CN111445991A - 一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法,包括以下步骤:利用现有的人体免疫细胞转录组数据作为训练集进行机器学习,得到免疫监测算法模型;对有免疫监测需求的个体收集其富含免疫细胞的体液样本,获得个体转录组数据;利用免疫监测算法模型对个体转录组数据进行分析,获得该个体的免疫监测数据,并结合其与健康人群的基准值比较以及其他临床检验数据和临床症状,获得该个体的单次临床免疫监测报告。本发明采用分子生物学的细胞转录组数据为基础数据,采用机器学习形成免疫监测算法模型,作为该智能免疫监测***的核心数据处理模块,彻底改变了临床免疫监测的形式,降低了样本使用量,灵活性强。
Description
技术领域
本发明涉及免疫监测技术领域,具体涉及一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法。
背景技术
人体体液(比如外周循环血)中的免疫细胞由淋巴细胞(如T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤/NK细胞)、单核细胞(Monocytes)、巨噬细胞(Macrophages)和树突状细胞(DCs)等多种细胞亚群组成,在正常生理情况下特定体液中每个亚群细胞的数量都相对稳定,有独特的形态学特点、分子生物学特点和特定的转录表达谱。
在目前的临床检验工作中,最常用的血液免疫细胞分析手段是血细胞分析仪,其工作原理是通过体积测量、电导检测、激光散射分析、化学染色等技术分析不同种类血细胞的物理化学特点,比如直径、体积、表面特征、电阻率,光散射脉冲次数、内部颗粒结构等等。
常规的血细胞分析仪包括半自动和全自动的三分类(或五分类)血液分析仪,可将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞(中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞)共3(或5)类细胞亚群。因为这类分析设备主要是根据细胞体积大小对免疫细胞进行粗略的分群,给出的自动分析报告只能在血液检查指标大致正常时才可作为白细胞分类的参考,当白细胞数量显著偏离参考范围或是仪器提示细胞数据异常时,仍然需要临床检验医师通过显微镜检查给出人工分析报告。
还有一类功能更强大的高端血液检测***称为血液流式细胞分析平台,将血液分析仪与流式细胞仪各自的优势整合在一起,比如贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司的新型血液流式分析平台HematoFlow使用6个免疫标志物的抗体试剂盒可获得多达16种细胞亚群(中性粒细胞、B淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、CD16+单核细胞等)的信息。
但目前的免疫监测手段,存在以下缺点:
(1)血液流式分析平台或者是单独使用流式细胞仪在异常样本检测、细胞治疗监测、免疫材料制备、器官移植监测、细胞因子监测,以及医学科研等过程中都有着重要的作用,但是因为流式分析仪器严重依赖进口,抗体耗材成本高,平台收费昂贵,所需样本量大,分析流程复杂等原因,该类平台的临床应用受到了限制;
(2)除了临床的需求之外,大量的基础医学和转化医学科研也需要对人或者实验哺乳动物的循环血样本中多种免疫细胞亚群做详细的数量分析,而当前的主要分析方法是流式细胞分选术,但是该方法对分析设备、样本量、耗材质量、操作者的经验等要求都比较高,而产出的细胞亚群种类有限,免疫细胞数据相对单一。
有鉴于此,针对上述免疫监测手段的局限性,亟需为医学临床实践和转化医学科研提供一种新型的免疫监测手段,以降低设备成本,提高适用性和输出数据的多样性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有的免疫检测手段存在经济成本高、操作复杂和产出数据单一、适用性差的问题。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是提供一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法,该方法采用富含免疫细胞的体液样本进行检测,所述方法包括以下步骤:
