SK10932001A3

SK10932001A3 - Mikrobiálny spôsob výroby pravastatínu

Info

Publication number: SK10932001A3
Application number: SK1093-2001A
Authority: SK
Inventors: Antonia Jekkel; Attila Konnya; Istvan Barta; Eva Ilkoy; Gyorgy Somogyi; G�Bor Ambrus; Gyula Horvath; Karoly Albrecht; Istvan M. Szabo; Nee Suto Julianna Mozes; Janos Salat; Attila Andor; Laszlo Birincsik; Sandor Boros; Ildiko Lang; Nee Igloy Margit Bidlo
Original assignee: Institute For Drug Research Ltd.
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2002-06-04
Also published as: EP1154979A4; CN1537935A; HK1042686A1; CN1260344C; AR023368A1; AU774438B2; KR100648541B1; IL144697A0; AU2004214559A1; TR200103127T2; PT1154979E; DE60019898D1; IS6036A; CN1177793C; MXPA01007807A; BR0009180A; DE60019898T2; AU3356700A; ES2240072T3; KR20060061406A

Description

Mikrobiálny spôsob výroby pravastatinu

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu výroby pravastatinu, konkrétne mikrobiálneho spôsobu výroby pravastatinu v priemyslovom rozsahu.

Doterajší stav techniky

Najrizikovejším faktorom aterosklerózy a stenózy koronárnych artérii je vysoká plazmatická koncentrácia cholesterolu. V posledných dvoch dekádach bola dôkladne študovaná reduktáza 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzýmu A (EC.1.1.1.34), ktorá je kľúčovým enzýmom regulujúcim rýchlosť syntézy cholesterolu. Pravastatín, zlúčenina vzorca I,

a iné príbuzné zlúčeniny (kompaktín, mevinolín, simvastatín) sú kompetitívne inhibítory HMG-CoA reduktázy (A. Endo et al.: J. Antibíot. 1976, 29, 1346-1348; A. Endo et al.: FEBS Lett.

1976, 72, 323-326; C.H. Kuo et al.: J. Org. Chem. 1983, 48, 1991).

Pravastatin prvýkrát izoloval M. Tanaka et al. (nepublikované výsledky) z moču psov v priebehu vyšetrovania metabolizmu kompaktinu (Arai, M. et al.: Sankyo Kenkyusyo Nenpo, 1988, 40, 1-38,). V súčasnosti je pravastatin činidlo znižujúce hladinu cholesterolu s najvýhodnejším mechanizmom účinku. Jeho významnou vlastnosťou je tkanivová selekcia, t.j. inhibícia syntézy cholesterolu vo dvoch hlavných miestach genézy cholesterolu, v pečeni a v tenkom čreve, zatiaľ čo v iných orgánoch je jeho účinok na intracelulárny enzým obtiažne postrehnuteľný. Limitujúci účinok mevinolínu a simvastatínu na biosyntézu cholesterolu je významný vo väčšine orgánov (T. Koga et al.: Biochim. Biophys Acta 1990, 1045, 115-120,).

Pravastatin sa vo svojej chemickej štruktúre významne odlišuje od mevinolínu a simvastatínu, ktoré majú lipofilnejší charakter. V prípade týchto dvoch zlúčenín je substituent naviazaný na C-l atóm uhlíka hexahydronaftalénového skeletu zakončený 6-členným laktónovým kruhom, zatiaľ čo v prípade pravastatínu je miesto laktónového kruhu prítomná biologicky aktívna, otvorená sodná soľ dihydroxy kyseliny. Iným významným štrukturálnym rozdielom je to, že miesto metylovej skupiny prítomnej v C-6 pozícii hexahydronaftalénového kruhu mevinolínu a simvastatínu je v pravastatíne prítomná hydroxylová skupina, čo vedie k ďalšiemu zvýšeniu jeho hydrofilného charakteru.

V dôsledku vyššie uvedených štrukturálnych odlišností môže pravastatin prenikať cez lipofilné membrány periférnych buniek v len minimálnej miere (A.T.M. Serajuddin et al.: <7. Pharm. Sci. 1991, 80, 830-834) .

Priemyslová výroba pravastatínu môže byť uskutočnená dvomi fermentačnými procesmi. V prvom spôsobe je mikrobiálne pripravený kompaktín, ktorý je potom behom druhej fermentácie za použitia sodnej soli kyseliny kompaktinovej ako substrátu premenený na pravastatin mikrobiálnou hydroxyláciou v 6βpozícii.

Podľa publikovaných patentov môže byť mikrobiálna hydroxylácia kompaktinu uskutočnená v rôznom rozsahu za použitia plesni rôznych rodov a za použitia vláknitých baktérii patriacich do rodu Nocardia, tried Actinomadura a Streptomyces (Belgická patentová prihláška č. 395090, Japonská patentová prihláška č. 5810572, US patenty č. 4537859 a 4346227, a publikovaná Európska patentová prihláška č. 0605230). Biokonverzia kompaktínového substrátu bola publikovaná v koncentrácii 500 μς/πιΐ za použitia vláknitých plesni, ako je Mucor hiemalis, Syncephalastrum nigricans, Cunninghamella echinulata, a v koncentrácii 2000-4000 μ9/πι1 pre kmene Nocardia, Actinomodura a Streptomyces patriace k organizmom bez bunečného jadra.

Obecným problémom v prípade výroby pravastatínu pri použití vláknitých plesní je, že v dôsledku antimykotického účinku kompaktinu mikroorganizmy netolerujú kompaktínový substrát v kultúre ani pri nízkych koncentráciách (Serizawa et al.: J. Antibiotics, 1983, 36, 887-891). Bunečná toxicita tohoto substrátu bola tiež pozorovaná pri hydroxylácii so Streptomyces carbophilus, ktorá bola intenzívne študovaná japonskými výskumníkmi M. Hosobuchi et al.: Biotechnology and Bioingineering, 1993, 42, 815-820).

Japonský autori sa pokúsili zlepšiť hydroxylačnú schopnosť kmeňa Streptomyces carbophilus pomocou techník rekombinantnéj

DNA. Systém cytochróm P-450 monooxygenázy je nutný pre hydroxyláciu kompaktinu (Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 1989, 184, 707-713) . Podlá autorov však bakteriálny systém cytochróm P-450 monooxygenázy netvorí jeden proteín, ale jedná sa o viacej preteínov zúčastňujúcich sa na transporte elektrónov, čo sťažuje použitie techník rekombinantnej DNA. Vývoj cenovo výhodných mikrobiálnych metód hydroxylácie pre výrobu pravastatínu je extrémne zložitý, komplexný problém.

Cielom predkladaného vynálezu je nový mikrobiálny spôsob prípravy pravastatínu z kompaktinu v priemyslovom rozsahu, ktorým by mohol byť pravastatín vyrábaný výhodnejšie ako doteraz. Behom výskumu sme sa pokúsili nájsť mikrobiálny kmeň s hydroxylázou, ktorý by mohol byť použitý pre mikrobiálnu transformáciu kompaktinu na pravastatín vo vysokých koncentráciách.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je mikrobiálny spôsobu prípravy zlúčeniny vzorca (I) (

(I)

HO' zo substrátu vzorca (II)

kde R znamená alkalický kov alebo amóniový ión;

kde uvedený spôsob zahrnuje stupne (a) kultiváciu vláknitej plesni kmeňa Mortierella maculata schopnej ββ-hydroxylácie zlúčeniny vzorca (II) v živnom médiu obsahujúcom asimilovatelné zdroje uhlíka a dusíka a anorganické soli; (b) pridávanie substrátu, ktorý má byť transformovaný, do kultúry Mortierella maculata; (c) fermentáciu substrátu do konca biokonverzie; (d) separáciu zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného média; a (e) izoláciu zlúčeniny vzorca (I).

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež biologicky čistá kultúra Mortierella maculata n. sp. E-97 uložená v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001266 a biologicky čistá kultúra jej mutanta, Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13, uložená v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001267.

Podrobný opis vynálezu

Behom vyhladávacieho programu sme testovali približne 5500 kmeňov bez bunečného jadra a s bunečným jadrom. Vybraných bolo kmeňov, ktoré boli schopné hydrolyzovať kompaktín. Z týchto kmeňov boli vláknité plesne najvhodnejšie pre produkciu pravastatinu z dôvodu najvyššej rezistencie voči kompaktinu v porovnaní s kmeňmi známymi z publikovaných patentov. Podlá taxonómických štúdii bolo zistené, že tento kmeň je novým predstavitelom druhu prináležiaceho do rodu Mortierella (Mortierella maculata n. sp.). Z vybraných plesní bol nový kmeň vybraný jednak pomocou metódy mutácia-selekcia a jednak pomocou indukcie hydroxylázy kmeňa, ktorý bol schopný hydroxylovať kompaktínový substrát na pravastatín vo vyšších koncentráciách, než bolo doteraz popísané. Ako mutagénne činidlá boli použité fyzikálne a chemické mutagény (UV žiarenie, metylmetánsulfonát, N-metyl-N'-nitro-Nnitrózoguanidín). Pre prípravu haploidných buniek bola po mutagenézii suspenzia spór nanesená na agarové platne obsahujúce benomyl a potom boli vzniklé kolónie za účelom indukcie hydroxylázy naočkované na agarové platne obsahujúce 100 μg/ml 8-de-(2-metyl-butyryl) kompaktín alebo kompaktín. Pomocou týchto metód bol z nového kmeňa pripravený mutantný kmeň, ktorý bol schopný premieňať kompaktín na pravastatín vo významne vyššej miere než pôvodný kmeň.

Behom optimalizačných pokusov sme určili zloženie najvýhodnejšieho inokula a najvýhodnejšieho biokonverzného média pre hydroxyláciu kompaktinu, rovnako ako optimálny spôsob pre opakované pridávanie kompaktinu vo vysokých koncentráciách.

