SE454047B - Forfarande for framstellning av ett komplex av streptokinas och en lett plasminkedja med ett serinproteasaktivt centrum - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 454 047 2 människoplasminogen och komplexet av streptokinas och människo- plasmin aktiva vid omvandling av nötplasminogen till nötplasmnm Det är känt, att plasmin kan delas i en tung kedja (A-kedja) och en lätt kedja (B-kedja) genom spjälkning av plasminmoleky- lerna vid disulfidbindningarna mellan kedjorna (en eller två disulfidbindningar per molekyl), och det är känt att den tunga kedjan och den lätta kedjan kan separeras från varandra. Rickli och Otavasky anger i Eur. J. Biochem., 59, 441-447 (1975), att fraktionerna kan separeras genom adsorption av den tunga kedjan pâ en adsorbent av L-lysinsubstituerad polyakrylamid med elue- ring av den lätta kedjan. Författarna anger icke några egen- skaper hos den eluerade B-kedjefraktionen, men undersökningar har nu visat, att den med deras förfarande framställda B-kedje- fraktionen vid komplexbindning till streptokinas ger ett kom- plex, som är väsentligen inaktivt för omvandling av plasminogen till plasmin.

Den tunga fraktionen (A-kedjan) kan icke ge något strepto- kinaskomplex.

Av säkerhetsskäl kan terapeutiska material, som härrör från människoblod, inklusive plasminogen och plasmin, icke insprutas i blodströmmen hos en patient, enär sådan injektion kan över- föra virussmitta, t.ex. hepatitvirus, till patientens blodström.

Förenta Staternas Food and Drug Administration kräver, att allt material, som härrör från människoblod, skall värmas vid GOOC under 10 timmar för inaktivering av eventuellt hepatitvirus, för att materialet eller ett derivat därav skall kunna godkän- nas för försäljning som terapeutiskt material för insprutning i blodströmmen.

Om ett komplex av streptokinas och plasmin utsätts för sådan värmebehandling, förändras dess karaktär och blir det inaktivt för omvandling av plasminogen till plasmin. Om man utsätter plasminogen för sådan värmebehandling, innan det omvandlas till plasmin och komplexbinds med streptokinas, förändras även det erhållna komplexets karaktär. Ehuru streptokinaskomplexet allt- jämt har aktivitet för omvandling av plasminogen till plasmin, är dess proteinkomponent så denaturerad av värmebehandlingen, att antigena och pyrogena reaktioner kan äga rum, då komplexet insprutas i blodströmmen hos en patient. 10 15 20 25 30 35 454 047 3 På grund härav har man inte använt komplex av streptokinas och plasmin som rutinmässig terapeutisk behandling för upplös- ning av blodproppar hos människor.

Föreliggande uppfinning avser framställning av ett komplex av streptokinas och en lätt plasminkedja med ett serinproteas- aktivt centrum. Det har visat sig, att det serinproteasaktiva katalytiska centrum hos plasminmolekylen finns pâ molekylens lätta sida (B-sida), men att kända förfaranden för spjälkning av plasminmolekylen och separering av de'lätta och den tunga kedjan medför inaktivering av det serinproteasaktiva centrum på den lätta kedjan, så att denna blir lika inaktiv som den tunga kedjan, vilken icke har något dylikt katalytiskt centrum.

Det har vidare visat sig, att kända reversibla inhibitorer för det serinpreteasaktiva centrum, såsom leupeptin, inhiberar desaktiveringen eller förgiftningen av det serinproteasaktiva centrum i den lätta kedjan och därigenom skyddar dess aktivitet under reduktions- och separeringsstegen.

Det har också visat sig, att streptokinas skyddar det serin- proteasaktiva centrum och att ett komplex av streptokinas och plasminogen eller av streptokinas och plasmin kan utsättas för reduktions- och separeringsstegen utan att en reversibel inhi- bitor för det serinproteasaktiva centrum behöver förekomma, för framställning av ett komplex av streptokinas och den lätta kedjan med fibrinolytisk aktivitet.

