SK108496A3 - Pharmaceutical composition and its use to inhibit thrombin formation - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobov použitia fibrínovo špecifickej protilátky na inhibíciu tvorby trombu in vivo. Poskytuje tiež farmaceutické prípravky a kity pre takéto použitie.

Doterajší stav techniky

1. Tvorba trombu v dôsledku choroby alebo chirurgického zákroku

Krvné zrazeniny alebo tromby sa tvoria v miestach poškodenia krvných ciev. Klinické manifestácie patologickej trombózy alebo trombotického ochorenia sú výrazne odlišné a zahrňujú hlbokú žilnú trombózu (DVT) a arteriálnu a venóznu trombózu.

Tromboembolizmus a trombotické komplikácie iných vaskulárnych ochorení (napríklad aterosklerózy) môžu vyústiť do oklúzie hlavných artérii, čo vedie k orgánovej ischémii a k sprievodným život ohrozujúcim stavom, ako sú cerebrovaskulárna príhoda (mŕtvica), infarkt myokardu, atď.

Okrem toho, invazívne chirurgické zákroky, vrátane, ale bez ohraničenia na balónovú angioplastiku a orgánovú transplantáciu (prirodzenú i umelú) môžu podporovať tvorbu trombov. Napríklad balónová angioplastika, metóda používaná na vyčistenie upchaných artérii, môže skutočne poškodiť stenu arteriálnej cievy, s následnou reoklúziou navodenou prostredníctvom usadenia novovzniknutého trombu. Podľa jedného pozorovania sa pri perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike vyskytuje reoklúzia cievy v 25 až 35 % prípadov. Gimple, L. V. et al., Circulation, 86: 1536 až 46 (1992). Podobne je to tiež v Sarembock, J. H. et al., Circulation, 80: 1029 až 40 (1989); a Ip, . J. H. et al., JACC,

17: 77Β až 88B (1991). Skutočne sa v jednej správe uvádza, že mechanizmus angioplastiky, ktorý sa vo väčšine prípadov rozvinie do endoteliálneho poškodenia a plakového pretrhnutia alebo disekcie (cit.), je veľmi podobný s procesom, ktorý vedie k akútnym ischemickým syndrómom. Tenaglia, A. N., Ann. Rev. Med., 44: 465 až 79, 466 (1993).

Keďže sa ukázalo, že liečba antikoagulanciami, ako napríklad heparínom a kumarínom, má malý alebo žiadny vplyv na zabránenie reoklúzie po angioplastike (Ip, J. H. et al., JACC, 17: 77B až 88B (1991) a keďže takéto antikoagulačné liečby často predstavujú pre pacientov riziko sytémového krvácania (Physican’ s Desk Reference, 47. vyd., Medical Economics Data (1993), bolo by potrebné zaviesť nové, lokálne špecifické postupy liečby na inhibíciu alebo zabránenie tvorby trombov v prípadoch predchádzajúceho vaskulárneho ochorenia a pri invazívnych chirurgických zákrokoch.

2. Hemostatický systém

Hemostatický mechanizmus, pri ktorom dochádza k tvorbe trombu predstavuje mechanizmus komplexnej fyziologickej odpovede organizmu, ktorý sa podieľa na oprave poškodenia porušenej krvnej cievy. Viď. Harker, L. A. a Mann, K. G., Trombóza a fibrinolýza v : Trombóza pri kardiovaskulárnych poruchách, Fuster, V. a Verstraete, M. (eds), V. B. Saunders Co. (1992), s. 1 až 16.

Hemostáza sa dosiahne pomocou vzájomných interakcií medzi stenou poškodenej krvnej cievy, doštičkami a koagulačným systémom. Viď. Fúrie, B. a Fúrie B. C., Celí, 53: 505 až 18 (1988).

Úloha koagulačného systému spočíva v poskytnutí nerozpustnej fibrínovej matrice na stabilizáciu a zakotvenie doštičkovej zátky, ktorá sa nahromadila na subendoteliálnej štruktúre porušenej cievy v mieste poškodenia. Koagulácia je amplifikačný proces, ktorý zahrňuje reťazec enzymatických reakcií, pri ktorých sa následne aktivujú proenzýmy (zrážacie faktory), aby sa vytvorili aktívne enzýmy. Tvorba fibrí3 novej matrice z cirkulujúceho fibrinogénu je výsledkom tejto kaskádovej sekvencie enzymatických reakcií, výsledkom ktorých je explozívna produkcia enzymatického trombínu v požadovanom mieste, konverzia fibrinogénu na fibrín pôsobením trombínu a prekríženie fibrínu faktorom XlIIa, čím dôjde k tvorbe trombu.

Sekvenciu reakcií možno zjednodušene vyjadriť nasledovným procesom zloženým z troch krokov:

Trombín krok 1 - Proteolýza: Fibrinogén ->

Monoméry fibrínu (DesAA, Des AABB) + FPA a FPB krok 2 - Polymerizácia: Monoméry fibrínu ->

<Rozpustné polyméry fibrínu (neprekrížené a prekrížené) krok 3 - Zrážanie: Rozpustné polyméry fibrínu ->

Nerozpustná zrazenina fibrínu

Fibrinogén sa skladá z troch párov nerovnakých polypeptidových reťazcov: Αα, Ββ a t. Viď. L. Stryer, Biochemistry,