Predkladaný vynález je preto založený na zistení, že kmene E-97 a E-97/15/13 izolovanej plesni Mortierella maculata, ktoré boli uložené pod prírastkovými číslami NCAIM(P)F 001266 a NCAIM(P)F 001267, v príslušnom poradí, v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Department of

Microbiology and Biotechnology, University of Agriculture and the Food Industry, Budapešť), sú za vhodných podmienok schopné vyrábať pravastatin vo vysokom rozsahu, zatiaľ čo nežiadúce príbuzné zlúčeniny, ako sú kyseliny 6a-hydroxy-kompaktínu, 2ahydroxy-kompaktínu, 8-de- (2-metyl-butyryl)-kompaktínu, 3α,5βdihydroxy-5,6-dihydro-izokompaktínu, 8a,β-hydroxy-kampaktínu a hydroxylované deriváty v pozíciách 2 a 3 2-metyl-butyrylového vedľajšieho reťazca kompaktínu sú získané behom biokonverzie len v malých alebo stopových množstvách. Preto sú tieto kmene zvlášť vhodné pre výrobu pravastatínu v priemyslovom merítku.

Keď sa vezme do úvahy, že ekonomická výroba aktívnej zložky je funkciou koncentrácie kompaktínového substrátu, potom je významné mať kmeň, ktorý bude tolerovať vysoké koncentrácie kompaktínu a pravastatínu. Ďalšou významnou časťou vynálezu je preto zistenie, že hydroxylačná schopnosť pôvodne izolovanej plesne môže byť zlepšená technikami mutácia-selekcia a indukciou enzýmu, a ďalej zistenie, že vývoj vhodnej metódy pre pridávanie substrátu hydroxylácie veľkých množstiev kompaktínu na pravastatin sa môže uskutočniť v jednom postupe. Nový mutantný kmeň označený Mortierella maculata n.sp. E97/15/13 je obzvlášť vhodný pre výrobu pravastatínu.

Taxonómické rysy nových izolovaných druhov plesní v porovnaní s najvýznamnejšími diagnostickými znakmi iných druhov Mortierella sú zhrnuté ďalej.

Taxonómický opis holotypného kmeňa Mortierella maculata nov. sp. E-97

Na médiu škrob-kaseín-sladový extrakt-agar sa aerálne mycélium dobre vyvíja (viac ako 10 μπι tlstá vrstva mycélia pokrývajúca substrát). Na počiatku sa javí ako ľahko zvlnená biela sieť hýf, v ktorých sa neskoršie objavia žltasté spórulujúce škvrny o priemere niekoľko mm (nový názov maculatus znamená škvrnitý) . Toto žltasté zafarbenie sa môže rozšíriť na väčší povrch aerálnej siete. Farba mycéliového substrátu je na Czapek-, krvný-Czapek-, tyrozín-, škrobkaseín-, sladový extrakt- atd. agaru obvykle bezfarbá alebo svetlo žltá. Farba mycéliového substrátu na médiu kvasinkový extrakt-glukóza-peptón červenavá. Produkcia difundovatelných a rozpustných pigmentov vo vyššie uvedených médiách nie je pravidlom a len občas sa na týchto médiách vyskytuje nevýznamné žltasté zafarbenie. Kolónie kmeňa E-97 môžu mať, v dôsledku produkcie prchavého oleja, podobne ako mnoho iných kmeňov Mortierella (okrem kmeňa Isabellina), veľmi charakteristický zápach.

Spórangiospóry, označené číslami 1 až 7 na obr. 1, často vznikajú lokálne na aerálnych hýfach (ale menej na substrátových) vo veľkom počte vo veľmi rôznych vzdialenostiach od seba. Nie sú rozvetvené, ale sú najčastejšie priame alebo zahnuté. Ich dĺžka je obvykle 60-80 μιη. Východzím miestom je vo valnej väčšine prípadov kratšia či dlhšia, ale výrazne zväčšená hyfálna časť aerálnej siete, od ktorej sú oddelené stenou. Spórangiospóry môžu byť sami o sebe napučané (niekedy významne) , ako je uvedené pod číslom 6 na obr. 1, ale vo smere spórangia sa postupne zužujú, od 5,0-9,0 μιη na 1,0-2,0 μιη. Významným taxonómickým rysom je to, že pod spórangiospórami sa nikdy nerozširujú (viď č. 8) .

Spórangia sú guľovité; v niektorých prípadoch sa jedná o ľahko sploštené sféry. Ich priemer je približne 6017,0 μιη, čo znamená, že sú relatívne malé v porovnaní so spórangiami iných druhov Mortierella. Spórangie môžu obsahovať mnoho spór, ale môžu tiež existovať spórangia obsahujúce len jednu spóru.

Spóry 9 sú cylindrické alebo oválne. Ich veľkosť je 3,0-5,0 x 1,5-2,0 pm. V jednotlivých spórach môžu byť prítomné jedna alebo dve malé tmavé sférické olejové kvapky 10. Kvôli veľmi ľahkému rozpadu steny spórangia sa vo vlhku spóry rýchlo rozptýlia. Po rozpade spórangia, niekedy na konci spórangiospór, môže byť pozorovaná jemná vidlicovitá kolumela a veľmi krátka rudimentárna (a nie typická) kolumela. Rozmnožovacie púčiky 15-28, ktoré sú sférické alebo cylindrické, sa môžu vyskytovať na väčšine diagnostických médiách. Ich obvyklá veľkosť je 10-25 pm. V kultúrach sa môžu tiež vyskytovať reťazce sférických rozmnožovacích púčikov 13, pučiacich buniek, interkalované rozmnožovacie púčiky 15-23, asociácie hýf, konkrétne špirálovitý rast jedného vlákna okolo iného 11,štruktúry podobné anastomózam a obrovské bunky atd. V aerálnom mycéliu môžu byť tiež pozorované veľké (50-250 pm v priemere) veľmi husté siete vlákien, v ktorých nie sú prítomné postrehnuteľné zygoty.

Kultúry kmeňa E-97 sú schopné redukovať dusičnany na dusitany, nehydrolyzujú škrob, eskulín, arginín alebo želatínu, ale hydrolyzujú Tween polysorbáty a nerozkladajú parafínové uhľovodíky. Kultúry kmeňa E-97 majú ureázovú aktivitu vykazujúcu dobrý rast pri pH medzi 7,0 a 9,0 a tolerujú maximálne 2% NaCl. Účinky xantínu, hypoxantínu, lecitínu, tyrozínu a adenínu sú negatívne. Silná produkcia kyselín kultúrami bola pozorovaná z glukózy, fruktózy, glycerínu a galaktózy, ale slabá alebo žiadna produkcia bola pozorovaná z xylózy, arabinózy, rafinózy, sórbitolu, inozitolu, inulínu atd. Slabý rast bol pozorovaný na pyruváte a acetáte, ale žiadny rast nebol zaznamenaný na benzoáte, salicyláte, citráte, laktáte, jantarane, vínnane a jablčnane. Dobrý rast bol pozorovaný pri použití glukózy a fruktózy ako jediného zdroja uhlíka v médiu. Testy využívania xylózy, arabinózy, ramnózy, sacharózy, arfinózy, manitolu a inozitolu boli negatívne. Kultúry nerozkladali celulózu.

Systematická pozícia: Kmeň E-97 patrí do čeľadi Mortierellaceae a je typickým predstaviteľom rodu Mortierella·. spórangie obsahujú obvykle mnoho spór, kolumela je obvykle extrémne redukovaná, rozmnožovacie púčiky sú často prítomné, výskyt zygot nebol zaznamenaný a kolónie majú veľmi charakteristický zápach. V rode Mortierella je kmeň E-97 typickým predstaviteľom skupiny Alpina. Táto je charakterizovaná veľmi krátkymi nerozvetvenými spórangiospórmi (maximálna dĺžka 200 μιη) a malými spórangiami (Zycha, H., und Siepmann, R.: Mucorales. Eine Beschreibung aller Gattungen und Artendieser Pilzgruppe, D-3301 Lehre, Verí, von J. Cramer, 1969). Medzi ostatnými členmi skupiny Alpina vykazuje kmeň E97 najväčšiu podobnosť s kmeňom M. thaxteri Bjorling 1936 a M. renispora Dixon-Stewart 1932. Údaje v tabuľke 1 však jasne ukazujú rozdiely v diagnostických charakteristikách kmeňa E-97 a týmito dvomi kmeňmi. Jedná sa preto o nový kmeň označený Mortierella maculata nov. sp. E-97.

Tabuľka 1: Porovnanie holotypného kmeňa Mortierella maculata

n.sp. s kmeňmi M. renispora a M. thaxteri podľa kľúčových diagnostických charakteristík

	Mortierella renispora	Mortierella kmeň E-97	Mortierella thaxteri
Odstup sporangiospór	Pravidelne, hýfy sú však širšie než normálne, laterálne z rozšírených hýf	Laterálne z rozšírených alebo normálnych hýf alebo neseparovaných častí substrátových hýf	Laterálne z rozšírených separovaných segmentov aerálnych hýf alebo neseparovaných častí substrátových hýf
Tvar a veľkosť sporangiospór	Postupne sa zmenšujúce od vrcholu 10 pm do 3 pm. Dĺžka približne 200 pm.	Väčšinou priame alebo zakrivené, bez vetvenia. Šírka sa postupne zmenšuje od konca: od 5-9 pm do 1,5-2,5 pm. DÍžka približne 60-80 pm. Na konci sa nikdy nerozširujú.	Dĺžka približne 60-90 pm. Šírka na začiatku približne 5-7 pm, na konci 1,5-2 pm. Hneď pod spórangiom rozšírenie.
Tvar a veľkosť spórangií	Bezfarbé, priemer je 25 pm.	Väčšinou sférické (priemer 6-17 pm), ale menej často sploštené. Obvykle obsahujú mnoho spór, výnimočne jednu spóru.	Sférické (12-20 pm v priemere). Obsahujú mnoho spór, ale na niektorých médiách obsahujú len jednu spóru.
Stena (membrána) spórangií	Rozšírená membrána. Po rozpade zostáva golieriková štruktúra.	Rozpadajúce sa. Zostáva vidlicovitý golierik.	Rozpadajúce sa. Zostáva spätne stočený malý golierik.
Tvar a veľkosť spór	Obličkovitého tvaru, hyaliná štruktúra, veľkosť 2x4 pm.	Cylindrické. Dĺžka (3-5 pm) je zhruba dvojnásobkom šírky (1,5-2 pm).	Elipsoidné hyaliné spóry 3,5-4 pm x 1,5x2 pm.
Rozmnožovacie púčiky	Vyskytujú sa na väčšine médií.	Časté na väčšine médií, najčastejšie na aerálnom mycéliu. Sférické alebo pretiahnuté (10-25 pm).	Interkaláme, oválne (10-14 pm) v substrátovom mycéliu.

