SE440596B

SE440596B - Forfarande for framstellning av ett heme-koncentrat ur en blandning av heme och blodsubstans erhallen vid spaltning av hemoglobin

Info

Publication number: SE440596B
Application number: SE8002591A
Authority: SE
Inventors: Paul Goran Sigvard Lindroos
Original assignee: Paul Goran Sigvard Lindroos
Priority date: 1980-04-03
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1985-08-12
Also published as: EP0056025B1; EP0056025A1; SE8002591L; JPH0134204B2; IE810644L; WO1981002834A1; SU1660573A3; JPS57500431A; DK154266B; IN152639B; IE51040B1; DK154266C; DK530181A; US4431581A

Description

8002591 '-9 Föreliggande uppfinning berör ett förfarande för framställning av ett heme-koncentrat ur en blandning av heme och blodsubstans erhållen vid spaltning av hemoglobin.

Heme, järn-heme, sammansätts av järn och proto- porfyrin (se exempelvis Textbook of Biochemistry, West & Todd, MacMillan Co. 1961, sid 533), och utgör den pros- tetiska gruppen i hemoglobin, och uppgår till 3,8 vikt-% räknat på hemoglobinet.

Såsom utgångsmaterial användes lämpligen en heme- produkt, som erhålles genom att spalta upp hemoglobin i heme och globin.

Denna uppspaltning kan göras på olika sätt, exempel- vis genom att behandla hemoglobin i sur eller alkalisk miljö.

Râmaterialet kan utgöras av exempelvis helblod, röda blodkroppar, eller hemoglobin i annan miljö.

Ett speciellt lämpligt utgångsmaterial utgör den heme-produkt, som erhålles enligt den metod, som beskrives i det svenska patentet nr 7407882-5 (publ. nr 389596) och i den svenska patentansökan nr 7513987-3.

Enligt denna metod spaltas hemoglobinet upp i en etanol-vatten-lösning med en etanolhalt av minst 40 vol-%, vid pH lägre än 4,5. Den härvid bildade fällningen av heme-produkt avskiljes. Den kvarvarande globinlösningen är så gott som fri på heme.

Denna kända produkt innehåller c:a 10 vikt-% heme, resten utgöres av övrig blodsubstans, troligen till huvud- delen av protein. Vidare ingår troligen blodsubstanser såsom lipoproteiner, lipider, fosfatidylföreningar och' kolesterol i denna heme-produkt.

Enligt det nya förfarandet utvinnes ett heme- koncentrat med en hemehalt av cza 40 vikt-%. Samman- sättningen är ej känd. Detta heme-koncentrat är avsett att användas som läkemedel mot järnbrist och som järn- berikningsmedel i livsmedel. 8002591 '-9 Blodproteinet, huvudsakligen globin, som samtidigt utvinnes, är avsett för livsmedels- och fodermedelsändamâl.

Förfarandet är tekniskt och ekonomiskt realiserbart i fabriksskala.

Kännetecknande för det nya förfarandet är, att nämnda heme-blodsubstans-blandning extraheras med en lägre alkohol eller en blandning av lägre alkoholer, lämpligen etanol i en koncentration av över 40 vol-%, företrädesvis 60-80 vol-%, vilken extraktion sker antingen a) vid ett pH av 8,0 - 10,7, lämpligen 9,0 - 10,5, eller b) i närvaro av ett separeringen av heme-koncentrat och blodsubstans underlättande ämne, i form av imidazol eller derivat därav, vid ett pH av 6,0 - 8,5, lämpligen 6,5 - 8,5, och varvid eventuellt proteinfällning stabiliserande medel tillsättes, t.ex. natrium-, kalium- eller ammonium- klorid, -sulfat, -fosfat, -citrat eller -tartrat, vid en temperatur mellan +25 och -20°C, lämpligen mellan -5 och -20°C, varefter den olösta, fasta blodsubstansen avskiljes, och heme-koncentratet tillvaratages ur den resterande lösningen.

Förfarandet går alltså ut på att nämnda blandning heme och blodsubstans extraheras med en lägre alkohol eller en blandning av lägre alkoholer i alkalisk miljö, eller vid tillsats av imidazol eller derivat därav i neutral miljö. Separeringen låter sig ej genomföras i sur miljö.

