SE503288C2 - Fiskvaccin omfattande en virulent, invasiv bakterie samt förfarande för framställning av detsamma - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 A'so3 288 2 (Kawano et al., Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 50, 1984, s 771-774; Ward et al., i Fish Immunology, M.J. Manning och M.F. Tatner (eds), 1985, s 221-229). att injektion av ett vaccinpreparat ger överlägset det Experiment har visat basta resultatet med den längsta immuniseringsdurationen, medan nedsänkning och oral administrering ger ett mindre effektivt skydd mot de ifrågavarande infektionerna.

Vidare har ett vaccin som omfattar kloroform-inakti- lösligt antigen och kombinerat helcell och lösligt antigen av en avirulent stam av Aeromonas sal- verade hela celler, monicida visats skydda fisk mot furunkulos (Cipriano et J. World Maricul. Soc., 1983, 14, 201-211).

En förbättrad förståelse av de patogena egenskaperna al., hos fiskpatogener mot vilka det är önskvärt att utveckla en bra immunrespons är viktig för konstrueringen av ett effektivt vaccin. Trots den utbredda förekomsten av epi- zooti i fiskfarmar förorsakat av en mångfald olika pato- gener, både bakteriella och virala, har studier beträf- fande egenskaper som bidrar till virulens hittills varit begränsade i antal. Ifråga om V. anguillarum, har ett antal studier fastställt förekomsten i denna bakterie av en virulensplasmid av 65 kb (kilobaspar) vilken kodar för ett komplext system som är viktigt för bakteriens förmåga att ta upp Fe3+ (Crosa, Nature 284, 1980, s 566-568). har visat för många patogena mikroorganismer att förmågan att ta upp Fe3+ är viktig för bakterierna under infek- tionsprocessen. Om V. anguillarum botas från virulens- plasmiden blir den avirulent för fisk (Crosa et al., Infect. 27, 1980, s 897-902).

Vidare beskriver ett antal publikationer möjliga Man Immun. virulensdeterminanter, såsom serumresistens (Trust et al., Infect. 34, 1981, s 702-707), hemolysin (Munn, FEMS Microbiol. Lett. 3, 1978, s 265-268), extracellulärt proteas (Inamura et al., Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 51, 1985, s 1915-1920) och andra extracellulära faktorer (Kodama et al., Am. J. Vet. Res. 45, 1984, s 2203-2207).

Det har varit möjligt att på ett eller annat sätt Immun . 10 15 20 25 30 35 503 288 3 korrelera dessa virulensdeterminanter med utbrott av sjukdomen. Det har emellertid ännu inte slutligt bevisats att dessa bakteriella produkter är virulensdeterminanter som är viktiga för bakteriens patogenicitet.

Under senare år har intresset ökat för utveckling av levande vacciner baserade på levande, försvagade bakte- riestammar för användning vid förebyggande av humana sjukdomar, särskilt mot enterala agens (Hone et al., J.

Inf. Dis. 156, 1987, s 167-174; Wahdan et al., J. Inf.

Dis. 145, 1982, s 292-295). Cipriano och Stasliper, Prog. 167-169, har beskrivit ett vaccin Levande Fish-Cult., 44, 1982, som omfattar en försvagad A. salmonicida stam. vacciner har i allmänhet den fördelen jämfört med vacciner baserade på avdödade patogener eller bakteriella kompo- nenter att de ger en högre grad av immunitet jämte en mer prolongerad effekt, och är mera fullständiga än när en- skilda komponenter, såsom antigener, administreras. Där- till kan de erfordra en verksam dosering som är mindre jämfört med avdödade patogener eller enskilda komponenter.

Levande vacciner kan också vara billigare att framställa än de som är baserade på en renad enskild komponent, eftersom inget reningssteg erfordras. Det skulle därför vara en fördel att utveckla ett levande vaccin för admi- nistrering åt fisk som erfordrar en lägre immuniserings- dosering än existerande fiskvacciner baserade på avdödade patogener eller membrankomponenter.

Det finns klart ett behov av att utveckla ett vaccin mot fiskpatogener, vilket kan framkalla ett långvarigt och effektivt immunologiskt skydd mot ett brett spektrum av fiskpatogener efter nedsänkning av fisken i vaccinet.

Idealiskt bör ett vaccin omfatta en bakteriestam som besitter så många karaktäristikor för patogena mikroorganismer som möjligt, men utan deras förmåga att förorsaka sjukdom. Det är av speciell betydelse att utvälja vaccinstammar som kan penetrera in i och proliferera i fiskkroppen, för att därigenom framkalla en stark immunrespons. 10 15 20 25 30 35 "5o3 288 SANHVIANFATTNING AV UPPFINNINGEN Följaktligen hänför sig föreliggande uppfinning till ett levande vaccin för immunisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpatogener, varvid vaccinet omfattar en avirulent, invasiv, immunogen mutant stam av en fiskpato- gen bakterie.

Uttrycket "patogen" anger en mikroorganisms förmåga att förosaka sjukdom. Patogenicitet är en taxonomiskt signifikant bestämning och är egenskapen hos en species; sålunda patogen för fisk. Individuella stammar av en bakterie- säges t ex bakteriespecies Vibrio Anguillarum vara species kan emellertid vidsträckt variera ifråga om deras förmåga nicitet bestämning för en stam inte ett species; man kan tala om att skada värdspecies, och denna relativa patoge- kallas "virulens". Följaktligen är virulens en en högvirulent, en lågvirulent eller t o m en avirulent stam av en särskild mikrobiell species, t ex Vibrio anguillarum. I allmänhet bestäms virulensen hos en stam av ett patogent species av två faktorer: dess "invasionsför- måga", eller förmåga att penetrera in i och proliferera i värdens kropp, och dess "toxigenicitet", eller förmåga att producera kemiska substanser som skadar värdens vävnader.

En virulent stam av ett bakteriespecies kan förlora sin virulens, men fortfarande bibehåller sin förmåga att invadera värden men utan att förorsaka sjukdom.

I detta sammanhang förstås uttrycket "avirulent" betyda att en ursprungligen virulent bakteriestam har förlorat sin förmåga att förorsaka sjukdom i fisk som infekterats med stammen, ehuru dess förmåga att invadera fisk, dvs att penetrera in i fisken genom den vanliga vägen för bakterier och att proliferera i fiskkroppen förblir väsentligen intakt, varvid det är en avgjord fördel att bakterierna själva har förmåga att penetrera in i fisken för att framkalla en relevant immunrespons där istället för att man måste lita till yttre metoder, såsom 10 15 20 25 30 35 503 288 5 injektion (detta är ett för dyrt, ehuru effektivt, admi- nistreringssätt när det gäller fisk) för att komma till ett ställe i fisken där deras närvaro kommer att alstra en relevant immunrespons. Avirulenta mutanter av patogena bakterier kan utväljas genom att underkasta fisk för experimentella infektioner genom nedsänkning i en sus- pension som kontaminerats med varje mutant stam och att bestämma LDSO (den dosering som erfordras för att döda 50% av fisken i badet), exempelvis så som beskrivits i detalj i Exempel 1 nedan. som över- skrider vid nedsänkning 2xlO7 bakterie/ml definieras som avirulent inom ramen för föreliggande uppfinning. Emel- lertid kan för andra stammar som är användbara i levande En mutant stam med en LDSO vacciner enligt uppfinningen LD50 vara lägre, vilka stam- mar ändå anses vara avirulenta.

Graden av virulens hos en särskild bakteriestam kan också bero på känsligheten hos olika fiskspecies för bak- terierna.

