SE448062B - SET TO MAKE A PROTEIN CONCENTRATE CONTAINING IMMUNOLOGICAL FACTORS CONCERNING MILK - Google Patents

Description

15 20 25 35 40 448 062 2 i 0 Det anar nu påvisats att satt att 1 man-seriell skala. fram- ställa ett proteinkoncentrat som innehåller immunoglobuliner utan denaturering av dessa under den tekniska processens förlopp. 15 20 25 35 40 448 062 2 in 0 It has now been shown that 1 man-serial scale. produce a protein concentrate containing immunoglobulins without denaturing them during the course of the technical process.

Denna produkt åstadkommer en lokal, passiv immunisering i tarmen utan resorption och.utan någon märkbar nedbrytning av dess akti- vitet 1 mazsmaitningskañaisn. a i Sättet enligt uppfinningen kännetecknas av följande steg: a Mjölken utvinnes från hyperimmuniserade, mjölkbärande honor.å Grädden och föroreningar frånskiljes, och den klarnade och skummade mjölken koaguleras, varefter kaseinet frånskiljes och proteinerna i vasslan filtreras, ultrafiltreras och steriliseras genom ultrafiltrering, samt produkten indrives och torkas under betingelser som icke denaturerar immunoglobulinerna.och som bi-7 behåller sterila förhållanden. l l D I den medföljande ritningen visas schematiskt de olika stegen i processen. på å l De mjölkbärande honor som användes utgöres av nöt, speci- ellt då av kor. g 1 Den mjölk som behandlas kan vara.av olika typer som är mer eller mindre rika på antikroppar, såsom râmjölk (cclostrum), övergångsmjölk (mjölk från de 8 dagarna.efter kalvning) eller mjölk från laktationsperiodens slut (de 2 sista månaderna av W mjölkutsöndringen). Lämpligen behandlas en blandning av dessa mjölktyper för erhållande av en hög antikropphalt under så lång tidsperiod som möjligt. i 7 Hyperimmuniseringen av kon genomföres medelst en kombinerad. vaccination. Exempelvis åstadkommes den genom intracisternal in- fusion i mjölkkörteln, parenteral injektion (subkutan eller intra- venös), injektion i det retromammära ganglionsystemet, skarifi~ kation, oral intagning eller genom en kombination av flera av dessa sätt. D l Det är att föredraga att en kombination av dessa sätt an- vändes enligt ett immuniseringsschema som är noggrant uppgjort för erhållande av en tillfredsställande antikropphalt i varje typ av använd mjölk. Förframjöiksn och övargangsmjöiken är sålunda vaccineringen parenteral och intracisternal under de 8-2 veckorna före kalvningen, och oral under veckan före kalv- lningen. i i a É För mjölken vid laktationstidens slut genomföres alter- nerande en parenteral, lokal och oral vaccination med början F” 10 15 20 25r as 448 062 3 2 och en halv månad före det antagna slutet av mjölkutsönd- . uringen. _ Det använda vaccinet utgör lämpligen en blandning av den utvalda antigenen och ett tillsatsmedel på basis av homologt blodserum från immuniserade kor, vilket på detta sätt möjliggör en detoxifiering av vaccinet och bildning av immunokomplex. j När kor användes som produktionsdjur utgöres de Ig som ingår i proteinkoncentratet väsentligen av IgG (speciellt av IgGl) till skillnad från modersmjölk, vilken som övervägande Ig innehåller IgA.' j de Halten av lg i det proteinkoncentrat, vari proteinerna utgör 70-80 viktprocent; utgör 25-35 viktprocent. Vissa fördelar när förbundna.med det förhållandet, att vid genomförande av pro- _cessen Ig icke skiljes från de övriga vassleproteinerna, vilka således även föreligger i det erhållna koncentratet. På detta _ sätt undvikes processerna.med selektiv_utfällning, exempelvis med ammoniumsulfat, och dialys.This product produces a local, passive immunization in the intestine without resorption and without any appreciable degradation of its activity in the mazsmaitningskañaisn. The process according to the invention is characterized by the following steps: a The milk is recovered from hyperimmunized, milk-bearing females. The cream and impurities are separated, and the clarified and skimmed milk is coagulated, after which the casein is separated and the whey proteins are filtered, ultrafiltered and sterilized. and dried under conditions which do not denature the immunoglobulins and which maintain sterile conditions. l l D The accompanying drawing schematically shows the different steps in the process. The milk-bearing females used consist of cattle, especially cows. g 1 The milk being treated can be.of various types that are more or less rich in antibodies, such as colostrum (cclostrum), transitional milk (milk from the 8 days after calving) or milk from the end of the lactation period (the last 2 months of W milk excretion). Suitably, a mixture of these types of milk is treated to obtain a high antibody content for as long a period of time as possible. i 7 The hyperimmunization of the cow is performed by means of a combined. vaccination. For example, it is accomplished by intracisternal infusion into the mammary gland, parenteral injection (subcutaneous or intravenous), injection into the retromammary ganglion system, scarification, oral ingestion, or by a combination of several of these methods. It is preferred that a combination of these methods be used according to an immunization schedule that is carefully calculated to obtain a satisfactory antibody content in each type of milk used. Thus, pre-calving and transient milking are vaccinated parenterally and intracisternally during the 8-2 weeks before calving, and orally during the week before calving. i i a É For the milk at the end of the lactation period, a parenteral, local and oral vaccination is alternately performed starting F ”10 15 20 25r as 448 062 3 2 and a half months before the assumed end of milk excretion. the ring. The vaccine used is suitably a mixture of the selected antigen and an additive based on homologous blood serum from immunized cows, thus enabling a detoxification of the vaccine and the formation of immunocomplexes. When cows are used as production animals, the Ig contained in the protein concentrate consists essentially of IgG (especially of IgG1) in contrast to breast milk, which as predominantly Ig contains IgA. The content of Ig in the protein concentrate, wherein the proteins constitute 70-80% by weight; constitutes 25-35% by weight. Certain advantages when associated with the fact that in carrying out the process Ig is not separated from the other whey proteins, which are thus also present in the concentrate obtained. In this way the processes are avoided by selective precipitation, for example with ammonium sulphate, and dialysis.

Vidare återfinnas 1 proteinkoncentratet vissa bakterio- _ statiska eller antivirala faktorer,_exempelvis laktoferrin ueller enzymsystem, såsom laktoperoxidas och ribonukleas, vilka finnes närvarande i vasslan. nivarje typ av antigen av viralt eller bakteriellt ursprung kan-användas, och de erhållna.antikropparna.är beroende av typen av de antigener som administreras till kon. Man kan exempelvis erhålla ett skydd mot enteropatogena bakterier och virus som åstadkommer gastroenteriter, åtföljda av kraftig diarré med dehydratisering, genom införlivande av det protein- koncentrat som innehåller Ig 1 varje bärare som är lämplig för oral administrering. Denna bärare kan utgöras av någon excipi- ent, eller företrädesvis av en dietisk produkt, såsom mjölk eller mjölkpulver för småbarn, s.k. "humaniserad" eller för 7 spädbarn anpassad mjölk, eller en mjölk som är speciellt an- passad till en speciell grupp av nyfödda, exempelvis en mjölk till för tidigt födda barn eller barn med undervikt vid föd- seln, etc. Öm man exempelvis önskar använda ett koncentrat som inne- _håller Ig anti E. coli i profylaktisk dos med en mjölk som bärare, införlivas 0,8 - 3 gram koncentrat i 100 gram torrsub- ugstans, och upp till 6 gram i terapeutisk dos. lo ' 15 20 25 35 448 D62. 8 84 lFör genomförande av förfarandet är-det nödvändigt att se till att skumnings- och klarningsprocesserna är mycket långt- gående för att en följande igensättning av filtren och ultra- filtren skall undvikas. Skumningen genomföres lämpligen i två steg, först i kyla för att avlägsna huvuddelen av fettsubstan- ser och föroreningar (exempelvis det blod som ofta ingår i rå- mjöiken), och seaan_i värme för att fu11standigfi frånskilga dem.Furthermore, the protein concentrate contains certain bacteriostatic or antiviral factors, for example lactoferrin or enzyme systems, such as lactoperoxidase and ribonuclease, which are present in the whey. level type of antigen of viral or bacterial origin can be used, and the antibodies obtained depend on the type of antigens administered to the cone. For example, one can obtain protection against enteropathogenic bacteria and viruses which cause gastroenteritis, accompanied by severe diarrhea with dehydration, by incorporating the protein concentrate containing Ig 1 into any carrier suitable for oral administration. This carrier may consist of any excipient, or preferably of a dietary product, such as milk or milk powder for infants, so-called "humanized" or milk adapted for 7 infants, or a milk that is specially adapted to a special group of newborns, for example a milk for premature babies or children underweight at birth, etc. If, for example, you wish to use a concentrate containing Ig anti E. coli in prophylactic dose with a milk as carrier, 0.8 - 3 grams of concentrate is incorporated in 100 grams of dry sub-pesticide, and up to 6 grams in therapeutic dose. lo '15 20 25 35 448 D62. 8 84 lTo carry out the process, it is necessary to ensure that the foaming and clarification processes are very far-reaching in order to avoid a subsequent clogging of the filters and ultra-filters. The foaming is suitably carried out in two steps, first in the cold to remove most of the fatty substances and contaminants (for example the blood which is often included in the raw milk), and in the heat to completely separate them.

Koaguleringen kan genomföras vid kaseinets isöelektriska pH- värde i närvaro av löpe med tillsats av svra,_exempelvis citron- syra. Det är lämpligt att genomföra koaguleringen genom till- sats av syra, exempelvis saltsyra, till ett pH av cirka 4,6, samt värmn1ng_t111 4o°c. Frånsk11¿anaee av kaseinet åtföijes av en klarning av vasslan för att frånskilja fint material.The coagulation can be carried out at the isoelectric pH value of the casein in the presence of rennet with the addition of sorghum, for example citric acid. It is convenient to carry out the coagulation by adding acid, for example hydrochloric acid, to a pH of about 4.6, and heating at 40 ° C. Fragrance of the casein is accompanied by a clarification of the whey to separate fine material.