3. vyd., V. H. Freeman a spol., New York (1988), s. 249. V začiatočnom kroku, kde sa fibrinogén konvertuje na fibrín, znázornený vyššie v kroku 1, sa fibrinogén štiepi trombínom, aby sa uvoľnil fibrinopeptid A (FPA) z koncových amino- zakončení dvoch fibrinogén Aa- reťazcov. Zostávajúca časť molekuly fibrinogénu je monomér fibrínu, označený ako DesAA. Ako bolo tiež uvedené v kroku 1, trombín súčasne (ale pomalšie) štiepi fibrinopeptid B (FPB) z aminokoncových zakončení dvoch fibrinogénových Ββ-reťazcov. Zostávajúca časť molekuly fibrinogénu po tomto druhom štiepení je tiež monomérom fibrínu, označeným ako DesAABB. Ako výsledok uvoľňovania FPA a FPB nové koncové amino zakončenia vyčnievajú na a a reťazcoch monoméru fibrínu. Viď. V. Nieuwenhuizen, Blood

Coagulation and Fibrinolysis, 4: 93 až 96 (1993). V kroku 2 monoméry fibrínu začínajú spontánne tvoriť nekovalentné inter-monomérové väzby ( nie prekrížené), aby sa vytvoril rozpustný polymér. Faktor XIIla pôsobí na tento polymér enzymatickým pridávaním kovalentných prekrížených väzieb medzi jednotkami monoméru fibrínu. Prekrížený polymér môže zostať rozpustným, ale v určitom bode počas procesov polymerizácie a prekríženia sa stáva polymér fibrínu nerozpustný, za tvorby fibrínovej zrazeniny, ako je naznačené v kroku 3.

Rozpustné polyméry fibrínu sú okamžitými prekurzormi zrazeniny fibrínu. Skutočne sa zistilo, že plazmatické hladiny rozpustných polymérov fibrínu sú zvýšené u jedincov s hroziacou alebo existujúcou trombózou. Dôkaz a meranie množstva týchto polymérov v krvi, najmä DesAABB rozpustných polymérov fibrínu sa ukázalo byť vhodným ako indikátor pre začiatočnú tvorbu krvnej zrazeniny. Viď Nieuwenhuizen, s. 94; a Marder et al., US Patent č. 5, 206, 140.

3. Protilátky smerujúce proti zložkám hemostatického systému

Prirodzene sa vyskytujúce, ako aj laboratórne získané protilátky zohrali úlohu pri charakterizovaní zložiek hemostatického systému a pri objasňovaní ich funkcií.

Marciniak, E. a Greenwood, M. F., Blood, 53: 81 až 92 (1979) opisujú prípad inhibítora zrážania krvi v sére u 14-ročného pacienta s Downovým syndrómom, ktorý bol prítomný v IgG frakcii, a ktorý inhiboval enzymatické uvoľňovania fibrinopeptidu A z fibrinogénu. Hoots, V. K. et al., New Engl. J. Med., 304: 857 až 61 (1981) uvádzajú prípad

13-ročného pacienta s chronickou agresívnou hepatitídou a poruchou koagulácie, kde sa porucha pripísala prítomnosti protilátok v krvi pacienta, ktoré vykazovali vysokú afinitu k fibrinogénu a fibrínu a ktoré inhibovali polymerizáciu monomérov fibrínu, teda zabraňovali tvorbe fibrínového gélu.

Sóla, B. et al., Thromb. Res., 29: 643 až 53 (1983) opisujú vytvorenie hybridómovej bunkovej línie, ktorá vylučuje monoklonové protilátky špecifické pre fibrinogén aj fibrín. Elms, M. J. et al. , Thromb. Haemostas. , 50: 591 až (1983) opisujú prípravu hybridómovej bunkovej línie, ktorá vylučuje protilátky, ktoré rozpoznávajú antigénový determinant v D diméri, špecifickom fragmente, ktorý pochádza z degradácie skríženého fibrínu. Hui, K. Y. et al. , Science, 222: 1129 až 32 (1983) a Scheefers-Borchel, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7091 až 95 (1985) opisujú použitie syntetických hexapeptidov reprezentujúcich amino- zakončenie a a reťazca ako antigénov a použitie humánneho fibrínu na produkciu monoklonových protilátok, ktoré sa nadväzujú na fibrín dokonca v prítomnosti fibrinogénu. Kudryk, B. et al. , Mol. Immunol., 21: 89 až 94 (1984) opisujú prípravu hybridómovej bunkovej línie vylučujúcej monoklonové protilátky nasmerované k N-DSK časti fibrinogénu. Sobel, J. H. et al., Thromb. and Haem. , 60: 153 až 59 (1988) opisujú použitie dvoch rozdielnych monoklonových protilátok, ktoré sa viažu na fragmenty CNBr Aa reťazca fibrinogénu, na skoré sledovanie prekrižovanie a reťazca medzi susednými fibrínovými molekulami. Mirshagi, M. et al., Fibrinogen, 4: 49 až 54 (1980) opisujú prípravu hybridómovej bunkovej línie, ktorá vylučuje monoklonové protilátky nasmerované k fibrinogénu, ktoré sú schopné inhibovať polymerizáciu fibrínu. Ciernievski, C. S. a Budzynski, A. Z., Biochemistry, 31: 4248 až 53 (1992) opisujú prípravu a použitie polyklonových a monoklonových protilátok nasmerovaných proti purifikovanému ľudskému fibrinogénu, ktoré inhibujú rýchlosť polymerizácie monomérov fibrínu a interferujú s účinkom trombínu na fibrinogén. Tymkewycz, P. M. et al., Blood Coag and Fibrinol., 4: 211 až 21 (1993) opisujú produkciu piatich monoklonových protilátok s vysokou afinitou k fibrínu, ktoré nereagujú s fibrinogénom. Gargan, P. E. et al. , Fibrinolysis, 7: 275 až 83 (1993) opisujú zavedenie hybridómovej bunkovej línie

MH-1, ktorá produkuje monoklonové protilátky špecifické tak voči skríženej, ako aj neskríženej polymerickej štruktúre fibrínu, ktoré ale nevykazujú žiadnu detegovateľnú imunoreaktivitu voči fibrinogénu, ani voči žiadnym degradačným produktom fibrínu alebo fibrinogénu. Na dôvažok, MH-1 protilát6 ka nereaguje s DesAA alebo DesAABB monomerom fibrínu, ani nebola zistená žiadna reaktivita s jednotlivými a, alebo τ reťazcami fibrinogénu.