Vidare har det visat sig, att en aktiv lättkedjefraktion kan framställas av ett plasminogenutgângsmaterial, som har värmebenanalats vid eo°c under 10 timmar, och att den sålunda framställda fraktionen kan bindas vid streptokinas till ett fibrinolytiskt aktivt komplex, som framkallar väsentligt svaga- re antigen eller pyrogen reaktion vid insprutning i patientens blodström än ett komplex av streptokinas och en värmebehandlad plasminogen, som icke har fraktionerats.

Det på grund av dessa rön utarbetade förfarandet enligt upp- finningen definieras närmare i kravet 1. Förfarandet innefattar företrädesvis den åtgärden, att människoplasminogen utsättes för en inledande värmebehandling vid 60°C under 10 timmar för inaktivering av eventuella virusföroreningar. Den värmebehand- lade plasminogenen aktiveras sedan till plasmin och blandas med 10 15 20 25 30 35 454 047 4 en inhibitor för det serinproteasaktiva centrum, t.ex. leupemin (acetyl-L-leucin-L-arginina1) i sådan mängd, att plasminaktivi- teten helt eller till största delen inhiberas. Blandningen av plasmin och leupeptin reduceras sedan med ett reduktionsmedel, t.ex. 2-merkaptoetanol eller ditioerytritol, för spjälkning av disulfidbindningarna i plasminmolekylerna, så att tunga plasmin- kedjor (A-kedjor) och lätta plasminkedjor (B-kedjor) erhålles.

Sedan alkylerar man produkten med ett alkyleringsmedel, t.ex. natriumjodacetat, för att hindra disulfidbindningarnas brutna ändar (sulfhydrylgrupper) att förenas på nytt. Den alkylerade produkten ledes genom en affinitetskromatografikolonn, vari A- kedjefraktionen adsorberas och B-kedjefraktionen elueras och går genom kolonnen utan att adsorberas. Den lätta kedjan (B- kedjan) fâlles med ammoniumsulfat, centrifugeras och löses på nytt i ett buffertmedium. Då kedjan fälls, stannar största de- len av leupeptinet kvar i vätskefasen. Den ringa mängd leupep- tin, som stannar hos den fälld och omlösta lätta kedjan hjälper till att konservera denna vid lagring i vätskefas, men försäm- rar icke dess aktivitet, enär den spädes till försumbar koncen- tration när komplexet av den lätta plasminkedjan och strep- tokinas införes i patientens blodström.

Den lätta kedjan komplexbinds med streptokinas, rå eller renad, genom att materialen blandas med varandra i ekvimolära proportioner och blandningen inkuberas en kort tid.

Enligt vår parallellansökan 83 01795~4 kan ett ekvimolärt komplex av lätt kedje och streptokinas även framställas ur ett plasmin-streptokinaskomplex genom att reducera komplexet för spjälkning av disulfidbindningarna i komplexet plasminmolekyler, så att man får tunga plasminkedjor och lätta plasminkedjor bund- na vid streptokinasen, alkylera produkten och leda den genom en kromatografikolonn, vari den tunga plasminfraktionen adsorberas och komplexet av den lätta plasminkedjan och streptokinasen elueras och går genom kolonnen utan att adsorberas.

I sistnämnda fall är det onödigt att använda leupeptin eller annan reversibel inhibitor för serinproteasaktiva centra, enär streptokinasen har samma funktion och förhindrar aktivitetsför- lust i den lätta kedjan under reduktionen av plasminstrukturen och under separeringen. 10 15 20 25 30 35 494 047 5 Det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som fram- ställts ur ett plasmin-streptokinaskomplex enligt vår parallell- ansökan, har mycket lägre proteolytisk aktivitet än det plasmin- streptokinaskomplex varur det erhållits, i allmänhet mindre än omkring 20 mol-% och mindre än omkring 35 vikt-%. Typiskt har det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som fram- ställts ur ett plasmin-streptokinaskomplex, en proteolytisk aktivitet, mätt på kaseinsubstrat, av omkring 2 - 3,5 CTA-enhe- ter per mg protein eller omkring 0,14 -'0,25 CTA-enheter per nmol protein. Med "CTA-enheter" avses standardaktivitetsenheter enligt Committee on Thrombolytic Agents (National Heart and Lung Institute) och World Health Organization, såsom beskrives i Johnson m.fl., Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica, 21, sid. 259-272 (1969).