Det är vidare nödvändigt att genomföra de processer som erfordrar en värmebehandling (indrivning och torkning) under sådana betingelser att inaktivering av Ig undvikes.It is further necessary to carry out the processes which require a heat treatment (recovery and drying) under such conditions that inactivation of Ig is avoided.

För att minska förlusterna av Igg av vilket en del bort-l går med grädden vid skumningen och en ytterligare del med kaseinet när detta frånskiljes, är det lämpligt att extrahera grädden och ostmassan med vatten och att behandla det tvätt- vatten som innehåller Ig för återvinning.In order to reduce the losses of Ig1, part of which is lost with the cream during foaming and a further part with the casein when it is separated, it is convenient to extract the cream and curd with water and to treat the washing water containing Ig for recovery. .

De följande eåemplen, i vilka mängder och andelar är räknade efter vikt, såvida intet annat angives, visar hnr uppfinningen kan genomföras. 8 _ Exempel 1.8 Kor av olika raser hyperimmuniseras enligt det följande schemat med ett vaccin, vars framställning angives i det följande, och mjölken uppsamlas från de två sista månaderna av mjölkutsöndringen och från de 8 första dagarna efter kalv- ning. 7 8 7 7 Framställning av vaccinet1l De följande enteropatogena.serotyperna.av E.coli användes: o 18 =lK 76g (B 20) g g- o 111 = K 58 g(B 4) o 20 = Kl17 (L) 8 112 = K 68 (B 11) o 26 : K 6o l(B 6) 119 = K 69 (B 14) go 44 = K 74 (L) 124 : K 72 (B 17) 0æ=Kæ mm 1æ=KwABm o 78 = K 80 (-) 126 3 K 71 (B 16) o 86 = K 61A (B 7) 127 ; K 63 (B 8) 4' “ 4 128 =8K 68 (B 12) O_OOO_OOO t: LL I) 15 20 448 062 5 De olika stammarna.härrör från fall av gastroenterit hos barn, inlagda på sjukhus. Serotyperingen genomfördes med anti- sera av multityp och envärda sera (Difco). Bakterierna odlades i minimal vätskemiljö, innehållande 2% aminosyror, härrörande från kasein (kasaminosyror Difco) och 2% glukos under 2& timmar vid 3700 utan omblandning i odlingskärlen.'För inaktivering av bak- terierna uppdelades odlingarna genom centrifugering i sedimen- terade celler och överstående vätskefas. Cellerna.bringades åter i suspension och inkuberades vid 3?°C under QÄ timmar i närvaro av 0,5% formaldehyd, medan överfasen inaktiverades på angivet sätt, men med 0,05 %'formaldehyd. Efter en ny centrifugering och eliminering av överfasen bringades bakterierna åter i suspension i den ursprungliga, inaktiverade överfasen. Detta.förfarande möjliggör bibehållande av överfasen, vilken innehåller bakteri- ella exotoxiner-för vaccinet. Ett vaccin erhölls med 1-2 x l09 bakterier per ml, vilket därefter späddes genom blandning med en 2-procentig lösning av Al(OH)3 och homologt blodserum från immuniserade kor. - Immuniseringsförfarande A. Följande schema visar immuniceringen för erhållande av råmjölk och övergångsmjölk som innehåller immunoglobiner för anti-E.coli. Den antagna dagen för kalvningen betecknas med-Xf Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt X --8 veckor 05 ml vaccin (5 x'1o7 X - 7 vegkor X - 6 veckor X - 5 1/2 veckorg X - 5 veckor X - 4ïl/2 veckor bakterier/ml + 5 ml serum 5 ml vaccin (5 x 1070 bakterier/ml) 0 c+ 5 ml 2% A1K(oH) + 5 ml serum 10 mi vaecin (5 x 107 bakterier/ml 20 m1 vaccin (5 X 107 bakterier/ml) W + 10 ml 2% Al (OH)3 40 ml vaccin (5 x 107 -(bakterier/ml) + 20 ml serum 24 ml vaccin (5 x 10 bakterier/mlx 8 _+ 8 ml serum subkutan injektion intravenös injektion subkutan injektion injektion i det retro- mammära ganglio- systemet infusion av 4 X-15 ml i ijuvret genom spen- kánalerna subkutan injektionxx 10 448 062 forts} Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt X - 4 veckor 40 ml vaccin (5 x 107 bakterier/ml) + 20 ml serum infusion av 4 X 15 ml i juvret geno spen- kanalerna X - 3 veckor 10 ml vaccin (5 x lO8 subkutan injektion j bakterier/ml) X - 2 veckor 5 ml vaccin (5 x 108 intravenös injektion bakterier/ml ' + 5 ml 2% Al (OH)3 X - l.vecka ' 100 ml accin oral intagning (l x 10 bakterier/ml) under idisslandet X - l vecka 100 ml accin oral intagning (l X 10 bakterier/ml) under idisslandet K Dessa serumtillsatser genomföres endast i de fall när kon immuniserats för första gången. xx Denna.subkutana injektion fördelas i lymfsystemet på följande sätt: 5 2 x 4 ml i de preskapulära lymfkörtlarna 2 x 4 ml de postskapulära lymfkörtlarnaa 2 x 4 ml i ljumskens lymfkörtlar 2lx 4 ml i knäveckens lymfkörtlar |Jå B. Följande schema visar immunisering för erhållande ay emjölk från laktationsperiodens slut (de 2 sista.mânaderna.aNe laktationen), innehållande immunoglobulin anti-E.coli. Denna immunisering genomföres endast på kor,.vilka redan immuniserats under perioden med råmjölk och övergångsmjölk. Den antagna dagen för mjölkutsöndringens slut betecknas med X.The following examples, in which amounts and proportions are by weight, unless otherwise indicated, show how the invention may be practiced. Example 1.8 Cows of different breeds are hyperimmunized according to the following schedule with a vaccine, the preparation of which is given below, and the milk is collected from the last two months of milk excretion and from the first 8 days after calving. 7 8 7 7 Preparation of the vaccine 11 The following enteropathogenic serotypes of E.coli were used: o 18 = 1K 76g (B 20) g g- o 111 = K 58 g (B 4) o 20 = Kl17 (L) 8 112 = K 68 (B 11) o 26: K 6o l (B 6) 119 = K 69 (B 14) go 44 = K 74 (L) 124: K 72 (B 17) 0æ = Kæ mm 1æ = KwABm o 78 = K 80 (-) 126 3 K 71 (B 16) o 86 = K 61A (B 7) 127; K 63 (B 8) 4 '“4 128 = 8K 68 (B 12) O_OOO_OOO t: LL I) 15 20 448 062 5 The different strains.are derived from cases of gastroenteritis in children, hospitalized. Serotyping was performed with multitype antisera and monovalent sera (Difco). The bacteria were grown in minimal liquid environment, containing 2% amino acids, derived from casein (casamino acids Difco) and 2% glucose for 2 & hours at 3700 without mixing in the culture vessels. For inactivation of the bacteria, the cultures were divided by centrifugation into sedimented cells. liquid phase. The cells were resuspended and incubated at 3 ° C for 4 hours in the presence of 0.5% formaldehyde, while the supernatant was inactivated as indicated, but with 0.05% formaldehyde. After a new centrifugation and elimination of the supernatant, the bacteria were resuspended in the original, inactivated supernatant. This method allows the retention of the superphase, which contains bacterial exotoxins for the vaccine. A vaccine was obtained with 1-2 x 10 9 bacteria per ml, which was then diluted by mixing with a 2% solution of Al (OH) 3 and homologous blood serum from immunized cows. - Immunization procedure A. The following scheme shows the immunization for obtaining colostrum and transition milk containing immunoglobins for anti-E.coli. The assumed day for calving is denoted by-Xf Treatment time Vaccine + ev. additive Method of administration X --8 weeks 05 ml vaccine (5 x'1o7 X - 7 vegkor X - 6 weeks X - 5 1/2 weeks X - 5 weeks X - 4ïl / 2 weeks bacteria / ml + 5 ml serum 5 ml vaccine (5 x 1070 bacteria / ml) 0 c + 5 ml 2% A1K (oH) + 5 ml serum 10 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml 20 ml vaccine (5 X 107 bacteria / ml) W + 10 ml 2% Al (OH) 3 40 ml vaccine (5 x 107 - (bacteria / ml) + 20 ml serum 24 ml vaccine (5 x 10 bacteria / mlx 8 _ + 8 ml serum subcutaneous injection intravenous injection subcutaneous injection injection in the retro- mammary ganglio system infusion of 4 X-15 ml in the udder through the spinal canals subcutaneous injectionxx 10 448 062 cont.} Treatment time Vaccine + possible addition Method of administration X - 4 weeks 40 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 20 ml serum infusion of 4 X 15 ml in the udder through the teat canals X - 3 weeks 10 ml vaccine (5 x 10 8 subcutaneous injection j bacteria / ml) X - 2 weeks 5 ml vaccine (5 x 108 intravenous injection bacteria / ml '+ 5 ml 2% Al (OH) 3 X - 1 week '100 ml of oral excin ing (l x 10 bacteria / ml) during the ruminant X - 1 week 100 ml accin oral ingestion (l x 10 bacteria / ml) during the ruminant K These serum additives are only used in cases where the cone has been immunized for the first time. xx This subcutaneous injection is distributed in the lymphatic system as follows: 5 2 x 4 ml in the prescapular lymph nodes 2 x 4 ml in the postcapular lymph nodes 2 x 4 ml in the lymph nodes of the groin 2lx 4 ml in the lymph nodes of the knee folds | Yes B. showing the following schema obtaining ay milk from the end of the lactation period (the last 2 months.aNe lactation), containing immunoglobulin anti-E.coli. This immunization is carried out only on cows, which have already been immunized during the period with colostrum and transitional milk. The assumed day for the end of milk secretion is denoted by X.