I föreliggande sammanhang definieras uttrycket "mu- tant stam" som en stam vilken har isolerats som en spontan mutan (ett frekvent fenomen i naturen) eller i vilken en mutation har avsikligt inducerats genom underkastande av en moderbakteriestam för behandling med ett mutagen, såsom ultraviolett strålning, joniserande strålning, eller ett kemiskt mutagen, såsom mitomycin C, 5-bromouracil, metyl- metansulfonat, kvävesenapsgas eller en nitrofuran, eller genom tillgripande av rekombinant DNA-tekniker.

Uttrycket “immunogen" förstås betyda att stammen har förmåga att framkalla en relevant immunrespons i den fisk till vilken vaccinet har administrerats. Det finns belägg för att föreslå att levande, verket kan framkalla en starkare immunreaktion än avdödade försvagade stammar i själva patogener, eftersom antigendeterminanterna hos en levande stam inte skadas genom kemisk behandling. Föredragna stam- mar enligt uppfinningen är sådana som ger immunitet mot både homologa och heterologa stammar av samma patogen, dvs både moderstammen från vilken mutanten härstammar och i'5o3 288 10 15 20 25 30 35 6 andra patogena stammar av samma species, för att åstad- komma ett bredspektrumskydd mot patogenen ifråga. Det har t o m fastställts (jämför Exempel 2 i föreliggande be- skrivning) att vissa mutanta stammar kan ge upphov till korsskydd mot en annan bakteriespecies än den till vilken den mutanta stammen hör, utan att något DNA från det andra species, som kodar för en antigendeterminant därav, av- siktligt har införts i mutanten. Det finns också vissa indikationer på (jämför Exempel l i föreliggande beskriv- ning) att mutanter valda eller avsiktligt inducerade från virulenta stammar som har förmåga att infektera fisk genom nedsänkning visar ett särskilt högt skydd genom den nedsänkta vaccinationen, varvid anledningen eventuellt är att den höga virulensen hos moderstammen återspeglar en hög grad av invasionsförmåga, vilken egenskap bibehålls i mutanten som härstammar därifrån.

I en annan aspekt hänför sig föreliggande uppfinning till en avirulent, invasiv mutant stam av en fiskpatogen bakterie för användning som ett levande vaccin för immu- nisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpato- gener.

I en ytterligare aspekt hänför sig uppfinningen till användning av en sådan levande, avirulent, invasiv mutant stam för framställning av ett levande vaccin för immunise- ring av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpatogener, jämte ett förfarande för immunisering av fisk mot sjuk- domar förorsakade av fiskpatogener, vilket omfattar admi- nistrering åt fisken av en immunologiskt effektiv mängd av en levande, avirulent, invasiv, mutant stam av en fiskpa- togen bakterie.

I ytterligare en aspekt hänför sig uppfinningen till en fisk vilken har immuniserats med det levande vaccinet enligt uppfinningen. Denna kommer i allmänhet att höra till en av de fiskspecies som odlas för kommersiella än- damål, huvudsakligen laxfisk som hittills har varit av största kommersiella betydelse, såsom olika species av genus Salmo, Salvelinus och Oncorhynchus, men också ål, 10 15 20 25 30 35 503 288 7 havskatt, karp och ayu (kommersiellt odlad i Japan).

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Förutom att bli isolerad som en spontan mutant av en patogen bakterie eller framställas genom behandling av en virulent patogen bakterie med ett mutagen, såsom ovan an- givits, kan den avirulenta mutanta stammen också framstäl- las genom botande av en virulent stam från en virulens- plasmid, eftersom denna gör bakterien avirulent för fisk, ifråga om V. anguillarum en 65 kb plasmid; jfr Crosa et al., Infect. 27, 1980, s 897-902). Vidare kan den mutanta stammen vara en i vilken en gen vars produkt erfordras för bakteriell virulens är defekt eller frán- varande, dvs en stam som framställts genom rekombinant DNA-tekniker (detta inkluderar en defekt i en promotor eller ett reglersystem för genen). Genen kan vara en som kodar för en av de postulerade virulensdeterminanterna, såsom serumresistens, hemolysin, extracellulärt proteas och eventuellt andra extracellulära toxiska produkter som ovan angivits, men kan också koda för andra funktioner eller produkter som är viktiga för bakteriernas virulens.

Defekten i genen kan orsakas av en DNA-insättning, som får avläsningsrammen för genen ur fas. DNA-insätt- ningen kan vara av vilken som helst längd från ett enda baspar till en hel gen. Kortare insättningar kan utföras genom site-specifik mutagenes medelst syntetiska oligonuk- leotider på ett i och för sig känt sätt, t ex såsom be- skrivits i G. Winter et al., Nature 299, 1982, s 756-758, eller Zoller och Smith, Nucl. Acids Res. 10, 1982, s 6487- 6500. Insättningar av större DNA-fragment kan utföras genom genblockinsättningar (Forsberg och Wolf-Wats, Mol.

Microbiol. 2, 1988, s 121-137): sådana insättningar kan antingen vara i-ramen (t ex antibiotika-markörer) eller Immun. ur-ramen.

Förutom detta kan DNA-insättningen vara i form av en transposon-insättning. En transposon kan införas slumpvis i en virulent stam genom konjugering av denna stam med en bakterie som bär en transposon, på i och för sig känt sätt 10 15 20 25 30 35 "5os 288 8 (Ely, B., Mol. Gen. 200, 1985, s 302-304). lenta stammar som resulterar från konjugeringsexperimentet Genet. Aviru- kan isoleras genom avsökning för unika transposanter och testning av dessa för avirulens, exempelvis i LDSO-testet som beskrivs i Exempel 1 nedan.

Vid alstrande av avirulenta stammar genom transposon- insättning finns det en liten risk att sådana stammar kan återgå till vild-typ, dvs excidera transposon-DNA och igen blir virulent. ligt föreliggande uppfinning som framställs genom trans- Det bör emellertid noteras att stammar en- posonmutagens har testats för återgång genom odling under 500 generationer och ingen sådan återgång har uppträtt.

Stammar som inte kan återgå till vild-typ kan framställas genom partiellt eller fullständigt utplånande av en gen vilken producerar en produkt som är essentiell för bak- teriell virulens eller ett promotor- eller reglersystem för denna gen. För att göra ett sådant utplånande kan det vara nödvändigt att Detta kan av transposon-sitet först identifiera genen som är av intresse. exempelvis göras genom identifiering i en framgångsrikt transposerad mutant genom hybridisering enligt konventionella förfaranden (Maniatis et al., i Manual, Cold Spring Molecular Cloning. A Laboratory Harbor, 1982) inbegripet isolering av ett DNA-fragment som bär en del av transposonen och en del av genen medelst en syntetisk, homolog, oligomer sekvens, och med användning av detta fragment som en prob för av- sökning av vild-typen genom konventionella hybridiserings- förfaranden (jfr Southern, Methods in Enzymology 68, 1980, s 151-176). När den relevanta genen en gång har identifie- rats är det möjligt att utplåna den partiellt eller full- ständigt, exempelvis med användning av lämpliga restrik- tionsenzymer, site-dirigerad mutagenes genom homolog rekombination med en syntetisk oligonukleotid som innehål- ler färre basbar än DNA-fragmentet på genen med vilken det är homologt (t ex såsom beskrivits av Chan och Smith, Nucl. Acids Res. 12, 1984, s 2407-2419, eller G. Winter et Soc. Trans. 12, 1984, s 224-225) eller genom al., Biochem. 10 15 20 25 30 35 503 288 9 införande av direkt repeterade nukleotidsekvenser vid var- dera änden av genen och utväljande av mutanter i vilka genen har avlägsnats genom rekombinationsexcision. När sådana defekta gener har framställts kan de insättas i sitet hos intakta gener i virulenta stammar genom homolog rekombination för att åstadkomma ytterligare avirulenta stammar.

