SE465965B - Foerfarande foer immobilisering av ett intracellulaert, glutaraldehydkaensligt enzym - Google Patents
Foerfarande foer immobilisering av ett intracellulaert, glutaraldehydkaensligt enzymInfo
- Publication number
- SE465965B SE465965B SE7903357A SE7903357A SE465965B SE 465965 B SE465965 B SE 465965B SE 7903357 A SE7903357 A SE 7903357A SE 7903357 A SE7903357 A SE 7903357A SE 465965 B SE465965 B SE 465965B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- glutaraldehyde
- cells
- activity
- immobilized
- stirring
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 28
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 claims description 20
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 12
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 11
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 6
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 5
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 34
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 13
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 12
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 description 12
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 12
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 7
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 6
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 6
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000192134 Oenococcus oeni Species 0.000 description 3
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 3
- 241000193395 Sporosarcina pasteurii Species 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 2
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108090000073 malolactic enzyme Proteins 0.000 description 2
- VATYWCRQDJIRAI-UHFFFAOYSA-N p-aminobenzaldehyde Chemical compound NC1=CC=C(C=O)C=C1 VATYWCRQDJIRAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- -1 Polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229940034610 toothpaste Drugs 0.000 description 1
- 239000000606 toothpaste Substances 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
15 20 25 ÉO 35 40 465 965 22 tvärbindningsmedlet. Det är godkänt av hälsomyndigheterna och är också i dag det bästa tvärbindningsmedlet sett ur framställninge- synpunkt och ur ekonomisk synpunkt.
Föreliggande uppfinning avser emellertid immobilisering av intracellulära enzymer, som är känsliga gentemot glutaraldehyd.
Det har hittills varit svårt att immobilisera enzymer av detta slag utan en oönskat hög utspädningsgrad, eftersom det ej har va- rit möjligt att använda glutaraldehydmetoden för immobiliseringen, då en konventionell glutaraldehydbehandling av ett enzym av denna kategori alltid resulterar i praktiskt taget fullständig förlust av enzymaktiviteten. Immobiliseringen av enzymer, som är känsliga mot glutaraldehyd, skiljer sig därför principiellt från immobili- sering av enzymer, som icke är känsliga mot glutaraldehyd. I före- liggande beskrivning och krav betyder uttrycket "ett glutaraldehyd-_ känsligt enzym" ett glutaraldehydkänsligt enzym, som förlorar mera än 75% av sin ursprungliga aktivitet, när det immobiliseras genom glutaraldehydbehandling av de enzymhaltiga cellerna enligt de immobiliseringsmetoder, som beskrivs i US~Patentskrift 5 980 521 och DOS 2 223 540, till bildning av en partikelformig produkt med acceptabel fysikalisk hållfasthet för industriell användning (t.eX. användning för kontinuerlig drift eller i behållare för diskonti- nuerlig drift). Ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för immobilisering av intracellulära, glutaraldehydkänsliga enzy- mer, varvid man använder glutaraldehyd som tvärbindningsmedel, och varvid det immobiliserade enzymet kan framställas i mycket högt utbyte, till ett relativt lågt pris och med en relativt liten ut- spädning av enzymaktiviteten, för att möjliggöra framställning av en produkt, som omfattar ett immobiliserat enzym, vilket är väl lämpat för industriella användningar. _ Förfarandet enligt uppfinningen utmärkes av vad som anges i den kännetecknande delen av krav 1.
I föreliggande beskrivning med krav användes uttrycket "mikrobiella celler" som beteckning på hela mikrobiella celler, ett homogenat, som kan framställas på basis av hela mikrobiella celler, samt allt, vad som ligger däremellan, dvs. delvis sönder- slagna, mikrobiella celler.
I föreliggande beskrivning med krav användes uttrycket "betydande innehåll av primära aminogrupper" som beteckning på ett betydande innehåll av primära aminogrupper i förhållande till det lO 15 20 25 BO 35 40 I 3 " 465 965 totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper.
Med fördel är innehållet av primära aminogrupper över 5%, företrä- desvis 20% av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper. I ett typiskt fall kan förhållandet mellan primära, sekundära och tertiära aminogrupper vara l:2:l, när man använder en grenad polyetylenamin som polyamin. Det antas, att de primära aminogrupperna reagerar med glutaraldehyden, varvid det bildas stabila tvärbindningar, och att detta är anledning till att de primära aminogrupperna är viktiga. Försök, som har genomförts med polyetyleniminer, vilka har modifierats genom omsättning av de primära (och sekundära) aminogrupperna med en epoxiförening, har visat, att sådana modifierade polyetyleniminer är inoperabla.
Då reaktionen äger rum i ett vattenbaserat medium, är det underförstått, att den polyamin, som användes enligt uppfinningen, skall vara vattenlöslig.
