SI20922A

SI20922A - Monoklonsko protitelo, ki nevtralizira aktivnost katepsina B, in njegove uporabe

Info

Publication number: SI20922A
Application number: SI200100132A
Authority: SI
Inventors: Janko Kos; Ale� PREMZL; Nata�a KOPITAR-JERALA; Xiaohui Fan; Vito Turk; Marco Bestagno; Oscar R. Burrone
Original assignee: Krka Tovarna Zdravil, D.D., Novo Mesto
Priority date: 2001-05-18
Filing date: 2001-05-18
Publication date: 2002-12-31
Also published as: WO2002094881A2; US20050260207A1; EP1390409A2; WO2002094881A3; CA2447313A1; JP2005507373A

Abstract

Predloženi izum se nanaša na monoklonsko protitelo, ki je sposobno nevtralizirati katepsin B. Še zlasti se predloženi izum nanaša na uporabo takšnega protitelesa za zdravljenje ali detekcijo bolezni, povezanih s prekomerno ekspresijo in/ali prekomerno aktivnostjo katepsina B, kot je rak ali artritis.ŕ

Description

Krka, tovarna zdravil, d.d., Novo mesto

Monoklonsko protitelo, ki nevtralizira aktivnost katepsina B, in njegove uporabe

Tehnično področje izuma

Predloženi izum se nanaša na monoklonsko protitelo, ki je sposobno nevtralizirati aktivnost katepsina B. Še zlasti se predloženi izum nanaša na uporabo takšnega protitelesa za zdravljenje in detekcijo bolezni, povezanih s prekomerno ekspresijo in/ali prekomerno aktivnostjo katepsina B, kot je rak ali artritis.

Ozadje izuma

Izkazalo se je, da je lizosomska cisteinska proteinaza katepsin B udeležena v procesih tumorske rasti, invazije in metastaziranja. (Kos, J. in Lah, T.T. Oncology Reports 5:1349-1361, 1996). Pokazalo seje, daje tumorski katepsin B lahko translociran na plazemski membrani ali pa se izloča bodisi kot prekurzor ali kot aktivni encim iz tumorskih celic, kjer sodeluje v razgradnji komponent ekstracelulamega matriksa in bazalne membrane, kar je ključna stopnja procesa metastaziranja (Sloane, et al., Biochemical and Molecular Aspects of Selected Cancers, T.G. Pretlow and T.P. Pretlow eds., Academic Press, New York, str. 411-465, 1994). Aktivnost katepsina B značilno kontrolirajo endogeni inhibitorji cisteinskih proteinaz - kot sta intracelulami stefin A in B ter ekstracelulami cistatini, kininogeni in a2-makroglobulin. Izkazalo se je, da povišan nivo tumorskega katepsina B ni uravnotežen z ustreznim povišanjem inhibitorjev cisteinskih proteinaz, kar lahko vodi do nekontrolirane proteolize ekstracelulamega matriksa. V kliničnih študijah raka prsi, glave in vratu, črevesnega in pljučnega raka je povišana aktivnost Cat B v tumorskem tkivu in povišana koncentracija proteinov korelirala z bolj agresivnim obnašanjem tumorjev, z zgodnejšo ponovitvijo bolezni in krajšim celokupnim preživetjem (Kos, J. in Lah, T.T.

Oncology Reports 5: 1349-1361, 1996). Znatno povišani nivoji Cat B so bili ugotovljeni tudi v serumih bolnikov z rakom prsi, črevesnim rakom, rakom jeter, trebušne slinavke in melanomom (Kos et al., Int. J. Biol. Markers, 15: 84-89, 2000).

Po drugi strani pa so menili, da tudi zmanjšanje inhibitome sposobnosti prispeva k neustrezni kontroli katepsina B pri napredovanju raka. Na primer, stefin A, očiščen iz humanega sarkoma, je izražal nižjo inhibitomo aktivnost v primerjavi s stefinom A, izoliranim iz jeter (Lah et al., Biochim. Biophys. Acta 993: 63-73, 1989). V pljučnem tumorskem tkivu je bil katepsin B bolj odporen na inaktivacijo z E-64 kot katepsin B iz kontrolnega pljučnega tkiva (Krepela et al., Int. J. Cancer 61: 44-53, 1995). Poleg tega je katepsin B iz bolj metastatskih pljučnih celic izražal drugačne nivoje inhibicije z E-64 kot encim iz celičnih linij manj metastatskega pljučnega raka. (Spiess et al., J. Histochem. Cytochem. 42: 917-929, 1994). Izkazalo se je, da je nivo kompleksa katepsinB/cistatin C nižji v serumih bolnikov s pljučnim in črevesnim rakom v primerjavi s tistimi z benignimi boleznimi ali z zdravimi kontrolami (Zore et al., Biol. Chem. 382: 2001).