»Behandlingstid Vaccin + ev. tillsats Administreringssätt x - 70 dagar 5 mi vaeein (5 x 1o7_ intrarenöe injektion 5 bakterier/ml i i + 5 m1 2% A1 (oH)a3 X - 65 dagar 20 ml vaccin (5 x 1082 injektion i det retro- .~ bakterier/ml) mammära ganglionsystemet x - 60 dagar 24 mi vaeein (5 x 108 eublewean injektion” 5 bakterier/ml som i A enligt ovan) X - 55 dagar 1oo mi vaeein (1 x 109 erai incagning under 2 “ ibakterier/ml) A idisslande X - 50 dagar 40 ml vaccin (5 X 107 infusion i juvret som bakterier/ml) _ " enligt A ovan f ve) *(1 EE* '10 15 20 25,- 448 062 bakterier/ml) 7 ' forts.»Treatment time Vaccine + ev. additive Method of administration x - 70 days 5 ml vaeein (5 x 1077 intrarenoe injection 5 bacteria / ml ii + 5 m1 2% A1 (oH) a3 X - 65 days 20 ml vaccine (5 x 1082 injection in the retro-. ~ bacteria / ml) the mammary ganglion system x - 60 days 24 ml vaeein (5 x 108 eublewean injection "5 bacteria / ml as in A as above) X - 55 days 1oo mi vaeein (1 x 109 erai incage under 2" ibacteria / ml) A ruminant X - 50 days 40 ml vaccine (5 X 107 infusion in the udder as bacteria / ml) _ "according to A above f ve) * (1 EE * '10 15 20 25, - 448 062 bacteria / ml) 7 'cont.

Behandlingstid Vaccin + ev; tillsats Administreringssätt .X - 40 dagar- 5100 ml vaccin (l-X 109 oral intagning under bakterier/ml) idisslandet X - BQ dagar ' 20 ml vaccin (5 X 108 injektion i det- D bakterier/ml) ' rektromammära ganglion- 0 ' systemet _ X - 25 dager 40 ml vaccin (5 x 107 infusion 1 juvret som 5 bakterier/ml) enligt A ovan X --10 dager 5 100 ml vaccin (1 X 109 oral intagnlng under idisslandet c - Exempel 2. Mjölken från de åtta första dagarna efter kalvning, uppsamlad från kor som vaccinerats enligt exempel 1, behandlas på följande sätt: Skumningen genomföras i två steg, Steg A i kyla och Steg B ä ei värme.Treatment time Vaccine + ev; additive Method of administration .X - 40 days- 5100 ml vaccine (1X 109 oral ingestion under bacteria / ml) ruminant X - BQ days' 20 ml vaccine (5 X 108 injection in the- D bacteria / ml) 'rectomammary ganglion- 0' system X - 25 days 40 ml vaccine (5 x 107 infusion in the udder as 5 bacteria / ml) according to A above X - 10 days 5 100 ml vaccine (1 X 109 oral ingestion during rumination c - Example 2. The milk from the eight The first days after calving, collected from cows vaccinated according to Example 1, are treated as follows: The foaming is carried out in two steps, Step A in cold and Step B in heat.

A: 1100 kg mjölk ledes i kyla.genom en centrifugalsepara- (tor till ett buffertkärl om 2500 liter, varefter den pumpas till en centrifugavskiljare med hög acceleration (cirka ll OOO g) för-avlägsnande av blod och föroreningar (slam).A: 1100 kg of milk is passed in the cold through a centrifugal separator to a buffer vessel of 2500 liters, after which it is pumped to a centrifuge separator with high acceleration (approx. 1100 g) for removal of blood and contaminants (sludge).

B: Den kalla, renade mjölken lagras i en behållare om - 2500 liter och pumpas genom en till 400 inställd värmare till den separator, som redan i det föregående använts, så att på detta 'sätt frånskiljes 110 kg grädde, vilken tillveraxeges, och 5 kg slam, vilket förstöras. Som variant kan en självrenande skumnings- anordning användas i skumningsprocesserna i kyla och i värme, och en_renare mellan dessa processer, så att på detta sätt tiden för skumningen minskas.B: The cold, purified milk is stored in a container of - 2500 liters and pumped through a heater set to 400 to the separator already used above, so that in this way 110 kg of cream, which is produced, is separated, and kg of sludge, which is destroyed. As a variant, a self-cleaning foaming device can be used in the foaming processes in cold and in heat, and a cleaner between these processes, so that in this way the time for foaming is reduced.

Den skummade och renade, varma mjölken (985 kg) fördelas därefter i 4 fyrkantiga koaguleringskar om vardera 750 liter och försedda med omblandare för koaguleringsprocessen, En l N saltsyralösning tillsättes vid 37°c tills ett pH av cirka 4,6 - stabiliserats och temperaturen upprätthålles under omblandning i 20 minuter. Därefter kyles det hele till cirka l5°c§ 5 Den följande processen utgöres av frànskiljande av kaseih.The skimmed and purified hot milk (985 kg) is then distributed in 4 square coagulation vessels of 750 liters each and equipped with mixers for the coagulation process. A 1 N hydrochloric acid solution is added at 37 ° C until a pH of about 4.6 is stabilized and the temperature is maintained. while mixing for 20 minutes. Then the whole is cooled to about 15 ° C § 5 The following process consists of separating kaseih.

Den består av två centrifugeringar i serie av den skummade, koae lgulerade och brutna.mjölken. I den första frånskiljes huvuddelen av det koagulerade kaseinet medelst en självrenande klarnare, vilken frånskiljer 150 kg kasein, och vasslan ledes till en buffertbehållare. Den andra centrifugeringen avlägsnar varje 10 ,l5 20' 25 35 40 448 062 7 8 , spår av partiklar som skulle kunna.hindra.den följande filtrerings- och ultrafiltreringsprocessen, och exempelvis användes en oentri- fugrenare, som använts i processen A för skumningen. 854,7 kg renad vassla erhålles, vilken pumpas till en behållare om 2500 liter.It consists of two series of centrifugations of the skimmed, coagulated and broken milk. In the first, the main part of the coagulated casein is separated by means of a self-cleaning clarifier, which separates 150 kg of casein, and the whey is passed to a buffer container. The second centrifugation removes every 10, 20, 40 traces of particles that could impede the following filtration and ultrafiltration process, and for example, a non-centrifugal agent used in process A for foaming. 854.7 kg of purified whey is obtained, which is pumped to a container of 2500 liters.

Därefter genomföras en filtrering och sedan en ultrafiltre- ring av vasslan. Filtreringen bör vara mycket ingående för att undanröja varje svårighet vid ultrafiltreringen. och frånskilja mycket fina kaseinpartiklar. Den genomföras medelst filter Seitz Supra 100 i plattor om 20 x 20 cm. Filtratet förvaras i en behållare på 3000 liter, varefter det pumpas till ultrafiltret.Then a filtration is performed and then an ultrafiltration of the whey. The filtration should be very thorough to eliminate any difficulty in ultrafiltration. and separate very fine casein particles. It is carried out by means of filter Seitz Supra 100 in plates of 20 x 20 cm. The filtrate is stored in a 3000 liter container, after which it is pumped to the ultrafilter.

Ultrafiltreringen genomföres i två eller tre steg med återföring av retentatet till behållaren. Två seriekopplade centrifugal- pumpar åstadkommer tillförseln mot ax inloppstryck i ultra- filtrets inloppsbehållare av cirka 700 kPa, och vid utträdet hålles trycket vid cirka 450 kPa. För att undvika en återvärmning av retentatet genom den från pumparna.tillförda energin, kyles det till cirka. io-1;z°c. 0 Det första steget i själva.ultrafiltreringen_möjliggör fràn- skiljande av löst material med hög molvikt, proteiner, vilka kvarhålles av membranet ooh återfinnes i retentatet, medan en del av laktosen, vitaminer, mineralsalter och vatten avgår med per- meatet. Med användning av en modul DDS med membran 800 (membran- yta 7 m2) är förhållandet mellan retentat och permeat cirka l till 3,1, varvid erhålles 580 kg permeat I och 274,7 kg retentat med en medelavgivning av 14,17 kg permeat per m2 och timme.The ultrafiltration is carried out in two or three steps with return of the retentate to the container. Two series-connected centrifugal pumps provide the supply against axial inlet pressure in the ultrafilter inlet container of approximately 700 kPa, and at the outlet the pressure is maintained at approximately 450 kPa. To avoid reheating of the retentate through the energy supplied from the pumps, it is cooled to approx. io-1; z ° c. The first step in the ultrafiltration itself allows the separation of high molecular weight solutes, proteins which are retained by the membrane and are found in the retentate, while some of the lactose, vitamins, mineral salts and water leave with the permeate. Using a DDS module with membrane 800 (membrane surface 7 m2), the ratio of retentate to permeate is about 1 to 3.1, whereby 580 kg of permeate I and 274.7 kg of retentate are obtained with an average release of 14.17 kg of permeate per m2 and hour.

Det andra steget utgör en diafiltrering, under vilken till retentatet kontinuerligt sättes 825 kg vatten, och lösningen bringas att cirkulera under samma betingelser som i det första .ja steget. Diafiltreringen avbrytes när permeatets elektriska led- ningsförmåga uppnår det önskade värdet, varvid förhållandet mellan retentat och tillsatt vatten är cirka l till 3. På detta sätt åtskiljes 825 kg permeat II och 274,7 kg retentat med en medelavgivning av 11,77 kg permeat per m2 och timme. Det tredje steget utgör en koncentrering, vilken eventuellt genomföras medelst återföring av retentatet till membranet till en torr- \ substanshalt av cirka l0 %, genom eliminering avf82,5 kg permeat III. På detta. sätt erhålles 192,2 kgpförkoncentrerad lösning.The second step is a diafiltration, during which 825 kg of water are continuously added to the retentate, and the solution is circulated under the same conditions as in the first step. The diafiltration is stopped when the electrical conductivity of the permeate reaches the desired value, the ratio between retentate and added water being about 1 to 3. In this way, 825 kg of permeate II and 274.7 kg of retentate are separated with an average release of 11.77 kg of permeate per m2 and hour. The third step is a concentration, which is optionally carried out by returning the retentate to the membrane to a dry matter content of about 10%, by eliminating 82.5 kg of permeate III. On this. 192.2 kgp preconcentrated solution is obtained.