Närvaron av polyaminen resulterar överraskande i ett mycket högt aktivitetsutbyte av enzymet. Utan polyaminen kan aktivitets- utbytet av enzymet vara av storleksordningen O-15%, medan däre- mot aktivitetsutbytet med polyamin kan vara av storleksordningen 30-70%. Man behöver inte någon partikelformig bärare, och utspäd- ningen av enzymaktiviteten är därför liten. , När man genomför immobiliseringen, tillsättes polyaminen till de mikrobiella cellerna före eller samtidigt med glutaralde- hyden. Om glutaraldehyden tillsättes till de mikrobiella cellerna först, kommer aktivitetsutbytet av enzymet i den immobiliserade produkten att bli reducerat, om inte polyaminen tillsättes mycket snabbt efter glutaraldehydtillsatsen, beroende på pH, temperatur, koncentration och liknande parametrar.
Det torde observeras, att de relativa mängderna av mikro- biella celler, glutaraldehyd och polyamin bör väljas på ett sådant- sätt, att produkten omfattande immobiliserat enzym är väl lämpad för industriellt ändamål, vilket innebär att produkten bör ha hög enzymaktivitet, högt aktivitetsutbyte (i förhållande till den to- tala enzymaktiviteten före immobilisering), hög enzymstabilitet och hög mekanisk stabilitet.
Vid en föredragen utföringsform av uppfinningen omsätter man hela mikrobiella celler.
Vid en annan föredragen utföringsform av uppfinningen immobi- liseras glutaraldehydkänsligt penicillin V-acelas framställt med hjälp av bakteriestammen NRRL ll24O (eller stammar, som i huvusak 10 15 20 25 ÉO 35 40 465 965 , 4 är identiska därmed, häribland mutanter och varianter därav).
Ytterligare föredragna utföringsformer av uppfinningen omfattar immobilisering av ureas framställt med hjälp av en stam hörande till arten Bacillus pasteurii, av laktas framställt med hjälp av en stam hörande till arten Kluyveromyces fragilis eller av stam- men NRRL B-ll 229 samt även av ett malolaktiskt enzym framställt med hjälp av en stam hörande till arten Leuconostoc oenos.
En föredragen utföringsform av uppfinningen omfattar använd- ning av en vattenbaserad del av fermentationsvätskan som vatten- baserat medium. Denna utföringsform, som omfattar direkt behand- ling av fermentationsvätskan med glutaraldehyd, är därför en ytterst enkel och ekonomisk immobiliseringsmetod. Emellertid kan cellerna separeras från fermentationsvätskan, t.ex. genom centri- fugering, och därefter på nytt suspenderas i vatten eller en lämp- lig buffert med pH mellan 5 och 10, varvid den vattenbaserade de- len av denna suspension är det vattenbaserade mediet, som där- efter behandlas med glutaraldehyd. På liknande sätt kan den vat- tenbaserade delen av det cellslam, som separeras från fermenta- tionsvätskan, t.eX. genom centrifugering, och som har konsistens som en tandpasta, användas som det vattenbaserade medium, som där-_ efter behandlas med glutaraldehyd. , Det föredras, att man som polyamin använder en polyalkylen- imin, företrädesvis en grenad polyalkylenimin, vari alkylendelen innehåller mellan 2 och 4 kolatomer.
Företrädesvis användes en grenad polyetylenimin eller en polyalkylen-polyamin som nämnda polyamin.
Vid ännu en annan föredragen utföringsform av uppfinningen användes en grenad polyetylenimin med en molekylvikt av mellan 500 och 100 000 Dalton som polyamin.
Företrädesvis användes ett förhållande primära aminekviva- lenter/aldehydekvivalenter inom intervallet mellan 0,0l:l och lO:l, företrädesvis mellan O,l:l och lzl.
En föredragen utföringsform av uppfinningen omfattar den sekvens, som består i att polyaminen sättes till det vattenbase- rade mediet med de mikrobiella cellerna och att därefter glutar- aldehyden tillsättes.
Vid förfarandet enligt uppfinningen kan man företrädesvis använda ett förhållande glutaraldehyd/mikrobiella celler (vikt/W vikt) av mellan 0,0l:l och l0O:l, företrädesvis mellan O,l:l och l0:l. m., 10 15 20 25 50 35 40 5 465 965 Vid ännu en föredragen utföringsform av uppfinningen formas de isolerade, immobiliserade cellerna, företrädesvis genom granu- lering eller strängsprutning. Enligt en annan utföringsform formar man tvättade och isolerade immobiliserade celler genom torkning, marnbehandling och siktning till en partikelstorlek inom området mellan 100 och 1000/um, företrädesvis mellan 200 och 700/um.
Uppfinningen omfattar även en immobiliserad enzymprodukt, som har framställts under användning av förfarandet enligt uppfin- ningen.
Vidare omfattar uppfinningen användning av den immobiliserade enzymprodukten enligt uppfinningen, varvid den immobiliserade enzymprodukten kan användas diskontinuerligt eller kontinuerligt, i sistnämnda fall företrädesvis i en kolonn.
En föredragen utföringsform för användning av den immobili- serade enzymprodukten enligt uppfinningen omfattar användning av immobiliserat penicillin V-acylas framställt med hjälp av stammen NRRL 11240 (eller stammar, som i huvudsak är identiska därmed, är ibland mutanter och varianter därav), varvid man använder immobili- serat penicillin V-acylas kontinuerligt.