Trenutno izgleda, da je pri bolnikih z rakom sposobnost endogenih inhibitorjev cisteinskih proteinaz, da bi učinkovito uravnotežili prekomerno ekspresijo in/ali prekomerno s tumorji povezano aktivnost cisteinskih proteinaz, zmanjšana. Sicer ni neposrednega dokaza za s tumorji povezane faktorje, ki bi vplivali na inhibicijo katepsina B in vivo, vendar obstaja več in vitro študij, ki poročajo o s tumorji povezanih post-translacijskih modifikacijah katepsina B, spremembah v stabilnosti pH, prisotnosti aktivatorjev ali vezavi glikozaminoglikanov (GAG-ov), ki vsi lahko spremenijo konformacijo aktivnega mesta katepsina B in posledično vezavo inhibitorjev (Zore etal., Biol. Chem. 382: 2001).

Ker bi inhibitorji cisteinskih proteinaz lahko zagotovili terapevtsko orodje za zdravljenje raka, smo pripravili različne naravne proteinske inhibitorje, pa tudi njihove sintetične analoge, ter jih testirali na anti-tumorski učinek. Na žalost pa specifičnost naravnih inhibitorjev ni omejena le na posamezen encim. Nadalje se je izkazalo, da so majhni sintetični inhibitorji, reverzibilni in ireverzibilni, v višjih koncentracijah citotoksični. Posledično, v stroki obstaja potreba po dodatnih orodjih za zdravljenje raka in drugih motenj, povezanih s prekomerno ekspresijo in/ali prekomerno aktivnostjo katepsina B, kot so artritis, avtoimune bolezni, astma, nevrodegenerativne bolezni, periodontalna bolezen, mišična distrofija, osteoporoza itd..

Povzetek izuma

V teku intenzivnih študij, ki so vodile do predloženega izuma, so tukajšni izumitelji ugotovili, da nevtralizirajoča monoklonska protitelesa, usmerjena proti katepsinu B, zagotavljajo dodatno možnost za specifično inhibicijo omenjene proteolitske aktivnosti navedenega encima.

Torej predloženi izum po prvem vidiku zagotavlja nevtralizirajoča monoklonska protitelesa usmerjena proti katepsinu B, tako da se zmanjša njegova biološka aktivnost.

Po še eni izvedbi izum zagotavlja monoklonsko protitelo, ki prepozna katepsin B in zmanjša njegovo biološko aktivnost, pri čemer protitelo obsega glodalske variabilne regije in humane konstantne regije (kimemo protitelo).

Po še nadaljnjem vidiku predloženi izum zagotavlja humanizirana monoklonska protitelesa z gornjimi karakteristikami.

Predloženi izum zagotavlja tudi polipeptidne fragmente, ki obsegajo le del strukture primarnega protitelesa in ki posedujejo eno ali več imunoglobulinskih aktivnosti (miniprotitelesa).

Po še enem vidiku predloženi izum zagotavlja hibridomsko celično linijo, ki izraža takšno monoklonsko protitelo, in ki je bila deponirana pri Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Nemčija, dne 17.5.2001 in je dobila pristopno številko DSM ACC2506. DSMZ ima status mednarodnega depozitamega organa po Budimpeštanski pogodbi.

Predloženi izum zagotavlja tudi uporabo tukaj opisanih protiteles za zdravljenje in/ali diagnosticiranje bolezni, povezanih s prekomerno ekspresijo katepsina B in/ali njegovo prekomerno aktivnostjo. Takšna bolezen je še zlasti rak ali artritis.

Podroben opis izuma

Na slikah je:

Sl. 1 prikazuje rezultate izoelektričnega fokusiranja monoklonskih protiteles 2A2. Niz prog smo fokusirali v območju pl med 6,55 in 7,2, ki kaže monoklonalnost protitelesa.

Sl. 2 prikazuje rezultate inhibicije aktivnosti katepsina B na BODIPYL FL kazeinskem substratu z uporabo nevtralizirajočih anti-katepsin B protiteles. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili katepsin B.

Sl. 3A - 3E prikazujejo rezultate inhibicije invazije MCF-10A neoT celic skozi Matrigel z monoklonskim protitelesom (Mab) v smislu izuma (sl. 3A) in, za primerjavo, rezultate inhibicije z ireverzibilnim inhibitorjem E-64 (sl. 3B), CLIK-148 (sl. 3C), kokošjim cistatinom (sl. 3D) in SQAPI-podobnim inhibitorjem (sl. 3E). Za določitev molame koncentracije monoklonskega protitelesa 2A2, smo le-tega tretirali kot dvovalenti inhibitor.

Sl. 4 in 4A prikazujeta shemo za konstruiranje kimeme težke verige.

Sl. 5 in 5A prikazujeta shemo za konstruiranje kimeme lahke verige.

