 (en) | 2008-05-02 | 2014-12-04 | Seagen Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| AU2010279294B2 (en) | 2009-08-06 | 2014-12-04 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Methods for improving recombinant protein expression |
| ES2699718T3 (es) | 2009-09-15 | 2019-02-12 | Medlmmune Ltd | Células para expresión transitoria y usos de las mismas |
| EP2494040B1 (en) * | 2009-10-30 | 2018-08-29 | Aptevo BioTherapeutics LLC | Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins |
| EP2339009A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-29 | Sandoz Ag | Cold inducible promoter sequences |
| BR112012024713B1 (pt) | 2010-03-31 | 2021-02-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | anticorpo humanizado, seus usos e composição farmacêutica que o compreende |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| SG10201604605VA (en) | 2010-11-04 | 2016-07-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-il-23 antibodies |
| EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
| US20150158934A1 (en) | 2011-09-09 | 2015-06-11 | Ucl Business Plc | Broadly neutralizing vhh against hiv-1 |
| LT3378535T (lt) | 2011-10-28 | 2023-02-27 | Prothena Biosciences Limited | Humanizuoti antikūnai, atpažįstantys alfa-sinukleiną |
| MY195289A (en) | 2011-11-16 | 2023-01-12 | Boehringer Ingelheim Int | Anti IL-36R Antibodies |
| SG11201403445YA (en) | 2011-12-22 | 2014-07-30 | Hoffmann La Roche | Full length antibody display system for eukaryotic cells and its use |
| JP6096802B2 (ja) | 2011-12-22 | 2017-03-15 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 発現ベクター要素の組み合わせ、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用 |
| KR102280111B1 (ko) | 2011-12-22 | 2021-07-21 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 발현 벡터 구성, 신규한 생산 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 그의 용도 |
| RU2642262C2 (ru) | 2012-01-27 | 2018-01-24 | Протена Биосайенсис Лимитед | Гуманизированные антитела, которые распознают альфа-синуклеин |
| EP2812702B1 (en) | 2012-02-10 | 2019-04-17 | Seattle Genetics, Inc. | Diagnosis and management of CD30-expressing cancers |
| KR20140131957A (ko) * | 2012-02-14 | 2014-11-14 | 포톨라 파마슈티컬스, 인코포레이티드 | Xa 인자 억제제에 대한 재조합 해독제를 제조하는 방법 |
| EP3326649B1 (en) | 2012-05-03 | 2022-02-09 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-il-23p19 antibodies |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| JP2015536148A (ja) | 2012-11-20 | 2015-12-21 | ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | 改変第ｉｘ因子タンパク質についての方法および組成物 |
| SI2971005T1 (sl) | 2013-03-12 | 2020-10-30 | Agc Biologics, Inc. | Izboljšana rekombinantna proteinska ekspresija z uporabo hibridnega CHEF1-promotorja |
| CN105121465B (zh) | 2013-03-13 | 2020-09-08 | 普罗塞纳生物科技公司 | Tau免疫疗法 |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| RU2535871C1 (ru) * | 2013-07-10 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
| US9951131B2 (en) | 2013-07-12 | 2018-04-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| US9850302B2 (en) | 2013-07-12 | 2017-12-26 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| EP3071974A2 (en) | 2013-11-19 | 2016-09-28 | Prothena Biosciences Limited | Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms |
| AU2015315834B2 (en) | 2014-01-31 | 2019-12-12 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel anti-BAFF antibodies |
| WO2015136471A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3 |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| EP3116907A1 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5 |
| DK3116911T3 (da) | 2014-03-12 | 2019-09-30 | Prothena Biosciences Ltd | Anti-mcam-antistoffer og tilhørende fremgangsmåder til anvendelse |
| US10562973B2 (en) | 2014-04-08 | 2020-02-18 | Prothena Bioscience Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| EP3708679A1 (en) | 2014-07-24 | 2020-09-16 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases |
| TWI718122B (zh) | 2015-01-28 | 2021-02-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI718121B (zh) | 2015-01-28 | 2021-02-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI711631B (zh) | 2015-01-28 | 2020-12-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| US10308705B2 (en) | 2015-02-06 | 2019-06-04 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Optimized human clotting factor VIII gene expression cassettes and their use |
| CN107530425A (zh) | 2015-04-14 | 2018-01-02 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 治疗疾病的方法 |