Det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som har framställts ur streptokinas och en lätt kedja (B-kedja) enligt föreliggande förfarande, har en proteolytisk aktivitet av unge- fär samma storleksordning som det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som framställts ur ett plasmin-streptokinas- komplex.

Det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas som har framställts ur plasmin-streptokinaskomplexet enligt vår paral- lellansökan har typiskt en aktivitet såsom nötplasminogenakti- vator, vilken är omkring 1,6 - 1,8 gånger så stor, räknat på 'viktbas, som aktiviteten av det plasmin-streptokinaskomplex, varur det är framställt. Pâ molär bas är nötplasminogenaktivi- teten hos komplexet av lätt kedja och streptokinas omkring 0,8 - 1,0 gånger så stor som aktiviteten hos det plasmin-stremxr kinaskomplex, varav det är framställt. Typiska värden pâ akti- viteten som nötplasminogenaktivator hos komplex av lätt plasmm- kedja och streptokinas, som är framställda av plasmin-strepto- kinaskomplex, mätt på kaseinsubstrat, är omkring 3 - 4 CTA- enheter per ug protein eller omkring 200 - 260 CTA-enheter per nmol protein. 7 Aktiviteten som nötplasminogenaktivator hos det komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som är framställt av strepto- kinas och en lätt plasminkedja (B-kedja) enligt föreliggande förfarande, är omkring 0,70 - 0,75 av aktiviteten hos det 10 15 20 25 30 35 454 047 6 komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som framställts av ett plasmin-streptokinaskomplex.

Aktiviteten som människoplasminogenaktivator hos det kompæx av lätt plasminkedja och streptokinas, som framställts av plasmin-streptokinaskomplexet enligt vår parallellansökan, är i allmänhet omkring 1,8 - 2,2 gånger (pâ viktbas) aktiviteten hos det plasminstreptokinaskomplex, varur det är framställt.Pâ molbas är aktiviteten som människoplasminogenaktivator hos kom- plexet av lätt plasminkedja och streptokinas omkring 1,6 - 1,2 gånger aktiviteten hos det plasmin-streptokinaskomplex, varur det är framställt.

Typiska värden på aktiviteten som människoplasminogenakti- vator hos komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas, mätt på kaseinsubstrat, är omkring 8 - 12 CTA-enheter-per ug protein eller omkring 550 - 800 CTA-enheter per nmol protein. värdena på aktiviteten som människoplasminogenaktivator hos komplex av lätt plasminkedja och streptokinas, som framställts av en lätt plasminkedja och streptokinas, är omkring 0,9 - 1,9 gånger värdena hos det komplex av lätt plasminkedja och strepto- kinas som framställts av ett plasmin-streptokinaskomplex.

De väsentligt högre värdena på aktiviteten som människoplas- minogenaktivator hos komplexet av lätt plasminkedja och strepto- kinas, i förhållande till aktiviteten hos plasmin-streptokinas- komplexet, gör det möjligt att använda lägre intravenös dose- ring av komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas för upp- nående av en viss fibrinolytisk verkan än vid användning av plasmin-streptokinaskomplexet. ' Dessutom har försök in vitro visat, att komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas är väsentligt verksammare än plasmin-streptokinaskomplexet för minskning eller upplösning av blodproppar även vid doser, som är jämförbara vad avser akti- viteten som människoplasminogenaktivator. Troligen beror denna höjda effekt på att komplexet av lätt plasminkedja och strepto- kinas har mindre molekylvikt än plasmin-streptokinaskomplexet och därmed större förmåga att tränga in i och verka på det inre i en en blodproppsstruktur.