Sl. 6 prikazuje zaporedje nukleotidov variabilne regije težke verige monoklonskega protitelesa 2A2 (v sekvenčni listi predstavljeno kot SEQ ID NO:1). Izvedena regija amino kislin je prikazana v zgornji vrstici (v sekvenčni listi predstavljena kot SEQ ID NO: 2).

Sl. 7: prikazuje zaporedje nukleotidov variabilne regije lahke verige monoklonskega protitelesa 2A2 (v sekvenčni listi predstavljeno kot SEQ ID NO: 3). Izvedena regija amino kislin je prikazana v zgornji vrstici (v sekvenčni listi predstavljena kot SEQ ID NO: 4)

Protitelesa, ki so opisana tukaj in za katera je zahtevana zaščita, imajo sposobnost, da nevtralizirajo katepsin B. V kontekstu tega izuma je izraz nevtraliziranje definiran tako, da pomeni poslabšanje biološke aktivnosti. Ob upoštevanje tega smo ugotovili, da to poslabšanje verjetno prispeva k lastnosti predmetnih protiteles, da v bistvu ustavijo napredovanje metastaz.

Protitelesa v smislu predloženega izuma lahko pripravimo v katerikoli živali, ki je primerna za proizvodnjo protiteles, kot je miš, kunec ali kokoš. Vendar pa so, kadar jih uporabimo pri ljudeh, takšna protitelesa imunogena tako da posameznik, ki ga zdravimo, razvije imunski odziv proti dodanim protitelesom. Zaradi tega lahko protitelesa spremenimo, kot na primer s pomočjo kimerizacije. V ta namen nemodificirane ne-humane variabilne domene s pomočjo rekombinantne genske tehnologije povežemo s humanimi konstantnimi regijami lahke verige in težkih verig ter proizvedemo kimemo protitelo v ustreznih celicah. Na ta način se ohrani vezavna afiniteta originalnega ne-humanega protitelesa, medtem ko se imunogenost znatno zmanjša.

V naslednji stopnji lahko protitelo tudi humaniziramo. Za doseganje te naloge variabilne regije ne-humanega dela protitelesa prilagodimo humanim konformacijam. Tehnike za pripravo humaniziranih protiteles so v stroki dobro znane, kot je npr. navedeno v Hurle in Gross, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 428-433, 1994.

Z ozirom na predhodno, gre izraz protitelo interpretirati kot da obsega živalska protitelesa, kimema protitelesa, humanizirana protitelesa, pa tudi miniprotitelesa prej omenjenih tipov, prednostno fragmente kot so Fab, Fv in/ali scFv deli.

Protitelesa, modificirana na način, kot je opisan zgoraj, lahko proizvedemo v ustreznih celicah kot so E. coli, kvasovke ali sesalčje celice. Vendar pa so zaradi konformacijskih in imunogenskih razlogov prednostne sesalčje celice, ker lahko zagotovijo glikozilacijski vzorec, ki posnema vzorec normalnih humanih celic.

Po prednostni izvedbi predloženega izuma so variabilne regije težke verige in lahke verige monoklonskega protitelesa v smislu predloženega izuma takšne, kot so prikazane v priloženi sekvenčni listi in podane kot SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 in SEQ ID NO: 4.

Hibridomska celična linija, sposobna izraziti protitelo v smislu predloženega izuma, je bila deponirana 17.5.2001 pri Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Nemčija in je prejela pristopno številko DSM ACC2506. Ta hibridomska celična linija prav tako predstavlja predmet predloženega izuma.

Pokažemo lahko, da protitelesa v smislu predloženega izuma znatno zmanjšajo invazijo tumorskih celic skozi Matrigel, pri čemer umetni matriks posnema normalno tkivo. Torej lahko protitelesa v smislu predloženega izuma uporabimo za zdravljenje in/ali diagnosticiranje bolezni, povezanih s povečano koncentracijo in/ali aktivnostjo katepsina B, kot je rak ali artritis. Še zlasti lahko s protitelesom v smislu predloženega izuma dobro zdravimo rak, kot je npr. rak dojke, možgan, črevesni rak, pljučni rak, rak glave in vratu, rak prostate, ovarijev, melanom. Z uporabo nevtralizirajočega protitelesa v smislu predloženega izuma pa lahko zaviramo tudi tumorsko angiogenezo.

Presenetljivo se je izkazalo, da je katepsin B verjetno udeležen pri pojavu in razvoju artritisa. Potemtakem lahko tudi v tem primeru uporabimo protitelesa v smislu predloženega izuma.

Protitelesa lahko formuliramo v kakršnikoli galenski obliki, ki velja kot ustrezna, kot je raztopina ali prašek za raztopino za parenteralen vnos, t.j. subkutano, intramuskularno ali intravensko. Uporabimo lahko katerekoli sisteme za vnos zdravil, kot so liposomi, stealth liposomi, trdni nanodelci za intranazalno ali druge intervencije. Protitelesa lahko uporabimo skupaj s katerimikoli snovmi kot so toksini, radionukleotidi, druga monoklonska protitelesa, kemoterapevtiki in imunosupresivna sredstva, ki lahko pospešijo njihovo učinek ciljanja in terapevtski učinek.