Man räknar med att avirulenta, stammar kan framställas pà detta sätt fràn vilka som helst kända fiskpatogena bakterier, och exempel pà dessa är stammar av Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller Flexibacter columnaris, invasiva mutanta acromogenes, Aeromonas hydrophila, Cytophaga spp., salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Sporocytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus och Yersinia ruckerii. En för närvarande_föredragen fiskpato- gen är V. anguillarum.

Prover av specifika, isolerade, avirulenta stammar av V. anguillarum enligt uppfinningen har deponerats i enlig- het med bestämmelserna i Budapestöverenskommelsen för Internationellt erkännande av deponering av mikroorganis- mer för patentändamàl den 31 mars 1988 i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 18, Braunschweig, Västtyskland med följande accessionsnummer: VAN 20 DSM 4506 VAN 70 DSM 4507 VAN 1000 DSM 4508 Det är emellertid uppenbart för fackmännen pá området att andra avirulenta mutanter av denna eller en annan fiskpatogen bakterie kan isoleras på ett liknande sätt, med användning av utvalskriterierna och förfarandena som ovan angivits och beskrivits i Exemplen, utan att fràngá (503 288 10 uppfinningstanken och skyddsomfànget i föreliggande uppfinning.

Man räknar vidare med att den mutanta stammen enligt uppfinningen kan vara en som bär en DNA-sekvens som kodar för en antigendeterminant från en annan fiskpatogen, sàsom en bakterie eller ett virus och har förmåga att uttrycka kan nämnda DNA-sekvens. Nämnda DNA-sekvens kan ha vilken som helst lämplig längd, inbegripet en sekvens som kodar för en enda epitop upptill en sekvens som kodar för hela antigenet. Antigendeterminanten som uttryckts från sekven- sen behöver inte vara en virulensdeterminant, utan kan vara vilken som helst determinant som ger upphov till en relevant immunrespons i den fisk till vilken vaccinet administreras. Sålunda kan determinanten exempelvis väljas bland bakteriella endo- eller exotoxiner, adhesiner eller virala höljesproteiner eller fragment därav.

Patogenerna frán vilka antigendeterminanten kan här- stamma kan väljas bland A. bakteriepatogener för fisk och de sjukdomar som är associerade med dem.

BAKTERIE SJUKDOM Aeromonas salmonicida Furunkulos Aeromonas hydrophila Motil aeromonas septikemi Yersinia ruckeri Enteral rödmun Vibrio anguillarum Vibrios Vibrio ordalii Vibrios Flexibacter columnaris Columnaris Cytophaga psychrophila Lágtemperatursjukdom Cytophaga eller Flavobacterium Renibacterium salmoninarum Lactobacillus sp.

Edwardsiella tarda Pseudomonas sp.

Pasteurella sp Bakteriell gälsjukdom Bakteriell njursjukdom Pseudonjursjukdom Edwardsiellos Bakteriell hemorragisk septikemi Pasteurellos 503 288 11 BAKTERIE SJUKDOM Cytophaga och andra Fenröta Sporocytophaga sp. Saltvatten columnaris Mycobacterium sp. Mykobakterios Norcardia asteroides Nocardios Streptomyces sp. Streptomykos Streptococcus sp. Streptokockos Eubacterium tarentellus B. fiskvirus VIRUS Eubakteriell meningit GRUPP Infektiös Pancreasnekrosvirus Infektiös Hematopoiesnekrosvirus Herpesvirus salmonis Kanalhavskattvirus NeVTA Virus Onchorhynchus masou Virus Lymphocystis Virus Karpgälnekrosvirus Blàgälvirus Alvirus 2 Ålvirus A Ålvirus X Viral Hemorragisk Septikemivirus Spring Viremia av Karpvirus Gäddyngelrabdovirus Golden Shiner virus Ålvirus E Chum laxvirus Ålvirus 1 Grunt Fin Agent Reovirus-liknande Rabdovirus Herpesvirus Herpçsvirus Herpesvirus Herpesvirus Iridovirus Iridovirus-liknande Ortomyxovirus Ortomyxovirus Rabdøvirus Rabdovirus Rabdovirus Rabdovirus Rabdovirus Reovirus-liknande Reovirus-liknande Reovirus ogrupperat ogrupperat A503 288 10 15 20 25 30 35 12 (Båda tabellerna visas i Jorge H. Crosa (ed.), Bacterial and Viral Diseases of Fish: Molecular Studies. 1983).

En mutant stam som bär en antigendeterminant från en University of Washington, Seattle, annan fiskpatogen kan framställas i enlighet med tekniker som är väletablerade på humanmedicinområdet där flera exempel på levande orala vacciner omfattande en antigen- determinant uttryckt av en annan organism har utvecklats, t ex ett hybrid-Salmonella/Shigellavaccin (Formal et al., Infect. 34, 1981, s 746-750). Man kan föreslå två olika vägar för framställning av ett levande vaccin av Immun. denna typ: antingen kan en gen från fiskpatogenen isole- ras, karaktäriseras och testas för antigenegenskaper följt av insättning i en värdbakterie, eller kan genomiskt DNA från fiskpatogenen "shotgun"-klonas in i en värdbakterie och en eller flera stammar med en lämplig antigenicitet kan därefter utväljas. I det senare fallet kan stammarna konstrueras med användning som kloningsvektor av en plasmid med brett värdomràde som har förmåga att replikera i exempelvis E. coli och den önskade värdstammen, t ex V. anguillarum. Kloningsvektorn bör vidare bära en kloningskassett (dvs en DNA-sekvens som omfattar flera restriktions-sites och har förmåga att mobilisera från E. coli till V. anguillarum). När ett genbibliotek för patogenen ifråga konstrueras klonas först genomiskt DNA från patogenen i E. coli, och vektorn som bär detta genomiska DNA överförs sedan till exempelvis V. anguil- larum. Hybridbakterierna kan sedan användas för att infektera fisk enligt förfarandet som ovan beskrivits, och 2-4 veckor senare testas den infekterade fisken för immu- nitet mot patogenen ifråga.

Ehuru genen eller den subsekvens därav som kodar för antigendeterminanten teoretiskt kan insättas i och ut- tryckas av en bakterie som inte är patogen för fisk, är det föredraget att insätta den i en mutant stam enligt uppfinningen för att säkerställa en hög infekteringsgrad 10 15 20 25 30 35 503 288 13 och att erhålla immunitet mot två eller flera patogener medelst samma vaccin. Det anses vara särskilt fördelaktigt att konstruera en avirulent, invasiv mutant stam enligt uppfinningen genom insättning av genen eller den subsek- vens därav som kodar för antigendeterminanten in i en gen hos en patogen värdbakterie vars produkt krävs för bak- teriell patogenicitet, och sålunda erhålles i en operation en avirulent mutant stam som ger immunitet inte endast åt värdbakterien, utan också åt andra fiskpatogener. särskild utföringsform av vaccinet har inte endast en, utan två eller flera DNA-sekvenser som kodar för antigen- determinanter från olika fiskpatogener införts för er- hållande av ett vaccin som erbjuder bredspektrum skydd mot Ien en rad fiskpatogener.

När en lämplig mutant stam en gång har isolerats kan den förökas genom odling av den utvalda stammen i ett lämpligt kulturmedium aerobiskt under betingelser som är lämpade för förökning av varje bakterie-species under en tidsperiod som är tillräcklig för att ge minst 108 bak- terier/ml medium och de resulterande bakterierna skördas från mediet. Mediet är lämpligen ett rikt medium såsom Trypticas-sojabuljong; Luriabuljong, Näringsbuljong, Hjärna-hjärta-infusionsbuljong, eller liknande som inne- håller de erfordrade kol och kvävekällorna och mineral- näringsämnen. För odling av havsvattenpatogener, bör mediet dessutom utökas med NaCl i en mängd som motsvarar eller är något över den som finns i havsvatten, typiskt ca 1,5-2%. Odlingstemperaturen kommer typiskt att vara i området 18-25°C, och pH i området 6,8-7,8.