När man vill säkerställa frånvaro av virusföroreningar i komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas värmebehandlar 10 15 20 25 30 35 454 047 7 man plasminogenutgångsmaterialet för att inaktivera eventuella virusföroreningar före omvandlingen till plasmin eller komplex- bindningen med streptokinas. Vid vanlig värmebehandling enligt United States Food and Druk Adminstration, såsom anges ovan, hålles plasminogenen vid en temperatur av minst 60°C under minst 10 timmar. Det har visat sig att den lätta plasminkedjan och komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas enligt uppfin- ningen bibehâller i huvudsak all sin aktivitet, även när dessa produkter framställes av värmebehandlad plasminogen som utgångs- material.

Nâr ett plasmin-streptokinaskomplex framställes av värmebe- handlat plasminogenutgångsmateria1, bibehåller även detta kom- plex väsentligen all aktivitet. Inverkan av värme på plasmino- genmolekylen medför emellertid förändring eller denaturering av dennas struktur på ett antal ställen, och den erhållna relativt stora plasminmolekylen är också väsentligen denaturerad, så att den och dess komplex har benägenhet att bli antigena och pyro- gena vid införing i blodströmmen hos en patient.

När plasmin, som framställts av värmebehandlad plasminogen, reduceras och klyvs i en A-kedjefraktion och en B-kedjefraktion och den tunga fraktionen förkastas, förkastas även många av de denaturerade ställena, vilka finns på A-kedjefraktionen, varvid en nativ lättkedjefraktion erhålles, som kan vara väsentligen mindre antigen och mindre pyrogen än den totala denaturerade plasminen. Likaledes kan komplex av en sådan lättkedjefraktion, såsom streptokinaskomplex, vara väsentligen mindre antigena och mindre pyrogena än liknande komplex av den totala denaturerade plasminen.

Det har visat sig att det icke är nödvändigt att använda högrenad streptokinas, ty även råa streptokinasfraktioner kan användas för framställning av komplexen. I praktiken tjänar kopplingen av streptokinasen med lättkedjefraktionen eller med den totala plasminen till att separera streptokinasen från dess föroreningar i råform.

Exempel 1 150 mg leupeptin sättes till 10 ml människoplasmin (25 - 30 CTA-enheter per mg protein) i lösning i ett vattenhaltigtbuffert- medium innefattande 25 % glycerol, 0,04 mol/l tris(hydroxymetyl)- aminometan (nedan kallad “tris"), 0,02 mol/l lysin och 0,08 mol/l l 10 15 20 25 30 35 454 047 8 natriumklorid vid pH 9 och en koncentration av 5 mg/ml protein.

Plasminen var framställd av värmebehandlad människoplasminogen.

Under tillsatsen av leupeptin hölls plasminlösningen i ett 0°C isbad, och slutkoncentrationen av leupeptin 1 lösningen av 0,04 mol/1.

Till denna blandning av plasmin och leupeptin sattes 0,072ml »koncentrerad 2-merkaptoetanol (slutkoncentration 0,1 M), och blandningen av plasmin och leupeptin reducerades under 20 minu- ter i ett 20°C vattenbad. Den reducerade plasminen anbringades sedan i ett OOC isbad, och 0,29 mL 4 M natriumjodoacetat till- sattes för alkylering av de sulfhydrylgrupper, som bildats ge- nom brott av disulfidbindningarna i plasminmolekylerna under redaktionen. Alkyleringsreaktionen fortgick under 30 minuter vid o°c. - _ Den reducerade och alkylerade plasminen leddes sedan genom en kolonn av L-lysinsubstituerad “Sepharose" (1 X 20 cm), som ekvilibrerats och eluerats med en 0,1 M natriumfosfatbuffert vid pH 7,4 och vid 2°C. Elueringen fortskred vid ett flöde av 60 ml/h, och fraktioner av 3 ml volym uppsamlades separat. Den lätta kedan (B-kedjan) gick genom kolumnen oadsorberad och över- vakades genom absorbansmätningar vid 280 nm. Då absorbansen hade gått ned till 0, sammanfördes de fraktioner, som innehöll den lätta kedjan, och 0,31 g/ml ammoniumsulfat tillsattes vid 0°C för utfällning av den lätta kedjan under kvarlämnande av leupeptin i vätskefasen. De sammanslagna fraktionerna, som inne- höll ammoniumsulfat, fick stå över natten vid 4°C för fullstän- dig utfällning av den lätta kedjan, varpå fällningen avskildes genom centrifugering vid 6000 r/min under 1 timme vid É°C.