För att påvisa den överraskande aktivitetsbevarande effekten av polyaminen i kombination med de glutaraldehydkänsliga enzymerna hänvisas till följande jämförelseförsök. a) 2 g spraytorkat ureas, som innehåller celler från Bacillis pasteurii ATCC ll859 (6200 IE/g vid pH 7) suspenderades i 98 ml vatten med l0/uM B-merkaptoetanol. Cellsuspensionens pH var 7,7, när man under omröring tillsatte 1,6 ml 25% glutaraldehyd. Efter 20 minuters omröring vid rumstemperatur sjönk pH-värdet till 6,9.
De immobiliserade cellerna filtrerades och tvättades två gånger med 0,5 l l mM ß-merkaptoetanol i vatten. Efter vakuumtorkning (90 minuter vid ca 5000) erhölls 0,7 g immobiliserat preparat med en aktivitet av 64 IE/g, uppmätt under optimala förhållanden, med en partikelstorlek på 125-500 um. Detta svarar mot ett aktivitets- utbyte på 0,3%. I b) En cellsuspension, som är identisk med den ovan under a) beskrivna, behandlades i stället för medelst den under a) beskrivna behandlingen med 4 ml 10% polyetylenimin (molekylvikt 60 000, Dow Chemicals PEI 600), vars pH-värde var inställt på 7, varefter 2,75 ml 25% glutaraldehyd tillsattes. Omröringen fortsattes i 60 minuter vid rumstemperatur. Efter filtrering, tvättning och tork- ning som under a) hade de resulterande 0,75 g immobiliserade 465 965 cellerna en aktivitet på 5600 IE/g (125-500/um), dvs. aktivitets- utbytet var 54%.
Definitionerna av enheterna för de ursprungliga enzymatiska aktiviteterna av enzymerna i följande exempel framgår av följande Tabell I.
Tabell I Enzym Bestämning av ursprungliga enzymaktiviteter Ureas pH-stat-titrering med l N H01 vid pH 7,0 och 5000.
Man använde 5m*(0,5 M) karbamid i 0,2 M fosfat- buffert som substrat. l enhet är l/u mol karbamid hydrolyserat/minut.
“ Penicillin V- -acylas Inkubering vid 4000 med 5% penicillin V i 0,2 M fosfatbuffert vid pH 7,5. Efter avlägsnande av cellerna bestämdes bildad 6-APA med p-aminobens- aldehyd enligt Balasingham et al. (1972), Bio- chem. Biophys. Acta 276, 250-56. l enhet = 1/u mol 6-APA framställd/minut.
Laktas Först öppnas icke immobiliserade celler genom be- handling vid rumstemperatur med ca 8% 1-butanol i o,1 M feefetbuffert med pH 7 i 20 minuter. Imkube- ring (vid 5790 för Kluyveromyces fragilis lactase och vid 6000 för lactasen från NREL B-ll, 229) med 4,75% (vikt/vol) laktos i mjölkbuffert med pH 6,5 (Das grosse Melkerei Lexikon, Schultz 1965, band 2, M-Z p. 740). Efter avlägsnande av cellerna bestämdes den framställda glukosen med Boehringer Mannheims blodsockerreagens (GOD-Perid metod). l enhet = l/u mol glukos framställd/ minut. ' Malolaktiskt enzym Inkubering vid 3000 med 53 mM L-mdiet, 1,67 mm NAD* den 0,7 mm Mncig i 0,1 M foefetbdffert med pH 5. Efter avlägsnande av cellerna bestämdes bildat iektee med LDH + NAD* enligt Gutmenn, I., och Wahlefeld, A.W. (1974) i Methods of Enzymatic Analysis, andra upplagan, band 5, (H.U. Bergmeyer, ed.) Academic Press, sid 1465-67. l enhet = 1/u mol laktat bildat/minut. mn lO 15 20 25 50 465 965 Följande exempel illustrerar föreliggande uppfinning ytter- ligare. Exemplens principiella innehåll framgår av följande ta- bell.
Framställning Användning av Enzym av immobiliserat immobiliserat Exempel enzym enzym Penicillin x l ~ 7 V-acylas _ X 8 _ lo 2 x ll - lj Laktas ¿ . X ! 4 13 x l - l5 Ureas X 16 Malolaktiskt x l7 - 18 enzym x 19 - 20 Exempel l2 avser ett jämförelseförsök utan polyetylenimin.
I samtliga följande exempel inställes pH-värdet för poly- etyleniminen på ca 7 före tillsatsen. Emellertid kan man också er- hålla tillfredsställande immobiliserade enzymer med hjälp av poly- etyleniminer med andra pH-värden, t.ex. inom intervaller från ca 4 till ca 9.
Exempel l Till l l fermentationsvätska svarande mot stammen NRRL ll240, innehållande ca l% torra celler och l,5 penicillin V-acy- lasenheter/ml, tillsatte man under omröring 50 ml 10% polyetylen- imin (grenad, molekylvikt 60 000, PEI 600 från Dow Chemicals), följt av 25 ml 25% glutaraldehyd efter 5 minuter. Man fortsatte omröringen i ytterligare 60 minuter vid rumstemperatur, och de immobiliserade cellerna avfiltrerades därefter, varpå de tvättades. med fosfatbuffert (50 mM pH 7) och lufttorkades. Härvid erhölls 14,2 g torkade immobiliserade celler med en aktivitet på 71 enhe- ter/g med en partikelstorlek mellan 180 och 420/um, motsvarande ett aktivitetsutbyte på 65%. ' Exempel 2 Till 1,5 l fermentationsvätska härrörande från stam NRRL ll240 (0,68 penicillin V-acylasenheter/ml) tillsattes under omröring 45 ml av 10% polyetylenimin (grenad, molekylvikt 600, PEI 6 från Dow Chemicals) och 50 ml 25% glutaraldehyd vid 400.