Härvid erhålles en heme-produkt, som ej är ett rent heme-pigment, utan en förening av heme och annan blodsubstans. Denna heme-produkt, här kallad heme-kon- centrat, har speciella egenskaper: heme föreligger i nativ form, lösligheten i vatten vid pH 6-7 är god och järn- absorptionen i människa är god. Tidigare kända heme- pigment har inte dessa egenskaper. Ett flytschema av en utföringsform enligt det nya förfarandet har framställts i Figur 1. 8002591 -9 Det är tidigare känt att spalta upp hemoglobin i heme och globin i alkalisk miljö och därvid extrahera hemet, i t.ex. aceton eller metyletylketon och på detta sätt separera det från globinet. Denna extraktion göres i 100 %-ig aceton och ger ett rent heme utan övrig blod- substans. Detta heme har dock visat sig vara polymeriserat och har dålig löslighet (se figur 2).

Genom den svenska patentansökan 76-00020-7 är det känt att framställa ett hemoglobinbaserat järnpreparat genom att koppla järnporfyrin till hemoglobin eller globin vid pH 8-9.

Enligt det nya förfarandet separeras heme-kon- centratet från övrig blodsubstans, huvudsakligen protein sålunda, att heme-koncentrat-delen överföres i löst form, medan övrig substans föreligger i olöst form.

Lämpliga extraktionsmedel är etanol, metanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol, etylenglykol och glycerol. Etanol är att föredraga p.g.a. at det ej är giftigt.

Halten av extraktionsmedlet bör vara över 40 vol-%, företrädesvis över 60 vol-%. pH-värdet bör vid närvaro av imidazol eller derivat därav vara minst 6,0, lämpligen 6,5-8,5, och i annat fall bör pH-värdet vara minst 8,0, lämpligen 9,0-10,5.

I För att förhindra en denaturering av proteinet hålles temperaturen låg, företrädesvis lägre än -SCC.

Temperaturen påverkar ej reaktionen, endast graden av denaturering av proteinet.

För att hindra att blodsubstans ur heme-blodsubstans- blandningen löses samtidigt med heme-koncentratet i ex- traktionslösningen kan blodsubstansen, huvudsakligen globin, utfällas före extraktionen. Utfällningen kan exempelvis göras genom att reglera pH för blandningen till 7-8, iso- elektriska pH-intervallet för globin, och/eller genom tillsats av olika salter. Lämpliga salter är exempelvis Na-, K-, NH4-, -klorid, -sulfat, -citrat, -fosfat, -tartrat. 8002591 -è Salttillsatsen har den sedvanliga utsaltnings- effekten för proteiner, men har ingen speciell inverkan på upplösningen av heme-koncentratet.

Salttillsatsen gör sig främst gällande då ex- traktionen göres på en heme-blandning, som därförinnan ej separerats på globindelen.

Vidare kan tillsättas andra separeringen befräm- jande medel, såsom en aminosyra, t.ex. glycin, glutamin eller lysin.

Glycin har den effekten att den höjer utbytet av heme-koncentrat till c:a 99 %, se ex. 8, då samtidigt övriga betingelser är ideala. Utan glycin-tillsats stannar utbytet på c:a 93-95 %.

Den olösta substansen avskiljes exempelvis genom centrifugering eller filtrering.

Heme-koncentratet fälles ur den resterande lös- ningen, d.v.s. ovanvätskan eller filtratet, genom att sänka pH till under 6,5, lämpligen till 4,0-6,0. Härvid utfaller en svart flockig fällning. Utfällningen blir mera kvan- titativ då pH-värdet är lägre än 5. ge koncentratet en skonsam behandling göres utfällningen lämpligen vid en temperatur under OOC. pH sänkes exempelvis med 0,1 M HCl. Fällningen avskiljes exempelvis genom centrifugering eller filtrering, och tvättas fri på etanol, salter och imidazol med isvatten.

Fällningen löses i vatten genom att höja pH, exempelvis till 8, och lösningen kan frysas och frystorkas.

Utbytet av heme ur extraktionslösningarna uppgår till cza 90. endast delvis denaturerad form, och har därigenom de funktionella egenskmgnza bbehållna. Detta är viktigt i livsmedelssammanhang där man eftersträvar proteiner med ~u 8002591-9 texturerande egenskaper. Speciellt bra blir proteinet då det utvinnes vid pH lägre än c:a 9.