Fällningen av den lätta kedjan löstes till en koncentration av 10 mg/ml (E:c:=16) i ett vattenhaltigt buffertmedium liknande det, som användes för upplösning av plasminen. Den lätta kedjan klarades vid 3000 r/min under 1 timme vid 2°C och lagrades vid -2o°c.

Typiskt har den sålunda erhållna lätta plasminkedjan en pro- teolytisk aktivitet på kaseinsubstrat av 0,07 CTA-enheter per nmol protein eller 2,6 CTA-enheter per mg protein gentemot en proteolytisk aktivitet av 2,63 CTA-enheter per nmol protein eller 27,2 CTA-enheter per mg protein för den plasmin, varur flv 10 15 20 25 30 35 454 047 9 den lätta kedjan erhållits. Typiskt kan den sålunda erhållna lätta plasminkedjan upptaga 0,09 mol tritierat diisopropylfos- forofluoridat per mol protein gentemot 0,95 mol per mol protein för plasminutgångsmaterialet.

Exempel 2 Ett ekvimolärt komplex av lätt plasminkedja och streptokinas framställdes genom tillsats av 0,5 ml streptokinas (32 mg/ml) till 0,9 ml av den i exempel 1 framställda lätta kedjan. Det ekvimolära komplexet inkuberades vid 25°C under 10 minuter och lagrades sedan vid -20°C. , Typiskt har det sålunda framställda ekvimolära komplexet en proteolytisk aktivitet på kaseinsubstrat av 0,16 CTA-enheter per nmol protein eller 2,3 CTA-enheter per mg protein, i jäm- förelse med en proteolytisk aktivitet av 1,52 CTA-enheter per nmol protein eller 11,6 CTA-enheter per mg protein för det ekvi- molära komplex, som framställts av plasminutgångsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten som nötplasminogenaktivator hos det ekvimolära komplexet i exempel 2 på kaseinsubstrat är 2,6 CTA-enheter per Ng protein eller 175 CTA-enheter per nmol protein, i jämförelse med 2,1 CTA-enheter per ug protein eller 264 CTA-enheter per nmol protein för det ekvimolära strepto- kinaskomplexet med plasminutgångsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten som människoplasminogenaktiva- tor hos det ekvimolära komplexet i exempel 2 på kaseinsubstrat 9,3 CTA-enheter per ng protein eller 636 CTA-enheter per nmol protein, i jämförelse med 4,9 CTA-enheter per ug protein eller 622 CTA-enheter per nmol protein för det ekvimolära strepto- kinaskomplexet av plasminutgângsmaterialet.

Typiskt kan det ekvimolära komplexet i exempel 2 uppta 0,50 mol tritierat diisopropylfosforofluoridat per mol protein i jäm- förelse med 0,90 mol per mol protein för ett ekvimolärt komplex av streptokinas och plasminutgángsmaterialet.

Exempel 3 Värmebehandlad människoplasminogen (25 - 30 CTA-enheter per mg protein) löstes i ett vattenhaltigt buffertmedium innehållan- de 0,05 mol/l tris, 0,02 mol/1 lysin och 0,1 mol/l natripmklorid med pH 9 till en koncentration av 22 mg/ml protein. Till 3 ml av denna plasminogenlösning i ett 0°C vattenbad sattes 1 ml strepto- kinas (100 000 enheter per mg protein) vid en koncentration av 10 15 20 25 30 35 454 047 10 32 mg/ml protein i en 0,067 M natriumfosfatbuffert vid pH 7,4.