Man fortsatte omröringen under reducerad hastighet i 60 minuter, och de bildade multi-cellpartiklarna filtrerades därefter, varpå de tvättades med fosfatbuffert med pH 7 och lufttorkades. Det tor- kade preparatet (21 g) hade en penicillin V-acylasaktivitet pä lO 15 25 50 465 965 , 8 14,5 enheter/g vid en partikelstorlek av 200-700/um, vilket sva- rar mot ett aktivitetsutbyte på 50%.
Exempel 5 580 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,5 avxyldes till ca 1500, och 40 1 10% polyetylenimin (Polymin P, BASF) tillsattes under omröring, efterföljt av 9,4 l 25% glutaraldehyd (Union Carbide). satte härefter omröringen vid reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varpå man tillsatte ß-merkaptoetanol till en slutlig koncentration av 25 mM, och delimmobiliserade cellerna separerades på en filterpress. Den våta filterkakan granulerades, och granula- tet torkades som en fluidiserad massa vid 50-5500. Härvid erhölls _ 7,1 kg torrt preparat med 55 enheter/g (icke fraktionerade partik- lar), vilket motsvarar ett aktivitetsutbyte på Äl%.
Exempel 4 En serie immobiliserade preparat från samma fermentations- vätska med stammen NRRL ll240 som i Exempel 5 visar effekten av variationer av koncentrationen av polyetylenimin vid konstant tillsats av glutaraldehyd. Resultaten framgår av Tabell II. penicillin V-acylasenheter/ml) Man fort- Tabeii Ii ïgåïššïšegšmin Penicillin v-acyiasaktivitét, % Vikt/Vol ' enheter/g produkt (200-400/um) 0,2 1 0,5 36 0,8 58 1,0 ii 1,2 70 I samtliga fall tillsatte man den angivna mängden Polyamin P (BASF) under omröring som en 10% lösning till 0,5 l fermentations-' vätska med stammen NRRL ll24O (2,5 Penicillin V-acylasenheter/g) I efterföljt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omröringen med reducerad hastighet i ytterligare 60 minuter, varefter cellerna avfiltrerades, tvättades med 25 mM ß-merkaptoetanol i 50 mM fos- fatbuffert med pH 7,5 och lufttorkades. Härvid erhölls ca 9 g torrt material vid varje försök.
Exempel 5 Till 2 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,0 penicillin V-acylasenheter/ml) tillsattes 200 ml 10% polyetylen- imin (Polymin P, BASF), och cellerna koncentrerades därefter till 10 15 20 25 465 965 ca en tiondel av den ursprungliga volymen. 6 ml 25% glutaraldehyd tillsattes till cellslammet under omröring, och man lät omröringen fortsätta med reducerad hastighet i ytterligare 60 minuter. De immobiliserade cellerna filtrerades därefter och tvättades med 25 mM ß-merkaptoetanol i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5 på ett glasfilter. Efter lufttorkning vid rumstemperatur erhölls 20 g preparat med 65 enheter/g (200-400/um). Detta motsvarar ett akti- vitetsutbyte“på ca 55%.
En serie immobiliserade¿preparat, som framställdes på samma sätt som beskrivits ovan men med varierande mängder glutaraldehyd, visar effekten av variationer av glutaraldehydkoncentrationen efter konstant tillsats av polyetylenimin och efterföljande koncentre- ring. Resultaten framgår av följande Tabell III.
Tabell III Glutaraldehyd, Penicillin V-acylasaktivitet % vikt/vol ' enheter/g torrt preparat (200-400/um). 0,5 106 0,75 65 1,0 I 56 1,5 57 5,0 25 Det erhölls mellan 9 och ll g torrt material vid varje för- sök per l fermentationsvätska.
Exempel 6 550 l fermentationsvätska med stammen NRRL ll240 (2,4 peni- cillin V-acylasenheter/ml) kyldes tilf¥ï5OC, och under omröring tillsattes 24,5 l 10% polyetylenimin (grenad, molekylvikt ca 700, PEI l5T från Taihei Sangyo Kaisha) följt av 5,5 l 50% glutaralde- hyd (Union Carbide). Man fortsatte därefter omröringen med reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varefter B-merkapto- etanol tillsattes till en slutlig koncentration av 25 mM, och de immobiliserade cellerna separerades på en membranpress. Filter- kakan strängsprutades (öppning 500/um), och partiklarna torkades i en fluidiserad massa vid 50-5500. Utbytet var 6,2 kg torrt pre- parat med 85 penicillin V-acylasenheter/g (partikelstorlek under 500/um) svarande mot ett aktivitetsutbyte på 65%. 10 15 20 4 10 465 965 .