Ehuru det är teoretiskt möjligt att tillsätta bakte- rierna i den form de odlats, dvs odlingsmediet innehål- lande bakterierna, till den suspension i vilken fisken skall nedsänkas, är det i allmänhet föredraget att fram- ställa ett koncentrat för erhållande av ett högre bak- terieantal för administrering. Koncentratet kan exempelvis framställas genom centrifugering eller filtrering, och bakterierna kan vidare tvättas före tillsättning till "sus 10 15 20 25 30 35 288 14 badet. Bakteriekoncentratet kan sedan tillsättas i vått tillstånd eller kan, långtidslagring, frystorkas eller spraytorkas på i och för för att underlätta transport och sig känt sätt. Det resulterande pulvret kan sedan sättas direkt till nedsänkningsbadet eller kan blandas med fiskfoder och doseras oralt åt fisken.

Såsom ovan angivits har man funnit det fördelaktigt att immunisera fisken genom tillsättning av bakteriepre- paratet (antigenen vått eller torrt) till en suspension till vilken fisken överförs för immuniseringsändamål, eftersom immunisering genom injektion, ehuru effektivt i experiment, inte är en kommersiellt genomförbar metod.

Sålunda utförs företrädesvis administrering av de mutanta bakterierna genom nedsänkning av en fisk i en lämplig suspension av avirulenta mutanta bakterier under en tidsperiod som är tillräcklig för att åstadkomma en adekvat immunisering. Man har funnit att en längre immuniseringstid i allmänhet ger en förbättrad immunitet.

I enlighet med föreliggande uppfinning, för att utnyttja immuniseringstider av 15 min eller mera, har 30 min befunnits ge en tillfredsställande immunitet i det försök som beskrivs i Exempel 1. Suspensionen av avirulenta, invasiva mutanta bakterier innehåller 1xl02-lxl08 bak- terier/ml, företrädesvis 1x1O6-1x108 bakterier/ml, varvid ett antal av lxlO7/ml-2x107/ml har befunnits ge en adekvat immunisering vid nedsänkning av fisken under 30 min.

Under forskningen som ledde till föreliggande upp- finning har föreliggande uppfinnare funnit att fisk högst sannolikast exponeras för infektioner förorsakade av viru- lenta patogener när vattnets temperatur ökar till l8°C eller mera (detta gäller åtminstone för V. anguillarum).

Detta infekteringsmönster gör det fördelaktigt att admini- strera vaccinet enligt uppfinningen minst en gång per år vid en tidpunkt på året då risken för infektion genom fiskpatogener är särskilt hög, eller företrädesvis omedel- bart före denna period. Den dosering som då administreras kan ge en adekvat skyddande immunitet mot infektionen 10 15 20 25 30 35 505 288 15 ifråga för hela perioden när risken för infektion är hög (typiskt sommarmånaderna) eller om den inte gör det kan den följas upp vid någon lämplig tidpunkt med en eller flera boosterimmuniseringar. Immuniseringen av fisk genom nedsänkning utförs fördelaktigt med användning av en suspension av den avirulenta, invasiva mutanta stammen som har en temperatur av 0-25°C, företrädesvis 0-18°C, i vilken suspension NaCl-koncentrationen är minst 0,3% (vikt/vikt). Immuniseringens effektivitet kan lämpligen testas genom det ovan beskrivna LDSO-testet.

I enlighet med uppfinningen kan det vara särskilt fördelaktigt att immunisera fiskyngel, dvs fisk med en vikt av frán ca 3-5 g till ca 20 g, med vaccinet enligt uppfinningen eftersom dessa verkar vara mera mottagliga för fiskpatogener än fullvuxna fiskar.

Ehuru det är fördelaktigt av olika anledningar, sàsom ovan angivits, att använda ett levande vaccin enligt uppfinningen för att immunisera fisk, räknar man med att det är möjligt att använda den avirulenta mutanta stammen enligt uppfinningen i ett avdödat vaccin. Följaktligen hänför sig uppfinningen vidare till ett avdödat vaccin för immunisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fisk- patogener, vilket omfattar en avdödad avirulent immunogen mutant stam av en fiskpatogen bakterie. De i vaccinet använda bakterierna kan avdödas genom vilken som helst av de metoder som i allmänhet används pà vaccinomràdet, sàsom genom behandling med formalin. Bakterierna kan i övrigt uppvisa de ovan beskrivna egenskaperna för den mutanta stammen enligt uppfinningen, och vaccinet kan utnyttjas väsentligen pà samma sätt som ovan beskrivits för det levande vaccinet.

Uppfinningen beskrivs mera detaljerat i de följande icke-begränsande exemplen.

EXEMPEL 1 Framställning av en avirulent, invasiv mutant stam av V. anguillarum och dess användning som ett levande vaccin. '”5o3 288 16 Material och metoder Bakteriestammar: De stamar som används i denna studie och deras källor är uppräknade i Tabell 1.

TABELL 1 STAM KÄLLA MARKÖRER V. anguillarum U.B.S. Sörensen och 775 J.L. Larsen, "Serotyping of Vibrio anguillarum".

Appl. Environ. Microbiol. 51, 1986, s 593-597 775.17B Denna studie Rifr, Strr- derivat av 775* 6018/1 Sörensen och Larsen, Supra 53-507 Sörensen och Larsen, Supra ATCC 19264 Allmänt tillgänglig fràn ATCC NB 10** Denna studie NB 15 Denna studie Rifr, Ster* E. coli Bly, B. 1985. Vektorer för K 12/C 600 transposon mutagenes pRK20l3:Tn5/132 av non-eterala bakterier Tetr, Am r*** Mol. Gen. Genet. 200, s 302-304 kromosomal resistens mot rifampicin och streptomycin; erhàllen som en spontan mutant genom selektion pà TSA-plattor innehållande rifampicin (200 pg/ml) och streptomycin (100 pg/ml). ** isolerat frán njuren hos en regnbàgsforell som dött av en kk* 10 15 20 25 30 35 503 288 17 epizootisk vibros i en fiskfarm i norra botaniska viken. plasmidresistens mot tetracyklin och ampicillin.

Isolering och karaktärisering av stam 775: Stammen isolerades från en sjuk fisk (Onchorhynchus kisutsch).

Utstryk inokulerades pà blodagarplattor som inkuberades under 48 h vid 25°C. Typiska bakteriekolonier som påminde om V. anguillarum, dvs låg konvexa, halvgenomskinliga, och hemolytiska, isolerades för primär identifiering i enlig- het med följande karaktäristika: gram-negativa rörliga stavar vilka var känsliga för vibriostatiskt agens 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridin, 10 pg/skiva); kata- las- och oxidas-positiva; positiva vid nitratreduktions- och arginindekarboxylattester; negativa för lysin- och ornitindekarboxylaser; fermentativ i oxidationsfermente- ringstest och med förmåga att växa i 6% NaCl men inte i 7% NaCl. Stammen hör till serotypen 01 enligt det system som beskrivits av Sörensen och Larsen, supra.

Konjugation- och transpositionsexperiment: Plasmid pRK2013 överfördes frán E. coli K 12 C600/pRK2013:Tn5-132 genom konjugering pá filter (Walter et al. 1975). Donatorn (E. coli) och recipienten (V. anguillarum) odlades över natten i Luria-buljong (E. coli) eller hjärna-hjärta-in- fusionsbuljong som utökats med 2% NaCl (V. anguillarum).