Torej se predloženi izum nanaša tudi na farmacevtski sestavek, ki obsega protitelo, kot je opisano tukaj. Jasno je, da bo v odvisnosti od načina uporabe farmacevtski sestavek vseboval običajno uporabljane nosilce in ekscipiente. Poleg tega se pričakuje, da bo lečeči zdravnik izbral ustrezen način uporabe ob upoštevanju ustreznega stanja bolezni, ki jo zdravi.

Predloženi izum je ponazorjen z naslednjimi neomejujočimi primeri

Primer

1. Imunizacija

Z namenom pripraviti specifična monoklonska protitelesa, smo miši imunizirali z dobro očiščenim rekombinantnim humanim katepsinom B, izraženim v E. coli (Kuhelj et al., Eur. J. Biochem. 229: 533-539, 1996). Štiri BALB/c miši smo imunizirali subkutano s katepsinom B (25pg/miš), emulgiranem v kompletnem Freund-ovem adjuvansu, čemur so na 14., 28. in 42. dan sledile intraperitonealne injekcije enake količine antigena v nekompletnem Freund-ovem adjuvansu. 49. dan smo odvzeli testne krvne vzorce in z uporabo ELISA testa na imobiliziranemu antigenu določili titer anti-katepsin B specifičnih protiteles. Miši z najvišjim titrom smo dali na 56. in 57. dan intraperitonealno poživilno injekcijo katepsina B (30 μg/miš) v fiziološki solni raztopini in na 59. dan uporabili za fuzijo.

Priprava hibridomov

Za pripravo hibridomov smo 9,5 x 10⁶ splenocitov in 5,6 χ 10⁶ mielomskih celic (NS-l/l-Ag4-l) zlili z uporabo PEG (Koehler in Milstein, Nature 256: 495-497, 1975). Po fuziji smo hibridomske celice gojili na mikrotitrskih ploščah s 96 vdolbinicami ob uporabi gojišča DMEM, dopolnjenega s HAT. Po HAT selekciji smo supematante hibridomskih celic testirali na produkcijo protiteles, specifičnih za katepsin B, z uporabo ELISA testa na imobiliziranemu antigenu.

Presejavanje (screening) hibridomskih celic, ki proizvajajo nevtralizirajoča antikatepsin B protitelesa

Supematante hibridomov, pozitivnih na produkcijo protiteles proti katepsinu B, smo nadalje testirali na inhibitomo aktivnost proti katepsinu B z uporabo fluorimetričnega testa in sintetičnega substrata Z-Arg-Arg-AMC (Bachem, Švica). Presejavanje smo izvedli na fluorimetričnih mikrotitrskih ploščah s 96 vdolbinicami. Katepsin B (10 μΐ, 5xl0'⁸ M), aktivacijski pufer (30 μΐ, 4,5 mM cistein) in supematante (50 μΐ) smo predinkubirali 30 minut, nato dodali substrat (10 μΐ, 5 μΜ) in dodatno inkubirali 15 minut. Reakcijo smo ustavili z dodatkom jodacetata (100 μΐ, 1 mM). Katepsin B je razgradil Z-Arg-Arg-AMC v fluorescentni produkt 7-amino-4-metilkumarin. Njegovo prisotnost smo detektirali v fluorimetru z uporabo vzbujevalne valovne dolžine 370 nm in emisijske valovne dolžine 460 nm. V kontrolnem vzorcu smo uporabili DMEM. 24 klonov, ki so izražali najvišji inhibitomi učinek, smo subklonirali v mikrotitrskih ploščah s 24 vdolbinicami.

Po 10. dneh smo supematante iz posameznih klonov testirali na Z-Arg-Arg-AMC pri enakih pogojih, kot je opisano zgoraj. 10 klonov z najvišjo inhibicijo aktivnosti katepsina B smo prenesli najprej v 25 cm² in nato v 75 cm² plastenke za tkivne kulture. Protitelesa smo izolirali od supematantov z uporabo afinitetne kromatografije na protein A sefarozi.

Očiščena protitelesa smo testirali na inhibitomo aktivnost proti katepsinu B, najprej z uporabo Z-Arg-Arg-AMC, kot je opisano zgoraj, in nato z uporabo fluorescentnega BODIPY FL kazeina (Molecular Probes, ZDA). Za zadnjega smo katepsin B (20 μΐ, 1x10⁷M) najprej predinkubirali z aktivatorjem (10 mM cistein v MES pufru, pH 6,0) 15 minut. Nato smo dodali monoklonska protitelesa (50 μΐ, ΙχΙΟ'⁷ M) in substrat (100 μΐ, 10 μg/ml) ter zmes inkubirali 1 uro na ploščnem stresalniku pri 20°C, zaščiteno pred svetlobo. Vsebnost sproščenih fluorescentnih BODIPY FL peptidov je ustrezala nivoju aktivnega katepsina B. Fluorescentne peptide smo detektirali z vzbujevalno/emisijsko valovno dolžino 485/538 nm. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili katepsin B, inkubiran brez protiteles. Zmanjšanje fluorescence, izmerjeno v vzorcih v prisotnosti protiteles, je kazalo inhibitomo aktivnost izoliranih protiteles.