Exempel Z En serie immobiliserade preparat från samma fermentations- vätska med stammen NRRL 11240 som i Exempel 5 och 4 visar effek- ten av de använda olika typerna av polyetylenimin.
Mol- I Penicillin ' Utbyte av Polyetylen- vikt % V-acy1asakti- torrt pre- imin X lo-5 PEI vitet, enhe- parat, g ter[g PEI 600, “ _ Dow Chemicals 60 A 0,5 105 8 Poiymin Hs, BAS? - f' 0,8 50 16 Polymin P, BASF - 1,0 70 10 Sedipur CL 950, BASF (100) 1,0 50 ll PEI 15 T, Taihei Sangvo Kaisha Ltd. 0,7 0,7 154 7 PEI 210 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd. 40-60 0,9 80 10 Epomin P-1000, Shokubai Kagaku Kogyo Co. 60-80 0,9 65 14 Epomin P-500, Shokubai Kagaku Kogyo Co. _50-40 0,9 120 7 I samtliga fall tillsatte man den angivna mängden poly- etylenimin under omröring som en 10% lösning till 0,5 l fermenta- tionsvätska med stammen NRRL 11240 (2,5 penicillin V-acylasenhe- ter/ml) följt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes med reducerad hastighet i ytterligare 45 minuter, varefter cellerna avfiltrerades, tvättades med 25 mM B-merkaptoetanol i 50 mM fos- fatbuffert med pH 7,5 och lufttorkades.
Exempel 8 10 g av de celler, som immobiliserades såsom beskrivits i Exempel 1, sattes till 200 ml 5% (vikt/vol) rått K-penicillin V i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5. Deacylering genomfördes vid 4000 med en omröringshastighet på 150 varv/minut och ett konstant pH av 7,5 (genom titrering med 4 N Na0H). 95% av penicillinet om- vandlades till 6-APA under loppet av 2,5 timmar. Metoden kunde < upprepas med färskt penicillin V minst 20 gånger utan någon väsent- lig reduktion av omvandlingen. Omvandlingsgraden bestämdes genom _ HPLC (vätskekromatografi under högt tryck), separation av reak- tionsblandningen på en Waters' uBondapak C-18-kolonn (eluerad med en gradient_från 20% metylalkohol i vatten till 50% metylalkohol Pic A-reagens) och efterföl- \'/ i vatten, jonparbildning med Water's lO 15 20 . 11' 465 965 jande uv-bestämning. Se Waters Associates' information brochure Paired-Ion Chromatography, D 61 Maj 1976, tryckt i USA (Maple Street, Milford, Mass.). Resultaten vad avser omvandling av 5% (vikt/vol) K-penicillin V till 6-APA vid 4000 framgår av Tabell IV.
Tabell IV Försöksnummer Omvandli s ad 1 0 _ 7:) L.
Exempel Q 9,7 g av de immobiliserade cellerna från Exempel 2 sattes till 100 ml 5% (vikt/vol) K-penicillin V i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5. Deacyleringen genomfördes vid 4000 med en omrörings- hastighet av 150 varv/minut och ett konstant pH av 7,5 med hjälp av en pH-stat. Mera än 90% penicillin omvandlades till 6-APA under 5 timmar. Efter 10 på varandra följande försök hade omvand- lingstiden stigit till ca 5,5 timmar och efter 20 på varandra föl- jande försök till 4 timmar.
Exempel 10 Immobiliserade celler motsvarande en torrvikt på 100 g och härrörande från produkten i Exempel 6 utsattes för ny svällning i 50 mM fosfatbuffert med pH 7,5 innehållande 5 mM-B-merkaptoetanolv och packad i en kolonn med en diameter på 10 cm (massvolym 400 ml). 65 g rått K-penicillin V i 1,5 1 av samma merkaptoetanolhaltiga buffert som angivits ovan recirkulerades genom en förvärmare till kolonnen (vars temperatur hölls på 5500) och tillbaka till en be- hållare (vars temperatur hölls vid 1200), i vilken pH-värdet kon- tinuerligt inställdes på 7,5 genom titrering med 4 M Na0H. Med en_ cirkulationshastighet av 14 bäddvolymer per timme uppnåddes en omvandling av penicillin V till 6-APA på 98% efter 4 timmars för- lopp. Efter 10 på varandra följande försök måste reaktionstiden ökas till 6 timmar. 465 965 12 Exempel ll Till 500 ml fermentationsvätska med Kluyveromyces fragilis NRRL Y 1109 (pH inställt på 7,5) tillsatte man under omröring 40 mi 10% polyatylenimin (grenad, moiakyivikt 700, PEI 15 T 5 från Taihei Sangyo Kaisha), följt av 16 ml 25% glutaraldehyd.
Efter 60 minuters omröring vid rumstemperatur utsattes partik- larna för filtrering, granulering och lufttorkning. Det erhållna 6,5 g torra materialet hade en laktasaktivitet på ca 500 enheter/g, vilket motsvarar ca 50% av den ursprungliga aktiviteten. 10 Exempel 12 ~ -1 ' Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-11,229 med 5,1 laktasenheter/ml sattes 25 ml 10% polyetylenimin (PEI 15 T från Taihei Sangyo Kaisha Co.) under omröring, följt av 10 ml 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes i l timme vid rumstemperatur, 15 varefter de immobiliserade cellerna avfiltrerades och lufttorka- des. 4,0 g torkat preparat innehöll 209 laktasenheter/g, vilket motsvarar ett uthyte på 55%.