S10、利用现有的人体免疫细胞转录组数据和免疫细胞丰度数据作为训练集进行机器学习,得到免疫监测算法模型,该免疫监测算法模型包括多种免疫细胞亚群评分值,以体现各个免疫细胞亚群活性状态,以及整个免疫***的多样化程度、和协调/紊乱程度;
S20、对有免疫监测需求的个体收集其富含免疫细胞的体液样本,去除无核成分后抽提mRNA,获得个体转录组数据;
S30、利用免疫监测算法模型对个体转录组数据进行分析,获得该个体的免疫监测数据,并结合其与健康人群的基准值比较,以及其他临床检验数据和临床症状,获得该个体的单次临床免疫监测报告。
在另一个优选的实施例中,还包括步骤S40、通过对同一个体不同时间点不同阶段的多次临床免疫监测报告,描绘出代表相应多种免疫细胞亚群动态变化的监测曲线,与健康人群的基准线比较,结合该个体的健康史、疾病史和治疗史,获取随时间发展变化的多次连续临床免疫监测报告。
在另一个优选的实施例中,步骤S10中,从多种机器学***均排名最高的3-5种算法,再利用这3-5种算法分别分析每一个转录组特征,使用3-5倍交叉验证和平衡准确性度量,直到使用与发现队列同样来源但相对独立的验证集进行测试后得到的评估准确度在95%以上,从而确定最终的算法集合,构成免疫监测算法模型。
在另一个优选的实施例中,步骤S20中,转录组分析在Illumina的NGS RNA-Seq测序平台、赛默飞世尔科技的Affymetrix GeneChip基因芯片平台、或NanoString的nCounter平台上完成。
在另一个优选的实施例中,步骤S30和S40中,所述单次临床免疫监测报告和多次连续临床免疫监测报告的数据都采用本地数据库与云端数据库双储存平台,与中央数据中心联网,和终端随身设备同步,而且该免疫监测算法模型进行实时优化、分级和更新。
在另一个优选的实施例中,所述富含免疫细胞的体液样本为人体的外周血全血细胞或外周血单个核细胞。
在另一个优选的实施例中,步骤S20中,该富含免疫细胞的体液样本为3-5ml全血细胞或者超过106个的外周血单个核细胞,其中全血细胞样本需要使用EDTA或肝素抗凝剂,通过梯度离心法从血液样本中抽提出外周血单个核细胞,过滤掉离群的细胞,对合格细胞抽提mRNA之后,根据不同转录组分析平台的要求进行相应的DNA文库构建和转录组分析,最终得到完整的血液细胞转录组数据。
在另一个优选的实施例中,所述富含免疫细胞的体液样本包括但不限于人体的脑脊液、腹水、肺灌洗液或呼吸道标本。
与现有技术相比,本发明,提供了一种与传统监测方法截然不同的监测方法,传统的免疫检测方法通常利用流式细胞仪或血液流式分析平台等物理化学和形态学手段,但本发明采用高通量分子生物学手段收集的细胞转录组数据为基础数据,采用多种机器学习算法相结合的方法,形成免疫监测算法模型,作为本免疫监测***的核心数据处理模块。本发明彻底改变了免疫监测的形式,采用现在比较普遍且成本较低的转录组分析技术,有效降低了设备和试剂成本,为细胞基因数据的生物信息解读、免疫细胞的智能识别、和临床免疫监测的自动化报告等提供数据参照和算法依据,并且能够充分利用细胞转录组数据,有效提高输出数据的多样性。
附图说明
图1为本发明的工作流程图;
图2为本发明的多次临床免疫监测报告示意图;
图3为本发明的分析样例的聚类热度图;
图4为对本发明的分析样例中对免疫监测算法模型有贡献的71种基因的分布及权重的条形图;
图5为本发明的分析样例中临床患者的各个细胞亚群丰度图;
图6为本发明的分析样例中临床患者的所有细胞亚群整体二维分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法,下面以人体的外周血单个核细胞(即PBMCs)样本为例,结合说明书附图对本发明具体实施方式做出详细说明。
如图1所示,本发明提供的基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法,包括以下步骤:
S10.免疫细胞特征提取和标志物建模。
通过对现有的免疫细胞转录组数据和免疫细胞丰度数据进行比对和筛选,然后对提取出的特征基因的表达水平及其免疫相关关系,作为训练集进行机器学习和数学建模,得到的数学模型称之为免疫监测算法模型,该免疫监测算法模型能够将血细胞转录组数据转化为与每个免疫细胞亚群对应的评分值,以体现各个免疫细胞亚群活性状态,以及整个免疫***的多样化程度、和协调/紊乱程度。