2. Biokemijska karakterizacija izbranih inhibitornih protiteles

Inhibicija invazije tumorskih celic z nevtalizirajočimi protitelesi

Epitelijska celična linija, pridobljena iz humanih prsi MCF10A neoT, je bila izpeljana iz starševske (parentalne) nesmrtne (imortalizirane) celične linije MCF10A (Soule et al., Cancer Res. 50: 6075-6086, 1990) s transfekcijo ob uporabi plazmida, ki je vseboval gen, rezistenten na neomicin, in humani T-24 mutirani Ha-ra.v onkogen (Ochieng et al., Invasion Metastasis 11:38-47, 1991), in je bila dobljena pri prof. B. Sloane-u, Wayne State University, Detroit.

Celice smo kultivirali do 80 % konfluentnosti kot enojno plast v 75 cm² plastenkah za tkivne kulture (Flacon, ZDA) v gojišču DMEM/F12 (1:1), dopolnjenem z 12,5 mM HEPES (Sigma, ZDA), 5 % fetalnim telečjim serumom (Hyclone, ZDA), 10 μg/nll hidrokortizona, 0,02 μg/ml epidermalnega rastnega faktorja (vsi Sigma, ZDA) in antibiotiki (penicilin, streptomicin, Krka, d.d. Slovenija) pri 37°C in 5 % CO₂. Za subkultivacijo smo celice odlepili z 0,05 % tripsinom in 0,02 % etilendiamintetracetatom (EDTA) v fosfatnem pufru (PBS). Pred uporabo v testih invazivnosti in viabilnosti smo celice odlepili z 0,4 % EDTA in 0,1 % govejim

-1010 serumskim albuminom (BSA) v PBS, pH 7,4. Viabilnost celic, uporabljenih v poizkusih, je bila vsaj 90 %, kar smo določali z barvanjem z nigrosinom. Celice smo gojili v prisotnosti fetalnega telečjega seruma, kateremu smo odstranili inhibitorje cisteinskih proteinaz z afmitetno kromatografijo na koloni s CM papain-sefarozo (Kos et al., 1992). Na kratko, 20 ml seruma, razredčenega 1:2 v/v z 0,02 M PBS pufra, pH 7,4, smo inkubirali z 10 ml CM papain-sefaroze (Pharmacia, Švedska) 20 minut in z njo napolnili kolono. Frakcije (3 ml) smo testirali na preostalo inhibitorno aktivnost z BANA (Bz-DL-Arg-2-Nnap, Serva, Nemčija) in shranili pri -20°C do uporabe.

Celice smo prešteli z MTT kolorimetričnim testom kot je opisan (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983). Test temelji na razgradnji rumene tetrazolijeve soli, 3-4,5 dimetiltiazol-2,5 difenil tetrazolijevega bromida (MTT) (Sigma, ZDA), v kristale formazana, ki so netopni v vodi, z mitohondrij skim encimom sukcinatdehidrogenazo, ki je prisoten v živih celicah. Kristale formazana smo raztopili z izopropanolom in izmerili optično gostoto na ELISA čitalniku (SLT, Rainbow) pri 570 nm, referenčni filter 690 nm.

Učinek nevtralizirajočih monoklonskih protiteles smo primerjali s tistim za naslednje naravne in sintetične inhibitorje cisteinskih proteinaz:

1. Ireverzibilni inhibitor E-64, trans-epoksisukcinil-L-levcilamido-(4gvanidino)butan (Sigma, ZDA) - splošni inhibitor cisteinskih proteinaz (Barret etal., Biochem. J. 201:189-198, 1982)

2. Reverzibilni proteinski inhibitor s tesno vezavo, kokošji cistatin - splošni inhibitor cisteinskih proteinaz (Kos et al., Agents Actions 38: 331-339, 1992)

3. CLIK-148 - epoksisukcinilni peptidni derivat (Premzl et al., Biol. Chem. 382: 2001), zagotovil prof. Nobuhiko Katunuma, Tokushima Burni University, Japonska - inhibitor katepsina L

4. Pepstatin A (Sigma, ZDA) - inhibitor katepsina D

5. SQAPI - podoben inhibitor - proteinski inhibitor katepsina D, izoliran iz buče, Cucurbitapepo (Christeller et al., Eur. J. Biochem. 254: 160-167, 1998).