Det vid förfarandet enligt uppfinningen utvunna heme-koncentratet har vanligen en heme-halt av c:a 35-40 %, i speciella fall kan produkter med lägre (15 %) och även högre (upp till 55 %) heme-halt erhållas.

Heme-koncentratet är möjligen en ny kemisk förening bestående av heme och blodsubstans. Sammansättningen på den del som här anges med "blodsubstans" är ej känd. Heme- koncentratet låter sig ej uppdelas i sina komponenter på fysikalisk väg, ex. genom gelfiltrering. Föreningen har tydligen bildats under de förhållanden, som råder då hemet spaltas från hemoglobinet. I etanol-vatten-lösningar med en etanol-halt över 40 vol-% och pH-värden högre än 6,0 frigöres denna förening från övrig blodsubstans, och då lösligheten är god, låter den sig med lätthet separeras från övrig blodsubstans, som ej är löslig under dessa betingelser.

Närvaron av imidazol eller derivat därav under- lättar separareringen av heme-koncentratet från vid- häftande blodsubstans, så att en kvantitativ separering låter sig genomföras redan vid pH-värdet 7.

Heme-koncentratets goda löslighet tyder på att hemet föreligger i nativ form, ej polymeriserat. Förut- sättningarna finns härmed att järnet absorberas ur heme- koncentratet och det då kan användas såsom ett järn- berikningsmedel i livsmedel och såsom ett läkemedel mot järnbrist.

Lösligheten av heme-koncentratet I figur 2 visas lösligheten för heme-koncentrat vid olika pH-värden. Heme-koncentrat 1 är representativt för produkten framställd enligt uppfinningen.

Då koncentatet behandlas med ett proteolytiskt enzym, t.ex. trypsin, spjälkes koncentratet upp i mindre enheter och lösligheten blir något bättre; heme-koncentrat 2 åskådliggör detta. f? i' I. n i 5, f, - 4- 8002591-9 Som jämförelse har inritats löslighetskurvan för hemin (framställt enligt Nishida, Porphyrins och Metallo- porphyrins, Kevin M. Smith, 1975, sidan 809).

Såsom tidigare nämnts är det nödvändigt att heme- preparatet är lösligt vid ett pH-värde, som är lägre eller lika med det pH-värde, 7,5-8,2, som råder i tarmen' där järnbristabsorptionen äger rum.

Järnabsorptionen ur heme-koncentratet Järnabsorptionen bestämdes genom klinisk prövning.

Tio försökspersoner serverades en vattenlösning av heme-koncentrat märkt med isotopen 55Fe. Som jämförelse- substans användes blod märkt med isotopen 59Fe.

Den absorberade järnmängden bestämdes genom radio- aktiv mätning. Resultaten har framställts i tabell I.