	Mortierella renispora	Mortierella kmeň E-97	Mortierella thaxteri
Zygoty	Časté na všetkých diagnostických médiách. Priemer spoločne s prekrývajúcim vláknom je približne 500 μηι, bez neho približne 30 μιη.	Nezistené	Nepozorované
Husté lokality siete vlákien.		Veľké husto prepletené regióny hýf (50-250 μιη) sú časté, ale bez zygot.	V starých kultúrach veľké (priemer 100-125 μιη) žlto-zelené husté siete hýf, bez zygot.
Farba a charakteristický rast aerálneho mycélia	Voľné, skoro biele hýfy	Biele s žltkastými škvrnami	Najskôr ako pavučina, potom hustejšie

V spôsoboch prípravy pravastatinu podľa predkladaného vynálezu je výhodne použitá kultúra plesne Mortierella maculata n.sp. E-97 alebo jej mutácia označená ako E-97/15/13. Vybraný kmeň je výhodný kvôli rýchlemu rastu. Ako zdroj uhlíka lahko využíva glukózu, glycerín, fruktózu alebo galaktózu. Ako zdroj dusíka môže byť použitý kvasinkový extrakt, peptón, kaseín, mäsový extrakt, sójová múčka, výluh z kukurice, dusičnan sodný alebo síran amónny.

V kultivačnom médiu použitom pre výrobu pravastatinu môžu byť okrem zdroja uhlíka a dusíka prítomné anorganické soli, napríklad dihydrofosforečnan sodný, chlorid horečnatý, síran horečnatý, stopové prvky (železnaté, mangánové soli), aminokyseliny a činidlá proti peneniu.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa suspenzia spór pripravená z kultúry Mortierella maculata n.sp. E-97 alebo jej mutanta (NCAIM(P)F 001267) označeného E-97/15/13 na šikmom agare naočkuje do očkovacieho média; potom sa 10% očkovacej kultúry, ktorá sa kultivuje po dobu 3 dní pri teplote asi 2530 °C, výhodne približne 24-28 °C, najlepšie pri asi 28 °C, prenesie do biokonverzného média. Toto médium sa potom inkubuje po dobu 4 dní pri teplote asi 25-28 °C, lepšie asi 28 °C, a potom sa do kultúry pridá glukóza a sodná sol kyseliny kompaktínovej. V závislosti na koncentrácii kompaktínového substrátu pokračuje kultivácia po dobu 2-12 dní za aerobných podmienok pri udržiavaní pH medzi 5,5 a 7,5, výhodne 7,0. Biokonverzia sa uskutočňuje za miešania s rýchlosťou 400 otáčok za minútu a za prevzdušňovania s prietokom vzduchu 0,2 vvm.

Po biokonverzii kompaktínového substrátu sa behom fermentácie aplikuje vysokotlaká kvapalinová chromatografia (HPLC).

Pri tomto spôsobe sa vzorka média zriedi metanolom na dvojnásobok, odstredí sa a supernatant sa použije pre HPLC analýzu za nasledujúcich podmienok: Waters vybavenie pre analytickú HPLC; kolóna - Nucleosil Ci₈ 10 μη; detekčná vlnová dĺžka: 238 nm; injekčný objem 20 μΐ; prietok 1 nl/minútu; gradientová elúcia, eluenty: A = 0,05% vodný roztok kyseliny fosforečnej, B = acetonitril.

Gradientová elúcia

Čas (minúty)	Eluent A (%)	Eluent B (%)
0	70	30
20	0	100
25	0	100
25,1	70	30
35	70	30

Približné retenčné časy: pravastatín 8,6-9,0 minút; kompaktinová kyselina 11,6-12,0 minút; laktón pravastatinu 15,0-15,5 minút; kompaktin 16,5-17,0 minút.

Pri výrobe pravastatinu sa vodný roztok sodnej soli kompaktinovej kyseliny pridá v 96. hodine kultivácie. Pre tento krok sa substrát pripraví v pevnej forme nasledujúcim spôsobom. Laktón kompaktínu sa hydrolyzuje v 0,2 M roztoku hydroxidu sodného po dobu 2 hodín pri 40 °C, potom sa pH reakčnej zmesi upraví kyselinou chlorovodíkovou na 7,5 a neutralizovaný roztok sa vloží na Diaion HP-20 adsorpčnú kolónu; chlorid sodný vzniklý počas neutralizácie sa odstráni premytím kolóny vodou a potom sa sodná sol kompaktinovej kyseliny eluuje z kolóny 50% vodným roztokom acetónu. Potom sa eluát destiluje vo vákuu a vodný zbytok sa lyofilizuje. Po neutralizácii vodného roztoku alkalického hydrolyzátu kompaktínu môže byť tento roztok tiež použitý priamo ako substrát. V prípade sodnej soli kyseliny kompaktinovej sa obsah hydrolyzátu meria HPLC a roztok sa uchováva pri teplote 20 °C do použitia.

Vyššie pH média dosiahnuté 4. deň fermentácie je pre hydroxyláciu kompaktínového substrátu výhodnejšie. Pridávanie kompaktínového substrátu je zahájené vtedy, keď pH média presiahne 6,3. Štvrtý deň fermentácie sa pridá toľko sterilné filtrovaného vodného roztoku sodnej soli kompaktínovej kyseliny, koľko je treba k dosiahnutiu koncentrácie 500 μg/ml. Glukóza sa tiež pridáva do kultúry prostredníctvom 50% roztoku sterilizovaného pri 121 °C behom 25 minút nasledujúcim spôsobom: pokiaľ je pH média vyššie než 6,7, pridáva sa 1% glukózy vzhľadom k objemu média, pokiaľ však je pH v rozmedzí 6,3-6,7, pridáva sa 0,5% glukózy vzhľadom k objemu média. Sodná soľ kyseliny kompaktínovej sa spotrebuje z média behom hodín, ako bolo zistené HPLC analýzou transformácie.

V takomto prípade sa na každý ml média pridá ďalších 500 kompaktínu. Okrem kompaktínového substrátu sa tiež pridáva glukóza, spôsobom popísaným vyššie. Morfológia kultúry po 120 hodinách je charakterizovaná rastom malých guličiek (priemer guličky: 0,5-3,0 mm). Po 24 hodinách je z média spotrebovaná aj druhá dávka substrátu a preto sa pridá ďalšia dávka sodnej soli kyseliny kompaktínovej nutná pre dosiahnutie koncentrácie 500 gg/ml a zároveň sa pridá glukóza v množstve závislom na pH substrátu. Od 4. dňa fermentácie sa substrát a glukóza pridávajú denne popísaným spôsobom do 17-18. dňa fermentácie.

Pre získanie produktu z média je výhodné vziať do úvahy skutočnosť, že behom biokonverzie sa pravastatín tvorí ako kyselina, takže môže byť z filtrátu média izolovaný adsorpciou na kolóne obsahujúcej aniónovú iónomeničovú živicu. Pre izoláciu produktu je výhodné použiť silne bázickú aniónovú iónomeničovú živicu, ktorou je polystyrén-divinylbenzénový polymér obsahujúci kvartérne amóniové aktívne skupiny. Produkt môže byť adsorbovaný priamo z filtrátu média pomocou zmiešania filtrátu a aniónovej iónomeničovej živice v hydroxylovej forme. Produkt adsorbovaný na aniónovú iónomeničovú živicu môže byť eluovaný z kolóny zmesou acetón-voda obsahujúcou kyselinu octovú alebo chlorid sodný, výhodne zmesou acetónvoda (1:1) obsahujúcou 1% chloridu sodného. Frakcie obsahujúce pravastatín sa zmiešajú a acetón prítomný v eluáte sa oddestiluje vo vákuu. Pomocou 15% kyseliny sírovej sa upraví pH koncentrátu na 3,5-4,0 a vodný roztok sa extrahuje etylacetátom. Etylacetátový extrakt sa premyje vodou a suší sa bezvodým síranom sodným. Potom sa z pravastatínu pripraví laktónový derivát. Uzatvorenie laktónového kruhu sa uskutoční za miešania v suchom roztoku etylacetátu pri teplote miestnosti pomocou indukcie tvorby laktónového kruhu kyselinou trifluóroctovou prítomnou v katalytickom množstve. Postup transformácie sa overí chromatografiou na tenkej vrstve (TLC). Po dokončení tvorby laktónu sa etylacetátový roztok premyje najskôr 5% vodným roztokom hydrouhličitanu sodného a potom vodou, suší sa bezvodým síranom sodným a odparí sa vo vákuu. Odparený zbytok sa spracuje v roztoku acetónu aktívnym uhlím a potom sa znovu odparí a rekryštalizuje sa z alifatického alkoholu obsahujúceho 1-4 atómy uhlíka, výhodne z etanolu. Odparený zbytok z rekryštalizácie pôvodnej kvapaliny sa prečistí chromatografiou na silikagéle za použitia zmesi etylacetát-n-hexán s postupne stúpajúcou koncentráciou etylacetátu ako eluentu.

Z laktónu pravastatínu získaného po rekryštalizácii a po chromatografickom prečistení sa pravastatín získa hydrolýzou pri teplote miestnosti v acetóne pomocou ekvivalentného množstva hydroxidu sodného. Keď je tvorba sodnej soli pravastatínu dokončená, zriedi sa reakčná zmes vodou a neutralizuje sa a acetón sa oddestiluje vo vákuu. Pravastatín sa adsorbuje zo získaného vodného zbytku na kolónu obsahujúcu Dianon HP-20 živicu, premyje sa deionizovanou vodou a eluuje sa z kolóny zmesou acetón-deionizovaná voda. Frakcie obsahujúce pravastatín sa skombinujú, acetón sa oddestiluje a po lyofilizácii vodného zbytku sa získa pravastatín s vysokou čistotou, ktorý môže byť rekryštalizovaný zo zmesi etylacetát-etanol.