Pre ďalšie informácie ohľadom použitia monoklonových protilátok špecifických voči zložkám hemostatického systému pozri Kudryk, B. J. et al., Monoklonové protilátky ako sondy pre proteolýzu fibrínu (fibrinogénu) v : Monoklonové protilátky v imunoscintigrafii, Chatal, J. F. (ed.), CRC Press, Boca Raton, Fl. (1989), s. 365 až 398.

Modifikované protilátky nasmerované na hemostatické

zložky boli	vyvinuté	pre klinické použitie ako činidlá na
zobrazovanie	trombov	in situ. Viď. napríklad	Liau, C-S,
a Su, C-T,	J	For m.	Med. Assoc., 88: 209 až	12	(1989);
Vasser, M.	N	. J. M.	et al., Blood, 74: 708 až	14	(1989);
Alavi, A. et	al., Radiology 175: 79 až 85 (1991)5;	Valker,
K. Z. et	al	., Eur.	J. Nucl. Med., 16: 787 až	94	(1990);
Vasser, M.	N	. J. M.	et al., Thromb. Res., Supp	. X:	91 až
104 (1990);	a	Kanke,	M. et al., J. Nucl. Med.,	32:	1254 až
60 (1991).

Pre terapeutické použitie boli vyvinuté protilátky proti fibrínu, konjugované s trombolytickými enzýmami. Viď. napríklad Bode, C. et al., Science, 229: 765 až 67 (1985). V tejto práci sa naznačuje, že miestne špecifické dodávanie trombolytického agensu má významný vplyv na zvýšenú účinnosť agensu v lyžujúcich zrazeninách.

Konečne niekoľko US patentov uviedlo, že sú smerované k príprave a/alebo k spôsobom použitia monoklonových protilátok špecifických voči fibrinogénu, fibrínu alebo voči ich degradačným produktom. Viď. US Patent Nos. 4 722 903; 4 758 524; a 4 916 070, pričom sa toto ich vyčíslenie nepovažuje za vyčerpávaj úce.

4. Spôsoby prevencie tvorby trombov

Antitrombotická terapia typicky zahrňuje podávanie jedného alebo viacerých antikoaguancií, ako sú heparín a kumarín. Physician’s Desk Reference, 47. vyd., Medical Economics

Data (1993); The Merck Manual of Diagnostics and Therapy,

15. vyd., Merck, Sharpe & Dohme Research Labs (1987). Tieto antikoagulanciá sa často používajú v snahe zabrániť rekurentnej trombóze u pacientov postihnutých vaskulárnym ochorením a v snahe zabrániť akútnej trombotickej chorobe, ako aj v snahe zabrániť akútnej trombotickej reoklúzii po angioplastike.

Hlavnou nevýhodou používania takýchto systémových antikoagulancií je riziko vzniku systémovej hemorágie. Podávajúci lekári sú vystríhaní, že k hemorágii môže dôjsť skutočne v ktoromkoľvek mieste u pacientov, ktorí dostávajú heparín. Physician’s Desk Reference, 47. vyd., Medical Economics Data (1993), s. 2568.

Na dôvažok sa ukázalo, že účinnosť takýchto antikoagulancií pri prevencii reoklúzie po angioplastike nie je rozdielna od placeba, alebo je nereprodukovateľná. (Ip, J. H. et al., JACC, 17: 77B až 88B (1991). Podľa toho je výhoda používania takýchto antikoagulancií nevyvážená z hladiska riskovania hemorágie a z hľadiska ich otáznej účinnosti pri prevencii reoklúzie.

V snahe znižovať pomer reoklúzie po angioplastike bolo použitých množstvo biologických a mechanických stratégií, avšak žiadna liečba nevykazovala jednoznačne pozitívne účinky. Na základe toho sa zvyšuje záujem o miestne špecifické alebo priame dodávanie antitrombotických čnidiel na miesta poškodenia ciev. Gimple, L. V. et al., Circulation, 86: 1536 až 46 (1992).

Miestne špecifické dodávanie antitrombotických činidiel, používajúcich protilátky namierené voči zodpovedajúcim zložkám hemostatického systému by mohli slúžiť na lokalizovanie takýchto činidiel na miesto poškodenia ciev. Jednou z výhod takejto lokalizácie je, že by bolo možné požadovať nižšiu podávanú dávku. Druhou výhodou lokalizácie by mohlo byť zíženie rizika systémovej hemorágie.

V niekoľkých prípadoch sa protiláky namierené proti špecifickým zložkám hemostatického systému prejavili inhibíciou polymerizácie fibrínu. Francis, S. E. et al., Am. J.