Blandningen inkuberades i ett 25°C vattenbad under 10 minuter för omvandling till ett plasmin-streptokinaskomplex. Sedan kyl- des komplexet i ett 0°C isbad och späddes till 12 ml genom till- sats av 8 ml av den i exempel 1 beskrivna buffertlösningen med 25 % glycerol.

Till 12 ml av det enligt ovan framställda plasmin-strepto- kinaskomplexet sattes 0,07 ml koncentrerad 2-merkaptoetanol till en slutkoncentration av 0,1 M. Komplexet reducerades under 20 minuter i ett 20°C vattenbad, kyldes sedan till 0°C och alkyle- rades genom tillsats av 0,35 ml 4 M natriumjodoacetat. Sedan det reducerades och alkylerade streptokinaskomplexet fått stå 30 minuter vid OOC leddes det genom en kolonn av L-lysinsubstitue- rad FSepharose" (1 X 20 cm), såsom beskrives i exempel 1 för den reducerade ocñ alkylerade plasminen. Komplexet av lätt kedja och streptokinas gick utan adsorption genom kolonnen och övervakades, uppsamlades, fälldes, centrifugerades, löstes och klarades på i. samma sätt som den lätta kedjan i exempel 1. å Typiskt har komplexet av lätt plasminkedja och streptokinas i exempel 3 en proteolytisk aktivitet på kaseinsubstrat av 0,21 CTA-enheter per nmol protein eller 2,9 CTA-enheter per mg pro- tein, i jämförelse med en proteolytisk aktivitet av 1,52 CTA- enheter per nmol protein eller 11,6 CTA-enheter per mg protein för det ekvimolära streptokinaskomplexet av plasminutoângsmate- rialet.

Typiska värden på aktiviteten som nötplasminogenaktivator hos komplexet i exempel 3 på kaseinsubstrat är 3,6 CTA-enheter per ng protein eller 237 CTA-enheter per nmol protein, i jäm- förelse med 2,1 CTA-enheter per pg protein eller 264 CTA-enheter per nmol protein för det ekvimolära streptokinaskomplexet av plasminutgângsmaterialet.

Typiska värden på aktiviteten som människoplasminogenaktiva- tor hos komplexet i exempel 3 på kaseinsubstrat är 10,0 CTA- enheter per pg protein eller 685 CTA-enheter per nmol protein, i jämförelse med 4,9 CTA-enheter per ug protein eller 622 CTA- enheter per nmol protein för det ekvimolära streptokinaskomp- .lexet av plasminutgångsmaterialet. *r 471 10 15 20 25 30 35 454 047 11 Typiskt kan komplexet i exempel 3 uppta 0,70 mol tritierat diisopropylfosforofluoridat per mol protein i jämförelse med 0,90 mol per mol protein för ett ekvimolärt komplex av strepto- kinas med plasminutgångsmaterialet_ Exempel 4 I exempel 1 beskrives plasminutgångsmaterialet som "fram- ställt av värmebehandlat människoplasminogen" och i exempel 3 beskrivs plasminogenutgångsmaterialet som "värmebehandlat".

I båda fallen inställdes människoplasminogen vid en koncent- ration av 20 mg/ml i en buffert av 0,05 M tris, 0,02 M lysin och 0,1 M Nacl med pa 9,0 och vid o°c på pa 3,0 med ln ncl, och dia- lyserades sedan grundligt mot en buffert av 0,15 M glycin och 0,001 M HCl vid pH 3,0. Efter dialysen späddes proteinlösningen med bufferten av 0,15 M glycin och 0,001 M Hcl till en slutkon- centration av 1 mg/ml protein och värmdes i en sluten kolv på vattenbad vid 60°C under 10 timmar. Sedan kyldes plasminogenen i ett isbad och fälldes genom en tillsats av fast ammoniumsulfat (0,31 g/ml lösning). Den värmebehandlade plasminogenen tillvara- togs genom centrifugering vid 6000 r/min under 1 timme, och fäll- ningen löstes till en koncentration av 10 mg/ml i bufferten av 0,05 M tris, 0,02 M lysin och 0,10 M NaCl vid pH 9,0. Det värme- behandlade plasminogenkoncentratet klarades vid 3000 r/min un- der 1 timme, och olösligt protein avskildes och förkastades.