V priebehu celého postupu môže byť všetok pravastatín adsorbovaný. Behom uzatvárania laktónu sa môže tiež tvoriť 3ahydroxy-izo-kompaktín a iné vedľajšie produkty. Akokoľvek tieto reakcie znižujú výťažok izolácie, môžu byť takéto zlúčeniny oddelené vyššie popísanou prečisťovacou metódou, a tak pravastatín vyrobený týmto spôsobom môže byť vo farmaceutický prijateľnej kvalite.

Po dokončení biokonverzie môže byť pravastatín extrahovaný buď z fermentačného média, alebo z filtrátu získaného po separácii vláknitých buniek plesne. Vláknité bunky plesne môžu byť odstránené buď filtráciou, alebo odstredením; avšak, v priemyslovej výrobe je výhodné uskutočniť extrakciu celého média. Pred extrakciou sa pH fermentačného média, alebo filtrátu upraví na 3,5-3,7 pomocou anorganickej kyseliny, výhodne pomocou zriedenej kyseliny sírovej. Extrakcia sa uskutoční esterom kyseliny octovej a alifatickým alkoholom obsahujúcim 2-4 atómy uhlíka, výhodne etylacetátom alebo izobutylacetátom. Extrakčný krok by mal byť urobený veľmi rýchlo, aby sa eliminovala tvorba laktónového derivátu z pravastatínu pri kyslom pH.

Z extraktu v organickom rozpúšťadle môže byť pravastatín vo forme kyseliny prenesený do vodnej fáze ako sodná soľ. Napríklad, z etylacetátového extraktu'môže byť pravastatín extrahovaný 5% hydrouhličitanom sodným v objemovom pomere 1/10 a 1/20 alebo slabo alkalickou vodou (pH 7,5-8,0). Bolo zistené, že v čistej forme môže byť pravastatín získaný z vyššie uvedeného alkalického vodného extraktu chromatografiou na kolóne s použitím neiónovej adsorpčnej živice. Výhodným spôsobom je, keď sa najskôr odstráni rozpúšťadlo rozpustené vo vodnej fáze destiláciou vodného alkalického extraktu vo vákuu, a potom sa vodný extrakt spracuje na Diaion HP-20 kolóne.

Sodná soľ pravastatínu adsorbovaná na kolóne sa prečistí elúciou zmesi so zvyšujúcim sa obsahom acetónu vo vodnom roztoku a potom sa hlavné frakcie obsahujúce pravastatín kombinujú a zahustia sa vo vákuu. Vodný koncentrát sa prečistí ďalšou chromatografiou na inej Diaion HP-20 kolóne za zisku koncentrátu obsahujúceho čistý pravastatín, z ktorého môže byť po ďalšom prečistení na aktívnom uhlí a lyofilizáciou získaný pravastatín vo farmaceutický prijateľnej kvalite.

Tento izolační postup sa skladá z menej krokov než predošlý postup, pretože nezahrnuje tvorbu laktónu pravastatínu a jeho hydrolýzu. Behom izolácie je pravastatín vystavený len na obmedzenú dobu kyslému prostrediu, v ktorom je menej stabilný než v alkalických alebo neutrálnych roztokoch, a preto prakticky nie sú behom izolácie tvorené artefakty.

Ďalej bolo zistené, že chromatografia na Sephadex LH-20 Dextránovom gélu (hydroxypropylovaný derivát) je výhodne použitá na prečistenie pravastatínu. Pri použití tejto metódy môže byť vyrobený pravastatín s čistotou presahujúcou 99,5% (ako je zmerané HPLC).

Behom našich pokusov bolo zistené, že z extraktov v organickom rozpúšťadle, výhodne z etylacetátových alebo izobutylacetátových extraktov kultivačného média alebo filtrátu kultivačného média vláknitej plesne alebo vláknitej baktérie, ako je Mortierella maculata n. sp. kmeň schopný 6βhydroxylácie zlúčeniny obecného vzorca (II), môže byť pravastatín vyzrážaný vo forme kryštalickej soli so sekundárnymi amínmi. Ďalej bolo zistené, že pre tvorbu soli sú vhodné niektoré sekundárne amíny obsahujúce alkylové, cykloalkylové, aralkylové alebo arylové substituenty. Príklady použiteľných netoxických sekundárnych amínov sú dioktylamín, dicyklohexylamín, dibenzylamín. Izolácia solí s organickými sekundárnymi amínmi, napríklad dibenzylamínové soli, sa uskutočnila pridaním 1,5 ekvivalentu (vzhľadom k pravastatínu) dibenzylamínu do extraktu, potom zahustením extraktu destiláciou vo vákuu na 5% pôvodného objemu, potom pridaním .

ďalšieho dibenzylaminu do zahusteného materiálu v množstve 0,2 ekvivalentu. Z koncentrátu sa vyzráža kryštalická dibenzylamínová soľ. Kryštalický surový produkt sa prefiltruje a súši vo vákuu. .Potom sa získaný materiál prečistí aktívnym uhlím a rekryštalizuje sa z acetónu.

V postupe uvedenom vyššie, v ktorom sa uskutočňuje extrakcia organickým rozpúšťadlom a reextrakcia pri alkalickom pH, sa môže použiť spôsob izolácie založený na tvorbe soli so sekundárnym amínom miesto prečistenia na chromatografickej kolóne. V tomto prípade je výhodné vyzrážať dibsnzylamínovú soľ pravastatínu z izobutylacetátového extraktu získaného po okyslení alkalického vodného extraktu.

Soli pravastatínu s organickými sekundárnymi amínmi môžu byť transformované na pravastatín pomocou reakcie s hydroxidom sodným alebo alkoxylom sodným, výhodne etanolátom sodným.

Transformácia je podrobne popísaná pre dibenzylamínovú soľ pravastatínu. Rekryštalizovaná dibenzylamínová soľ sa suspenduje v zmesi izobutylacetát-voda a potom sa do suspenzie, za miešania a udržovania pH v rozmedzí 8,0-8,5, pridá ekvivalentné množstvo hydroxidu sodného vo vodnom roztoku. Po vymiznutí suspenzie sa fáze oddelia a vodný roztok obsahujúci pravastatín sa premyje dvakrát izobutylacetátom. Vodný roztok sa prečistí pomocou aktívneho uhlia a lyofilizuje sa so ziskom pravastatínu vo farmaceutický prijateľnej kvalite.

Jedným výhodným spôsobom transformácie dibenzylamínovej soli pravastatínu na pravastatín je suspendovanie rekryštalizovanej dibenzylamínovej soli v etanole, potom sa do suspenzie za miešania pridá ekvivalentné alebo o niečo vyššie množstvo etanolátu sodného, reakčná zmes sa potom zahusti vo vákuu a ku koncentrátu sa pridá acetón na vyzrážanie pravastatínu v kryštalickej forme.

Iným výhodným spôsobom transformácie dibenzylaminovej soli pravastatínu na pravastatin je rozpustenie rekryštalizovanej dibenzylaminovej soli vo zmesi etylacetát-etanol a pridanie do roztoku ekvivalentného alebo o niečo vyššieho množstva hydroxidu sodného v etanole, za vyzrážania pravastatínu.

Izolácia pravastatínu cez soľ so sekundárnym amínom je jednoduchšia ako akýkoľvek skôr známy postup izolácie. Behom izolácie sa netvoria artefakty a separácia pravastatínu od vedľajších produktov biokonverzie a od rôznych metabolických produktov biosyntetizovaných hydroxylujúcimi mikroorganizmami môže byť uskutočnená bez použitia akýchkoľvek chromatografických metód.

Štruktúry pravastatínu, laktónu pravastatínu a izolovaných solí pravastatínu so sekundárnymi amínmi boli overené metódami UV, IR, ^XH“NMR, ¹³C-NMR a hmotnostnou spektróskopiou.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 je ilustráciou fyzikálnych charakteristík Mortierella maculata č. sp. E-97.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález bude teraz popísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sú len ilustratívne a nijak neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Príklad 1

Suspenzia spór bola pripravená s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného získaného zo 7-10 dennej kultúry Mortíerella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) schopnej δβ-hydroxylácie kompaktínu na šikmom agare obsahujúcom sladový extraktkvasinkový extrakt a tato suspenzia bola použitá k naočkovaniu 100 ml očkovacieho média PI sterilizovaného v 500 ml Erlenmeyerovej banke.

Zloženie média PI:

Glukóza 50 g

Sójová múčka 20 g v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0 a potom sa uskutočnila sterilizácia pri 121 °C po dobu 25 minút. Kultúra sa trepala na rotačnej trepačke (250 rpm, amplitúda 2,5 cm) po dobu 3 dní pri teplote 28 °C, potom sa 10 ml získanej kultúry prenieslo do 100-100 ml biokonverzného média MU/4 v 500 ml Erlenmeyerovej banke sterilizovaného po dobu 25 minút pri 121

Zloženie média MU/4:

Glukóza

Sójová múčka kaseín-peptón

40, 0 g

20,0 g

1,0 g

Asparagín

Dihydrofosforečnan draselný

2,0 g

0, 5 g v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0 a potom sa uskutočnila sterilizácia pri 121 °C po dobu 25 minút.

Banky sa trepali na rotačnej trepačke (250 rpm, amplitúda

2,5 cm) po dobu 4 dní pri teplote 25 °C, potom sa 50-50 mg kompaktínoveho substrátu (sodná soľ kyseliny kompaktínovej) pridalo v sterilnej prefiltrovanej forme do kultúr a kultivácia pokračovala. Piaty deň sa do kultúr plesne pridalo ďalších 50-50 mg sodnej soli kyseliny kompáktínovej a fermentácia pokračovala po dobu ďalších 24 hodín. Obsah pravastatínu v médiu sa určil HPLC. Fermentácia pokračovala po dobu 168 hodín. Na konci biokonverzie bola priemerná koncentrácia pravastatínu vo fermentačnom médiu 620 μg/ml.

Príklad 2

V laboratórnom fermentačnom tanku o pracovnom objeme 5 1 sa pripravilo MU/S biokonverzné médium, zložky kultivačného média sa pridali v množstve odpovedajúcom 5 litrom, ale objem sa doplnil len do 4,5 litru a potom sa uskutočnila sterilizácia po dobu 45 minút pri 121 °C a naočkovanie 500 ml inokulačnej kultúry pripravenej podľa príkladu 1.

ml získanej kultúry sa prenieslo do 100-100 ml biokonverzného média MU/4 v 500 ml Erlenmeyerovej banke sterilizovaného po dobu 25 minút pri 121 °C.