Hem., 18: 11 až 19 (1985), opisujú sledovania, kedy monoklonové protilátky vytvorené proti fibrinogénu mali mierny antikoagulačný účinok. Mirshahi, M. et al., Fibrinogen, 4: 49 až 54 (1990), opisujú získanie hybridómovej bunkovej línie vylučujúcej monoklonové protilátky, v ktorých antigénom bol fragment D, plazmínový degradačný produkt fibrinogénu. Tieto monoklonové protilátky silno reagovali s fibrinogénom a inhibovali polymerizáciu fibrínu. Ciernewski, C. S., Budzynski, A. Z., Biochemistry, 31: 4248 až 53 (1992), opisujú získanie troch rozdielnych hybridómových bunkových línií, v ktorých antigénom bol natívny ľudský fibrinogén a ktoré vylučovali monoklonové protilátky, ktoré inhibovali rýchlosť polymerizácie fibrínu.

Všetky tri práce majú obmedzené alebo žiadne použitie z hľadiska vyvinutia miestne špecifického terapeutického alebo profylaktického antitrombotického činidla. Je to preto, lebo vo všetkých týchto prípadoch protilátky reagujú skrížené alebo s fibrinogénom alebo s jeho degradačnými produktmi , a tieto všetky sú všadeprítomné v hemostatickom systéme. Akokoľvek takáto protilátka podaná pacientovi by sa mohla naviazať na fibrinogén alebo jeho degradačné produkty a nebola by dostupná z hľadiska inhibície polymerizácie fibrínu alebo tvorby trombu v mieste cievneho poškodenia.

Predkladaný vynález umožňuje zvoliť celkom iný prístup k inhibícii tvorby trombu pomocou monoklonových protilátok, ktoré sú fibrínovo špecifické (t. j. bez významnej skríženej reaktivity s fibrinogénom alebo s plazmínovo odvodenými degradačnými produktmi z fibrinogénu alebo fibrínu). Predkladaný vynález poskytuje spôsob použitia uvedených fibrínovo špecifických monoklonových protilátok, ktorý prekvapujúco inhibuje tvorbu trombu v mieste cievneho poškodenia.

Podstata vynálezu

Predkladný vynález poskytuje spôsob inhibície tvorby trombu v mieste poškodenia krvnej cievy človeka, ktorý potrebuje takúto inhibíciu, podávaním fibrínovo špecifickej monoklonovej protilátky. Predkladaný vynález ďalej poskytuje fragmenty alebo deriváty fibrínovo špecifickej protilátky, ktoré obsahujú väzbovú doménu protilátky. Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutický prípravok obsahujúci fibrínovo špecifickú monoklonovú protilátku, jej fragment alebo derivát a farmaceutický účinný nosič, ktorý je v dostatočnom množstve účinný pri inhibícii tvorby trombu u človeka. Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutické kity obsahujúce jednu alebo viac zložiek farmaceutických prípravkov podlá vynálezu.

1. Využiteľnosť

Prekvapujúco sa zistilo, že fibrínovo špecifická monoklonová protilátka môže inhibovať polymerizáciu fibrínu a tvorbu trombu. Teda, fibrínovo špecifické protilátky možno použiť pri prevencii alebo liečbe akýchkoľvek chorobných stavov u človeka, ktoré sú preventabilné alebo liečiteľné inhibíciou polymerizácie fibrínu alebo tvorby trombu. Fibrínovo špecifické monoklonové protilátky sú napríklad vhodné u ľudí s akýmkoľvek vaskulárnym ochorením, ktoré zahrňuje riziko patologicej trombózy. Nelimitujúcimi príkladmi takýchto vaskulárnych ochorení sú hlboká žilná trombóza (DVT), arteriálna alebo žilová trombóza, mŕtvica, tromboembolizmus, pľúcny embolizmus a trombotické komplikácie pri ateroskleróze.

Fibrínovo špecifické monoklonové protilátky sú tiež napríklad vhodné pri liečbe ľudí, ktorí sa pripravujú, alebo sa podrobujú chirurgickým zákrokom, alebo sú v stavoch po chirurgických zákrokoch. V intenciách predkladaného vynálezu sa pod termínom invazívny chirurgický zákrok rozumie akýkoľvek chirurgický zákrok, ktorý môže vyústiť do poškodenia arterálnej alebo venóznej cievy, čo môže viesť k trombotickým komplikáciám. Nelimitujúcimi príkladmi takýchto zákrokov sú balónová angioplastika a transplantácia orgánov (prirodzená i umelá).

Na doplnenie fibrínovo špecifických monoklonových pro10 tilátok, môžu byť protilátkové fragmenty s obsahom idiotypu (väzbová doména) fibrínovo špecifickej protilátky pripravené známymi technikami. Napríklad takéto fragmenty zahrňujú, ale nie sú ohraničené na: (1) F(ab )₂ fragmenty, ktoré môžu byť produkové pepsínovou digesciou molekuly protilátky; (2) Fab fragmenty, ktoré môžu byť vytvorené redukciou disulfidových mostíkov F (ab )₂ fragmentu; a (3) Fab fragmenty, ktoré možno vytvoriť opracovaním molekuly protilátky papaínom a redučným činidlom. Takéto protilátkové fragmenty spadajú pod predkladaný vynález. Ďalšie príklady prípravy a použitia protilátkových fragmentov viď. Parham, P. et al.,

J. Immunol. Meth., 53: 133 (1982) a Khaw, B. A. et al., J. Nucl. Med., 34: 2264 až 68 (1993).

Okrem fibrínovo špecifických monoklonových protilátok a protilátkových fragmentov možno ďalšie protilátkové deriváty s obsahom idiotypu (väzbová doména) fibrínovo špecifickej protilátky vyrobiť známymi technikami. Napríklad je možné zosyntetizovať rekombinantné a syntetické oligopeptidy a ich analógy, ktoré vykazujú rovnaký inhibíčny účinok na tvorbu trombu ako fibrínovo špecifická monoklonová protilátka alebo jej deriváty. Ďalšie príklady použitia syntetických oligopeptidov so sekvenciami založenými na primárnej väzbovej oblasti monoklonovej protilátky viď. Knight, L et al., J. Nucl. Med., 35: 282 až 88 (1994).