Plasminogenen renades ytterligare med en affinitetskromatografi- kolonn av L-lysinsubstituerad "Sepharose" och tillvaratogs efter eluering med e-aminokapronsyra genom fällning med ammoniumsulfat.'7 Ungefär 74 % av det ursprungliga proteinet och 73 % av den ur- sprungliga proteolytiska aktiviteten tillvaratogs efter värme- behandlingen med praktiskt taget ingen förändring i plasmino- genens specifika aktivitet.

Andra reversibla inhibitorer, för serinprotessaktiva centra, såsom bensamidin och derivat därav, kan användas i stället för leupeptin. Inhibitorn användes lämpligen vid tillräcklig kon- centration för att ge omkring 90 % plasmininhibition. Med bens- amidin som inhibitor blir den proteolytiska aktiviteten hos den lätta kedjan och dess streptokinaskomplex icke så låg som hos produkter, vilka erhållits vid användning av leupeptininhibitor, men lägre än hos streptokinaskomplexet med helplasmin. Åktivite- ten som plasminogenaktivator är också högre hos produkter .- A 10 15 20 25 30 35 40 454 Û47 12 framställda under användning av bensamidin såsom inhibitor, näm- ligen upp till omkring 8 CTA-enheter per ug protein eller 600 CTA-enheter per nmol för aktiviteten som nötplasminogenaktivator eller upp till omkring 25 CTA-enheter per ug protein eller 1500 CTA-enheter per nmol för aktiviteten scm människoplasxninogenaktivator.

I stället för 2-merkaptoetenol kan man använda andra reduk- : tionsmedel, såsom ditioerytritol eller ditiotreitol, för att klyva disulfidbindningarna i plasminmolekylerna.

Alkyleringsmedlet kan utgöras av natriumjodoacetat, såsom visas i exempel 1 och 3, men även av jodoacetamid eller annat känt alkyleringsmedel, som ger en skyddsgruppvidenfri sulfiiydrylgruæ.

Plasminogenutgångsmaterialet behöver icke vara rent. Râmate- ; rial i form av plasmafraktioner eller t.o.m. total plasma kan an- vändas, enär rening sker under materialets fortsatta bearbetning.I I stället för L-lysinsubstituerad "Sepharose" i affinitets- kromatografikolonnen kan man använda andra selektiva adsorben- ter, såsom L-lysinsubstituerad polyakrylamid eller L-lysin- substituerad agaros eller "Sepharose“, polyakrylamid eller aga- ros substituerad med L-arginin eller D-lysin. Den kromatogra- 3 fiska separeringen kan vid behov utföras satsvis istället förien kolonn.

Ehuru uppfinningen beskrivs i samband med ett ekvimolärt komplex av den lätta plasminkedjan och streptokinas, är det gi- vet, att den lätta plasminkedjan även bildar användbara komplex med alla andra substanser, som bildar ekvimolära komplex med människoplasminogen under bildning av en aktivator, t.ex. sta- fylokinas. Sådana komplex framställes på samma sätt som ovan be- skrivs för komplexen med streptokinas och är användbara pâ lik- nande sätt för sin fibrinolytiska aktivitet.

Dessa ekvimolära komplex tillföres företrädesvis intravenöst för fibrinolytisk effekt. De kan tillföras gradvis under en läng- re tid i utspädd form i en fysiologisk glykos-saltlösning eller i mera koncentrerad form lösta i fysiologisk glykos-saltlösning, ensamma eller blandade med andra material, såsom människoalbumin.

Doserna kan variera beroende på patientens tillstånd, men ligger i allmänhet vid 0,01 - 1,0 mg/kg kroppsvikt per dygn.