Zloženie média MU/8:

Glukóza

Glycerín

Sójová múčka

Peptón

Dihydrofosforečnan draselný

Polypropylénglykol 2000

20,0 g

5, 0 g

0, 5 g

1,0 g v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0.

Fermentácie sa uskutočnila pri 28 °C za miešania pri 400 rpm a prevzdušňovania od dna rýchlosťou 60 litrov/hodinu po dobu 4 dní. Na konci 2. dňa po prenesení kultúry sa začala silno tvoriť pena, čo sa znížilo pridaním ďalšieho polypropylénglykolu 2000. Na začiatku fermentácie (16-20 hodín) sa pH znížilo z počiatočnej hodnoty 6,5 na 5,0-5,5, a potom sa 3. deň začalo zvyšovať a 4. deň dosiahlo hodnoty 6,3-7,5. Pridávanie kompaktínového substrátu mohlo začať vtedy, keď pH média dosiahlo hodnoty 6,3. Štvrtý deň fermentácie sa pridalo

2,5 g kompaktínového substrátu vo forme sterilné filtrovaného vodného roztoku. Objem 0,5-1,0% glukózy vzhladom k objemu média sa pridával do kultúry podía pH vo forme 50% roztoku sterilizovaného pri 121 °C po dobu 25 minút súčasne so substrátom. Po 24 hodinách sa kompaktínový substrát v kultúre spotreboval, čo sa určilo HPLC analýzou vzoriek odberaných z fermentačného tanku. V takomto prípade sa spôsobom popísaným vyššie pridali ďalšie 2,5 g substrátu a glukózy a biokonverzia pokračovala po dobu 24 hodín, kedy bol substrát premenený na pravastatín.

Po dokončení fermentácie sa 5,1 litrov média obsahujúceho

630 μg/ml pravastatínu prefiltrovalo cez filter. Dva litre vody sa pridali k separovanému mycéliu a potom sa mycéliová suspenzia miešala po dobu 1 hodiny a prefiltrovala sa. Tieto dva filtráty sa zmiešali a aplikovali sa za prietoku 500 ml/hodinu do kolóny obsahujúcej 138 g (50 ml) Dovex Al 400 (OH) živice (priemer kolóny 3,4 cm, výška lôžka 28 cm) a potom sa živicové lôžko premylo 300 ml deionizovanej vody. Potom sa uskutočnila elúcia z kolóny za použitia 1 litru zmesi acetónvoda (1:1) obsahujúcej 10 g chloridu sodného. Objem každej frakcie bol 100 ml. Eluát sa analyzoval nasledujúcou metódou chromatografie na tenkej vrstve (TLC): adsorbent: Kieselgel 60 F254 DC (Merck) hliníková fólia; vyvíjajúci systém: zmes acetón-benzén-kyselina octová (50:50:30); detekcia: kyselina fosfomolybdénová. R_f hodnota pre pravastatin je 0,5. Frakcie obsahujúce produkt sa kombinovali a acetón sa oddestiloval vo vákuu. Pomocou 15% kyseliny sírovej sa upravilo pH 400 ml koncentrátu na 3,5-4,0 a potom sa koncentrát extrahoval trikrát 150 ml etylacetátu. Etylacetátové extrakty sa kombinovali a sušili sa bezvodým síranom sodným. Potom sa z kyseliny pravastatínu pripravil laktón pravastatínu pridaním kyseliny trifluóroctovej v katalytickom množstve za stáleho miešania pri teplote okolia. Tvorba laktónu pravastatínu sa kontrolovala TLC (Rf hodnota laktónu pravastatínu vo vyššie uvedenom TLC systéme je 0,7). Po dokončení tvorby laktónu sa etylacetát premyl 2x50 ml 5% vodného roztoku hydrouhličitanu sodného, potom 50 ml vody, sušil sa bezvodým síranom sodným a odparil sa vo vákuu. Odparený zbytok získaný v množstve 3 g sa rozpustil v 100 ml acetónu a prečistil sa 0,3 g aktívneho uhlia. Potom sa aktívne uhlie odfiltrovalo a acetón sa odparil vo vákuu. Získaný surový produkt sa kryštalizoval z 20 ml etanolu. Vyzrážaný kryštalický laktón pravastatínu sa odfiltroval a premyl sa na filtre 30 ml n-hexánu a sušil sa pri teplote okolia vo vákuu. Týmto spôsobom sa získalo 1,5 g chromatograficky čistého laktónu pravastatínu. Teplota tavenia

140-142 °C, [α]ο= +194 ⁰ (c=0,5, metanol). Pôvodná kvapalina z kryštalizácie sa odparila vo vákuu a získalo sa 1,2 g zbytku, ktorý sa spracoval chromatografiou na kolóne obsahujúcej 24 g Kieselgel 60 adsorbent (priemer kolóny 1,6 cm, výška lôžka 20 cm). Surový produkt rozpustený v 5 ml benzénu sa prevrstvil na kolónu. Pre elúciu sa použila zmes etylacetát-n-hexán, v ktorej sa postupne zvyšoval obsah etylacetátu. Laktón pravastatínu mohol byť eluovaný z kolóny zmesou 60% etylacetátu a 40% n-hexánu. Frakcie sa kontrolovali TLC za použitia etylacetátu a n-hexánu (9:1) ako vyvíjajúceho rozpúšťadla. Frakcie obsahujúce laktón pravastatínu sa kombinovali a odparil sa vo vákuu. Týmto spôsobom sa získalo 0,3 g čistého produktu, ktorého kvalita bola rovnaká ako kvalita laktónu pravastatínu získaného kryštalizáciou.

Dve šarže laktónu pravastatínu sa kombinovali a sodná soľ sa pripravila nasledujúcim spôsobom: 1,8 g laktónu pravastatínu sa rozpustilo vo 20 ml acetónu a za miešania sa pridalo 4,5 ml 1 M vodného roztoku hydroxidu sodného a potom sa roztok miešal po dobu pol hodiny pri teplote miestnosti. Po dokončení tvorby soli sa do zmesi pridalo 20 ml vody a roztok sa neutralizoval a acetón sa potom odparil vo vákuu. Vodný koncentrát sa spracoval chromatografiou na kolóne naplnenej 150 ml Diaion HP20 živice (priemer kolóny 2,6 cm, výška lôžka 30 cm). Pre elúciu sa použila zmes acetón-deionizovaná voda, v ktorej sa koncentrácia acetónu zvyšovala po 5% krokoch. Pravastatín mohol byť eluovaný z kolóny zmesou acetón a deionizovaná voda obsahujúcou 15% acetónu. Frakcie sa analyzovali TLC. Frakcie obsahujúce produkt sa kombinovali a acetón sa odparil vo vákuu. Lyofilizáciou vodného zbytku sa získalo 1,3 g pravastatínu. Chromatograficky čistý produkt sa kryštalizoval zo zmesi etanol a etylacetát.

Teplota tavenia: 170-173 °C (rozklad) [cc]^D2o= +156° (c=0,5, vo vode)

Ultrafialové absorpčni spektrum (20 μς/ιηΐ, v metanole) : X_max = 231, 237, 245 nm (log ε -4,263; 4,311; 4,136)

Infračervené absorpčni spektrum (KBr): vOH 3415, vCH 2965, vC =0 1730, vCOO 1575 cm'¹.

1H-NMR spektrum (D₂0, δ, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH₃) ; 5,92, dd, J=10,0 a 5,4 Hz, 1H (3-H) ; 5,99, d, J=10,0 Hz, 1H (4-H) ; 5,52, br 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m, 1H (P-H), 3,65, m, 1H (b-H) ; 1,05, d, 3H (2’-CH₃); 0,82, t, 3H (4 ' -H₃) .

¹³C-NMR spektrum (D₂O, δ, ppm): 15,3, q(2-CH₃); 139,5, d (C—3) ; 129,5, d, (C-4); 138,1, s (C-4a) , 127,7, d (C-5) ; 66,6, d (C6); 70,1, d (C—8) ; 182,6 s (COCH) ; 72,6, d (C-P) ; 73,0, d (Co); 182,0, s (C-ľ) 18,8; q (2'-CH₃); 13,7, q (C-4’).

Pozitívne FAB hmotnostné spektrum (charakteristické ióny): [M+Na] ⁺ 469; [M+H]⁺ 447.

Negatívne FAB hmotnostné spektrum (charakteristické ióny): [M-H]⁺ 445, [M-Na]⁺ 423, m/z 101 (kyselina 2-mety-máselná-H]“

Príklad 3

V laboratórnom fermentačnom tanku o pracovnom objeme 5 1 sa spôsobom popísaným v príklade 1 pripravilo MU/4 biokonverzné kultivačné médium. Zložky kultivačného média sa pridali v množstve odpovedajúcom 5 litrom, ale objem sa doplnil len do

4,5 litru. Potom sa uskutočnila sterilizácia po dobu 45 minút pri 121 °C a naočkovanie 500 ml inokulačnej kultúry pripravenej podía príkladu 1. Fermentácie sa uskutočnila pri 25 °C za miešania rýchlosťou 300 rpm a prevzdušňovaním 50 litrov/hodinu po dobu 4 dní. Potom sa do kultúry pridalo 5 g kompaktínového substrátu a biokonverzia sa uskutočnila spôsobom podľa príkladu 2.