I en variant uteslutas detta tredje steg, och sterilfiltreringen 'ha genomföras direkt. 'Én ß f io 15f 20"' 25, - 35 40 448 Û62f 9 a _ Sterilfiltreringen utgör ett viktigt steg i de samlade pro- ' cesstegen, eftersom värmebehandlingar icke kan tillämpas för sterilisering, då de medför en denaturering av immunoglobulinerna.In a variant, this third step is excluded, and the sterile filtration is carried out immediately. Sterile filtration is an important step in the overall process steps, as heat treatments cannot be applied to sterilization, as they result in a denaturation of the immunoglobulins.....................................

Sterilfiltreringen avlägsnar från retentatet de mikroorganismer som fortfarande kan föreligga (huvuddelen av dessa har redan peliminerats vid fränskiljande av grädden, kaseinet och slam).The sterile filtration removes from the retentate the microorganisms that may still be present (most of these have already been eliminated by separating the cream, casein and sludge).

För att undvika igensättning av sterilfiltren erfordras en slam- avlägsning genom centrifugering och-en trippelfiltrering av retentatet. Efter avlägsnandet av slam lagras retentatet i en behållare och ledes genom en filtreringslinje, innefattande en förfiltrering genom trippelfilter Seitz Supra.l00, EK och EKS, anbringade i serie, âtföljd av sterilfiltrering genom filterf Seitz Supra 20 och Millipore HA 0,45 pm, anbringade i serie och fi förväg steriliserade med överhettat vatten. Det sterila retentatecg1agras_1_en steril benå11are_om 5oo liter.To avoid clogging of the sterile filters, sludge removal by centrifugation and triple filtration of the retentate are required. After sludge removal, the retentate is stored in a container and passed through a filtration line, including a pre-filtration through triple filters Seitz Supra.100, EK and EKS, applied in series, followed by sterile filtration through filter Seitz Supra 20 and Millipore HA 0.45 μm, applied in series and fi pre-sterilized with superheated water. The sterile retentatecg1agras_1_en sterile benå11are_om 5oo liter.

Samtliga.av de slutliga processerna genomföres under ste- rila betingelser. Överföringen till det följande indrivninge- esteget kan exempelvis åstadkommas med hjälp av komprimerad och sterilfiltrerad kvävgas.All of the final processes are carried out under sterile conditions. The transfer to the next recovery step can be effected, for example, by means of compressed and sterile filtered nitrogen gas.

Indrivningen åstadkommes med en tunnskiktsindunstare (med fallande vätskefilm med ytan 1 m2) vid en värmningstempera- tur av 7500, varvid produktens temperatur är cirka 30°C, till en -torrsubstanshalt av minst 20 %; För undvikande av varje infektion genomföres överföringen medelst en peristaltisk pump från reten-_ tatbehållaren till koncentratbehållaren, vilken är förbunden W med ett kretslopp som innefattar indunstaren, så att koncentre- ringsprocessen genomföres i sluten krets. Detta.arbetssätt på- verkar icke aktiviteten hos immunoglobulinerna. 7 _Koncentratet (96 kg) torkas därefter medelst någon lämplig metod, exempelvis genom frysning, åtföljd av frystorkning. Frys- ningen kan genomföras på plattor vid -40°C. Immunoglobulierna _kan förvaras vid -3006 utan aktivitetsförlust under cirka 45 in dygn; Produkten vid -30°C frystorkas på plattor vid ett tryck av 66 Pa och en temperatur i kondensorn om -5000 och plattorna värmda till 30-35°C. Torkningssättet påverkar icke aktiviteten fnos immunogiobuiinernal På detta sätt erhålles 19,1 kg torr pprodukt, innehållande-25-35 % immunoglobuliner,'vilken förvaras sterilt.The collection is carried out with a thin-layer evaporator (with falling liquid film with an area of 1 m2) at a heating temperature of 7500, the product temperature being about 30 ° C, to a dry matter content of at least 20%; To avoid any infection, the transfer is carried out by means of a peristaltic pump from the retentate container to the concentrate container, which is connected W to a circuit comprising the evaporator, so that the concentration process is carried out in a closed circuit. This approach does not affect the activity of the immunoglobulins. The concentrate (96 kg) is then dried by any suitable method, for example by freezing, followed by freeze-drying. Freezing can be performed on plates at -40 ° C. The immunoglobulins _can be stored at -3006 without loss of activity for about 45 in days; The product at -30 ° C is lyophilized on plates at a pressure of 66 Pa and a temperature in the condenser of -5000 and the plates heated to 30-35 ° C. The drying method does not affect the activity of the immunoglobulin. In this way 19.1 kg of dry p product are obtained, containing 25-35% of immunoglobulins, which are stored sterile.

»Exempel 3. Vid förfarande som i exempel 2 med behandling av mjölk från de första àtta.dagarna.efter kalvning och den mjölk 10 15 20 25 35 ÄO 448 062 _ 10 som uppsamlas under de sista 4 veckorna av laktationen erhålles ett proteinkoncentrat med följande medelsammansättningz Proteiner 75 Ü 5 % J |+ 40 _ 15 35 5 5 51% immunoglobuliner |+ 5 % a-laktalbuminer 5 ä ß-iakvógloßïiimaeí- l+ |+ 2 %dseruma1buminer l+ 2l% andra proteiner i mindre mängder kvarvarande fukthait _ 4 “I o, 5 e 'laktos , ' i e “ 1o “S 2 yá mineralsalter _ f5 É 2o % kvävehaltiga substanser, andra _+, -an proteiner 5 5 - 2 % Exemgel 4. Förfarandet genomföres som 1 exempel 2, med den skill- naden att grädden och kaseinet extraheras med vatten för åter- vinnande av en del av de förlorade immunoglobulinerna, varvid tvättvattnen återföres till framställningskedja.Example 3. In a procedure as in Example 2 with the treatment of milk from the first eight days after calving and the milk collected during the last 4 weeks of lactation, a protein concentrate is obtained with the following Agent Composition Proteins 75 Ü 5% J | + 40 _ 15 35 5 5 51% Immunoglobulins | + 5% α-lactalbumins 5 ä ß-iacvogloßïiimaeí- l + | I o, 5 e 'lactose,' ie “1o“ S 2 yá mineral salts _ f5 É 2o% nitrogenous substances, other _ +, -an proteins 5 5 - 2% Exemgel 4. The procedure is carried out as 1 example 2, with the difference the cream and casein are extracted with water to recover some of the lost immunoglobulins, whereby the washings are returned to the production chain.

Skumingen i kyla (Steg A) genomföras med en parallell linje för vattenextraktión av de proteiner som innehåller immuno» globuliner som medförts av grädden. Grädden från den första centrifugeringen (115 kg) förvaras 1 en behållare på 1000 liter smed omrörare och blandas med 150 kg ljummet vatten vid 40°C, var» efter det hela omblandas i'30 minuter och centrifugeras i sepa~ rator. På detta sätt åtskiljes ll5 kg grädde och 150 kg lösning, vilken sammanslås med den skummade och renade mjölken. Härvid erhålles 1130 kg vätska, vilken ledes till sknmningen i värme (Steg B) och koaguleringen.The foaming in the cold (Step A) is carried out with a parallel line for water extraction of the proteins containing immunoglobulins carried by the cream. The cream from the first centrifugation (115 kg) is stored in a 1000 liter container with a stirrer and mixed with 150 kg of lukewarm water at 40 ° C, after which it is mixed for 30 minutes and centrifuged in a separator. In this way, 115 kg of cream and 150 kg of solution are separated, which is combined with the skimmed and purified milk. 1130 kg of liquid are obtained, which is led to the heating in heat (Step B) and the coagulation.

Frånskiljandet av kaseinet ger med utgående från 1145 kg skummad, med löpe försatt och surgjord mjölk 991 kg vassla och 154 kg kasein. En parallell produktionslinje möjliggör en extrak~ tion av den proteinandel som innehåller immunoglobulinerna med vatten från koagulatet.oKoagulatet förvaras vid utträdet från klarnings- och reningscentrifugen i en omrörarförsedd behållare och omblandas med 300 kg ljummet vatten vid 4000 under 30 minuter, samt ledes till en kolloidkvarn. Den finfördelade koagulatsuspen~ sionen uppdelas därefter i en klarnings- och reningsanordning. 154 kg tvättat kasein utvinnes och 300 kg tvättvätska, vilken sammanslås med vasslan för de följande processerna. 1291 kg vassla filtreras och ultrafiltreras, varvid erhålles 2010 kg per- meat (I, II och III) och 2l6 kg förkoncentratß Indnnstningen ger 0,-, 10 15 20 25 ss, no, 448 062 ll 108 kg koncentrat, vilket vid torkning ger 21,6 kg torr produkt.The separation of the casein gives 991 kg of whey and 154 kg of casein, starting with 1145 kg of skimmed milk, with skimmed and soured milk. A parallel production line allows the protein portion containing the immunoglobulins to be extracted with water from the coagulate. The coagulate is stored at the exit of the clarification and purification centrifuge in a stirred container and mixed with 300 kg of lukewarm water at 4000 for 30 minutes, and passed to a colloid mill. . The atomized coagulum suspension is then divided into a clarifying and purifying device. 154 kg of washed casein are recovered and 300 kg of washing liquid, which is combined with the whey for the following processes. 1291 kg of whey is filtered and ultrafiltered, whereby 2010 kg of permeate (I, II and III) and 2l6 kg of pre-concentrate are obtained. The preparation gives 0, -, 10 15 20 25 ss, no, 448 062 ll 108 kg of concentrate, which on drying gives 21.6 kg dry product.