För att demonstrera effekten av polyetyleniminen utfördes ett jämförelseförsök utan polyetylenimin på följande sätt. 20 Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-ll, 229 med 5,1 laktasenheter/ml satte man 10 ml 25% glutaraldehyd under omrö- ring. Omröringen fortsattes i l timme vid rumstemperatur. De be- handlade cellerna flockulerades med 0,5% Superfloc (l2,5 ml 20% Superflock C 521, ett katjoniskt flockuleringsmedel), filtrerades 25 och lufttorkades. 5,7 g torkat preparat innehöll 105 laktasen- heter/g, vilket motsvarar ett utbyte på 15%.
Exempel 15 Till 500 ml fermentationsvätska med NRRL B-ll, 229 innehål- lande intracellulärt laktas sattes 50 ml 10% polyetylenimin 50 (PEI 15 T från Taihei Sangyo Kaisha) följt av 14 ml 25% glutar- aldehyd. Man fortsatte omröringen i 50 minuter, och preparatet filtrerades och lufttorkades. Det visade sig, att de torkade partiklarna innehöll ca 50% av den ursprungliga laktasaktiviteten, och att de kunde användas för upprepade diskontinuerliga omvand- 55 lingar av 4% laktos vid 6000.
Exempel 14 Till 500 ml 6 gånger koncentrerad fermentationsvätska med Bacillus pasteurii ATCC ll 859 (6,5 g torra celler, 9500 ureas- enheter/g) satte man under omröring 18 ml 10% polyetylenimin 40 (grenad, molekylvikt 60 000, PEI 600 från Dow Chemicals), följt 10 _15 20 25 50 35 40 « 15' 465 965 av 20 ml 25% glutaraldehyd. Efter ytterligare 60 minuters omrö- ring vid rumstemperatur avfiltrerades de immobiliserade cellerna, varpå de lufttorkades. Härvid erhölls 13,8 g torra, immobilise- rade celler med en ureasaktivitet på 1900 enheter/g och med en partikelstorlek på 500-700/um. Detta motsvarar ett aktivitetsut- byte på ca 45%. ' Exempel 15 Till 100 ml av en 4% (vikt/vol) vattenbaserad suspension av Bacillus pasteurii ATCC 11 859 med 250 ureasenheter/ml satte man 32 ml 10% polyetylenimin (Polymin HS, BASF) under omröring, följt av 5 ml 25% glutaraldehyd. Man fortsatte omröringen i 1 timme vid 490, varefter cellerna avfiltrerades och lufttorkades. 2,3 g torrt preparat innehöll en ureasaktivitet på 3100 enheter/g (partikelstorlek 500-700/um), vilken motsvarar ett aktivitetsut- byte på 51%.
Exempel 16 0,5 g av de celler, som immobiliserades såsom beskrivits i Exempel'14, packades i en kolonn (1 cm ø x 10 cm), och ett substrat, som innehåller 1% karbamid (0,0l% MgCl , 10 mM ß-mer- kaptoetanol) och vars pH-värde var inställt på 9, fördes genom massan vid 4000. 98% av karbamiden kunde hydrolyseras med en strömningshastighet på 50 ml/h, och halveringstiden för enzym- aktiviteten var ca 1000 timmar.
Exempel 12 Till 0,25 l fermentationsvätska med Leuconostoc oenos DSM 20252, inställd på pH 6,5 med Na0H, med 14 enheter malo- laktisk aktivitet per 1, sattes under omröring 5 ml 10% poly- etylenimin (Polymin P, BASF), följt av 1 ml 25% glutaraldehyd.
Omröringen fortsattes i ytterligare 50 minuter vid 400, varefter de immobiliserade cellerna avfiltrerades, tvättades med 0,1 M fosfatbuffert med pH 6 och vatten och därpå frystorkades. De torkade cellerna hade konstant en malolaktisk aktivitet på 5,4 enheter/g, vilken motsvarar ett aktivitetsutbyte på ca 40%.
Exempel lå 1,6 g våta celler av Leuconostoc oenos DSM 20252 med 96 enheter malolaktisk aktivitet/g suspenderades i 16 ml vatten, och pH-värdet inställdes på 7,0. Man tillsatte 1,7 ml 10% poly- etylenimin (Polymin P, BASF) under omröring, följt av 1,5 ml av 25% glutaraldehyd. Omröringen fortsattes i l timme vid rums- temperatur, varefter de immobiliserade cellerna filtrerades, 465 965 , 10 15 lfl tvättades med vatten och lufttorkades. Den torkade produkten (0,5 g) hade en malolaktisk aktivitet på 55 enheter per g, vilket motsvarar ett aktivitetsutbyte på 28%.
Exempel 19 Immobiliserade celler som beskrivits i Exempel 17 i en mängd svarande mot 4 g torrt material sattes till 50 ml mM L-malat i 0,1 M fosfatbuffert vid pH 5,0 tillsammans med 85/umol NAD+ och 55/umol MnC1é. Härvid erhölls total omvandling av malat till laktat under loppet av 5 timmar. Metoden kunde upprepas minst 5 gånger utan någon ökning av reaktionstiden.