Po dokončení biokonverzie sa 4,9 litrov média, ktoré obsahovalo 660 μ9/πι1 pravastatínu, prefiltrovalo a separované mycélium sa premylo 2x1 litrom deionizovanej vody. Pomocou 20% kyseliny sírovej sa upravilo pH kombinovaného filtrátu o objemu 5,6 litru na 3,5-3,7 a potom sa kyslý filtrát miešal s 2750 ml etylacetátu po dobu 30 minút. Potom sa fáze separovali. Vodná fáza sa znovu extrahovala 4740 ml etylacetátu a potom sa pomocou 1 M hydroxidu sodného upravilo pH zmesi vody s etylacetátom na 7,5-8,0. Po 20 minútovom miešaní sa fáze separovali a etylacetátový extrakt sa extrahoval 2x235 ml deionizovanej vody spôsobom popísaným vyššie. Kombinovaný slabo alkalický vodný roztok o objeme 280 ml sa zahustil na objem 280 ml. Koncentrovaný vodný roztok sa vniesol do chromatografickej kolóny (pomer výška : priemer = 6,5) naplnenej Diaion HP-20 (Mitsubishi Co., Japan) neiónovou živicou. Adsorpcia na kolónu bola uskutočnená pri prietoku 250-300 ml/hodinu a kolóna sa potom premyla 840 ml deionizovanej vody. Potom sa kolóna eluovala v nasledujúcom poradí: 800 ml 5%, 1000 ml 10%, 500 ml 15% a 500 ml 20% acetónu vo vode. Behom elúcie sa odberali 50 ml frakcie, ktoré sa analyzovali TLC spôsobom uvedeným v príklade 2. Frakcie obsahujúce pravastatín ako hlavnú zložku sa zmiešali a získaný roztok sa zahustil vo vákuu na objem 260 ml. Zahustený vodný roztok sa spracoval na kolóne obsahujúci 260 ml Diaion HP-20 živice. Po adsorpcii pravastatínu na kolónu sa kolóna premyla 790 ml deionizovanej vody, potom sa eluovala vodným roztokom acetónu v 260-260 ml podieloch s postupne sa zvyšujúcou koncentráciou acetónu (2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 a 20,0%) . Behom chromatografie na kolóne sa odberali 25 ml frakcie a obsah pravastatínu vo frakciách sa¹ analyzoval spôsobom popísaným vyššie. Frakcie obsahujúce pravastatín ako jedinú zložku podlá TLC sa kombinovali a odparili sa vo vákuu. Potom sa do koncentrovaného vodného roztoku (približne 30 ml) pridalo 0,3 g aktívneho uhlia a pravastatín sa prečisťoval pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Potom sa filtráciou z roztoku odstránilo aktívne uhlie a filtrát sa lyofilizoval. Týmto spôsobom sa získalo 1,62 g pravastatínu v lyofilizovanej forme.

Príklad 4

Zo šikmej kultúry Mortierella maculata n.sp. E-97 /NCAIM(P)F 001266) kultivovanej po dobu 10-12 dní sa pripravila suspenzia spór v 5 ml sterilného 0,9% roztoku chloridu sodného, a tato suspenzia sa použila pre naočkovanie 500 ml VHIG inokulačného média, ktoré bolo sterilizované v 3000 ml Erlenmeyerovej banke.

Zloženie VHIG média:

Glukóza 30,0g

Mäsový extrakt 8,0g

Kvasinkový extrakt 1,0g

Tween-80 (polyoxyetylén(20)sorbitán-monooleát) 0,5g v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0 a potom sa uskutočnila sterilizácia pri 121 °C po dobu 25 minút. Kultúra sa kultivovala po dobu 3 dní na rotačnej trepačke (250 rpm, amplitúda 2,5 cm) a potom sa získané inokulum kultúry použilo pre naočkovanie laboratórneho fermentačného tanku obsahujúceho biokonverzné kultivačné médium PK v 5 litrovom pracovnom obj emu.

Zloženie PK média:

Glukóza	40,0	g
Peptón	5, 0	g
Sójová múčka	20, 0	g.
K₂HPO₄	2, 0	g
KH₂PO₄	1,0	g
NaN0₃	2,0	g
KC1	0,5	g

v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0. Po naočkovaní, sa kultivácia, pridanie substrátu a biokonverzia uskutočnili rovnako ako v príklade 2 a pravastatín sa potom izoloval z média, v ktorom bola jeho koncentrácia na konci fermentácie 650 μg/ml.

Na konci fermentácie sa pH 4,9 litrov média obsahujúceho

650 μg/ml pravastatinu upravilo za miešania 2M hydroxidom sodným na 9,5-10,0 a potom sa pH po jednej hodine miešania upravilo na 3,5-3,7 pomocou 20% kyseliny sírové. Potom sa kyslý roztok extrahoval 2,45 litrami etylacetátu. Fáze sa separovali a pomocou odstredenia sa z emulzifikovanej organickej fáze pripravil číry extrakt. Médium sa znovu extrahovalo 2x1,22 litrami etylacetátu vyššie uvedeným spôsobom. Etylacetátové extrakty sa kombinovali a pridalo sa 0,4 litrov deionizovanej vody a potom sa IM hydroxidom sodným upravilo pH zmesi na 8,0-8,5. Fáze sa separovali a etylacetátová fáza sa extrahovala 2x0,2 1 deionizovanej vody a pH sa upravilo na pH 8,0-8,5 spôsobom popísaným vyššie.

Pomocou 20% roztoku kyseliny sírovej sa za miešania upravilo pH slabo alkalického roztoku obsahujúceho pravastatín na 3,53,7. Získaný kyslý roztok sa extrahoval 4x0,2 litrami etylacetátu. Kombinované etylacetátové extrakty sa premyli

2x0,2 litrami deionizovanej vody, potom sa do etylacetátového roztoku pridalo 150 mol% dibenzylamínu - vypočítané podlá obsahu pravastatínu zmeraného HPLC. Etylacetátový roztok sa zahustil vo vákuu na objem 0,2 litru. Do získaného koncentrátu sa pridalo ďalších 20 mol% dibenzylamínu a vyzrážaný roztok sa uchovával cez noc pri teplote 0-5 °C. Vyzrážaná dibenzylamínová sol pravastatínu sa premyla na filtre chladným etylacetátom a potom dvakrát n-hexánom, a nakoniec sa sušila vo vákuu pri teplote 40-50 °C. Získaný surový produkt (3,9 g) sa rozpustil v 100 ml metanolu pri teplote miestnosti a potom sa roztok prečistil 0,45 g aktívneho uhlia. Potom sa metyalkoholový extrakt zahustil vo vákuu. Odparený zbytok sa rozpustil v 120 ml acetónu pri vonkajšej teplote 62-66 °C a roztok sa potom ochladil na teplotu miestnosti. Rekryštalizácia ďalej pokračovala cez noc pri teplote 0-5 °C. Vyzrážané kryštály sa prefiltrovali a potom sa premyli na filtroch dvakrát chladným acetónom a dvakrát n-hexánom. Rekryštalizovaná dibenzylamínová sol pravastatínu sa suspendovala vo zmesi 160 ml isobutylacetátu a 80 ml deionizovanej vody. Za miešania sa potom do suspenzie pridal v ekvivalentnom množstve hydroxid sodný. Po zmiznutí suspenzie sa fáze separovali a roztok obsahujúci pravastatín sa premyl 2x30 ml izobutylacetátu. Získaný vodný roztok sa prečistil aktívnym uhlím. Vodný filtrát sa zahustil na objem približne 20 ml. Získaný vodný roztok sa vniesol do chromatografickej kolóny (dĺžka : priemer = 22) naplnenej 0,4 litrami Sephadex LH-20 gélu (dodávateľ: Pharmacia, Sweden). Behom chromatografie sa ako eluent použila deionizovaná voda a odberali sa 20 ml frakcie. Frakcie sa analyzovali TLC a frakcie obsahujúci pravastatín tiež HPLC za použitia vyššie popísaných metód. Frakcie obsahujúce čistý pravastatín sa zmiešali a lyofilizovali sa. Týmto spôsobom sa získalo 1,75 g pravastatínu, ktorého čistota bola podľa HPLC vyššia ako 99,5%.

Príklad 5

Zo šikmej kultúry Mortierella maculata n.sp. E-97 /NCAIM(P)F 001266) kultivovanej po dobu 10-12. dní sa pripravila suspenzia spór v 5 ml sterilného 0,9% roztoku chloridu sodného, a táto suspenzia sa použila pre naočkovanie 500 ml inokulačného média, za použitia spôsobu popísaného v príklade 4. V laboratórnom fermentačnom tanku o pracovnom objeme 5 litrov sa PC/4 biokonverzné kultivačné médium sterilizovalo po dobu 45 minút pri 121 °C a naočkovalo sa inokulačnou kultúrou.

Zloženie média PC/4:

Sladový extrakt	5, 0
Sójová múčka	1,0
Peptón	1,0
Kukuricový výluh	1,0
MgSO₄ x 7 H_z0	0,1

v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0. Po naočkovaní, sa kultivácia, pridanie substrátu a biokonverzia uskutočnili rovnako ako v príklade 2 a získalo sa 5,1 litrov média s koncentráciou 610 μς/πιΐ pravastatínu.

Z média sa spôsobom podľa príkladu 4 získalo 3,7 g surovej dibenzylamínovej soli pravastatínu, z ktorej sa po rekryštalizácii získalo 2,9 g dibenzylamínovej soli pravastatínu. Rekryštalizovaná dibenzylamínová soľ pravastatínu sa suspendovala v 45 ml etanolu a potom sa za miešania pridalo 110 mol% hydroxidu sodného v IM etanolovom roztoku hydroxidu sodného. Roztok sa miešal po dobu 1/2 hodiny a potom sa pridalo 0,3 g aktívneho uhlia a roztok sa miešal ďalšiu pol hodinu. Roztok sa prefiltroval a filtrát sa zahustil na 15 ml. Ku koncentrátu sa pri teplote 56-60 °C pridalo 60 acetónu. Získaný roztok sa ochladil na teplotu miestnosti a cez noc sa uchovával pri teplote +5 °C. Potom sa zrazenina odfiltrovala, premyla sa 2x20 ml acetónu, 2x20 ml etylacetátu a 2x20 ml n-hexánu a nakoniec sa sušila vo vákuu. Získaných 1,7 g surového pravastatinu sa rozpustilo v etanole, prečistilo aktívnym uhlím a kryštalizovalo zo zmesi etanolu s etylacetátom. Týmto spôsobom sa získalo 1,54 g pravastatinu, ktorý bol identický ako produkt v príklade 2.

Príklad 6

Rovnako ako v príklade 4 sa zo šikmej kultúry Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) kultivovanej po dobu 710 dní naočkovalo 500 ml inokulačného média MI sterilizovaného v 3000 ml Erlenmeyerovej banke a previedla sa inkubácia pri 28 °C po dobu 3 dní na rotačnej trepačke.