På detta sätt utvinnes cirka l4í% mer av immunoglobuliner i förhållande till processen enligt exempel 2.o Exempel 5._ l kg av det enligt exempel 2 eller 4 framställda ,pulvret, respektive 2_kg av det enligt_exempelf3 framställda pulvret blandas homogent med lOO kg mjölkpulver, och blandningen konditioneras sterilt för erhållande av en produkt, vilken inne- ghäller en profylaktisk dos av immunoglobulin; för en närings- tillförsel av 587 kJ per kg och dag, svarande mot 250 mg Ig- koncentrat per kg och dag, framställt enligt exempel 2 eller 4, "V respektive 500 mg Ig-koncentrat per kg och dag, framställt enligt exempel 3. e f- 'i - Exempel 6. Olika prov in vitro och in vivo har genomförts med proteinkoncentratet enligt exemplen 2 och 4, i det följande be-, nämnda "Ig-koncentrat", för att påvisa dels att immunoglobu- linerna från mjölk har en specifik antikroppverkan som normalt påvisas hos mänskliga immunoglobuliner, och att denna bibehålles under framställningsprocessen, dels att de specifika immuno- globulinerna från mjölk uppvisar en skyddande verkan och inverkar -på de patogena verkningarna hos de cnteropatogena.mikroorganis- amerna. 9 Passiv hemagglutinering a _ _ Röda blodkroppar från får.sensibi1iserades med ett karba- midextrakt av“en specifik serotyp av E.coli} Detta.extrakt fram- ställdes enligt Brodhage IH. Brodhage, (1961), J. Hyg., 1961, lšê, 9H1Å Bakterierna odlades på näringsagar (Difco) vid 3700 under.3O timmar i Roux-kolvar. Odlingen uttogs med 10 ml fosfat- buffraa saltlösning (8,8 g Nasi + 1,86 g Na2HPo4.2H2o + 0,43 g KH2PO¿ per 1000 ml H20) vid pH 7,2. Efter tillsats av 10 gram karbamid (Merk), fick suspensionen stå under 90 timmar vid 37°C med långsam omrörning. Efter centrifugering dialyserades över- a fasen-fullständigt mot en fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2, späddes till en slutvolym av 50 ml med fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2 och frystes i smàportioner vid -20°C. Sensibiliseringen av röda blodkroppar från får med detta.antigen genomfördes medelst en kombination av metoder enligt Avrameas et coll. (S.Avrameas, B. Taudou, S. Chuilon, Immunochemistry, 1969, Q, 67) och enligt Otto et coll. (H. Otto, H, Takamíya, A. Vogt, J. Immunol.Methods, 1973, Q, 137). De röda b1odkropparna.från får förbehanaiaaes X med glutaraldehyd (slutlig halt av röda blodkroppar från får 5 % p448 oe2_ D 12 och 0,5 % glutaraldehyd) varefter de tvättades och bringades i suspension till 20 %oi fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2, samt blandades med samma volym karbamidextrakt. Efter 16 timmars inkubering vid 2000 under mild omrörning tvättades de sensibili- serade röda blodkropparna.från får flera gånger och bringades i suspension till l % för omedelbar användning. De röda blodkrop- parna från får kan förvaras i 10-procentig suspension vid 400 under flera veckor. p Före filtrering skall varje undersökt prov absorberas på 'röda blodkroppar av får som förbehandlats med glutaraldehyd (0,1 ml sedimenterade röda blodkroppar från får till 1 ml Ig- koncentrat, 37°C, 60 minuter). p Titreringarna.genomfördes enligt systemet Microtiter (J.L. Sever, J. Immunol,, 1962, §§, 320, och T.B. Conrath, Handbook of Microtiter Procedures, l972) med användning av poly- styrenplattor med V-formade håligheter. En serie utspädningar om vardera 50 pl genomfördes med normalt kaninserum, utspätt till l/200, och 25 pl av sensibilisezade röda blodkroppar från får i l % sattes till varje utspädnirg. En serie bereddes med t de icke sensibiliserade röda blodkro1parna.från får som kontroll- prov för icke specifik agglutinering. Resultaten avlästes efter 2 timmar, och titern-för hemagglutineringen angavs av en sista utspädning som gav en tydligt positiv reaktion." De resultat som erhållits för 5 serotyper av E. coli an- gives i följande tabell: Serotyp av E.coli W Agglutin titer of 55 p 1/2561 o p111 1 1/ 64 o - 119 ' 1 1/128 o 127 of 1/128 o 128 1/ 64 kontroll Bakteriostatisk aktivitet in vitro .In this way about 14% more of immunoglobulins are recovered in relation to the process according to Example 2. Example 5. 1 kg of the powder prepared according to Example 2 or 4, and 2 kg of the powder prepared according to Example 3 are mixed homogeneously with 100 kg of milk powder. and the mixture is sterilized to obtain a product which contains a prophylactic dose of immunoglobulin; for a nutrient supply of 587 kJ per kg per day, corresponding to 250 mg Ig concentrate per kg per day, prepared according to Example 2 or 4, "V and 500 mg Ig concentrate per kg per day, respectively, prepared according to Example 3. Example 6 Various in vitro and in vivo tests have been performed with the protein concentrate of Examples 2 and 4, hereinafter referred to as "Ig concentrate", to demonstrate that the milk immunoglobulins have a specific antibody action that is normally detected in human immunoglobulins, and that this is maintained during the manufacturing process, and that the specific immunoglobulins from milk have a protective effect and have an effect on the pathogenic effects of the enteropathogenic microorganisms. Red blood cells from sheep were sensitized with a urea extract of a specific serotype of E. coli. This extract was prepared according to Brodhage IH. Brodhage, (1961), J. Hyg., 1961, lšê, 9H1Å. on when ingars (Difco) at 3700 for 30 hours in Roux flasks. The culture was started with 10 ml of phosphate buffered saline (8.8 g Nasi + 1.86 g Na 2 HPO 4 .2H 2 O + 0.43 g KH 2 PO 3 per 1000 ml H 2 O) at pH 7.2. After adding 10 grams of urea (Merk), the suspension was allowed to stand for 90 hours at 37 ° C with slow stirring. After centrifugation, the phase was completely dialyzed against a pH 7.2 phosphate buffered saline solution, diluted to a final volume of 50 ml with phosphate buffered saline solution at pH 7.2 and frozen in small portions at -20 ° C. The sensitization of red blood cells from sheep with this antigen was performed by a combination of methods according to Avrameas et coll. (S. Avrameas, B. Taudou, S. Chuilon, Immunochemistry, 1969, Q, 67) and according to Otto et coll. (H. Otto, H, Takamíya, A. Vogt, J. Immunol.Methods, 1973, Q, 137). The red blood cells from sheep are treated with glutaraldehyde (final red blood cell content from sheep 5% p448 oe2_ D 12 and 0.5% glutaraldehyde) after which they are washed and suspended in 20% in phosphate buffered saline at pH 7.2. and mixed with the same volume of urea extract. After 16 hours of incubation at 2000 with gentle stirring, the sensitized red blood cells were washed from sheep several times and suspended in 1% for immediate use. The red blood cells from sheep can be stored in a 10% suspension at 400 for several weeks. Prior to filtration, each sample examined should be absorbed into the red blood cells of sheep pretreated with glutaraldehyde (0.1 ml sedimented red blood cells from sheep to 1 ml of Ig concentrate, 37 ° C, 60 minutes). The titrations were performed according to the Microtiter system (J.L. Sever, J. Immunol, 1962, §§, 320, and T.B. Conrath, Handbook of Microtiter Procedures, 1972) using polystyrene plates with V-shaped cavities. A series of dilutions of 50 μl each were performed with normal rabbit serum, diluted to 1/200, and 25 μl of sensitized sheep red blood cells in 1% were added to each dilution. A series was prepared using the non-sensitized red blood cells from sheep as a control sample for non-specific agglutination. The results were read after 2 hours, and the titer of the haemagglutination was indicated by a final dilution which gave a clear positive reaction. "The results obtained for 5 serotypes of E. coli are given in the following table: Serotype of E. coli W Agglutin titer of 55 p 1/2561 o p111 1 1/64 o - 119 '1 1/128 o 127 of 1/128 o 128 1/64 control Bacteriostatic activity in vitro.

Den bakteriostatiska aktiviteten på tillväxten av olika serotyper av E.coli vid tillsats av Ig-koncentrat till odlings- miljön undersöktes.-Systemet Microtiter användes, anpassat för odlingen, vilket sålunda möjliggjorde användning av minimala provmängder och samtidig undersökning av ett maximalt antal prover. D o u få: flïë. m 1o 5 15 20 25 30 448 062 13 I Varje odling hade en slutvolym av 0,25 ml, antingen i en minimimiljö som innehöll l % glukos, eller i en rik odlingsmiljö.The bacteriostatic activity on the growth of different serotypes of E.coli when adding Ig concentrate to the culture environment was examined. The Microtiter system was used, adapted for the culture, thus enabling the use of minimal sample amounts and simultaneous examination of a maximum number of samples. D o u få: flïë. I 1o 5 15 20 25 30 448 062 13 I Each culture had a final volume of 0.25 ml, either in a minimum environment containing 1% glucose, or in a rich culture environment.

För varje undersökt värde på inkuberingstiden uttogs två prover för att minska riskerna för fel från volymvariationer. Utvärde- ringen genomfördes genom dubbel beräkning av prover på 10 pl på 5 plattor av näringsagar.For each examined value during the incubation period, two samples were taken to reduce the risk of errors from volume variations. The evaluation was carried out by double calculation of samples of 10 μl on 5 plates of nutrient agar.

Bakterieympkulturen bestod av en utspädning av en 16 timmars iodling i minimal-miljö, innehållande l-2 x lO« bakterier per ml.The bacterial inoculum culture consisted of a dilution of a 16 hour iodine culture in a minimal environment, containing 1-2 x 10 6 bacteria per ml.

Inkuberingen genomfördes i fuktig atmosfär vid 37°C. Ig-koncentra- P tet sattes i sluthalter av-l ag/ml, 10 pg/ml,*lOD ug/ml och 1 mg/ml till odlingsmiljön före inympning med 2 x 10 E.coli/ml.The incubation was performed in a humid atmosphere at 37 ° C. The Ig concentrate was added at final levels of -ag / ml, 10 pg / ml, * 10 ug / ml and 1 mg / ml to the culture medium before inoculation with 2 x 10 6 E.coli / ml.