Exempel_gQ 0,55 g av preparatet från Exempel 18 sattes till 10 ml 55mM L-malat i 0,1 M fosfatbuffert med pH 4,0 tillsammans med 17/umol NAD+ och 7/umol MnC12. Härvid erhölls total omvandling av malat till laktat under loppet av 6 timmar, och metoden kunde upprepas med färskt malat, NAD+ och MnC1p minst 5 gånger utan - någon ökning av reaktionstiderna. _ f)
Claims (3)
1. l. Förfarande för immobilisering av ett intracellulärt, glutaraldehydkänsligt enzym, k ä n n e t e c k n a t av att man i ett vattenbaserat medium och utan närvaro av partikelformig bärare omsätter mikrobiella celler, som innehåller intracellulä- ra, glutaraldehydkänsliga enzymer, med glutaraldehyd i när- varo av en polyamin med ett innehåll av primära aminogrupper av mera än 5 % av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper, och att man isolerar det erhållna, immobiliserade enzymet.
2. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att innehållet av primära aminogrupper i polyaminen över- stiger 20 % av det totala innehållet av primära, sekundära och tertiära aminogrupper.
3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t av att polyaminen är en polyalkylenpolyamin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1552178 | 1978-04-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE7903357L SE7903357L (sv) | 1979-10-20 |
| SE465965B true SE465965B (sv) | 1991-11-25 |
Family
ID=10060596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE7903357A SE465965B (sv) | 1978-04-19 | 1979-04-17 | Foerfarande foer immobilisering av ett intracellulaert, glutaraldehydkaensligt enzym |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4288552A (sv) |
| JP (1) | JPS54163888A (sv) |
| AT (1) | AT364880B (sv) |
| BE (1) | BE875657A (sv) |
| CH (1) | CH640882A5 (sv) |
| DE (1) | DE2915135A1 (sv) |
| DK (1) | DK146942C (sv) |
| FR (1) | FR2423497B1 (sv) |
| IT (1) | IT1116501B (sv) |
| NL (1) | NL7902860A (sv) |
| SE (1) | SE465965B (sv) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5836959B2 (ja) * | 1980-08-21 | 1983-08-12 | 三井製糖株式会社 | 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法 |
| US4347320A (en) * | 1980-11-24 | 1982-08-31 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of microorganisms in gelled carrageenan |
| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| US4355105A (en) * | 1981-03-30 | 1982-10-19 | Miles Laboratories, Inc. | Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells |
| US4486408A (en) * | 1981-04-07 | 1984-12-04 | Kiel Johnathan L | Insoluble crosslinked cytotoxic oxidase-peroxidase system |
| US4390627A (en) * | 1981-10-26 | 1983-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum |
| DE3222912A1 (de) * | 1982-06-18 | 1983-12-22 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Unloeslicher biokatalysator |
| JPS5951790A (ja) * | 1982-09-20 | 1984-03-26 | Nok Corp | 酵素固定膜の製造法 |
| US4760024A (en) * | 1983-08-10 | 1988-07-26 | Miles Inc. | Immobilization of enzymes |
| CA1210717A (en) * | 1983-08-10 | 1986-09-02 | Oreste J. Lantero, Jr. | Immobilization of biocatalysts |
| DE3408299A1 (de) * | 1984-03-07 | 1985-09-12 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen |
| US4898827A (en) * | 1984-10-17 | 1990-02-06 | Advanced Mineral Technologies, Inc. | Metal recovery |
| DK152764C (da) * | 1985-06-14 | 1988-10-03 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| USRE33441E (en) * | 1985-06-14 | 1990-11-13 | Novo Industri A/S | Immobilization of biologically active material with glutaraldehyde and polyazaetidine |
| IT1204845B (it) * | 1986-03-25 | 1989-03-10 | Foscama Biomed Chim Farma | Procedimento per preservare l'attivita' fosforilante del lievito di birra,applicato alla produzione di fruttosio-1,6-difosfato |
| JPH0424967Y2 (sv) * | 1987-07-16 | 1992-06-15 | ||
| DK589389D0 (da) * | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Novo Nordisk As | Immobiliseret enzympraeparat |
| US6551804B2 (en) | 1999-07-12 | 2003-04-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing 4-cyanopentanoic acid |
| US7964415B2 (en) | 2006-04-26 | 2011-06-21 | Cardiogenics Inc. | Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof |
| DE102006028817A1 (de) * | 2006-06-21 | 2007-12-27 | Evonik Degussa Gmbh | Aufarbeitung von Reaktionslösungen aus Ganzzell-Biotransformationen |
| US7695945B2 (en) * | 2007-10-31 | 2010-04-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
| US7741088B2 (en) | 2007-10-31 | 2010-06-22 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
| EP2776562B1 (en) * | 2011-11-11 | 2020-11-04 | Guild Associates, Inc. | Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same |