Zloženie média MI:

Glukóza	40, 00	g
Kaseín	5, 00	g
KC1	0, 50	g
NaNO₃	3,00	g
KH₂PO₄	2,00	g
MgSO₄ x 7 H₂0	0, 50	g
FeSO₄ x 7 H₂O	0,01	g
v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 6,0 a sterilizácia sa uskutočnila pri 121 °C po dobu 35 minút. Získaná kultúra sa naočkovala do 5 litrov biokonverzného média P12 sterilizovaného vo fermentačnom tanku.

Zloženie média P12:

Glukóza	10,0 g
Sladový extrakt	50,0 g
Kvasinkový extrakt	5,0 g
Kukuricový výluh	5,0 g
MgSO₄ x 7 H₂O	1,0 g
Tween 80	0, 5 g

v 1000 ml vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 7,0 a potom sa sterilizácia uskutočnila pri 121 °C po dobu 45 minút. Fermentácia, pridávanie substrátu a biokonverzia sa uskutočnili rovnako ako v príklade 2. Po dokončení biokonverzie sa pravastatín prítomný v koncentrácii 620 μς/ml izoloval nasledujúcim spôsobom.

Pomocou 2M hydroxidu sodného sa pH 5,15 litrov média obsahujúceho 620 μg/ml pravastatínu upravilo na 9,5 a zmes sa miešala pri teplote miestnosti po dobu 1 hodiny. Médium sa prefiltrovalo a mycélium sa premylo 1x2 litrami a potom 1x0,5 litrom vody. Filtráty sa kombinovali a pH vodného roztoku sa upravilo na 3,7 pomocou 20% kyseliny sírovej a zmes sa extrahovala 2,5 litrami a potom 1,5 litrom etylacetátu. Etylacetátové extrakty sa kombinovali, premyli sa 2x0,5 litrami vody a pridalo sa 1,95 g dicyklohexylaminu. Etylacetátový extrakt sa zahustil pri 40 °C na 200 ml za redukovaného tlaku a do koncentrátu sa znovu pridalo 0,195 g dicyklohexylaminu a zmes sa miešala pri 15 °C po dobu 6 hodín. Vyzrážaný kryštalický materiál sa prefiltroval, premyl sa 20 ml a 15 ml etylacetátu a sušil sa pri 40 °C. Týmto spôsobom sa získalo 3,51 g surového produktu. Po rekryštalizácii surového produktu v zmesi acetón a etanol sa získalo 3,05 g dicyklohexylamínovej soli pravastatínu (teplota tavenia 162

168 °C) , ktorá sa premenila na pravastatín spôsobom podľa príkladu 5.

Príklad 7

Fermentácia, pridávanie substrátu a biokonverzia sa uskutočnili s kmeňom Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) spôsobom popísaným v príklade 2. Pravastatín získaný biokonverziou sa izoloval z média nasledujúcim spôsobom.

Päť litrov kultivačného média obsahujúceho 650 μ5/πι1 pravastatínu sa prefiltrovalo cez filtračnú tkaninu. Mycélium plesne sa zmiešalo s 2 litrami 0,1 M hydroxidu sodného na dobu 1 hodiny a potom sa zmes prefiltrovala. Dva filtráty sa zmiešali a pH zmesi sa upravilo 15% kyselinou sírovou na 3,54,0. Potom sa roztok extrahoval 2x1,8 1 etylacetátu. Kombinované etylacetátové fáze sa premyli 800 ml vody. Pridalo sa 400 ml deionizovanej vody a pH zmesi sa upravilo na 8,0-8,5 pomocou IM hydroxidu sodného. Zmes sa miešala po dobu 15 minút a potom sa fáze separovali. K etylacetátovej fázy sa pridalo 300 ml vody a pH sa upravilo na 8,0-8,5. Po 15 minútovom miešaní sa fáze separovali. Do etylacetátovej fáze sa znovu pridalo 300 ml vody a pH sa upravilo na 8,0-9,5. Zmes sa potom miešala po dobu 15 minút. Dve fáze sa znovu separovali. Všetky vodné fáze sa kombinovali a pH sa upravilo 15% kyselinou sírovou na 3,5-4,0 a potom sa uskutočnila extrakcia 3x300 ml etylacetátu. Kombinované etylacetátové extrakty sa premyli 150 ml vody, sušili sa pomocou bezvodého síranu sodného a prefiltrovali sa. Potom sa 150 mol% dioktylamínu - vzhľadom k obsahu pravastatínu - pridalo do etylacetátového extraktu. Etylacetát sa odparil na približne 1/10 objemu a až do vyzrážania sa pridával acetón. Zmes sa ponechala pri teplote 5 °C cez noc. Zrazenina sa odfiltrovala na filtre G-4, premyla sa 20 ml acetónu a potom 20 ml n-hexánu a sušila sa vo vákuu pri teplote miestnosti. Získaných 3,3 g surovej dioktylamínovej soli pravastatínu sa rekryštalizovalo z 20 ml acetónu, čo viedlo k zisku 2,7 g čistej dioktylamínovej soli pravastatínu. Teplota tavenia: 143-146 °C. Dioktylamínová sol pravastatínu sa premenila na pravastatín spôsobom popísaným v príklade 5.

Príklad 8

Mutantný kmeň Mortierella maculata n.sp. E-97/15/13 (NCAIM(P)F 001267) bol pripravený indukciou hydroxylačnej schopnosti Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266), ktorá je schopná 6p-hydroxylácie kompaktínu, pomocou pokusov mutácia-selekcia a indukciou enzýmu.

Nami izolovaný kmeň Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) bol kultivovaný na MS šikmom agare pri 28 °C po dobu 7 dní.

Zloženie agarového média MS:

Glukóza 4 g Sladový extrakt 10 g Kvasinkový extrakt 4 g Agar 20 g v 1000 ml destilované vody.

Spóry sa vymyli zo šikmých kultúr 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného a po prenesení suspenzie spór do sterilnej Petriho misky sa spóry ožiarili ultrafialovým svetlom po dobu 1 minúty. Potom sa do suspenzie spór pridal N-metyl-N-nitro-Ň-nitrózoguanidín v konečnej koncentrácii 2000 μg/ml. Potom sa suspenzia preniesla do 100 ml Erlenmeyerovej banky a trepala sa pri teplote 28 °C rýchlosťou 150 rpm po dobu 20 minút. Potom sa spóry sedimentovali odstredením rýchlosťou 4000 rpm po dobu minút a suspendovali sa v sterilnom 0,9% roztoku chloridu sodného. Suspenzia sa naočkovala na agarovú platňu MU-VB obsahujúcu 10μg/ml· benomylu a 1% defibrinovanej krvi.

Zloženie agarového média MU-VB:

Glukóza 40,0 g

Asparagín 2,0 g Peptón 2,5 g Dihydrofosforečnan draselný 0,5 g Agar 20,0 g v 990 ml destilovanej vody; po sterilizácii sa médium doplnilo 10 ml hovädzej krvi a 10 mg benomylu.

Agarové platne sa inkubovali pri 28 °C po dobu 7 dní a potom sa vyrastené kolónie náhodne vybrané preniesli do testovacích skúmaviek obsahujúcich agarové médium PS.

Zloženie agarového média PS:

Glukóza	40	g
Mykologický peptón	10	g
Agar	15	g

v 1000 ml destilovanej vody.

Pred sterilizáciou sa pH média upravilo na 5,6 - 5,7. Sterilizácia sa uskutočnila pri 121 °C po dobu 20 minút.

Šikmé kultúry sa inkubovali pri 28 °C po dobu 12 dní a ich produkcia pravastatínu sa testovala postupom uvedeným v príklade 1. Mutantný kmeň Mortierella maculata n.sp. E97/15/13 bol vybraný týmto spôsobom a dosahoval 60% konverzie sodnej soli kyseliny kompaktínovej v koncentrácii 1000 μς/ml na pravastatin.

Hydroxyláza kmeňa Mortierella maculata n.sp. E-97/15/13 bola indukovaná kultiváciou na MU-VB agare obsahujúcom 100 μg/ml 8-de- (2-metyl-butyryl) kompaktínu a/alebo kompaktínu. Náhodne vybrané kolónie sa preniesli do induktoru obsahujúceho MU-VB šikmé média. Produkcia pravastatínu v kultúrach bola testovaná spôsobom popísaným v príklade 1 s tým rozdielom, že pridávanie kompaktínového substrátu v množstve 500 ug/ml sa uskutočňovalo od 4. dňa fermentácie po dobu ďalších 11 dní a kompaktín sodný sa pridával postupne v priebehu dvanásť dní, kedy bol úplne premenený na pravastatin. Na konci biokonverzie uskutočnenej v 50 kultúrach sa z 30 g kompaktínu sodného získalo 18,5 g pravastatínu, ako bolo zmerané HPLC. Získanie pravastatínu z kombinovaných fermentačných médií bolo uskutočnené nasledujúcim spôsobom.

Po dokončení fermentácie sa pH 5,5 litrov média obsahujúceho pravastatin v koncentrácii 3360 μg/ml upravilo na 3,5-3,7 pomocou 20% roztoku kyseliny sírovej. Potom sa kyslý roztok extrahoval 2,75 litrami etylacetátu. Fáze sa oddelili a číry extrakt sa pripravil odstredením emulzifikovanej organickej fáze. Médium sa extrahovalo ešte dvakrát 1,37 litrami etylacetátu, ako bolo vyššie popísané. Kombinované etylacetátové extrakty sa premyli 2 x 1,15 litrami deionizovanej vody, a potom sa do etylacetátového roztoku pridalo 150 mol% dibenzylamínu - vypočítané podľa obsahu pravastatínu zmeraného HPLC. Etylacetátový roztok sa zahustil vo vákuu na objem 0,23 litru. Do získaného koncentrátu sa pridalo ďalších 20 mol% dibenzylamínu a vyzrážaný roztok sa uchovával cez noc pri teplote 0-5 °C. Vyzrážaná dibenzylamínová soľ pravastatínu sa prefiltrovala a potom sa zrazenina premyla suspendovaním v chladnom etylacetáte a potom dvakrát v nhexáne, a nakoniec sa sušila vo vákuu pri teplote 40-50 °C. Získaný surový produkt (22,4 g) sa rozpustil v 0,67 litru acetónu pri teplote 62-66 °C a potom sa roztok prečistil 2,2 g aktívneho uhlia. Po prečistení sa acetónový filtrát zahustil vo vákuu na objem 0,56 litru. Kryštály vyzrážané z koncentrátu sa znovu rozpustili pri vyššie uvedenej teplote a roztok sa ochladil na teplotu miestnosti. Rekryštalizácia potom pokračovala cez noc pri teplote 0-5 °C. Vyzrážané kryštály sa prefiltrovali a potom sa premyli dvakrát chladným acetónom a dvakrát n-hexánom. Rekryštalizovaná dibenzylaminová sol pravastatínu sa sušila vo vákuu pri teplote 40-50 °C. Získaná dibenzylaminová sol pravastatínu (14,8 g) sa rozpustila pri teplote 40-44 °C v 740 ml zmesi etylacetát-etanol (9:1) a potom sa do roztoku pridalo 110 mol% hydroxidu sodného za zisku IM etanolového roztoku. Miešanie získaného vyzrážaného roztoku pokračovalo po dobu 1,5 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa zrážanie dokončilo chladením ľadom po dobu 1-1,5 hodiny. Zrazenina sa potom odfiltrovala a premyla sa dvakrát 150 ml chladného etylacetátu a 2x150 ml n-hexánu a nakoniec sa sušila vo vákuu pri teplote 40-50 °C. Získaný pravastatín sa rozpustil v etanole, prečistil sa 1,0 g aktívneho uhlia a potom sa rekryštalizoval zo zmesi etanol-etylacetát. Týmto spôsobom sa získalo 9,4 g pravastatín s fyzikálnymi konštantami, ktoré odpovedali hodnotám uvedeným v príklade 2.