Stammarna inokulerades i färska medier och odlades till lx108 bakterier per ml. En blandning innehållande 1,5 ml donator respektive recipient fick passera genom ett 0,45 m membranfilter. Filtret placerades på Trypticas-sojaagar (TSA)-plattor utökade med 2% NaCl under 3 h vid l8°C.

Efter inkubation överfördes filtren till TSA-plattor utökade med 2% NaCl innehållande tetracyklin (15 pg/ml), rifampicin (200 pg/ml) och streptomycin (100 pg/ml) för selektering av V. anguillarum exkonjuganter. Kolonier som uppträdde pà plattorna överfördes till nya TSA-plattor plus 2% NaCl plus tetracyklin, rifampicin och streptomy- '(503 288 10 15 20 25 30 35 18 cin. Efter inkubation nedfrystes exkonjuganterna vid -70°C före användning i experimentella fiskinfektioner.

Proteasbestämning: Detektering av proteasaktivitet utfördes genom att bakterierna sattes som fläckar pá Frazier-gelatinplattor (Rodina, 1972) utökade med 2% NaCl.

Efter inkubation vid 18°C under 24 h indränktes plattorna med l2,5% HgCl2 med IM HCl. En genomskinlig zon kring kolonien indikerade proteolytisk aktivitet.

Hemolysinbestämning: Närvaro av hemolytisk aktivitet bestämdes genom placering av bakterierna som fläckar pà Näringsbuljong (0xoid) utökad med 5% hästblod och 2% NaCl.

Blotting- och hybridiseringsförfaranden: Kromosomalt DNA, digererat med EcoRl och fraktionerat pà agarosgeler överfördes till nitrocellulosafilter, hybridiserades med en 32?-märkt prob som framställts genom 5'-ändmärkning, och tvättades (Maniatis et al., 1982). Den prob som användes var en 30-mer syntetisk oligonukleotid, komplementär till en del av ISL av Tn5 (Symbicom, Umeà, Sweden).

Järn-krav: Exkonjuganter testades för förmåga att avskilja järn genom placering av dem som fläckar pá M9 plattor utökade med 2% NaCl och 25M EDDA (etylendiamin- -di(o-hydroxifenyl)ättiksyra).

Experimentella fiskinfektioner: Virulenstester utför- des pá regnbàgsforell (Salmo gairdneri) med en vikt av 5-15 g. Bakterierna administrerades antingen genom intra- peritoneal injektion (i.p.) eller genom nedsänkning (im = immersion). För varje testad bakteriespädning användes fem fiskar.

Trypticas-sojabuljong (TSB) utökad med 2% NaCl vid 18°C.

Vid i.p. experimenten bedövades fiskarna med tricainmetan- Bakterierna var 24-h kulturer som odlats i sulfonat (100 mg/liter) och inokulerades subkutant i peri- tonealhàlan. Nedsänkningsinfektionerna utfördes genom tillsättning av bakterierna till akvariet i vilket fiskarna simmade. Efter 30 min tillsattes färskt bräckt vatten, varefter fiskarna hölls i det bräckta vattnet i 7 dagar. Döda fiskar uppsamlades varje dag och njurprover' 10 15 20 25 30 35 503 288 19 testades för närvaro av bakterier. Virulensen uttrycktes som 50% letal dos (LD50) (Reed och Muench, 1938).

Immuniseringsexperiment: Fisk nedsänktes i 2xlO bakterier/ml av V. anguillarum exkonjuganter, VAN 20 eller VAN 70, under 30 min vid l8°C. Fisken överfördes till tankar i vilka de hölls. Infekteringar utfördes 1, 2, 4, 10 och 17 veckor efter begynnelseimmuniseringen. Bakterie- 7 stammarna som användes för infektering var 775.178 och NB 10. Infekteringen utfördes såsom beskrivits i de föregà- ende avsnitten genom nedsänkning med tre pàvarandra följande 10-faldiga spädningar av bakterierna. Booster- immuniseringar utfördes efter 12 veckor pá samma sätt som begynnelseimmuniseringarna.

RESULTAT LDSO-mätningar av olika isolat av Vibrio anguillarum Den 50%-iga letala dosen av olika isolat av Vibrio anguillarum testades både genom injicering av bakterierna intraperitonealt (i.p.) eller genom nedsänkning (im) av fisken i vatten som innehöll bakterier. En stam av Escherichia coli användes som en negativ kontroll. _ TABELL 2 Bestämning av LDSO-värden för olika isolat av Vibrio anguillarum.

Isouvr 1.050 i.p. Lnso 1.m. 775 <1x1o2 2x1o5 53-507 4x1o3 2x1o7 Awcc 19264 1x1o4 sola/1 2x1o3 >sx1o7 NB 15 <1x1o2 sx1o7 E. C011 csoo 43106 Nn*/ */ icke bestämt 10 15 20 25 30 35 '"505 288 20 Ett isolat (775) var signifikant mera virulent efter nedsänkning än de andra testade isolaten. Därför valdes stam 775 för ytterligare studier, eftersom ett syfte med föreliggande undersökning var att skapa levande vaccin- stammar som kunde distribueras genom nedsänkning.

Konstruering av mutanter Vibrio anguillarum 775.l7B parades med E. coli C600/pRK20l3:Tn5-132 innehållande transposonen Tn5-132 (tetracyklinresistens). Tn5-132 bärs på en transposon- -leveransvektor som härstammar från pRK20l3. Eftersom pRK20l3 är baserad på ColE1-replikonen och har ett brett värdområdesöverföringssystem kan den överföras till, men har inte förmåga att replikera i, många non-enterala gram- negativa bakterier (Ely, 1985). Konjugeringar utfördes på filter som gav en frekvens av transposition av ca 10-7. på ett filter och placerades på non-selektiva medier under 3 h. Filtret överfördes till en selektiv platta och inkuberades vid l8°C. det säkert att varje koloni som uppträdde var en unik Donatorn och recipienten blandades Eftersom filtren inkuberades på selektiva medier var exkonjugant. Exkonjuganterna plockades och uttrycks på en ny selektiv platta. Parallellt fick recipientstammen, 775.17B, genomgå samma antal passager på plattor för att säkerställa att en eventuell förändring i patogenicitet inom exkonjuganterna inte var ett resultat av för många passager. Plasmidframställning av exkonjuganterna visade att leveransplasmidvektorn pRK20l3 inte replikerade i stam 775.178 (icke visade data), Avsökningéav avirulenta exkonjuganter Exkonjuganter avsöktes för virulens genom infektering av regnsbågsforell såsom ovan beskrivits. Infekteringen utfördes genom nedsänkning av fisk i vatten som innehöll sxioó vakades dagligen och experimenten pågick i 7 dagar. bakterier per ml under 30 min. Mortalitet över- 10 15 20 25 30 35 503 288 21 Två av de testade mutanterna befanns vara avirulenta.

Dessa två mutanter, VAN 20 och VAN 70, testades vidare beträffande deras virulens genom infektering av fisk både intraperitonealt och genom nedsänkning.

LDSO (i.p.) överskred 1x1O6 bakterier och LDSD (im) överskred 2xlO7 bakterier per ml för båda stammarna.

Motsvarande LD50-värden för moderstammen var 2x1o5 (Tabell 2).

Karaktärisering av exkonjuganter Produktion av proteaser och hemolytisk aktivitet har föreslagits vara involverade i bakteriers patogenicitet.

V. anguillarum uppvisar både en proteolytisk och en hemo- lytisk aktivitet. Alla isolerade exkonjuganters förmåga att producera proteolytisk aktivitet testades genom placering av bakterierna som fläckar på en gelatinplatta.

Ingen av de isolerade exkonjuganterna saknade proteasaktivitet.