S20.临床血液样本收集。
对有免疫监测需求的个体在需要的时间点收集其富含免疫细胞的体液样本,去除无核成分后抽提mRNA,然后制备DNA文库并进行血细胞样本的转录组分析,获得个体转录组数据;
S30.获取单次临床免疫监测报告。
通过对一次性获得的个体血液细胞转录组数据进行处理,利用免疫监测算法模型对个体转录组数据进行分析,获得该个体的免疫监测数据,免疫监测算法模型能够计算出来数十种免疫细胞亚群评分值,体现各个免疫细胞亚群活性状态,以及整个免疫***的多样化程度、和协调/紊乱程度,与健康人群的基准值比较,结合该个体的其他临床检验数据和临床症状等信息,从而获得该个体的临床免疫监测综合评估报告。
本发明专利申请,采用血液细胞作为样本进行免疫***检测,其免疫细胞亚群种类齐全,那么,也可以适应具体场合的要求,其他富含免疫细胞的体液样本类型(脑脊液、腹水、灌洗液、鼻咽拭子样本)也能够进行免疫监测。
与现有技术相比,本发明,提供了一种与传统监测方法截然不同的监测方法,传统的免疫检测方法通常利用流式细胞仪或血液流式分析平台等物理和形态学手段,但本发明采用高通量分子生物学手段收集的细胞转录组数据为基础数据,采用多种机器学习算法相结合的方法,形成智能免疫监测算法模型,作为本智能免疫监测***的核心数据处理模块。本发明彻底改变了免疫监测的形式,采用现在比较普遍且成本较低的转录组分析技术,有效降低了设备和试剂成本,为细胞基因数据的生物信息解读、免疫细胞的智能识别、和临床免疫监测的自动化报告等提供数据参照和算法依据,并且能够充分利用细胞转录组数据,有效提高输出数据的多样性。
在另一个优选的实施例中,本发明专利申请还包括步骤S40.获取多次临床免疫监测报告。
通过对同一个体不同时间点不同阶段的多次临床免疫监测报告,描绘出代表相应多种免疫细胞亚群动态变化的监测曲线,与健康人群的基准线比较,结合该个体的健康史、疾病史和治疗史,获取随时间发展变化的多次连续临床免疫监测报告。
在另一个优选的实施例中,步骤S10中,经过对公开的单细胞测序数据、免疫基因矩阵、以及免疫监测库数据组成的训练集进行机器学***均排名最高的3-5种算法,这3-5种算法可以采用袋装决策树BaggedDecision Trees、随机森林Random Forest、极度随机树Extra Trees、自适应增强AdaBoost和随机梯度提升Stochastic Gradient Boosting,然后采用集成方法把这3-5种给定算法结合,利用这3-5种算法分别分析每一个转录组特征,使用3-5倍交叉验证和平衡准确性度量,直到使用与发现队列同样来源但相对独立的验证集进行测试后得到的评估准确度(R2值)在95%以上,从而确定最终的算法集合,构成智能免疫监测算法模型。本实施例中,将每个算法用于采集和提取不同的基因矩阵特征,充分发挥每个算法的优势,来纠正数据本身的偏移以及其他误差。而且,对不同群体的样例可以进行算法集合的选择,并选择最优的算法集合,以提高每次样本监测的准确度。
在另一个优选的实施例中,步骤S20中,该血液样本为3-5ml全血细胞或者超过106个的外周血单个核细胞,其中全血细胞样本需要使用EDTA或肝素抗凝剂,通过梯度离心法从血液样本中抽提出外周血单核细胞,过滤掉离群的细胞,对合格细胞抽提mRNA之后,根据不同转录组分析平台的要求进行DNA文库构建和转录组分析,最终得到完整的血液细胞转录组数据。
在另一个优选的实施例中,步骤S20中,转录组分析在Illumina的NGS RNA-Seq测序平台、赛默飞世尔科技的Affymetrix GeneChip基因芯片平台、或NanoString的nCounter平台上完成。具体地,本实施例中,转录组分析RNA-Seq在Illumina的NGS测序平台IlluminaHiSeq 2500(人类基因组)上完成,通过R/Bioconductor数据包完成数据处理和基本分析。
在另一个优选的实施例中,步骤S30和S40中,单次临床免疫监测报告和多次连续临床免疫监测报告的数据都采用本地数据库与云端数据库双储存平台,与中央数据中心联网,和终端随身设备同步,而且该智能免疫监测算法模型进行实时优化、分级和更新。