En tydlig inhibering pàvisades av tillväxten hos E.coli O lll: B4 dunder de 4 första timmarna av inkuberingen vid en halt av Ig- xoncentrat av 10 ng/mi. I Jämförelse med xontroliprovet, be- g stående av enbart odlingsmiljön,_visade sig en överlägsen till- växt i närvaro av l mg/ml av normala proteiner från vassla, er- hållna med utgående-från icke immuniserade kor, Eliminering av E.ooli O lll:B4 hos möss För varje provning användes 8 möss (schweiziska vita han- n möss, på 20-24 gram), 2 som kontrollprov och 6 för 3 prövningar, åvardera utfört två gånger; Samtliga möss erhöll en subkutan in- jektion av 0,1 ml heparin (500 IE/ml), En lösning från 16 timmars odling av E.coli O lll:B4 späddes till en tiondel med steril saltlösning och späddes sedan till en hundradel genom tillsats av serum från kalvfoster (Difco), utspätt till en tiondel för kontrollproven och innehållande 3 valda halter av Ig-koncentrat. 0,2 ml av den erhållna lösningen injicerades intravenöst i svansvenen; varvid varje mus (2 möss §ör_kontrollprovet och 52 x 3 för proven) erhöll cirka 2 x 100 bakterier; där utgångs- bakteriesuspensionen innehöll 109 bakterier per ml. Omedelbart efter injektionen (vid tiden-O) och efter 20, 40 och 60 minuter genomfördes enïflodpunktion av 50 pl från ögonvenernas plexus medelst kalibrerade och heparinbehandlade kapillärrör, och lproverna överfördes omedelbart till 5 ml steril saltlösning (blodutspädning lO'2) och späddes därefter till lO'3 och lO"A i saltlösning. Räkningen genomfördes på agarplattor (Difco) medf l ml av varje utspädning och index för fagocytos k bestämdes enligt Biozzi et.coll. (G. Biozzi, C. Stiffel, B.N. Halpern,' L. Le minor; D. masten, J; Immunoi., 1961, §1, 296): 10 15 448 062 14 log C - log C K _ l 2 i Ta ' Ti _, Cl och 02 betecknar-resultatet från räkningarna vid tiderna ” Tl Och T2.A clear inhibition was demonstrated by the growth of E.coli OIII: B4 during the first 4 hours of the incubation at an Ig xon concentrate level of 10 ng / ml. In comparison with the xontroli sample, consisting only of the culture environment, a superior growth was shown in the presence of 1 mg / ml of normal whey proteins obtained from non-immunized cows, Elimination of E.ooli O lll: B4 in mice For each test, 8 mice (Swiss white male mice, weighing 20-24 grams) were used, 2 as a control test and 6 for 3 tests, each performed twice; All mice received a subcutaneous injection of 0.1 ml of heparin (500 IU / ml). A solution from 16 hours of culture of E.coli OII: B4 was diluted to one tenth with sterile saline and then diluted to one hundredth by addition. of serum from calf fetus (Difco), diluted to one tenth for the control samples and containing 3 selected levels of Ig concentrate. 0.2 ml of the resulting solution was injected intravenously into the tail vein; each mouse (2 mice for the control sample and 52 x 3 for the samples) received approximately 2 x 100 bacteria; where the starting bacterial suspension contained 109 bacteria per ml. Immediately after the injection (at time-0) and after 20, 40 and 60 minutes, a 50 μl puncture of the venous plexus was performed using calibrated and heparinized capillary tubes, and the samples were immediately transferred to 5 ml of sterile saline (blood dilution 10'2) and then diluted to 10'3 and 10 "A in saline. The count was performed on agar plates (Difco) with 1 ml of each dilution and the index for phagocytosis k was determined according to Biozzi et.coll. (G. Biozzi, C. Stiffel, BN Halpern, 'L. Le minor; D. masten, J; Immunoi., 1961, §1, 296): 10 15 448 062 14 log C - log CK _ l 2 i Ta 'Ti _, Cl och 02 betecknar -result från rekningarna vid tiden ” Tl And T2.

På detta sätt observerades en normal minskning av bakterie- antalet genom eliminering i det retikulo-indoteliala systemet i närvaro av fosterserum från kalv, medan en tillsats av 10 pg av Ig-konoentratet till injektionslösningen åstadkom en elimine- ring av 99,6 % av bakterierna från blodströmmen inom 20 minuter.In this way, a normal reduction in the number of bacteria was observed by elimination in the reticulo-indothelial system in the presence of fetal serum from calves, while an addition of 10 pg of the Ig concentrate to the injection solution achieved an elimination of 99.6% of the bacteria. from the bloodstream within 20 minutes.

Resultaten sammanfattas i följande tabell: tid bakterier i % av ursprungliga antalet (minuter efter ' vid tiden60 efter intravenös injektion injektion av av 2 x 10 E.coli 0 lll:B4 E.coli) Kontrollprov 1:10 Prover, Igfkonoentrat fosterserum av kalv 1000 ng 100 pg 10 pg O 2 0 0 100 100 100 100 20 _ 27,8 0,14 i 0,22 0,4 40 ._l5,5 0,02 0,02 7 0,12 600 - 10,0 0,02 0,02 0,06 Specificiteten hos behandlingen kontrollerades genom ut- tömmande absorption av Ig-koncentrat med serotypen 0 ll1:BÄ av 0E.coli, och det har visat sig att denna absorption förintar praktiskt taget all förstärkande aktivitet av fagooytosen, även med en mängd av 1 mg Ig-koncentrat. 6 t Den följande tabellen visar fagooytosindex K, erhållna på 20 minuter: * 0 Kontrollprov l000 pg Ig- 1000 pg 1:10 fosterserum koncentrat, Ig-koncentrat, av kalv icke absorberat absorberat K 0,015 0,128 0,039 Skvddsnrov hos möss ' Logaritmiska utspådningar (logïo) bereddes|av en odling av - E.co1i 0 lll:B4 1 näringsbuljong (Difoo), innehållande 103 bakte~ ricr par ml för erhållande av utspädningar med l0"n, l0'5, l0“Ö och 10-7 i 5 % mucin (kornat mucin av typen 1701-W för potentie- ring av virulensen hos bakterier från Wilson Laboratories, Chicago, Ilimois) . i ' 3,.The results are summarized in the following table: time bacteria in% of original number (minutes after 'at time60 after intravenous injection injection of of 2 x 10 E.coli 0 lll: B4 E.coli) Control sample 1:10 Samples, Igfconoentrate fetal serum of calf 1000 ng 100 pg 10 pg O 2 0 0 100 100 100 100 20 _ 27.8 0.14 i 0.22 0.4 40 ._l5.5 0.02 0.02 7 0.12 600 - 10.0 0, The specificity of the treatment was checked by exhaustive absorption of Ig concentrate with the serotype O111: BÄ of OE.coli, and it has been found that this absorption destroys virtually all the enhancing activity of the phagocytosis, even with an amount of 1 mg of Ig concentrate. 6 h The following table shows phage phytose index K, obtained in 20 minutes: * 0 Control sample 1000 pg Ig-1000 pg 1:10 fetal serum concentrate, Ig concentrate, of calf not absorbed absorbed K 0.015 0.128 0.039 Protective snout in mice 'Logarithmic predictions (logïo ) was prepared from a culture of - E.co1i 0 lll: B4 1 nutrient broth (Difoo), containing 103 bacteria per ml to obtain dilutions with l0 "n, l0'5, l0" Ö and 10-7 in 5 % mucin (granular mucin of the type 1701-W for potentiating the virulence of bacteria from Wilson Laboratories, Chicago, Ilimois).

(El.(El.

'Vf i' lO '15 20 paktiva fragment i matsmältningsapparaten. 5448 062 15 3 ml av varje utspädning blandades därefter med 0,6 ml provlösning, av saltlösning, respektive av lg-koncentrat och av proteiner från normal vassla (icke immunicerade kor). Med an- vändning av 5 möss för varje utspädning injicerades 0,6 ml av den erhållna blandningen på varje mus intraperitonealt. Resul- taten från utvärderingen av antalet döda möss per 5 behandlade möss efter 48 timmar angives i följande tabell: Antal döda möss per _5 behandlade möss Provat material 5 Halt av bakterier i behandlingen 5 x 10' 5 5 X 103 5 X 102 5 x 101 saltlösning a 5 5 5_ 5 5 ~5 10 p 5 Ig-koncentrat x ' 5 ' a 5 5 3 25 .n a ' Ig-koncentrat x ~ ' 5* p p 5 5 0 0_ 100 y 5 5 5 lg-koncentrat x - O. pp O O 0 10 p 7 I proteinerpfrån normal vassla d(icke immuniserade kor) 5 5- 5 5 - 5 25 M proteiner från _ normal vassla 5 5 5 5 l00 M proteiner från normal vassla ~ 5 5 5 5 X beräknat som totalproteiner, innehållande 35-45 % immuno- giobuiiner från mjölk.'Vf i' 10 '15 20 active fragments in the digestive tract. 3 ml of each dilution was then mixed with 0.6 ml of sample solution, of saline, respectively of Ig concentrate and of proteins from normal whey (non-immunized cows). Using 5 mice for each dilution, 0.6 ml of the resulting mixture was injected onto each mouse intraperitoneally. The results from the evaluation of the number of dead mice per 5 treated mice after 48 hours are given in the following table: Number of dead mice per _5 treated mice Sampled material 5 Content of bacteria in the treatment 5 x 10 '5 5 X 103 5 X 102 5 x 101 saline a 5 5 5_ 5 5 ~ 5 10 p 5 Ig concentrate x '5' a 5 5 3 25 .na 'Ig concentrate x ~' 5 * pp 5 5 0 0_ 100 y 5 5 5 lg concentrate x - O. pp OO 0 10 p 7 I proteinsp from normal whey d (non-immunized cows) 5 5- 5 5 - 5 25 M proteins from _ normal whey 5 5 5 5 l00 M proteins from normal whey ~ 5 5 5 5 X calculated as total proteins, containing 35-45% immunogiobuins from milk.

Det har visat sig att lOO pg av Ig-koncentrat gav ett full- dständigt skydd för samtliga provade bakteriehalter, medan 100 pg -av proteiner från vassla.som isolerats med utgående från mjölk av icke immunicerade kor icke gav något skydd.It has been found that 100 pg of Ig concentrate provided complete protection for all bacterial contents tested, while 100 pg of whey proteins isolated from non-immunized cow milk provided no protection.