-1111

Citotoksičnost nevtralizirajočih monoklonskih protiteles in inhibitorjev smo testirali, kot je opisano (Holst-Hansen in Briinner, Celi Biology, A Laboratory Handbook 2^nded. (Academic Press) str. 16-18, 1998). Na kratko, dodali smo celice s končno koncentracijo 5 χ 10⁴ celic/200 μΐ na vdolbinico mikrotitrske plošče s 96 vdolbinicami (Costar, ZDA). Dodali smo ustrezne koncentracije monoklonskega protitelesa, inhibitorja ali kontrolnega gojišča. Plošče smo inkubirali 24 ur pri 37°C in 5 % CO₂. Gojišče smo previdno odstranili, dodali 200 μΐ 0,5 mg/ml MTT in inkubirali tri ure pri 37°C in 5 % CO₂. Gojišče smo odstranili, raztopili kristale formazana v 200 μΙ/vdolbinico izopropanola. Absorbanco smo izmerili kot je opisano zgoraj. Vse teste smo izvedli v štirih paralelkah.

Učinke monoklonskega protitelesa in proteinaznih inhibitorjev na invazijo smo testirali z uporabo modificirane metode kot je opisana (Holst-Hansen et al., Ciin. Exp. Metastasis 14: 297-307, 1996). Uporabili smo Transwell plošče (Costar, USA) z 12 mm polikarbonatnimi filtri, velikosti por 12 pm. Na spodnjo stran filtrov smo nanesli 25 μΐ 100 pg/ml fibronektina (Sigma, ZDA) in jih pustili eno uro v sterilni komori, da so se posušili. Zgornjo stran filtrov smo prekrili s 100 μΐ 1 mg/ml Matrigela (Becton Dickinson, ZDA) in dodali 100 μΐ DMEM/F12. Matrigel smo preko noči sušili pri sobni temperaturi v sterilni komori in rekonstruirali z 200 μΐ gojišča eno uro pri 37°C. Zgornje oddelke smo napolnili z 0,5 ml celične suspenzije, končna koncentracija 4 χ 10⁵ celic/ml, ki je vsebovala ustrezno koncentracijo inhibitorja. Spodnje oddelke smo napolnili z 1,5 ml gojišča, ki je vseboval enako koncentracijo inhibitorja. Plošče smo inkubirali 24 ur pri 37°C in 5 % CO₂. H končni koncentraciji 0,5 mg/ml smo v zgornje in spodnje oddelke dodali MTT in plošče inkubirali nadaljnje 3 ure. Gojišča iz obojih oddelkov smo ločeno prenesli v Eppendorfove epruvete in centrifugirali pri 6200 vrt/min 5 minut. Supematante smo zavrgli in preostale kristale formazana raztopili v 1 ml izopropanola. Intenziteto barve smo merili kot je opisano zgoraj. Kot kontrole smo celice inkubirali z gojiščem, ki je vseboval ustrezne volumne metanola, destilirane vode in 50 mM NaHCO₃, 0,3 M NaCI, pH 7,5, topil, uporabljenih za pripravo koncentriranih raztopin monoklonskega protitelesa, in inhibitorjev. Invazijo smo zabeležili kot odstotek celic, ki so prešle

-1212 skozi filtre, prekrite z Matrigelom, v primerjavi s kontrolami in jo izračunali kot OD_spodnji/OD_spodnji+ OD_zgornji x 100. Vse teste smo izvedli v treh paralelkah.

3. Konstruiranje in ekspresija kimernega protitelesa

Priprava celotne RNA iz hibridomov, ki proizvajajo monoklonsko protitelo (MAb) proti katepsinu B

Celotno RNA smo izolirali iz 1,58 χ ΙΟ⁸ 2A2 hibridomske celične linije z uporabo gvanidinijeve metode.

Sinteza prve verige cDNA cDNA smo sintetizirali z RT-PCR.

Pomnoževanje genov V_L in V_H MAb s PCR in določitev njihovih zaporedij

Za PCR smo uporabili dva para primerjev:

Za lahko verigo:

A

Začetni primer (SEQ ID NO: 5):

NK4: 5'-GATGGATATCGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGG-3 '

Povratni primer (SEQ ID NO: 6):

NK3: 5'-GTGCCTCGAGTCGACTTAGCACTCATTCCTGTTGAATCTT-3 '

B

Začetni primer (SEQ ID NO: 7):

L5V: 5'-GTGTGCACTCTGATATTGTGATG-3 '

-1313

Povratni primer (SEQ ID NO: 8):

L3V: 5'-GGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTC-3 '

Za težko verigo:

A

Začetni primer (SEQ ID NO: 9):

NK-HD5: 5'-GTGAGAGCTCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCT-3 ' Povratni primer (SEQ ID NO: 10): nH3V: 5'-GGTGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3 '

B

Začetni primer (SEQ. ID NO: 11):