Konečne, akákoľvek funkčne ekvivalentná fibrínovo špecifická monoklonová protilátka, jej fragment alebo derivát spadajú pod predkladaný vynález. Termín funkčný ekvivalent vyjadruje akúkoľvek fibrínovo špecifickú monoklonovú protilátku, jej fragment alebo derivát, ktorý je dostatočne kvantitívne schopný inhibovať tvorbu trombu u ľudí, liečba ktorých vyžaduje naviazanie sa na ten istý epitop, na ktorý sa nadväzuje MH-1 protilátka.

2. Produkcia a charakteristika monoklonovej protilátky MH-1

Množstvo predchádzajúcich postupov bolo upravených za účelom získania fibrínovo špecifických protilátok založených na imunizácii zvierat solubilnými fibrínovými fragmentmi a syntetickými peptidmi, ktoré napodobňujú exponované neoantigénové miesta na fibríne. Viď. Hui, K. Y. et al. , Science, 222: 1129 až 32 (1983); Scheefers-Borchel, U., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7091 až 95 (1985); Elms, M.

J. et al. , Thromb. Haemostas. , 50: 591 až 94 (1983); a Kudryk, B. et al., Mol. Immunol., 21: 89 až 94 (1984). Uznáva sa však, že väzbové miesto takýchto protilátok je zachované počas procesu degradácie fibrínu, a preto sa môžu takéto protilátky viazať aj degradačné produkty fibrínu.

US patent č. 5 120 834 (ďalej ako patent 834) autor Gargan et al., vydaný 9. júna, 1992, na ktorý sa tu odvoláva citáciou, sa vo všeobecnosti týka spôsobu produkcie monoklonových protilátok z amikrobiálnych zvierat ich imunizáciou vybraným antigénom. Uvažuje sa, že výhodou použitia amikrobiálneho systému pri produkcii monoklonových protilátok je to, že takýto systém bude vykazovať výrazne zvýšenú imunitnú odpoveď voči antigénu, za zvýšenia pravdepodobnosti lokalizácie -lymfocytu, ktorý produkuje protilátku naviazania schopnú našpecifický epitop antigénu. Takýto systém bol označený za zvlášť vhodný pre tvorbu vysoko špecifickej protilátky proti fibrínu, ktorá má nízku alebo žiadnu skríženú reaktivitu s fibrinogénom. Získanie takejto rozlišovacej protilátky bolo problematické, keďže sa odhaduje, že štrukturálna a konformačná podobnosť medzi fibrínom a fibrinogénom je vyššia ako 98 % (Plow, E. F. et al. , Semin. Thromb. Haemostas., 8: 36 (1982). Výsledkom je, že iba malé percento epitopov na molekule fibrínu sú v skutočnosti neoantigény (t. j. špecifické voči fibrínu).

Patent 834 sa týka hybridómovej bunkovej línie ATCC č. 9739, vylučujúcej monoklonovú protilátku MH-1. Monoklonová protilátka MH-1 je špecifická voči skríženým a neskríženým polymérom fibrínu, ale nereaguje skrížené s fibrinogénom alebo degradačnými produktmi fibrinogénu alebo fibrínu odvodenými od plazmínu.

MH-1 je purifikovaná podľa postupov uvedených v patente 834. MH-1 sa špecificky nadväzuje na fibrín a nereaguje skrížené s fibrinogénom v kompetičných testoch. MH-1 nereaguje skrížené so žiadnymi plazmínovo vytvorenými degradačnými produktmi fibrinogénu, ani so žiadnymi od plazmínu odvodenými degradačnými produktmi fibrínu. Ako výsledok možno vysloviť názor, že: (1) MH-1 rozpoznáva epitop intaktnej fibrínovej molekuly, ktorá nie je prítomná alebo exponovaná na povrchu molekuly prekurzora fibrínu a (2) epitop je zjavne rozrušený plazmínovou digesciou skríženého fibrínu.

MH-1 bola ďalej charakterizovaná Scatchardovou analýzou (Frankel et al., Mol. Immunol., 16: 101 až 6 (1987) za použitia ^JI-značenej MH-1 protilátky na stanovenie afinity MH-1 voči fibrínu. Hodnota získaná pre disociačnú konštantu Kp bola 6,7 x ΙΟ^θ M, ktorá predstavuje asi 5 000-násobnú afinitu v porovnaní s tkanivovým plazminogénovým aktivátorom pre fibrín.

Vestern Immunoblotting analýza ukázala, že MH-1 nereaguje skrížené s Aa, B alebo Γ reťazcami fibrinogénu. Tá istá metóda ukázala, že MH-1 nereaguje skrížené s trombínom opracovanými reťazcami fibrinogénu Aa alebo B. Na doplnenie, analýza ELISA ukázala, že MH-1 reaguje aj s prekríženým aj s neprekríženým fibrínom, s afinitou väčšou voči prekríženému fibrínu.