Exempel 7. ' - _ a I: En första.serie av kliniska försök_visar att immunoglobu- liner från mjölk motstår den proteolytiska.nedbrytningen till in- ll barn (9 pojkar, 2 flickor), vilka inlaàts på sjukhus av olika orsaker, men som icke led av gastroenteriter, och vars ålder varierade från 2 veckor till l år erhöll till näring en mjölk, innehållande ett lg-koncentrat som framställts enligt exempel 2 eller 4 i en isokalorisk dos, svarande mot 2 g per kg V1' 10 15 20 25 35 40 448 062 « 16 kroppsvikt och jämnt fördelad över 24 timmar. Den första.och den sista måltiden med införlivandet av lg-koncentratet märktes med 0,2 g karminrött. Minst ett avföringsprov upptogs före tillför- seln av Ig-koncentratet, och systematiskt tillvaratogs samtlig följande avföring under 72 timmar, varvid proverna förvarades vid -2o°c, i i i , vtrakt av avföringen framställdes genom tillsats av tvâ delar avföring till en del fosfatbuffrad saltlösning med pH 7,2 och dispersion av avföringen vid 0°C med en glasstav. Suspensionen omblandades därefter under 20 minuter med en miniblandare (400 varv per minut) vid rumstemperatur, Därefter kyldes suspensionen snabbt vid 0°C och centrifugerades vid denna temperatur med 3500 g under 15 minuter. Överstående vätska tillvaratogs där- efter noggrant. i p -Närvaron av aktiva immunoglobuliner i avföringsextrakten bekräftades genom dubbel immunodiffusion (Ouohter1ony's prov) och genom immunoelektrofores. De antisera som användes i dessa provningar framställdes genom upprepade subkutana.och intra- venösa injektioner av l mg antikroppar från mjölk eller 0,1 mg Ig Gl hos kanin. För Ouchterlony's prov belades glasplattor (94 x 84 mm) med ett skikt av l % agargel i en fosfatbuffrad saltlösning vid pH 7,2, och i skiktet upptogs håligheter om 4 mm med 9,5 mm avstånd med en hålpipa (LKB-produkter AB), med användning av ett antiprotein-antiserum från vassla av rå- mjölk från nöt och ett specifikt, envärt antiserum-anti-IgG från komjölk. _ För immunoelektroforesen.belades glasplattor (100 x 85 mm) med 12 ml l-procentigt agargel i 0,05 M barbiturat, buffrat till pH 8,3 (lO,3 g natriumbarbiturat + 0,5 g oitronsyra.+ 0,5 g oxal- syra till l liter vatten) och den elektroforetiska separationen genomfördes vid rumstemperatur under 90 minuter vid 4 volt/cm.Example 7. '- _ a I: A first series of clinical trials shows that immunoglobulins from milk resist the proteolytic degradation in children (9 boys, 2 girls), who are hospitalized for various reasons, but who did not suffer from gastroenteritis, and whose age ranged from 2 weeks to 1 year received for nutrition a milk, containing an Ig concentrate prepared according to Example 2 or 4 in an isocaloric dose, corresponding to 2 g per kg V1 '10 15 20 25 35 40 448 062 «16 body weight and evenly distributed over 24 hours. The first and last meal with the incorporation of the Ig concentrate was marked with 0.2 g of carmine. At least one stool sample was taken before the Ig concentrate was added, and all subsequent stools were systematically collected for 72 hours, the samples being stored at -2 ° C, iii, extract of the stool was prepared by adding two parts of stool to one part of phosphate buffered saline with pH 7.2 and dispersion of the faeces at 0 ° C with a glass rod. The suspension was then mixed for 20 minutes with a mini mixer (400 rpm) at room temperature. Thereafter, the suspension was rapidly cooled at 0 ° C and centrifuged at this temperature with 3500 g for 15 minutes. The supernatant was then carefully collected. in p -The presence of active immunoglobulins in the fecal extracts was confirmed by double immunodiffusion (Ouohterlony's sample) and by immunoelectrophoresis. The antisera used in these tests were prepared by repeated subcutaneous and intravenous injections of 1 mg of antibodies from milk or 0.1 mg of Ig Gl in rabbits. For Ouchterlony's samples, glass plates (94 x 84 mm) were coated with a layer of 1% agar gel in a phosphate buffered saline solution at pH 7.2, and 4 mm cavities were recorded in the layer at a distance of 9.5 mm with a perforated pipe (LKB-produkt AB ), using an antiprotein antiserum from beef colostrum and a specific, monovalent antiserum anti-IgG from cow's milk. For immunoelectrophoresis, glass plates (100 x 85 mm) were coated with 12 ml of 1% agar gel in 0.05 M barbiturate, buffered to pH 8.3 (10, 3 g sodium barbiturate + 0.5 g oitric acid. + 0.5 g oxalic acid to 1 liter of water) and the electrophoretic separation was carried out at room temperature for 90 minutes at 4 volts / cm.

Efter diffusion av antisera (2Ä timmar) tvättades plattorna.med saltlösning, torkades och framkallades med azokarbin B.After diffusion of antisera (2 hours), the plates were washed with brine, dried and developed with azocarbine B.

Närvaron av immunoglobuliner från mjölk påvisades i av- föringcn trots avsevärda variationer i tiden för deras upp- trädande och i tiden för utsöndrandet av immunoglobulin, liksom även en god motsvarighet mellan uppträdandet och'försvinnandet av den röda karminmärkningen och immunoglobulinerna.The presence of immunoglobulins from milk was detected in the faeces despite considerable variations in the time of their appearance and in the time of the secretion of immunoglobulin, as well as a good correspondence between the appearance and disappearance of the red carmine label and the immunoglobulins.

För bekräftande av aktiviteten hos dessa immunoglobuliner 1 från mjölk genomfördes provet in vivo med serumskydd hos möss fä.To confirm the activity of these immunoglobulins 1 from milk, the test was performed in vivo with serum protection in mice.

UV 10 15 __ 5448 062 17 (som beskrives i exempel 6) med användning av 6 avföringsextrakt U från varje serie, och resultaten sammanfattas i följande tabell: Antal döda möss per _Avföringsextrakt Ia-intensitet i 5 behandlade möss âšíâïiâšâïšíïššëšo- 13,333;- ggrgfigråefâ m- foretisk undersökning lingeh e an ' _5><1o4 5x1o3 5x1o2 sxioï Barn M.D, I _____ 5 5 5 5 (2 veckor) II _ 5 5 5 5 i i Iv ' I i ++++ 2 1 o o V _ _ ++++ O O 0 O i VI f +++ 1 1 o o in i ' _____ 5 5 3 4 BarnlS.G. j i I + 5 ' 5 5 5 (1. månad) III t - 4 5 5 5 i Iv . » ++++ o o o o VI i ++++ o o o ,o X pt, ++ 53 0 l O XI ' + 5 2 o o _Ett klart samband kan påvisas nellan de positiva resultaten vid immunoelektroforesen och den_skycdande verkan hos det material som ingår i avföringsextrakten. Speciellt kan det uppskattas att halterna av immunoglobulin från mjölk i extrakten V (barnet M.D.)5 och IV och VI (barnet S;G.)_svarar mct minst l mg av lg-koncentrat.UV 10 15 __ 5448 062 17 (as described in Example 6) using 6 stool extracts U from each series, and the results are summarized in the following table: Number of dead mice per Stool extract Ia intensity in 5 treated mice âšíâïiâšâïšíïššëšo- 13,333; - ggrg fi gray - ethical examination lingeh e an '_5> <1o4 5x1o3 5x1o2 sxioï Children MD, I _____ 5 5 5 5 (2 weeks) II _ 5 5 5 5 ii Iv' I i ++++ 2 1 oo V _ _ ++ ++ OO 0 O i VI f +++ 1 1 oo in i '_____ 5 5 3 4 BarnlS.G. j i I + 5 '5 5 5 (1st month) III t - 4 5 5 5 i Iv. »++++ oooo VI i ++++ ooo, o X pt, ++ 53 0 l O XI '+ 5 2 oo _A clear connection can be demonstrated between the positive results of the immunoelectrophoresis and the_scavenging effect of the material contained in stool extracts. In particular, it can be estimated that the levels of immunoglobulin from milk in extracts V (child M.D.) and IV and VI (child S; G.) Correspond to at least 1 mg of Ig concentrate.

II: rI en andra serie av klinifika försök har de terapeu- 5 tiska och profylaktiska egenskaperna.undersökts hos Ig-koncentrat, framställt enligt-exempel 2 eller 4. tTerapeutiska egenskaper Denna undersökning genomfördes med barn upp till 5 månader och som drabbats av godartade till akuta gastroenteriter, fram- kallade av E.coli. I olika provserier administrerades till totalt 152 patienter antingen 2 gram lg-koncentrat per kg och dag under 5 dagar, eller l gram per kg och dag under 10 dagar i deras näring. 1Patienterna erhöll icke något läkemedel, såsom sulfamider eller dantibiotika, vare sig oralt eller parenteralt. Faecesodlingar genomfördes varje dag efter en administrering, den sista mellan 36 och 48 timmar efter den sista administreringen av Ig-koncentrat. 43 patienter behandlades på samma sätt, varvid dock Ig-koncentratet 20 25 35 40 448 062 ' 18 utbyttes mot proteiner från vassla, härrörande från icke immuni- serade kor. 5 __ï, 1 5 » 'T Negativa faeoesodlingar erhölls för 90 barn (57,? %) under 5 behandlingens förlopp. I kontrollserien visade endast I4 barn (27,7 %) ett spontant försvinnande av E.coli i faecesodlingarna.In a second series of clinical trials, the therapeutic and prophylactic properties have been studied in Ig concentrate, prepared according to Example 2 or 4. Therapeutic properties This study was performed with children up to 5 months and suffered from benign to acute gastroenteritis, induced by E.coli. In different test series, a total of 152 patients were administered either 2 grams of Ig concentrate per kg and day for 5 days, or 1 gram per kg and day for 10 days in their diet. 1Patients did not receive any medication, such as sulfamides or dantibiotics, either orally or parenterally. Faecal cultures were performed every day after one administration, the last between 36 and 48 hours after the last administration of Ig concentrate. 43 patients were treated in the same way, except that the Ig concentrate was exchanged for whey proteins derived from non-immunized cows. 5 __ï, 1 5 »'T Negative faeoes cultures were obtained for 90 children (57,?%) During the course of the treatment. In the control series, only I4 children (27.7%) showed a spontaneous disappearance of E.coli in the faecal cultures.