H5V: 5'-GTGTGCACTCTGAGGTGCAGCTG-3 '

Povratni primer (SEQ. ID NO: 12):

H3V: 5'-TGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3 '

PCR smo izvedli v GeneAmp PCR System 2400 (PERKIN ELMER) s primerjem za lahko verigo (primer NK4 in NK3) oziroma primerjem za težko verigo (primer NK-HD-5 in nH3V) znotraj 30 ciklusov pri naslednjih pogojih: pred-denaturacija pri 95°C 5 minut; denaturacija pri 95°C 30 sekund; prileganje pri 50°C 30 sekund in ekstenzija pri 72°C eno minuto. Produkte PCR smo prekontrolirali na 1 % agaroznem gelu in izrezali za nadaljnje čiščenje s kompletom GENELEAN.

Produkta PCR za lahko verigo in za težko verigo smo klonirali v pUC 19 oziroma pGEM-T Easy vektor. Njuna zaporedja smo določili z aparaturo ABI PPISM 310 Genetic Analyzer (PERKIN ELMER).

-1414

Konstruiranje kimerne lahke in težke verige

Skonstruirali smo kimemo lahko verigo oziroma kimemo težko verigo. Mišji Vl in Vh smo združili s konstantno regijo humanega IgG (Ck oz. Chi) in nato vstavili v ekspresijski vektor pcDNA3.

Lahka veriga

Po pomnoževanju fragmenta Vl s primerjema L5V in L3V pri naslednjih pogojih: pred-denaturacija pri 95°C 5 minut; denaturacija pri 95°C 30 sekund; prileganje pri 55°C 30 sekund in ekstenzija pri 72°C eno minuto, smo produkt PCR subklonirali v pUC/hCK, ki je vseboval humani C_K gen. Najprej smo kimemo lahko verigo subklonirali v pUTSEC vektor, ki smo ga dizajnirali zato, da smo zagotovili rekombinantne kimerne verige z začetnim peptidom, potrebne za sekrecijo proteinov (Li, E., et al., 1997). Na koncu smo kimemo lahko verigo in genomsko sekvenco s 163 bp, ki kodira sekrecijski signal težke verige mišjega imunoglobulina, klonirali v evkariotski ekspresijski vektor pcDNA3. Sekveniranje smo izvedli v vsakem vektorju, tako da smo potrdili pravilni vstavek.

Težka veriga

Po pomnoževanju fragmenta Vh s primerjema H5V in H3V pri naslednjih pogojih: pred-denaturacija pri 95°C 5 minut; denaturacija pri 95°C 30 sekund; prileganje pri 55°C 30 sekund in ekstenzija pri 72°C eno minuto, smo V_H domeno produkta PCR subklonirali v pUTSEC vektor in nato subklonirali v pUC/hlgGl vektor, ki je vseboval gen za humano Cyl regijo. Prav tako smo kimemo težko verigo klonirali v evkariotski ekspresijski vektor pcDNA3. Sekveniranje smo izvedli v vsakem vektorju, tako da smo potrdili pravilno zaporedje vstavka.

-1515

Transfekcija rekombinantne lahke verige in težke verige v Sp 2/0 celice mišjega mieloma ali celice ovarijev hrčka (CHO)

Približno 1 χ 10⁷ Sp 2/0 celic mišjega mieloma ali celic CHO smo resuspendirali v 0,5 ml hladnega PBS (10,1 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 3 mM KCI, pH 7,2) in dali v kiveto za elektroporacijo z elektrodno režo 0,4 cm; k celicam smo dodali 10 pg Bgl II-lineariziranih plazmidov (čistilni plazmidi lahke verige -pcDNA3 in težke verige -pcDNA3) in izvedli elektroporacijo z enojnim pulzom pri 960 μΡ, 290 V, v Bio-Rad genskem pulzatorju, opremljenim z ojačevalnikom kapacitete. Po elektroporaciji smo celice hranili 5-10 minut na ledu, jih sprali, resuspendirali v 10 ml gojišča z 10 % FCS RPMI 1640 in zasejali v 10 cm petrijevke z gostoto 3-4 χ 10⁵celic/petrijevko.

Po 24 urah smo dodali selektivno gojišče, ki je vsebovalo G-418 s končno koncentracijo 400 pg/ml. Supematante izbranih klonov smo pregledali z ELISA na ploščah, prekritih s katepsinom B in detektirali prisotnost izločenega kimemega MAb. Za preverjanje ekspersijskega produkta in afinitete kimemih MAb-jev smo uporabili tudi Westem - blot (prepivke).

Kimerno protitelo smo izolirali in testirali na inhibicijo invazije tumorskih celic kot je opisano zgoraj za glodalska protitelesa.