| CA3022547A1 (en) | 2015-05-12 | 2016-11-17 | Syntimmune, Inc. | Humanized affinity matured anti-fcrn antibodies |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| JP2018530540A (ja) | 2015-09-16 | 2018-10-18 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛症又は高安動脈炎の処置又は予防のための抗ｍｃａｍ抗体の使用 |
| TWI811716B (zh) | 2015-09-18 | 2023-08-11 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
| US11560418B2 (en) | 2015-10-20 | 2023-01-24 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor IX fusion proteins |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| MX2018012410A (es) | 2016-04-15 | 2019-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Metodos para tratar enfermedades inflamatorias. |
| CA3024421A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | Syntimmune, Inc. | Humanized affinity matured anti-fcrn antibodies |
| KR102471787B1 (ko) | 2016-05-02 | 2022-11-29 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 타우 인식 항체 |
| BR112018072394A2 (pt) | 2016-05-02 | 2019-02-19 | Prothena Biosciences Limited | anticorpos que reconhecem a tau |
| PT3452507T (pt) | 2016-05-02 | 2022-12-20 | Prothena Biosciences Ltd | Imunoterapia anti-tau |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2018007922A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| WO2018007924A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| WO2018007923A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| JP6818134B2 (ja) | 2016-09-29 | 2021-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ポリペプチド産生細胞を選択するための改善された方法 |
| EP4032906A1 (en) | 2016-10-14 | 2022-07-27 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Methods of treating diseases |
| WO2018183173A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti il-36r antibodies combination therapy |
| CN110881274A (zh) | 2017-05-02 | 2020-03-13 | 普罗塞纳生物科学有限公司 | 识别tau的抗体 |
| US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
| AU2017434556A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
| US20210062217A1 (en) | 2018-01-10 | 2021-03-04 | Agc Biologics, Inc. | Bidirectional chef1 vectors |
| CA3090321A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Stichting Vu | Inverse agonistic anti-us28 antibodies |
| WO2019156566A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Umc Utrecht Holding B.V. | Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain |
| WO2019226050A2 (en) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Wageningen Universiteit | Novel viral anti-infective reagents |
| WO2019235923A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases |
| KR20210027436A (ko) | 2018-06-29 | 2021-03-10 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-cd40 항체 |
| CN110904127A (zh) | 2018-09-18 | 2020-03-24 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
| EP3817773B1 (en) | 2018-11-26 | 2024-07-24 | Forty Seven, Inc. | Humanized antibodies against c-kit |
| WO2020130838A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Qvq Holding B.V. | Antibodies for preventing or treating candidiasis |
| CA3131531A1 (en) | 2019-03-03 | 2020-09-10 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| KR20210137520A (ko) | 2019-03-08 | 2021-11-17 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 항-il-36r 항체 제형 |
| CN114173809A (zh) | 2019-04-02 | 2022-03-11 | 伊缪纯有限公司 | 免疫刺激组合物及其用途 |
| AU2020267874A1 (en) | 2019-05-09 | 2021-10-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-Sema3A antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases |
| TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
| TW202126685A (zh) | 2019-09-24 | 2021-07-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 |
| IL298431A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-pd-1 antibodies |
| CA3183994A1 (en) | 2020-06-24 | 2021-12-30 | Philip James Dolan Iii | Antibodies recognizing sortilin |
| WO2022170008A2 (en) | 2021-02-05 | 2022-08-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il1rap antibodies |
| IL313655A (en) | 2021-12-22 | 2024-08-01 | Boehringer Ingelheim Int Gmbh | Anti-C3 antibodies and their antigen-binding fragments and their uses for the treatment of eyes or eye diseases |
| CN114540352A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-27 | 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 |
| WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
| WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3051411B2 (ja) * | 1989-03-14 | 2000-06-12 | 持田製薬株式会社 | 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド |
| US5266491A (en) * | 1989-03-14 | 1993-11-30 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment |
| ES2151463T5 (es) * | 1989-12-22 | 2012-10-29 | Merck Serono Sa | Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos |
| US5650294A (en) * | 1990-06-25 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α |
| AU664847B2 (en) * | 1991-05-15 | 1995-12-07 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous DNA targeting |
| CA2051085C (en) * | 1991-09-10 | 2001-08-21 | Shigekazu Nagata | Expression plasmids |
| TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
-
1997
- 1997-05-01 US US08/847,218 patent/US5888809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-01 CN CNB988009137A patent/CN100430477C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 DK DK98920128T patent/DK0920498T3/da active
- 1998-05-01 AU AU72770/98A patent/AU742561B2/en not_active Expired
- 1998-05-01 DE DE69833649T patent/DE69833649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 RU RU99101788/13A patent/RU2249617C2/ru active
- 1998-05-01 ES ES98920128T patent/ES2263206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 BR BRPI9804896-1B1A patent/BR9804896B1/pt active IP Right Grant
- 1998-05-01 JP JP10547444A patent/JP2000513948A/ja active Pending
- 1998-05-01 EP EP98920128A patent/EP0920498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 HU HU0004137A patent/HU225764B1/hu unknown
- 1998-05-01 CZ CZ0028099A patent/CZ296544B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 SK SK118-99A patent/SK285664B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 CN CNA2008101103936A patent/CN101570753A/zh active Pending
- 1998-05-01 IL IL12789798A patent/IL127897A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 EP EP06003954A patent/EP1676916A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-01 PL PL98331005A patent/PL195604B1/pl unknown
- 1998-05-01 AT AT98920128T patent/ATE318900T1/de active
- 1998-05-01 PT PT98920128T patent/PT920498E/pt unknown
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008906 patent/WO1998049289A1/en active Application Filing
-
1999
- 1999-01-04 NO NO19990025A patent/NO323853B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-15 HK HK00101582A patent/HK1022719A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-10 RU RU2004136574/13A patent/RU2004136574A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK11899A3 (en) | Hamster ef-1'alpha' transcriptional regulatory dna | |
| US5770421A (en) | Human ALK protein tyrosine kinase | |
| AU726386B2 (en) | Vectors and methods for tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens | |
| KR100996016B1 (ko) | 폴리뉴클레오티드 | |
| Leenders et al. | Role of the forkhead transcription family member, FKHR, in thymocyte differentiation | |
| WO1997005249A9 (en) | Extension of a protein-protein interaction surface to inactivate the function of a cellular protein | |
| US20010037016A1 (en) | Methods and compositions for screening for angiogenesis modulating compounds | |
| AU704341B2 (en) | Novel human chromosome 16 genes, compositions, methods of making and using same | |
| AU705640B2 (en) | Compositions and methods for mediating cell cycle progression | |
| US5759805A (en) | CD69 transcriptional regulatory elements | |
| US20010041353A1 (en) | Novel SSP-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor | |
| WO1998046756A9 (en) | Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor | |
| AU700224B2 (en) | Alpha-lactalbumin gene constructs | |
| CA2259145C (en) | Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna | |
| AU748461B2 (en) | Purification of high order transcription complexes from transgenic non-human animals | |
| AU3200195A (en) | Ikaros transgenic cells and animals | |
| EP1147184A1 (en) | Controlled expression of heterologous proteins in the mammary gland of a transgenic animal | |
| US20060288437A1 (en) | Zinc finger-based drug-dependent gene regulation system | |
| US20030138411A1 (en) | Gene expression in monocytes and macrophages | |
| AU721946B2 (en) | Novel human chromosome 16 genes, compositions, methods of making and using same | |
| Lin | Identification and characterization of genes involved in hematopoiesis using Cmyb mutant mice as a model system | |
| Han | Molecular cloning and functional testing of tissue-specific regulatory elements in human neutrophil elastase gene | |
| MXPA98004115A (en) | Purification of more elevated order transcription compositions from transgenic animals no huma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: CMC ICOS BIOLOGICS, INC., S.E. BOTHELL, WA, US Free format text: FORMER OWNER: ICOS CORPORATION, S. E. BOTHELL, WA, US Effective date: 20141010 |
|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20180501 |