在另一个优选的实施例中,富含免疫细胞的体液样本包括但不限于人体的脑脊液、腹水、肺灌洗液或呼吸道标本(如鼻咽拭子)。
下面为采用本发明的方法进行的免疫力分析样例。
一.建立智能免疫监测算法模型
分析样例中,将一组患者人数n=72,平均年龄16岁,三分之一为女性的I型糖尿病患者的T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞的混合测序数据作为训练集进行机器学***。
该分析样例的所有基因矩阵特征的表达水平和样品之间的相互关系如图3所示,其中,横坐标代表各个基因矩阵特征的数量,左边树状分类线代表72个样例患者的数目和对应基因矩阵特征的对应关系,上方代表72个样例患者共计56000个基因的表达水平。图5不仅将多个样例患者的相似的基因矩阵特征进行分组聚类,还将每个样例患者的基因表达状况都进行了详细的展示。颜色越深,代表该基因矩阵特征的表达水平相对较低,颜色越浅,代表基因矩阵特征的表达水平相对较高。
将上述数据进行初步整理之后,以细胞类型作为标记变量。然后将该数据集分为随机训练集和测试子集进行模型验证,最终实现了三种新的建模方法(随机森林RandomForest、极度随机树Extra Trees和随机梯度提升Stochastic Gradient Boosting)来预测细胞类型变量。
使用网格搜索进行超参数调整,并使用和R2值和均方根误差(RMSE)对这些模型的拟合度进行交叉验证和评估,最终的免疫模型评估报告显示该模型的R2值达到98.14%,而RMSE值为0.1362,评估结果的准确度高,达到预期效果。该操作是通过Python/sklearn等数据包完成的。
如图4所示,根据该模型筛选出对鉴定三种细胞亚群有用的基因矩阵特征为71个,每个基因矩阵特征对模型的贡献度和影响比重从0.004到0.05不等,基因矩阵特征对应的条柱越高,代表对模型的贡献度和影响比重越大,反之,则影响越小。
利用上述模型进行免疫分析,得到以下细胞亚群的具体信息:
二、对临床患者进行免疫检测。
1.临床患者和体液样本信息:男,45岁,病毒性肺炎,采集样本为外周血单个核细胞。经过处理得到转录组数据。
2.利用上一步的免疫监测算法模型对上述临床患者的外周血单个核细胞的转录组数据进行分析。然后得到细胞亚群状态丰度图和细胞亚群整体分布图,分别如图5和图6所示。图5中,Subsets代表亚群;图6中,Dim代表维度。
3.分析后得到免疫检测结果,如下表:
由此可知,利用本发明的免疫监测方法,能够对多个细胞亚群进行监测,对临床患者的免疫力检测十分精准,测得该患者体内的各个免疫相关的细胞亚群与正常指标存在的差异,对该患者的身体状况和疾病预测、治疗都起到了关键的辅证,因此本发明在临床使用上具有行之有效的监测力度和准确度。
本例子是用来详细说明本公开内容“智能免疫监测***”的实施方式,应当理解为本发明的保护范围不受具体实施方式的限制。
本发明,通过收集人外周血等富含免疫细胞的体液样本进行转录组表达分析和数据计算,与特定的免疫标志物数学建模模块比对,得到数十种细胞亚群的丰度分数和相关细胞因子的表达分数,从而为血液以及其他来源的免疫细胞提供快速而精准的定量分析,为临床和科研过程中的动态免疫细胞分析提供一种更广谱、更高效、同时成本更低、耗材量更少、且操作相对简单的方法。本发明与以往技术相比,具有以下有益效果:
1.与只测量3种或者5种免疫细胞亚群的传统临床免疫监测手段相比,本发明大幅度地提高了可监测的细胞亚群种类,提高了监测效率,为一线临床医生提供更丰富的血液或其他体液样本的免疫学检测报告,从而为治疗策略的决定提供了参考依据;
2.与需要做细胞分选和染色的传统监测手段相比,直接分析全血细胞样本,省却了活细胞分选和染色处理的过程,因此简化了分析流程,将出报告的时间从2-3天降低为当天内出报告,最终减少了临床检验医生的工作量,降低了对医院检验资源的占用;
3.与传统方法中每种细胞亚群的结果都需要重新采样和分析不同,此项技术一次样本量(5-10ml)可直接得出所有免疫细胞亚群的评估报告,大幅度的降低了样本使用量,同时减少了临床检查费用,减轻受检患者及其家属的经济负担;
4.传统监测方法所依赖的流式细胞分析设备和免疫标志物的抗体耗材价格昂贵且大多数为进口产品,成本高昂,本发明采用国内大量医院都已经普及的转录组分析方法和数据,并利用智能免疫监测模型进行分析,不需要购置费用高昂的耗材,简化实验室建设,有效降低检测成本;