3. Spôsoby podávania

Podľa predkladaného vynálezu sa fibrínovo špecifické monoklonové protilátky, ich fragmenty alebo deriváty podávajú človeku, ktorý si vyžaduje liečbu inhibujúcu tvorbu trombov. Protilátky, ich fragmenty alebo deriváty sa výhodne podávajú človeku vo forme, ktorá nie je konjugovaná so žiadnym rádioznačeným, trombolytickým alebo iným činidlom, ani so žiadnou jeho molekulou alebo časťou. Akokoľvek, spôsoby vynálezu možno tiež uskutočniť za použitia protilátok alebo derivátov, ktoré sú konjugované s rádioznačiacimi, trombolytickými alebo inými činidlami alebo ich molekulami alebo časťami a sú súčasťou vynálezu.

Termín nosič je priradený rozpúšťadlu, pomocnej látke alebo vehikulu, s ktorým sa fibrínovo špecifická monoklonová protilátka, jej fragment alebo derivát podáva.

Termín farmaceutický akceptovateľný nosič znamená, že nosič je povolený riadnou vládnou inštitúciou na federálnej alebo štátnej úrovni alebo je uvedený v US liekopise alebo inom všeobecne známom liekopise na použitie u zvierat a zvlášť u ľudí.

Termín antitrombotický prípravok používaný v predkladanom vynáleze zahrňuje prípravok obsahujúci fibrínovo špecifickú protilátku, jej fragment alebo derivát a farmaceutický akceprovateľný nosič, ktorý môže v dostatočnej miere inhibovať tvorbu trombu u ľudí, u ktorých sa takáto inhibícia vyžaduje.

Termín účinná dávka použitý v predkladanom vynáleze predstavuje množstvo monoklonovej protilátky, ktoré je dostatočne veľké na to, aby bola inhibovaná tvorba trombu u indikovaných jedincov. Dávka nemá byť taká vysoká, aby došlo k vedľajším účinkom, ako napríklad ku skríženým alebo anafylaktickým reakciám a podobne. Vo všeobecnosti bude dávka rozdielna podľa veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia u pacienta, prípadných kontraindikácií, imunitnej tolerancie a iných podobných rozdielov, individuálne upravená ošetrujúcim lekárom. Hoci dávkovanie je rozdielne podľa okolností, vo väčšine prípadov vaskulárneho ochorenia a vo väčšine chirurgických podmienok bude dávka určovaná telesnou hmotnosťou pacienta, u ktorého je liečba indikovaná, v rozmedzí od asi lpg/kg telesnej hmotnosti až po asi 50gg/kg hmotnosti a výhodne sa bude pohybovať od asi 5gg/kg telesnej hmotnosti až po asi 10pg/kg telesnej hmotnosti.

4. Spôsoby podávania

Fibrínovo špecifické monoklonové protilátky, ich fragmenty alebo deriváty, možno podávať človeku akýmkoľvek vhodným spôsobom, vrátane parenterálneho, jednou bolusovou injekciou, kontinuálnou infúziou, alebo v kombináciách týchto spôsobov. Podávanie možno tiež uskutočniť priamou infúziou katétrom, ako v prípade intrakoronárneho podávania za indikovaných okolností.

Prípravky na parenterálne podávanie napríklad zahrňujú rozriedenie lyofilizovaných fibrínovo špecifických protilátok, ich fragmentov alebo derivátov, v sterilnom fyziologickom roztoku bez endotoxínu, alebo bežnejšie, môžu zahrňovať zriedenie alebo disperziu fibrínovo špecifických protilátok, ich fragmentov alebo derivátov, v sterilných vodných alebo bezvodých roztokoch, suspenziách alebo emulziách. Príkladmi bezvodých rozpúštadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinný olej, ako olivový olej a injektabilné organické estery, ako etyloleát. Vodné nosiče zahrňujú vodu, alkoholicko-vodné roztoky, emulzie alebo suspenzie, vrátane fyziologického roztoku a pufrovaných médií. Parenterálne vehikulá zahrňujú roztok chloridu sodného, Ringerovu dextrózu, dextrózu a chlorid sodný, laktátový Ringerov roztok alebo fixované oleje. Intravenózne vehikulá zahrňujú tekutinu a nutričné náhrady, ako sú tie na báze Ringerovej dextrózy, a pod. Ochranné látky a iné aditíva môžu byť prítomné tiež, napríklad antimikrobiálne látky, antioxidanty, chelátotvorné činidlá a inertné plyny, a podobne. Výhodné je, aby farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu boli v sterilnej forme, aby boli v súlade s normami sterility podľa US Úradu pre potraviny a liečivá.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje farmaceutické kity obsahujúce jednu alebo viac zložiek farmaceutických prostriedkov podľa vynálezu uchovávaných samostatne alebo v oddelených zásobníkoch. Na týchto zásobníkoch môže byť informácia podľa predpisu vládneho úradu regulujúceho výrobu, použitie alebo predaj farmaceutických alebo biologických produktov, ktorá zahrňuje povolenie výroby, používania alebo predaja pre účely v humánnej medicíne. V kitoch, ktoré obsahujú iba lyofilizovanú protilátku, jej fragmenty alebo deriváty, môžu byť inštrukcie o tom, ktoré nosiče sú vhodné na použitie pri liečbe u človeka.

Rozsah, trvanie, doba podávania a spôsob liečby bude rozdielny podľa veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia u pacienta vyžadujúceho takúto liečbu a podľa úprav lekára vzhľadom na konkrétny prípad. Liečba môže byť aplikovaná okamžite pred, počas alebo po akomkoľvek chirurgickom zákroku, aj pred aj počas zákroku, alebo aj počas a po zákroku, alebo pred, počas a po zákroku, v závislosti na zvláštnostiach každého prípadu.