Undersökning av hemolytisk aktivitet på blodplattor gav också positiva resultat i samtliga fall.

Förmågan att avskilja låga mängder järn från värden har också varit en faktor som föreslagits vara involverad i virulens. Exkonjuganterna testades därför på minimala plattor innehållande järnkelatorn EDDA. Alla exkonjuganter hade förmåga att växa på plattorna, vilket indikerade att transposonen inte hade inkorporerats i 65 kb plasmiden som är känd för att koda för ett järnavskiljningssystem. Plas- miden isolerades från exkonjuganterna, varefter plasmiden digererades med BamH1. Ingen skillnad observerades när digestionsmönstret för stammens 775.178 plasmid jämfördes med exkonjuganternas motsvarande plasmid.

Sålunda hade inte i något fall transposonen inkorpo- rerats i 65 kb plasmiden.

Bakteriernas tillväxthastighet är en faktor som kunde påverka virulensen. För att studera huruvida införliv- ningen av transposonen ändrade exkonjuganternas tillväxt- hastighet odlades två avirulenta plus fyra virulenta ex- konjuganter och stammen av vild typ i MOPS minimala medier 10 15 20 25 30 35 44503 288 22 (Neidhardt et al., 1974) vid 20°C. Stammen av vild typ, 775.178, växte snabbare än mutanterna, men ingen korrela- tion kunde observeras mellan tillväxthastighet och grad av virulens bland exkonjuganterna (Tabell 3).

TABELL 3 Tillväxthastigheten hos exkonjuganter och stammen av vild typ i MOPS minimala medier VAN VAN VAN VAN VAN VAN 775 1 2 6 7 20 70 17B Tillväxthastighet (min) 226 189 254 243 219 240 186 För att undersöka om transposonen hade slumpvis införlivats i kromosomen isolerades kromosomalt DNA från sex olika exkonjuganter, digererades med EcoRl och separe- rades på en agarosgel. DNA överfördes sedan till ett nitrocellulosafilter. Filterhybridisering utfördes med an- vändning av en 32?-märkt oligonukleotid, som hade full- ständig homologi med nukleotider 49 till 78 i den inverte- rade upprepningen av Tn5-132. Alla sex exkonjuganter visade olika hybridiseringsmönster (Fig 1). Tn5-132 hade ett EcoR1-site i mitten av transposonen, vilket förklara- de förekomsten av två band i varje bana. Moderstammen 775 digererades och blottades också, men ingen hybridisering observerades. Sålunda kan man dra den slutsatsen att transposonen hade inkorporerats slumpvis i de olika exkon- juganternas kromosom.

Användning av avirulenta exkoniuganter som vacciner Två avirulenta exkonjuganter, VAN 20 och VAN 70, testades för deras potentiella förmåga som levande vac- ciner mot vibrios. Fisk nedsänktes i en bakteriesuspen- sion, innehållande antingen VAN 20 eller VAN 70, vid en koncentration av 2x107 bakterier per ml under 30 min vid l8°C. Infektering utfördes l, 2, 4, vaccination. Två olika stammar användes som infekterande organismer, den homologa 775.l7B och en heterolog stam NB 10 och 17 veckor efter 10 15 20 25 30 35 503 288 23 10. Den senare stammen uppvisade ett mycket lågt LD50- värde när fisken infekterades genom nedsänkning. In- fekteringen utfördes genom badning av fisken i vatten som innehöll tre olika koncentrationer av teststammarna. Detta gjorde det möjligt att bestämma LDSO-värdena för den vac- cinerade fisken jämfört med icke-vaccinerad fisk. Tvà veckor efter immunisering visade den vaccinerade fisken en ökad resistens mot den homologa stammen, observerat som en 10 till 30-faldig ökning av LD50-värdet (Tabell 4).

TABELL 4 Antal per ml av stam 775.17 och stam NB 10 som förorsakar 50% mortalitet hos vaccinerad eller icke-vaccinerad regn- bàgsforell (Salmo gairdneri ) 1, 2, 4, 10 och 17 veckor efter immunisering Veckor efter Vaccin LDSO (bakt/ml) immunisering stam ingen VAN 20 VAN 70 */ 1 3x1o6 sx1o6 3x1ø6 2 2x1o6 2x1o7 6x1o7 4 sxioó sx1o7 9x1o6 10 sxloó sx1o7 3x1o7 12 aooswsn sooswsn 17 2x1o6 axioö 9x1o7 2x1o6 1x1o8 #/ 17 s 10 10 s 2x1o5 = infektering med 775.17 # = infektering med NB 10 Efter 4 veckor var skyddet fortfarande signifikant och till och med efter 10 veckor hölls skyddet pà samma nivå. När den immuniserade fisken infekterades med den 10 15 20 25 30 35 *kaos 288 24 heterologa stammen NB 10, observerades också en svag positiv effekt. 12 veckor efter immuniseringen admini- strerades en boosterdos. Efter 17 veckor var fisken som inte erhållit någon boosterdos inte längre skyddad.

Emellertid uppvisade fisken som hade erhållit boosterdos skydd vid höga nivåer. Det bör noteras att skydd mot NB 10 (dvs den heterologa stammen) observerades i fisk som er- hållit VAN 70 boosterdos.

Baserat på dessa resultat kan man dra följande slut- satser: 1) Det var möjligt att framställa avirulenta stammar genom transposering av transposen Tn5-132 in i Vibrio anguillarum med användning av bred-värdområdesleverans- vektorn pRK20l3. Vektorn kunde inte replikera i V. anguillarum. 2) Transposen införlivades slumpvis i recipientens kromosom. 3) Det var möjligt att isolera exkonjuganter vilka var avirulenta mot regnsbàgsforell i laboratorieinfek- teringsexperiment. 4) De avirulenta mutanterna påverkades inte av någon av de testade potentiella virulensegenskaperna. 5) Användningen av de avirulenta exkonjuganterna som levande vacciner gav en ökad resistens både mot homologa och heterologa patogena agens.

EXEMPEL 2 Stammen VAN 1000 isolerades som en streptomycin- och rifampicin-resistent spontan mutant av V. anguillarum 775.178 genom selektion på TSA-plattor utökade med följt av selektion på TSA-plattor utökade med 100 pg/ml streptomycin väsentligen såsom 200 pg/ml rifampicin, beskrivits i Exempel 1.

Den isolerade stammen underkastades LDSO-mätningâr såsom beskrivits i Exempel 1. LDSO var större än 1xl0 /ml.

Immuniseringsexperimenten utfördes såsom beskrivits i Exempel 1 genom nedsänkning av fisk i vatten som innehöll 1x107/ml av VAN 1000. Resultaten, vilka mättes genom 25 bestämning av ökning av LD50-värdet, visas i Tabell 5.

TABELL 5 Stam Stam Stam * Veckor efter V. anguillarum V. anguillarum A. salmonicida immunisering 775.178 NB 10 LDSO LDSO LD50 (per ml) (per ml) (per ml) kontroll vacc. kontroll vacc. kontroll vacc.

Exp 1 1 23106 1x108 < 10 7x105 1x102 2x105 2 sx1o5 1x108 < 10 1x10° 5 a 6 2 5 3 2x10 >7x10 < 10 ax10 1x10 2x10 Exp 2 4 sx106 >sx108 10 sx106 >3x108 < 10 3x105 12 1x102 2x105 17 4x106 >4x108 < 10 >3x107 * En stam av vild-typ som erhållits isolerad från ett utbrott av furunkulos i Östersjön Av Tabell 5 framgår att VAN 1000 inte endast ger skydd mot en homolog och heterolog stam av V. anguillarum, utan också kors-skydd mot A. Salmonicida.