5.相对于需要大量样本和昂贵抗体试剂而数据产出单一的流式细胞术,本技术只需要少量的样本,样本采取更便捷,基于成本已大幅度降低的转录组分析和免疫监测算法模型,在获得完整的免疫转录组表达数据的同时,得到详细的免疫监测数据;
6.免疫监测算法模型是机器学***台和样本类型等多种因素的调整而自动升级、分级和优化;
7.不仅为临床免疫监测提供新方法,同时也为医学免疫学、医学遗传学、肿瘤学等领域的医学科研提供了一种新型免疫细胞监测手段。
本发明并不局限于上述最佳实施方式,任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化,凡是与本发明具有相同或相近的技术方案,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于细胞转录组数据进行临床免疫监测的方法,该方法采用富含免疫细胞的体液样本进行检测,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S10、利用现有的人体免疫细胞转录组数据和免疫细胞丰度数据作为训练集进行机器学习,得到免疫监测算法模型,该免疫监测算法模型包括多种免疫细胞亚群评分值,以体现各个免疫细胞亚群活性状态,以及整个免疫***的多样化程度、和协调/紊乱程度;
S20、对有免疫监测需求的个体收集其富含免疫细胞的体液样本,去除无核成分后抽提mRNA,获得个体转录组数据;
S30、利用免疫监测算法模型对个体转录组数据进行分析,获得该个体的免疫监测数据,与健康人群的基准值比较,结合其他临床检验数据和临床症状,获得该个体的单次临床免疫监测报告。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括:
步骤S40、通过对同一个体不同时间点不同阶段的多次临床免疫监测报告,描绘出代表相应多种免疫细胞亚群动态变化的监测曲线,与健康人群的基准线比较,结合该个体的健康史、疾病史和治疗史,获取随时间发展变化的多次连续临床免疫监测报告。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S10中,从多种机器学***均排名最高的3-5种算法,再利用这3-5种算法分别分析每一个转录组特征,使用3-5倍交叉验证和平衡准确性度量,直到使用与发现队列同样来源但相对独立的验证集进行测试后得到的评估准确度在95%以上,从而确定最终的算法集合,构成免疫监测算法模型。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S20中,转录组分析在Illumina的NGSRNA-Seq测序平台、赛默飞世尔科技的Affymetrix GeneChip基因芯片平台、或NanoString的nCounter平台上完成。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤S30和S40中,所述单次临床免疫监测报告和多次连续临床免疫监测报告的数据都采用本地数据库与云端数据库双储存平台,与中央数据中心联网,和终端随身设备同步,而且该免疫监测算法模型进行实时优化、分级和更新。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述富含免疫细胞的体液样本为人体的外周血全血细胞或外周血单个核细胞。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤S20中,该富含免疫细胞的体液样本为3-5ml全血细胞或者超过106个的外周血单个核细胞,其中全血细胞样本需要使用EDTA或肝素抗凝剂,通过梯度离心法从血液样本中抽提出外周血单个核细胞,过滤掉离群的细胞,对合格细胞抽提mRNA之后,根据不同转录组分析平台的要求进行DNA文库构建和转录组分析,最终得到完整的血液细胞转录组数据。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述富含免疫细胞的体液样本包括但不限于人体的脑脊液、腹水、肺灌洗液或呼吸道标本。
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