Je treba si uvedomiť, že akokoľvek boli popísané niektoré výhodné uskutočnenia, vynález tiež zahrnuje variácie a modifikácie popísaných uskutočnení. Rozsah vynálezu je preto obmedzený len pripojenými patentovými nárokmi.

Claims

1. Mikrobiálny spôsob prípravy zlúčeniny vzorca (I) zo substrátu vzorca (II) kde R znamená alkalický kov.alebo amóniový ión; vyznačujúci sa tým, že zahrnuje stupne:

(a) kultiváciu vláknitej plesne kmeňa Mortierella maculata schopnej δβ-hydroxylácie zlúčeniny vzorca (II) v živnom médiu obsahujúcom asimilovatelné zdroje uhlíka a dusíka a anorganické soli;

(b) pridávanie substrátu, ktorý má byť transformovaný, do kultúry Mortierella maculata;

(c) fermentáciu substrátu do konca biokonverzie;

(d) separáciu zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného média; a (e) izoláciu zlúčeniny vzorca (I).

2 . Spôsob podľa nároku 1 v y z n a č u j úci sa tým, že médiom je živné médium. 3. Spôsob podľa nároku 2 v y z n a č u j úci sa tým, že

stupeň separovania zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného média sa uskutočni adsorpciou na aniónovej iónomeničovej živici.

4. Spôsob podľa nároku 2 vyznačujúci sa tým, že stupeň separovania zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného média sa uskutoční extrakciou organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, po ktorej nasleduje príprava jej laktónového derivátu alebo soli sekundárneho amínu ako medziproduktu.

5. Spôsob podľa nároku 2 vyznačujúci sa tým, že stupeň separovania zlúčeniny vzorca (I) z kultivačného média sa uskutoční prečistením alkalického vodného extraktu získaného z extrakcie fermentačného média organickým rozpúšťadlom pomocou chromatografie na neiónovej adsorpčnej živici.

6. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že kmeň Mortierella maculata je Mortierella maculata n. sp. E-97 kmeň uložený v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapešť, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001266.

7. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že kmeň Mortierella maculata je Mortierella maculata n. sp. E97/15/13, uložený v National Collection of Agricultural and

Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001267.

8. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že enzým hydroxyláza kmeňa použitého pre transformáciu je indukovaný 8-de(2-metyl-butyryl)kompaktínom alebo kompaktínom.

9. Spôsob podľa nároku 2 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (II) je ako substrát pridávaná do kultúry súčasne s pridávaním živín, a tým, že pridávanie živín závisí na pH kultúry a je v množstve 0,5 - 0,1 % vzhľadom k objemu média.

10. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že stupeň fermentácie sa uskutoční na médiu obsahujúcom zdroj uhlíka vybraný zo skupiny zahrnujúcej glukózu, fruktózu a glycerín.

11. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že stupeň fermentácie sa uskutoční na médiu obsahujúcom zdroj dusíka vybraný zo skupiny zahrnujúcej sójovú múčku, peptón, kaseín, kvasinkový extrakt a mäsový extrakt.

12. Spôsob podľa nároku 2 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (I), ktorá sa tvorí behom biokonverzie, sa separuje z kultivačného média adsorpciou z filtrátu média a z vodného výplachu mycélia na aniónovej iónomeničovej živici, elúciou zlúčeniny vzorca (I) zo živice, úplnou transformáciou zlúčeniny vzorca (I) na laktónovú formu, izoláciou laktónového derivátu, hydrolýzou laktónového derivátu hydroxidom sodným a odsolením zlúčeniny vzorca (I) na neiónovej adsorpčnej živici.

13. Spôsob podľa nároku 12 vyznačujúci sa tým, že pre separáciu zlúčeniny vzorca (I) z filtrátu média sa použije aniónová iónomeničová živica obsahujúca polystyrén-divinylbenzénový polymér obsahujúci kvartérne amóniové aktívne skupiny.

14. Spôsob podľa nároku 4 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (I), ktorá sa tvorí behom biokonverzie, sa z média extrahuje vo forme kyseliny, kde médium bolo okyslené na pH 3,5-3,7, alebo z filtrátu média, organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou.

15. Spôsob podľa nároku 14 vyznačujúci sa tým, že uvedeným organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou je etylacetát.

16. Spôsob podľa nároku 14 vyznačujúci sa tým, že uvedeným organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou je izobutylacetát.

17. Spôsob podľa nároku 5 vyznačujúci sa tým, že uvedená zlúčenina vzorca (I) sa z organického rozpúšťadla extrahuje vo forme sodnej soli vodným roztokom hydroxidu sodného a je prečistená na neiónovej adsorpčnej živici.

18. Spôsob podlá nároku 14 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (I) sa z extraktu vyzráža v kryštalickej forme pomocou sekundárneho amínu obsahujúceho alkylové, cykloalkylové, aralkylové alebo arylové substituenty.

19. Spôsob podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že kryštalická soľ so sekundárnym amínom sa suspenduje vo zmesi Ci-4 alkyl esteru kyseliny octovej a vody; do suspenzie sa pridá ekvivalentné množstvo hydroxidu sodného vo vodnom roztoku tak, že sa vytvorí organická fáza a vodná fáza; organická a vodná fáza sa oddelia; vodná fáza sa premyje izobutylacetátom a potom sa prečistí aktívnym uhlím; a vodný roztok sa lyofilizuj e.

20. Spôsob podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že uvedeným alkylesterom je izobutylester.

21. Spôsob podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že kryštalická soľ so sekundárnym amínom sa suspenduje v alkohole obsahujúcom 1-4 atómy uhlíka; zo suspenzie sa pridaním etanolového roztoku hydroxidu sodného pripraví roztok zlúčeniny vzorca (I); a zlúčenina vzorca (I) sa vyzráža z roztoku acetónom.

22. Spôsob podľa nároku 21 vyznačujúci sa tým, že uvedeným alkoholom obsahujúcom 1-4 atómy uhlíka je etanol.

23. Spôsob podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že uvedená kryštalická soľ sekundárneho amínu sa rozpustí vo zmesi Ci-4 alkylesteru alkánkarboxylovej kyseliny obsahujúcej 14 atómy uhlíka a alkoholu obsahujúceho 1-4 atómy uhlíka; a z roztoku sa zlúčenina vzorca (I) vyzráža v kryštalickej forme pridaním hydroxidu sodného.

24. Spôsob podľa nároku 23 vyznačujúci sa tým, že uvedenou zmesou je zmes etylacetátu s etanolom.

25. Spôsob podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že pravastatín sa izoluje z fermentačného média prostredníctvom dibenzylamínovej soli zlúčeniny vzorca (I) vo forme kyseliny.

26. Spôsob podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že kyselinový derivát zlúčeniny vzorca (I) sa prečistí cez dicyklohexylamínovú soľ.

27. Spôsob podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že kyselinový derivát zlúčeniny vzorca (I) sa prečistí cez dioktylamínovú soľ.

28. Spôsob podľa nároku 19 vyznačujúci sa tým, že zlúčenina vzorca (I) sa prečistí na aspoň 99,5%, ako sa zmeria HPLC za použitia gélovej chromatografie.

29. Spôsob podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že uvedený kmeň Mortierella maculata je kultivovaný pri teplote približne 25 °C až približne 30 °C.

30. Biologicky čistá kultúra kmeňa Mortierella maculata n. sp. E-97 uloženého v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001266.

31. Biologicky čistá kultúra kmeňa Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 uloženého v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001267.

32. Mortierellová kultúra schopná δβ-hydroxylácie zlúčeniny vzorca (II) (II) kde R znamená alkalický kov alebo amóniový ión, ktorá sa skladá v podstate z nového kmeňa Mortierella maculata n. sp. E-97 uloženého v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001266.

33. Mortierellová kultúra schopná 6P-hydroxylácie zlúčeniny vzorca (II) (II) kde R znamená alkalický·kov alebo amóniový ión, ktorá sa skladá v podstate z nového kmeňa Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 uloženého v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Maďarsko, pod prírastkovým č. NCAIM(P)F 001267.

34. Sodná sol pravastatínu v kryštalickej forme.

35. Sodná sol pravastatínu podľa nároku 34, ktorej teplota tavenia sa pohybuje v rozmedzí približne od 170 °C do 173 °C.

36. Spôsob prípravy sodnej soli pravastatínu v kryštalickej forme vyznačujúci sa tým, že zahrnuj e:

a) vytvorenie roztoku obsahujúceho pravastatín a sodný katión v nižšom alifatickom alkohole;

b) pridanie etylacetátu do uvedeného roztoku;

c) kryštalizáciu sodnej soli pravastatínu z uvedeného roztoku.

37. Spôsob podľa nároku 36 vyznačujúci sa tým, že nižším alifatickým alkoholom je etanol.

1/1