EXEMPEL 3 Ett fältimmuniseringsförsök utfördes med användning av stammen VAN 1000. I januari 1988 vaccinerades 200 regn- bågsforeller (Salmo gairdneri) såsom beskrivits i Exempel 1 och 2 genom nedsänkning av fisken i vatten som innehöll 1x107/ml av den ovan angivna stammen under 30 min vid en temperatur av 18°C. Den vaccinerade fisken hölls i 1 m3 tråg från tidpunkten för vaccineringen till september 10 15 20 25 30 35 "sus 288 26 1988. Ovaccinerad fisk som hölls i två andra tràg (2000 resp 1000 fisk) tjänstgjorde som kontroller.

Det inkommande vattnet var orenat bräckt vatten frán Östersjön och vattnet var enda källan för infektion.

Vatteninloppet delades av alla tre tràg.

Utbrott av vibrios övervakades i trágen genom regi- streringar av antalet fiskar som dog i varje individuellt tràg. Sjukdomen bekräftades genm isolering av Vibrio anguillarum från ett representativt antal döda fiskar.

Utbrott av fatal vibrios uppträdde under juli vid tvà olika tillfällen i de tva tràgen med ovaccinerad fisk.

Ingen signifikant fiskdöd observerades efter månaden juli i kontrollgrupperna. I den vaccinerade gruppen av fisk dog emellertid endast en fisk i början av månaden, under vilken tidsperiod utbrott inte observerades i kontroll- tràgen. Under epidemierna i de ovaccinerade fiskgrupperna uppträdde inga dödsfall i den vaccinerade fisken.

Resultaten visas i Fig 2, där antalet döda fiskar ges som en procentsats av totala antalet levande fiskar i tràgen. I Figuren betecknar a ovaccinerad fisk i trág nr 1; betecknar b ovaccinerad fisk i tràg nr 2; och betecknar c vaccinerad fisk.

Sammanfattningsvis kan sägas att stammen VAN 1000 ger ett signifikant skydd mot infektering av en naturlig infektion under fältbetingelser i mottaglig regnbàgsfo- rell. 10 15 20 25 30 35 503 288 27 LITTERATUR Agius, C., M.T. Horne, och P.D. Ward, 1983.

Immunisation of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, against vibriosis: comparison of an extract antigen with whole cell bacterins by oral and intraperitoneal routes.

J. Fish Dis. 6: s 129-134.

Crosa, J.H. 1980. A plasmid associated with virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillerum specifies and iron-sequestering system. Nature 284, s 566-568.

Bly, B. 1985. Vectors for transposon mutagenesis of non-enteric bacteria. Mol. Gen. Genet. 200, s 302-304.

Hone, D., R. Morona, S. Attridge, och J. Hackett, 1987. Construction of defined galE mutant of Salmonella for use as vaccines. J. Inf. Dis. 156, s 167-174.

Inamura, H., K. Muroga, och T. Nakai, 1984. Toxicity of extracellular products of Vibrio anguillarym, Fish Pathol. 19, s 89-96.

Inamura, H., T. Nakai, och K. Muroga, 1985. An extra- cellular protease produced by Vibrio anguillarum. Bull.

Jap. Soc. Sci. Fish. 51, s 1915-1920.

Kawano, K., T. Aoki, och T. Kitao, 1984. Duration of protection against bvibriosis in ayu, Plecoglossus altivelis, vaccinated by immersion and oral administration with Vibrio anguillarum. Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 50, s 771-774.

Kodama, H., M. Moustafa, S. Ishiguro, T. Mikami, och H. Izawa, 1984. Extracellular virulence factors of fish Vibrio: Relationships between toxic material, haemolysin and proteolytic enzyme. Am. J. Vet. Res. 45, s 2203-2207.

Maniatis, T., E.F. Fritsch, och J. Sambrook, 1982.

Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York.

Munn, C.B., 1978. Haemolysin production by Vibrio anguillarum. FEMS Microbiol. Lett. 3, s 265-268.

Neidhardt, P.C., P.L. Bloch, och D.F. Smith, 1974.

Culture medium for enterobacteria. J. Bacteriol. 119, s 736-747. 505 288 10 15 20 25 30 35 28 Reed, L.J., och H. Muench, 1938. A simple method on estimating fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 27, s 493-497.

Rodina, A.G., s 254-255.

Trust, T.J., och M.H. Schiewe, nation ability of marine vibrios pathogenic to fish.

Infect. 34, s 702-702.

Wahden, M.H., C- Se'rie', Y. Cerisier, S. Sallam, och 1982. A controlled field trial of live Salmonella typhy strain Ty 21a oral vaccine against typhoid: three-year results. J. Inf. Dis. 145, s 292-295.

Walter, M.A., s. A. Potter, och J.H. cross, 1983.

Iron uptake system mediated by Vibrio anguillarum plasmid pJM1. J. Bacteriol. 156, s 880-887.

Ward, P.D., M.F. Tatner, 1985.

Factors influenoing the efficacy of vaccines against 1972. Methods in aquatic microbiology, I.D. Courtice, A.G. Khouri, J.H. Crosa, 1981. Serum resistance and haemaggluti- Immufl .

R. Germanier, och M.T. Horne, vibriosis caused by Vibrio anguillarum. I "Fish Immunology". M.J. Manning och M.F. Tatner (eds), s 221- 229.

Wolf, M.K., 1986. Evidence for the role of a siderophore in promoting Vibrio anguillarum J. Gen. Microbiol. 132, s 2949-2952. och J.H. Crosa, infections.

Claims (43)

503 288 29 PATENTKRAV Kravuppsättning A

1. Förfarande för framställning av ett levande vaccin för immunisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpatogener, vilket förfarande innefattar att man (1) isolerar en moderstam från en virulent, invasiv, immunogen fiskpatogenbakterie vald bland Vibrio anguillarum och Aeromonas Salmonicida, (2) från denna genom selektering på rifampicin och/eller streptomycin härleder en avirulent, invasiv, immunogen mutant stam, som uppvisar ett LD5o- värde överstigande 2x1O7 bakterier/ml vid nedsänkning av fisken i en suspension av nämnda mutanta stam, samt, då den är en Vibrio anguillarum, uppvisar förmåga att växa i närvaro av en järnkelator, (3) odlar den selekterade stammen i ett kulturmedium till bildning av ifrågavarande vaccin, (4) skördar de resulterande cellerna och bereder ett vaccin innefattade de skördade cellerna.

2. Förfarande enligt krav 1, där den mutanta stammen erhålles genom isolering från den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen och selektering på rifampicin och/eller streptomycin.

3. Förfarande enligt krav 1, där den mutanta stammen erhålles genom att moderstammen utsättes för en behandling med ett mutagen, såsom ultraviolett strålning, joniserande strålning eller ett kemiskt mutagen.

4. Förfarande enligt krav 1, där den mutanta stammen erhålles medelst rekombinant DNA-teknik resulterande i en gen, vars produkt erfordras för att bakteriell virulens skall bli defekt eller frånvarande.

5. Förfarande enligt krav 4, där den gen, som blir defekt eller frånvarande, är en sådan som kodar för en virulensdeterminant. 'A503 288 30

6. Förfarande enligt krav 4 eller 5, där en defekt av den gen, som blir defekt eller frånvarande, förorsakas av en DNA-insättning.

7. Förfarande enligt krav 6, där den DNA-insättning, som förorsakar en defekt, är en transposon-insättning.

8. Förfarande enligt krav 4 eller 5, där genen, vars produkt erfordras för bakteriell virulens, är partiellt eller fullständigt deleterad.

9. Förfarande enligt krav 1, där den mutanta stammen är härledd från Vibrio anguillarum.

10. Förfarande enligt krav 9, där den resulterande mutanta stammen är VAN 1000 (accessionsnummer DSM 4508), VAN 20 (accessionsnummer DSM 4506) eller VAN 70 (acces- sionsnummer DSM 4507).