Det är att beakta, att de nativa proteinerna från vassla som härrör från icke immuniserade kor innehåller en liten mängd av, immunoglobulinet anti-E.cdïi.'Det visade sig_även, att frånvaron av framgång.med behandlingen observerades oftare i de fall som erhöll den högre dosen under en kortare tid. __Ha_ w_ Konsistensen hos avföringen undersöktes i vart fall. Ett försvnmanaet av diarrén och en väsentlig klinisk .förbättring visade sig i ett-stort antal fall, även fastän faecesodlingarna förblev positiva. I de fall då faecesodlingarna.blev negativa, förbättrades konsistensen hos avföringen snabbare när Ig-kon- centratet administrerades i en mjölkkomposition som var fattig på laktos.6 nu Profylaktiska egenskaper e u ,_ För tidigt födda barn utgör en grupp som är ytterst käns- lig för gastroenteriter genom E.coli, och denna grupp utvaldes för kliniska undersökningar av profylaxen. fi* Denna undersökning genomfördes under 6 månader i 2 rum med 8 kuvöser i vardera rummet. Proven och kontrollproven för- delades i vardera.rummet, för att samtliga.patienter skulle ut- sättas för samma betingelser, och 14 kuvöser användes för provning och 4 för kontrollprov. Varje fall stannade i medeltal 41 dagar, .och ett barn uttogs efter tillfrisknande och ersattes av ett annat oavsett dess tillhörighet (provgrupp eller kontrollgrupp). 70 fall följdes, 36 som kontrollgrupp och 34 för provningsgruppen.It should be noted that the native proteins of whey derived from non-immunized cows contain a small amount of the immunoglobulin anti-E.cd.I. It was also found that the absence of success with the treatment was more often observed in the cases which received the higher dose for a shorter time. __Ha_ w_ The consistency of the stool was examined in any case. A worsening of the diarrhea and a significant clinical improvement were found in a large number of cases, even though the faecal cultures remained positive. In cases where faecal cultures became negative, the consistency of the faeces improved more rapidly when the Ig concentrate was administered in a milk composition which was low in lactose.6 now Prophylactic properties eu, _ Premature babies form a group that is extremely sensitive for gastroenteritis by E.coli, and this group was selected for clinical trials of prophylaxis. fi * This study was conducted for 6 months in 2 rooms with 8 incubators in each room. The samples and control samples were distributed in each room, so that all patients were exposed to the same conditions, and 14 incubators were used for testing and 4 for control samples. Each case lasted an average of 41 days, and one child was taken out after recovery and replaced by another regardless of its affiliation (test group or control group). 70 cases were followed, 36 as a control group and 34 for the test group.

Provningsgruppen erhöll Ig-koncentratet vid varje mål, fördelad över 24 timmar i en mängd av 0,25 gram per kg och dag. En faeces- odling genomfördes från försökets början, och faecesodlingarna undersöktes var femte dag. Av en totalmängd på 666 faecesodlingar härrörde 339 från kontrollgruppen och 327 från provgruppen. Bland de sistnämnda visade 33 närvaro av E.coli (lO,l %) medan 96 av de 5 339 odlingarna från kontrollgruppen var positiva (28,3 %). Vid a en undersökning av enbart serotypen E.coli O ll9!B14, vilken ofta; finnes förbunden lmed akuta. former av gastroenterit, var 7 frekvensen för positiva.faecesodlingar 5,5 % i provgruppen, mot 9 23,3 % i kontrollgruppen. ny. 448 062 19 Den slutsatsen, kan åragas, att införlivande a.v protein- koncentrat, innehållande specifika imrnunoglobuliner från mjölk som-är anti-Ewan -1 mjölken till för tidigt födda. avsevärt minskar infektionsgraden a.v E.coli hos denna. specieilt känsliga. grupp av nyfödda..The test group received the Ig concentrate at each meal, distributed over 24 hours in an amount of 0.25 grams per kg and day. A faecal culture was performed from the beginning of the experiment, and the faecal cultures were examined every five days. Of a total of 666 faecal cultures, 339 came from the control group and 327 from the sample group. Among the latter, 33 showed the presence of E.coli (10.1%) while 96 of the 5,339 cultures from the control group were positive (28.3%). In a study of only the serotype E.coli O ll9! B14, which often; are associated with emergency. forms of gastroenteritis, 7 the frequency for positive faecal cultures was 5.5% in the test group, compared to 9 23.3% in the control group. new. 448 062 19 It can be concluded that the incorporation of protein concentrates containing specific immunoglobulins from milk which is the anti-Ewan -1 milk into premature infants. significantly reduces the degree of infection due to E.coli in it. especially sensitive. group of newborns ..

Claims (9)

20 448» 062 I Eatentkrav20 448 »062 I Eatentkrav 1. Sätt att framställa ett proteinkoncentrat, inne- hållande ímmunologiska faktorer härrörande från mjölk, spe- ciellt då aktiva, icke-denaturerade immunoglobuliner, k ä n n e t e c k n a t av följande arbetssteg: a), 'mjölken utvinnes från mjölkbärande nötkreatur, vilka hyper- immuniserats_genom vaccination, innefattande en serie succes- siva admlnistreringar av antigener på parentoral och lokal väg vid den åttonde till den andra veckan före kalvning och på oral väg under de två veckorna före kalvning, och en serie successivayadministreringar av antigener med början cirka 2 1/2 månad före det antagna slutet av mjölkut- söndringen med alternerande mellan parenteral, lokal och oral administrering, varvid mjölken utgöres av råmjölk från_ 1-2 dagar efter kalvning, övergångsmjölk från 3-8 dagar efter kalvníng, och slutlig mjölk från de sista 60 dagarna av laktationsperioden, 7 b) grädden och föroreningar frånskiljes, c) “den skummade och renade mjölken bringas att koagulera, ad) kaseinet frânskiljes, och proteínerna i vasslan filt- reras, ultrafiltreras och steriliseras genom filtrering, samt e) produkten indunstas och torkas under betingelser som icke denaturerar immunoglobulinerna och som bibehåller steriliteten. _A method of preparing a protein concentrate containing immunological factors derived from milk, especially then active, non-denatured immunoglobulins, characterized by the following steps: a), the milk is recovered from milk-bearing cattle, which have been hyperimmunized by vaccination , comprising a series of successive administrations of antigens on a parental and local route at the eighth to second week before calving and orally during the two weeks before calving, and a series of successive administrations of antigens starting about 2 1/2 months before the assumed end of milk excretion with alternating between parenteral, local and oral administration, the milk consisting of colostrum from 1-2 days after calving, transitional milk from 3-8 days after calving, and final milk from the last 60 days of the lactation period, 7 b) the cream and impurities are separated, c) “the skimmed and purified milk is made to coagulate, ad) the casein f and the proteins in the whey are filtered, ultrafiltered and sterilized by filtration, and e) the product is evaporated and dried under conditions which do not denature the immunoglobulins and which maintain the sterility. _ 2. “2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att vaccinet är grundat pá antigener till Escherichia coli som orsakar neonatala gastroenteríter.2. “2. A method according to claim 1, characterized in that the vaccine is based on antigens to Escherichia coli which cause neonatal gastroenteritis. 3. I 3. Sätt enligt krav 1, k ü n n e t e c k n a t därav, att koagulcringen genomföres genom tillsats av salt- syra till ett pH~av ca 4,6 och värming till 40oC.3. A process according to claim 1, characterized in that the coagulation is carried out by adding hydrochloric acid to a pH of about 4.6 and heating to 40 ° C. 4. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att för undvikande av en följande igensättning av filter och ultrafilter, skumningen genomföres i två steg, först i kyla och därefter i värme, och att skumningen och frånskiljandet av kaseinet åtföljes av långtgående rening från slam och föroreningar.4. A method according to claim 1, characterized in that in order to avoid a subsequent clogging of filters and ultrafilters, the foaming is carried out in two steps, first in cold and then in heat, and that the foaming and separation of the casein is accompanied by extensive purification from sludge and contaminants. 5. S. Sätt enligt krav 1, k Ü n ngc t e c k n n t därav, att ultrafiltreringen av vasslan genomföres med tvättning av retentatet och återföring av det tvättade rctcntatet så, att dess halt av proteiner ökas. ”a .5. A method according to claim 1, characterized in that the ultrafiltration of the whey is carried out by washing the retentate and returning the washed rcentate so that its content of proteins is increased. ”A. 6. N 448 062 0. Sätt onlígt_krav I; k ü n n 0 t eyc k n u t därav, att den förkoncentrerude-vnsslun underkastas en för- filtrering, ütföljd av on stcrilfilfroring.6. N 448 062 0. Set onlígt_krav I; k ü n n 0 t eyc k n u t of the fact that the preconcentrated window treatment is subjected to a pre-filtration, followed by oncrilfil freezing. 7. Häll vn||gl krav I, k H n n v t 9 C k n n t düruv, att indunstningcn av don förkonconrrcrudc och steri- líserude vasslan genomföras i ett slutet kretslopp under sterila betingelser.Pour vn || gl requirements I, k H n n v t 9 C k n n t düruv, that the evaporation of don preconcrrcrudc and steriliserude whey is carried out in a closed cycle under sterile conditions. 8. Sätt enligt krav 1, k ä n n c t e c k n a t därav,_att den koncentrerade produkten torkas genom frysning, åtföljd av frystorkning och steril förpackning.8. A method according to claim 1, characterized in that the concentrated product is dried by freezing, accompanied by freeze-drying and sterile packaging. 9. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att i stegen b) och d) grädden och koagulatet extra- heras med vatten och att extraktionsvattnen sammanslås med den skummade mjölken, respektive med vasslan för återvínnande av immunoglobulincr som bortgått under dessa processer.9. A method according to claim 1, characterized in that in steps b) and d) the cream and coagulate are extracted with water and that the extraction waters are combined with the skimmed milk and with the whey for recovery of immunoglobulins lost during these processes.