Napríklad v prípade chirurgického zákroku, ako balónová angioplastika, ide často o prípad, kedy u pacienta sú už prítomné veľké množstvá roztrúsených krvných zrazenín. V tomto prípade bude vo všeobecnosti výhodné podávať anti-trombotický prípravok okamžite po výkone angioplastiky, výhodne za použitia angioplastického katétra, kým je ešte v mieste, aby bola poškodená časť krvných ciev priamo premývaná antitrombotickým prípravkom, so zameraním liečby na jedno miesto. Takto sa predchádza strate antitrombotického prípravku, k čomu by mohlo napríklad dôjsť po väzbe protilátky na tromby mimo miest zákroku.

V prípadoch vyžadujúcich invazívne chirurgické zákroky u pacientov bez patologických trombóz v anamnéze sa vo všeobecnosti bude vyžadovať podávanie antitrombotického prípravku okamžite pred alebo počas zákroku, keďže tu je menšie riziko, že dôjde k strate antitrombotického činidla pri väzbe na miesta mimo zákroku.

Ďalej, vo väčšine prípadov vyžadujúcich invazívne chirurgické zákroky je doba, počas ktorej je zvýšené nebezpečenstvo, že dôjde k tvorbe zrazenín, ohraničená na okamžik ukončenia zákroku. To znamená, že iba ohraničený počet aplikácií antitrombotika, alebo dokonca jedna aplikácia postačujú na účinnú inhibíciu tvorby trombu, čím sa podstatne znižuje riziko pochirurgickej tvorby zrazenín s nastupujúcimi rizikami pre pacienta.

V prípade chronického trombotického ochorenia je časový rozvrh, trvanie a počet antitrombotických liečebných zásahov závislý najmä na vyšetrení pacienta pred a po liečbe a po vyšetrení odpovede pacienta na predchádzajúcu antitrombotickú liečbu, čo je potrebné určiť, monitorovať a hodnotiť podávajúcim lekárom.

5. Stanovenie účinnosti liečby

Účinnosť antitrombotickej liečby pomocou MH-1 monoklonovej protilátky, alebo jej fragmentu alebo derivátu, môže byť stanovená štandardnými metódami. Príklady zahrňujú, ale nie sú ohraničené na: (l) angiografické monitorovanie pomocou zobrazovania toku arteriálneho alebo venózneho farbiva, kde objavenie sa obštruovaného toku farbiva naznačuje potrebu ďalšej liečby; (2) použitie scintigrafie využívajúcej trombo-špecifickú protilátku konjugovanú s rádioznačenou látkou, kde miesto trombu a jeho lokalizácia môžu byť monitorované pre prípad, že je potrebná ďalšia liečba; (3) monitorovanie výskytu a stupňa klinických symptómov, kde zvýšenie počtu alebo vážnosti symptómov môže naznačovať potrebu ďalšej liečby; a (4) meranie hladín fibrinogénu v krvi pacienta, keďže tu existuje inverzný vzťah medzi hladinami fibrinogénu a fibrínu, kde pokles hladiny fibrinogénu môže poukazovať na možné súvisiace zvýšenie hladiny fibrínu a polymerizácie fibrínu, naznačujúce potrebu ďalšej liečby.

Takto po všeobecnom popísaní predkladaného vynálezu bude tento lepšie pochopiteľný v špecifických príkladoch, ktoré sú tu uvedené iba na ilustráciu a nemajú charakter ohraničenia vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. Začlenenie MH-1 monoklonovej protilátky vo fibrinogén/trombínovej zrazeninovej reakčnej zmesi inhibuje rýchlosť aj absulútne množstvo zrazeniny. Fibrinogén a 45J predstavujú kontrolné reakcie.

Obr. 2. Začlenenie zvyšujúceho sa množstva MH-1 monoklonových protilátok vo fibrinogén/trombínovej zrazeninovej reakčnej zmesi má za následok zvyšujúci sa stupeň inhibície zrážanlivosti. Fibrinogén predstavuje kontrolnú reakciu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Inhibícia tvorby trombu in vitro

Na stanovenie vplyvu MH-1 na zrážanie krvi bola vykonaná séria experimentov in vitro. Purifikovaný humánny fibrinogén (Kabi, Chromogenix Co, Ohio) bol rozpustený v 150 mM fyziologického roztoku s fosfátovým pufrom, pri fyziologickom pH, pri koncentrácii 1 mg/ml a približne 100 μΐ sa umiestnilo do každej jamky mikrotitračnej platne (Costar). Do každej jamky sa pridalo približne 50 μΐ bovinného trombínu v konečnej koncentrácii 0,5 NIH jednotiek/ml, aby sa vytvorila reakčná zmes. K reakčnej zmesi bolo v čase 0 pridaných 50 ml z : (1) MH-1 monoklonová protilátka, aby bola konečná koncentrácia 100μg/ml; (2) 45J monoklonová protilátka (45J monoklonová protilátka, ktorá skrížené reaguje s fibrínom a fibrinogénom, je vylučovaná hybridómovou bunkovou líniou ATCC č. HB 9740, vyrobenej bežnou technikou za použitia myší Balb/c, kde myš bola imunizovaná fibrínom), aby sa získala konečná koncentrácia protilátky 200 μβ/πιΐ; alebo (3) fyziologický roztok. Reakcia sa nechala prebiehať 60 min. pri 37°C. Zrážanie sa meralo spektrofotometricky pri 340 nm každé 2 minúty. Zvýšenie absorbancie naznačovalo, že zrážanie sa zvyšovalo. Koniec procesu zrážania bol zistiteľný ako sploštenie krivky absorbancie versus čas.