Komplexen kan förpackas i vätskeform, i ampuller, såsom en lösning i fysiologisk glykos-saltlösning eller albuminhaltig saltlösning. De kan även packas i torr form, såsom ett pulver i blandning med människoalbumin, vilket framställts genom lyofyli- sering av en lösning av komplexet med albumin. u

Claims (14)

10 15 20 25 30 35 454 047 13 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett komplex av strepto- kinas och en lätt plasminkedja med ett serinproteasaktivt centrum, k ä n n e t e c k n a t av att man blandar plasmin med en reversíbel inhibitor för serinproteasaktiva centra, reducerar plasminmolekylernas disulfidbindningar mellan ked- jorna i blandningen för att framställa en blandning, som innehåller tung och lätt kedja, sedan separerar den lätta ked- jan från den tunga kedjan samt omsätter den erhållna lätta kedjan med en väsentligen ekvimolär mängd streptokinas för framställning av ett komplex av streptokinas och.den lätta kedjan.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att blandningen av tung och lätt kedja alkyleras före separeringen.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e - t e c k n a t ringsmedel, som består av natriumjodoacetat eller jodoacetat- av att alkyleringen genomföras med ett alkyle- amid.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att plasminen utgöres av människoplasmin.

5. Förfarande enligt patentkravet A, k ä n n e - t e c k n a t av att människoplasminen framställes ur plas- minogen, som värmebehandlats för inaktivering av virusförore- ningar.

6. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att serinproteasínhibitorn består av acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal eller bensamigin.

7. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att separeringen genomföres medelst affini- tetskromatografiadsorption.

8. B. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e - t e c k n a t av att affinitetskromatografiadsorptionen genomföras på L-lysinsubstituterat adsorptionsmaterial och att den lätta kedjan icke adsorberas.

9. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e - t e c k n a t av att affinitetskromatografiadsorptionsmate- fii 10 15 20 25 30 35 454 047 14 rialet består av L-lysinsubstituerad polyakrylamid, L-lys|n- substituerad aqaros, L-argininsubstltuerad polyakrylamid, L-arqininsubstítuerad agaros, D-lysinsubstituerad polyakryl- amid eller D-lysinsubstituerad agaros.

10. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t_e c k n a t av att man blandar människoplasmin, som ffam- ställts ur plasminogen, vilken värmebehandlas vid lägst 6000 under minst 10 timmar, med acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argimüml, reducerar reaktionsprodukten med 2-merkaptoetanol För Fram- ställning av en blandning av tung och lätt kedja, alkylerar blandningen med natirumjodoacetat och seban.separerar den lätta kedjan från den tunga kedjan genom elution i kolonn av L-lysinsubsliluerad agaros samt tillvaratar den lätta kedjan i den oadsorberade fraktionen.

11. Förfarande enligt något av oatentkraven 1 - 10, k ä n n e t e c k n a t av att omkring 1,0 mol av den lätta kedjan omsätta med omkring 0,9 mol streptokinas. A351-

12. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 10, k ä n n e t e c k n a t av att blandningen av tung och lätt kedja alkyleras Före separeringen.

13. Förfarande enligt patentkravet 12, k ä n n e- t e c k n a t av att alkyleringen genomföras med ett alkyle- ringsmedel, som består av natríumjodoacetat eller jodoacetamid.

14. förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e- t e c k n a t av att man blandar människoplasmin, som fram- ställts ur plasminogen, som värmebehandlats vid lägst 6000 under minst 10 timmar, med acetyl-L-leucyl-L-Leucyl-L-argüünal, reducerar reaktionsprodukten med 2 merkaptoetanol och bildar en blandning av tung och lätt kedja, alkylerar blandningen med 5 natriumjodacetat, separerar den lätta kedjan från den tunga kedjan genom elution genom en kolonn av L-lysinsubsiituerad agaros och tillvaratager den lätta kedjan i den oadsorberade fraktionen samt omsätter den tillvaratagna lätta kedjan med streptokinas 1 ett molförhållande av omkring 1,0 mol lätt kedja per omkring 0,9 mol streptokinas.