11. ll. Förfarande enligt krav l, vilket dessutom inne- fattar insats i den mutanta stammen av en DNA-sekvens som kodar för en antigendeterminant från en annan fiskpatogen, såsom en bakterie eller ett virus, varvid nämnda DNA-sek- vens har förmåga att uttryckas i den mutanta stammen.

12. Förfarande enligt krav ll, där den DNA-sekvens, som kodar för en antigendeterminant, är härledd från Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogenes, Aeromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salomoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Sporocytophaga spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus och Yersinia ruckerii.

13. Förfarande enligt krav ll eller 12, där den DNA- sekvens, som kodar för en antigendeterminant, insättes i en gen vilken kodar för en produkt som erfordras för bak- teriell virulens.

14. Förfarande enligt något av kraven ll till 13, vilket innefattar insats av tvà eller flera DNA-sekvenser, vilka kodar för antigendeterminanter fràn olika fiskpato- gener. 503 288 31

15. Levande vaccin för immunisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpatogener, vilket vaccin omfattar en avirulent, invasiv, immunogen mutant stam av en ursprungligen virulent fiskpatogen stam av Vibrio anguillarum eller Aeromonas salmonicida, vilken mutanta stam uppvisar ett LDSO-värde överstigande 2xl07 bakte- rier/ml vid nedsänkning av fisken i en suspension av nämnda mutanta stam, uppvisar resistens mot rifampicin och/eller streptomycin och, då den är en Vibrio anguil- larum, har förmåga att växa i närvaro av en järnkelator, varvid vaccinet åtminstone ger skydd mot homologa och heterologa Vibrio anguillarum samt korsskydd mot Aeromonas spp.

16. Vaccin enligt kravet 15, vari den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen är en stam av Vibrio anguillarum.

17. Vaccin enligt kravet 15 eller 16, vari den mutanta stammen är en spontan mutant, vilken har isolerats från den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen och selekterats genom nämnda resistens mot rifampicin och/eller streptomycin.

18. Vaccin enligt kravet 15 eller 16, vari den mutanta stammen är erhållen genom att den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen har underkastats behandling med ett mutagen, såsom ultraviolett strålning, joniserande strålning eller ett kemiskt mutagen.

19. Vaccin enligt kravet 15 eller 16, vari en kromo- somal gen i nämnda mutanta stam vars produkt erfordras för bakterievirulens är defekt eller frånvarande.

20. Vaccin enligt kravet 19, vari genen kodar för en virulensdeterminant.

21. Vaccin enligt kravet l9 eller 20, vari nämnda gen innehåller en DNA-insättning. '

22. Vaccin enligt kravet 21, vari nämnda DNA-insätt- ning är en transposon-insättning. ¶'so3 288 32

23. Vaccin enligt kravet 19 eller 20, vari nämnda gen är partiellt eller fullständigt utplánad.

24. Vaccin enligt kravet 15 eller 16, vari stammen är vald bland VAN 1000 (accessionsnummer DSM 4508), VAN 20 (accessionsnummer DSM 4506) och VAN 70 (accessionsnummer DSM 4507).

25. Vaccin enligt kravet 24, vari den mutanta stammen av den fiskpatogena bakterien bär en DNA-sekvens som kodar för en antigendeterminant fràn en annan fiskpatogen, såsom en bakterie eller ett virus och har förmåga att uttrycka nämnda DNA-sekvens.

26. Vaccin enligt kravet 25, vari DNA-sekvensen som kodar för antigendeterminanten är insatt i en gen som kodar för en produkt som erfordras för bakteriell virulens.

27. Vaccin enligt kravet 25, vari den mutanta stammen bär två eller flera DNA-sekvenser som kodar för antigen- determinanter från olika fiskpatogener.

28. Vaccin enligt vilket som helst av kraven 25-27, vari DNA-sekvensen som kodar för antigendeterminanten är härledd frán Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogenes, Aeromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Sporocytophaga spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus och Yersinia ruckerii.

29. Avirulent, invasiv, immunogen mutant stam av en ursprungligen virulent fiskpatogen stam av Vibrio anguil- larum eller Aeromonas salmonicidas, där den mutanta stam- men uppvisar ett LDSO-värde överstigande 2xl07 bakte- rier/ml vid nedsänkning av fisken i en suspension av nämnda mutanta stam, då den är en Vibrio anguillarum uppvisar förmåga att växa i närvaro av en järnkelator, uppvisar resistens mot rifampicin och/eller streptomycin 503 288 33 och uppvisar förmåga att förläna fisk, som har immuniserats med ett levande vaccin innehållande densamma,, skydd åtminstone mot sjukdomar förorsakade av homologa och heterologa Vibrio anguillarum samt korsskydd mot Aeromonas spp.

30. Avirulent, invasiv, immunogen mutant stam enligt kravet 29, vilket stam är en stam av Vibrio anguillarum.

31. Mutant stam enligt kravet 29, vari den mutanta stammen är en spontan mutant, vilken har isolerats från den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen och se- lekterats genom nämnda resistens mot rifampicin och/eller streptomycin.

32. Mutant stam enligt kravet 29 eller 30, vari den mutanta stammen är erhållen genom att den ursprungligen virulenta fiskpatogena stammen har underkastas behandling med ett mutagen, såsom ultraviolett strålning, joniserande strålning eller ett kemiskt mutagen.

33. Mutant stam enligt kravet 29 eller 30, vari en kromosomal gen i nämnda mutanta stam vars produkt erfordras för bakteriell virulens är defekt eller frånvarande.

34. Mutant stam enligt kravet 33, vari genen kodar för en virulensdeterminant.

35. Mutant stam enligt kravet 33 eller 34, vari nämnda gen innehåller en DNA-insättning.

36. Mutant stam enligt kravet 35, vari nämnda DNA- insättning är en transposoninsättning.

37. Mutant stam enligt kravet 33 eller 34, vari nämnda gen är partiellt eller fullständigt utplånad.

38. Mutant stam enligt kravet 30, vari stammen är vald bland VAN 1000 (accessionsnummer DSM 4508), VAN 20 (accessionsnummer DSM 4506) och VAN 70 (accessionsnummer DSM 4507). _

39. Mutant stam enligt kravet 29 eller 30, vari den mutanta stammen av den fiskpatogena bakterien bär en DNA- sekvens som kodar för en antigendeterminant från en annan fiskpatogen, såsom en bakterie eller ett virus och har 503 288 34 förmàga att uttrycka nämnda DNA-sekvens.

40. Mutant stam enligt kravet 39, vari DNA-sekvensen som kodar för antigendeterminanten är insatt i en gen som kodar för en produkt som krävs för bakteriell virulens.

41. Mutant stam enligt kravet 40, vari den mutanta stammen bär tvâ eller flera DNA-sekvenser som kodar för antigendeterminanter från olika fiskpatogener.

42. Mutant stam enligt något av kraven 39-41, vari DNA-sekvensen som kodar för antigendeterminanten är här- ledd från Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio ordalii, Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida eller acromogenes, Aeromonas hydrophila, Flexibacter columnaris, Cytophaga spp., Flavobacterium spp., Renibacterium salmoninarum, Lactobacillus spp., Edwardsiella tarda, Pseudomonas spp., Pasteurella spp., Sporocytophaga spp., Mycobacterium spp., Nocardia asteroides, Streptomyces spp., Streptococcus spp., Eubacterium tarentellus och Yersinia ruckerii.

43. Användning av en levande avirulent, invasiv, im- munogen mutant stam enligt något av kraven 29-42 för fram- ställning av ett levande vaccin för immunisering av fisk mot sjukdomar förorsakade av fiskpatogena bakterier.