-1616

Sekvence:

V tej prijavi so vsebovane naslednje sekvence:

SEQIDNO: 1:	nukleotidna sekvenca variabilne regije težke	verige
monoklonskega protitelesa 2A2
SEQ ID NO: 2:	aminokislinska regija, izvedena iz nukleotidne sekvence variabilne regije težke verige monoklonskega protitelesa 2A2
SEQID NO: 3:	nukleotidna sekvenca variabilne regije lahke monoklonskega protitelesa 2A2	verige
SEQ ID NO: 4:	aminokislinska regija, izvedena iz nukleotidne variabilne regije lahke verige monoklonskega protitelesa	sekvence 2A2
SEQ ID NO: 5:	začetni primer za lahko verigo - NK4
SEQ ID NO: 6:	povratni primer za lahko verigo - NK3
SEQ ID NO: 7:	začetni primer za lahko verigo- L5V
SEQ ID NO: 8:	povratni primer za lahko verigo - L3 V
SEQ ID NO: 9:	začetni primer za težko verigo - NK-HD5
SEQ ID NO: 10:	povratni primer za težko verigo - nH3 V
SEQIDNO: 11:	začetni primer za težko verigo - H5V
SEQ ID NO: 12:	povratni primer za težko verigo - H3 V

-1717

Sekvenčna lista

SEQ ID NO: 1

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCAGGGGCCTCAATCAAGTTGTCCT

GCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAG

GGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGTTCC

GGGGCAAGGCCACTATGACTGCAGACACATCCTCCAAAACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCT

GACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGCGAGAAGGCATGGGTACTATGAAATGGACT

ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 2

QVQLQQSGAELVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFRG

KATMTADTSSKTAYLQLSSLTSEDTA\/YYCNARRHGYYEMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 3

GATATTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCT

TGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTGAATTGGTTATTACAGAGG

CCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTACTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAG

GTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATT

TGGGAGTTTATTACTGCGTGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCT

GGAAATAAAA

SEQ ID. NO.:4

DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLLSKLDSGVPDRFTG

SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO: 5

NK4: 5'-GATGGATATCGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGG-3 '

SEQ ID NO: 6

NK3: 5'-GTGCCTCGAGTCGACTTAGCACTCATTCCTGTTGAATCTT-3 '

SEQ ID NO: 7

LAV: 5'-GTGTGCACTCTGATATTGTGATG-3 '

-1818

SEQ ID NO: 8

L3V: 5'-GGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTC-3 '

SEQ ID NO: 9

NK-HD5: 5'-GTGAGAGCTCSAGGTSMARCTGCAGSAGTCT-3 '

SEQ ID NO: 10 nH3V: 5'-GGTGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3 '

SEQIDNO: 11

H5V: 5'-GTGTGCACTCTGAGGTGCAGCTG-3 '

SEQ ID NO 12:

H3V; 5'-TGGTCGACGCTGAGGAGACGGT-3 '

Za

Krka, tovarna zdravil, d.d., Novo mesto:

Claims

Patentni zahtevki

1. Nevtralizirajoče monoklonsko protitelo usmerjeno proti katepsinu B.
2. Protitelo po zahtevku 1, označeno s tem, da protitelo obsega glodalske variabilne regije in humane konstantne regije (kimemo protitelo).
3. Protitelo po zahtevku 2, označeno s tem, da so variabilne regije težke verige in lahke verige monoklonskega protitelesa kot so prikazane s SEQ ID NO: 1 in SEQ ID NO: 3.
4. Protitelo po kateremkoli od predhodnih zahtevkov, označeno s tem, da je protitelo humanizirano.
5. Protitelo po zahtevku 1, označeno s tem, daje protitelo miniprotitelo.
6. Celica, ki izraža monoklonsko protitelo po kateremkoli od predhodnih zahtevkov.
7. Celica po zahtevku 6, ki je bila deponirana 17.5.2001 pri Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH pod pristopno št. DSM ACC2506.
8. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da vsebuje protitelo po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5.
9. Protitelo po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5 za uporabo v zdravljenju in/ali diagnosticiranju bolezni, povezane s povišano aktivnostjo katepsina B.
10. Protitelo po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5 za uporabo v zdravljenju in/ali diagnosticiranju bolezni, povezane s povišano aktivnostjo katepsina B, označeno s tem, da aktivnost izhaja iz povišane koncentracije katepsina B.

-2020
11. Protitelo po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5 za uporabo v zdravljenju in/ali diagnosticiranju bolezni, povezane s povišano aktivnostjo katepsina B, označeno s tem, daje bolezen rak ali artritis.
12. Uporaba protitelesa po kateremkoli od zahtevkov 1 do 5 za izdelavo zdravila za zdravljenje in/ali diagnosticiranje bolezni, povezane s povišano aktivnostjo katepsina B.
13. Uporaba po zahtevku 12, kjer povišana aktivnost izhaja iz povišane koncentracije katepsina B.
14. Uporaba po kateremkoli od zahtevkov 12 ali 13, kjer je bolezen rak ali artritis.