| CN107238645B (zh) * | 2017-05-11 | 2019-04-30 | 山东省科学院生物研究所 | 在线监测用葡萄糖氧化酶丝网印刷电极及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2035774A2 (en) * | 1969-03-19 | 1970-12-24 | Anvar | Active protein product - with polymeric carrier |
| US3796634A (en) * | 1970-03-19 | 1974-03-12 | Us Health Education & Welfare | Insolubilized biologically active enzymes |
| US3779869A (en) * | 1971-05-13 | 1973-12-18 | Miles Lab | Enzyme stabilization |
| BE785810A (fr) * | 1971-07-09 | 1973-01-04 | Reynolds Tobacco Co R | Procede de transformation enzymatique |
| GB1400468A (en) * | 1972-07-22 | 1975-07-16 | Beecham Group Ltd | Enzyme preparation and use thereof |
| GB1444539A (en) * | 1972-09-11 | 1976-08-04 | Novo Industri As | Immobilised enzymes |
| US3957580A (en) * | 1974-03-27 | 1976-05-18 | Pfizer Inc. | Immobilized microbial cells |
| US3989596A (en) * | 1974-03-28 | 1976-11-02 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Aggregate of dried flocculated cells |
| US3980521A (en) * | 1974-08-28 | 1976-09-14 | Novo Industri A/S | Immobilization of glucose isomerase |
| JPS51144778A (en) * | 1975-06-07 | 1976-12-13 | Res Inst For Prod Dev | A process for immobilizing microorganisms |
-
1979
- 1979-04-06 DK DK141779A patent/DK146942C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-04-10 CH CH339479A patent/CH640882A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-04-11 US US06/029,156 patent/US4288552A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-04-11 NL NL7902860A patent/NL7902860A/xx active Search and Examination
- 1979-04-12 DE DE19792915135 patent/DE2915135A1/de active Granted
- 1979-04-17 SE SE7903357A patent/SE465965B/sv not_active IP Right Cessation
- 1979-04-17 AT AT0284879A patent/AT364880B/de not_active IP Right Cessation
- 1979-04-18 BE BE0/194672A patent/BE875657A/xx not_active IP Right Cessation
- 1979-04-18 IT IT48765/79A patent/IT1116501B/it active
- 1979-04-18 FR FR7909800A patent/FR2423497B1/fr not_active Expired
- 1979-04-18 JP JP4679979A patent/JPS54163888A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK146942B (da) | 1984-02-20 |
| AT364880B (de) | 1981-11-25 |
| SE7903357L (sv) | 1979-10-20 |
| IT7948765A0 (it) | 1979-04-18 |
| BE875657A (fr) | 1979-10-18 |
| NL7902860A (nl) | 1979-10-23 |
| IT1116501B (it) | 1986-02-10 |
| DK146942C (da) | 1984-07-30 |
| FR2423497B1 (fr) | 1986-01-03 |
| JPS6222599B2 (sv) | 1987-05-19 |
| JPS54163888A (en) | 1979-12-26 |
| ATA284879A (de) | 1981-04-15 |
| US4288552A (en) | 1981-09-08 |
| DE2915135A1 (de) | 1979-10-31 |
| CH640882A5 (de) | 1984-01-31 |
| FR2423497A1 (fr) | 1979-11-16 |
| DK141779A (da) | 1979-10-20 |
| DE2915135C2 (sv) | 1988-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE465965B (sv) | Foerfarande foer immobilisering av ett intracellulaert, glutaraldehydkaensligt enzym | |
| US4950596A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| EP0297912B1 (en) | Process for immobilization | |
| RU2188864C2 (ru) | Нитрилаза, штамм rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилазы (варианты), способ получения акрилата аммония, способ детектирования нитрила, способ очистки полимера | |
| EP0366303B1 (en) | Biocatalysts | |
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| US4390627A (en) | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum | |
| SE423718B (sv) | Samtidigt immobiliserade enzym(er) och mikroorganism(er) och deras framstellning | |
| US4072567A (en) | Compound water-insoluble glucan and process for the production thereof | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| Barker et al. | Recovery and re-use of water-insoluble amylase derivatives | |
| US4681843A (en) | Immobilization of cells and enzymes | |
| JPS6196989A (ja) | Ｄ‐α‐アミノ酸アミドの相応するＤ‐α‐アミド酸への酵素加水分解法 | |
| KR100338566B1 (ko) | 기질상에고정된페니실린g아미다아제,글루타릴-7-aca아실라아제또는d-아미노산옥시다아제 | |
| CA1267618A (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| RU96115306A (ru) | Фиксированные на носителе ферменты | |
| Konecny et al. | Effects of carrier morphology and buffer diffusion on the expression of enzymatic activity | |
| US4420562A (en) | Method for producing creatinase | |
| JPH0369278B2 (sv) | ||
| EP0032987A1 (en) | Thermophilic aspartase, processes for producing, culture used, and L-aspartic acid preparation process using the same | |
| CA2044911A1 (en) | Process for producing ascorbic acid-2-phosphate | |
| NO871734D0 (no) | Fremgangsmaate til immobilisering av forankringsavhengige celler. | |
| EP0118979A1 (en) | Production of immobilised enzymes | |
| US3939041A (en) | Method of making fructose | |
| Illanes | Chitin as a matrix for enzyme immobilization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 7903357-7 Effective date: 19941110 Format of ref document f/p: F |