Obr. 1 naznačuje, že opracovanie MH-1 inhibovalo rýchlosť zrážania, ako je zrejmé z nižšieho počiatočného sklonu krivky absorbancia/čas pre reakčnú zmes opracovanú MH-1, v porovnaní s 45J kontrolnou reakčnou zmesou alebo s kontrolnou reakčnou zmesou s fyziologickýcm roztokom (fibrinogén). Na dôvažok, MH-1 redukovala absolútne množstvo objavenej zrazeniny, ako bolo zistené nižším stupňom sploštenia krivky v porovnaní s kontrolnými reakciami. Kontrolná reakčná zmes obsahujúca 45J protilátku (pri dvojnásobnej koncentrácii MH-1) nepreukázala žiadnu inhibíciu zrazeniny v porovnaní s kontrolnou reakciou s fyziologickým roztokom. Tieto údaje podporujú predpoklad, že MH-1 monoklonová protilátka je schopná inhibovať tvorbu trombu.

V druhom experimente sa testoval účinok niekoľkých rozdielnych koncentrácií MH-1 na dobu zrážania v porovnaní s fibrinogénovou kontrolnou reakciou. Obr. 2 ukazuje profily zrážacej reakcie (absorbancia/čas) naznačujúce zvyšujúcu sa inhibíciu zrážacej reakcie so zvyšujúcou sa koncentráciou MH-1 v reakčnej zmesi. (1:1000 = 1 gg/ml; 1:100 = lOgg/ml; 1:50 = 20 gg/ml; 1:20 = 50 gg/ml; 1:10 = 100 gg/ml; fibrinogén = kontrola).

Uloženie hybridómu

Hybridómové bunkové línie MH-1 a 45J boli uložené v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC) 9. júna 1988 a bolo im priradené prírastkové číslo HB 9739 a HB 9740. Adresa ATCC je 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. 20852. MH-1 protilátka je IgG protilátkou s kappa ľahkým reťazcom a zistilo sa, že MH-1 skrížené reaguje tak s humánnym ako aj s králičím fibrínom.

Predkladaný vynález nie je limitovaný na depozitnú hybridómovú bunkovú líniu ATCC é. HB 9739 alebo na MH-1 monoklonovú protilátku, ale považuje sa za jednoduchú ilustráciu skutočnosti, že fibrínovo špecifická monoklonová protilátka inhibuje tvorbu trombu. Akákoľvek funkčne ekvivalentná fibrínovo špecifická monoklonová protilátka, jej fragment alebo derivát spadá do rozsahu predkladaného vynálezu. Pod termínom funkčný ekvivalent sa rozumie, že monoklonová protilátka, jej fragment alebo derivát je schopný inhibovať tvorbu trombu naviazaním sa na ten istý epitop, na ktorý sa nadväzuje protilátka MH-1.

Predkladaný vynález možno využiť v iných špecifických formách, bez toho, aby sa upustilo od jeho zmyslu alebo základných atribútov, a podľa toho treba venovať pozornosť priloženým nárokom, skôr než prdchádzajúcim špecifikáciám, ako to naznačuje rozsah vynálezu. Všetky publikácie a patenty citované vyššie sú tu uvedené s odkazom.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie fibrínovo špecifickej monoklonovej protilátky jej fragmentu alebo derivátu, pričom fragment alebo derivát obsahuje väzbovú doménu uvedenej protilátky na výrobu farmaceutického prostriedku na inhibíciu tvorby trombu u človeka, znižovanie rizika postchirurgických trombotických komplikácií alebo na liečenie trombotického vaskulárneho ochorenia u človeka.
2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde fibrínovo špecifickou monoklonovou protilátkou je MH-1.
3. 3. Použitie podľa nároku 1, kde postchirurgické komplikácie vyplývajú z angioplastiky alebo transplantácie orgánov .
4. 4. Použitie podľa nároku 1, kde trombotickým vaskulárnym ochorením je mŕtvica, pulmonálny embolizmus, hlboká žilná trombóza, arteriálna alebo venózna trombóza alebo ateroskleróza.
5. 5. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nekonjugovanú fibrínovo špecifickú monoklonovú protilátku a farmaceutický akceptovateľný nosič, pričom uvedený prípravok je vo forme sterilného ptrípravku.
6. 6. Prípravok podľa nároku 5,vyznačujúci sa tým, že fibríno špecifickou monoklonovou protilátkou je MH-1.
7. 7. Farmaceutický prípravok, vyznačuj úci sa tým, že obsahuje nekonjugovaný fragment alebo derivát fibrínovo špecifickej monoklonovej protilátky, pričom fragment alebo derivát obsahuje väzbovú doménu uvedenej protilátky a farmaceutický nosič, pričom farmaceutický prostriedok je v sterilnej forme.
8. 8. Prípravok podľa nároku 7, vyznačuj úci sa t ý m, že fibrínovo špecifickou monoklonovou protilátkou je MH-1.
9. 9. Kit na liečbu u človeka, kde je indikovaná inhibícia tvorby trombu, vyznačujúci sa tým, že uvedený kit obsahuje nekonjugovanú fibrínovo špecifickú monoklonovú protilátku, jej fragment alebo derivát, fragment alebo derivát obsahuje väzbovú doménu uvedenej protilátky a farmaceutický nosič, pričom farmaceutický prostriedok je v sterilnej forme.
10. 10. Kit podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že kde fibrínovo špecifickou monoklonovou protilátkou je MH-1.
11. 11. Kit podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľný nosič, ktorý je v sterilnej forme.
12. 12. Kit podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že fibrínovo špecifickou monoklonovou protilátkou je MH-1.