Ur resultaten framgår att järnabsorptionen ur heme- koncentratet var ungefär lika stor, ofta t.o.m. något större än ur blod. Detta får tolkas som att heme i heme-koncentratet föreligger i nativ form, vilket ju är förutsättningen för en järnabsorption. 8002591~9 ov.o mm.o ﬂwhmmmnmcumﬁ moøwumwmmum cm >m w ow umumnuownm wﬁmâuon Eom ﬁomuwm Gm hmm ^mEv wmEmE wmnwnuomnm o«.> mo_o mo.o «o.~ wo.F “Emm æ.om «m.o mw.o ~.of o.m “wøHm>Hw®mz m.>m wm.o mm.o æ.øP w.w ww o~wP mß www om E @_°> Nw_o @m_0 m.wP F.Ff mv >_«f om wwf @~ a o~ww mm.o Nm.o m_oP «.m Nw m.w~ mm omv wm E «.Nm ww.o >w.o m.mF m.m~ ww m.v~ mn www wm E o.m> w«_o mw.o >.æ m~w mw m_mP ow fm? mm E m.ww wm.o mm.o w.w o.> æw m~mP mw oßf wm E P.~m w~.o >N.o @_m m.m Nw ~.m~ mm www om M >.~m m«_o F«_o w_w P.w ww ~.«~ mw wwf ßm M æ.om mm_o F«.o >.> m.w mw m_m~ mm mßf mm E N.mN Nw.o w>.o m.NF m.mP ow ~.mP mm NwP mw M »wav »anv lnmoﬁox lnwouox AW mv |mEmm øoﬁm lmëmm woﬂm w©uw> :ox Aæv lcﬂnoﬂm Amxv ^Eov Aumv nwnomnmm Amav ømnma ømuwngomnm Awv coﬁpmäowna »um |oawm »Eﬂ> wmswn umwH< |wEwwumm »mnucw0c0x|mEws Hø Emﬂøﬂumnomnmanmh H Hﬁwnma 8002591 -9 Utföringsexempel Exempel 1 En blandning av 4 ml 96 vol-% etanol och 0,8 ml l M HCl av -8°C temperatur droppades under omrörning och kylning i2,2g blodkroppsblandning av -5°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 3,1 och temperaturen -5°C. 3 ml isvatten och 1,8 ml 0,5D4NaOH i 70 vol-% etanol tillsattes under omrörning och kylning, bland- ningens temperatur var -5OC och pH 7,5. Efter 5 minuter tillsat- tes blandningen 10 ml 96 vol-% etanol, 10 ml 70 vol-% etanol,1 ml 1 M glycin i vattenlösning och 2,2 ml 0,5 M Na0H under omrörning och kylning. Blandningen innehöll nu 67 vol-% etanol, pH var 10,3 och temperaturen -5°C. Blandningen centrifugerades vid 3000 xg i 5 min, varvid erhölls 38 ml röd ovanvätska och en brun- röd pasta. Ovanvätskan innehöll 0,18 mg heme/ml (61,5 % av ut- gångsämnets heme-innehåll). Pastan rördes ut i 10 ml 70 vol-% etanol av -5°C temperatur, pH justerades till 10,3, och bland- ningen centrifugerades som ovan. Ovanvätskan innehöll 0,13 mg he- me/ml (11,7 % av utgângsämnets hemeinnehâll). Pastan behandlades en tredje gång på samma sätt som ovan, varvid erhölls 0,06 mg he- me/ml (5,4 % av utgångsämnets hemeinnehåll). Det totala utbytet heme-koncentrat var 78,6 %. Pastan var brun och vägde som torr 0,27 g (proteinutbyte 79, 5 %). _ Den ovan nämnda blodkroppsblandningen kan erhållas på följande sätt.

Slaktblod med natriumcitrat som antikoagulationsmedel se- parerades genom centrifugering, varvid erhölls plasma och röd blodkroppsgröt. Till blodkroppsgröten sattes natriumklorid och etanol, så att 2,2 g blodkroppsblandning innehöll 0,34g'pnﬁßin, 0,16 g natriumklorid, 0,26 g 100 %-ig etanol och 1,44 g vatten och i blodet förefintliga lösliga substanser. Proteinet, huvud- sakligen hemoglobin, bestämdes genom utfällning med etanol. 2,2 g blodkroppsblandning innehöll 11,1 mg hemin, bestämt enligt pyridin-metoden.

Exempel 2 På samma sätt som i exempel 1 sänktes pH till 3,1 och reg- lerades sedan till 7,5. Blandningen extraherades på samma sätt som i exempel 1 men dessutom med tillsats av 1 ml 2 M imidazol 8002591-9 10 i 70 vol-% etanol. pH reglerades till 8,4. Ovanvätskorna höll 79 %, 12 % respektive 4 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det to- tala utbytet heme-koncentrat var 95 %. Pastan var ljusbrun och representerade 85 % av utgångsämnets proteininnehåll.

Exempel 3 En blandning av 2 ml vatten och 0,7 ml l M HCl av +1°C temperatur droppades under omrörning och kylning i 2,2 g blod- kroppsblandning av -8°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 3,2 och temperaturen -5°C. 4 ml 96 vol-% etanol, 10 ml 70 vol-% etanol, 1 ml l M glycin i vattenlösning, 1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% eta- nol och 1,5 ml 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol tillsattes under om- rörning och kylning, blandningens temperatur var -5°C och pH 8,0, etanolhalten var c:a 56 vol-%. Blandningen centrifugerades efter 5 minuter som i ex. 1 och gav en ovanvätska med 59 % av utgångs- ämnets heme-innehåll och en brun pasta. Pastan extraherades två gånger med 10 ml 70 vol-% etanol var gång vid pH 8,0 och gav ovan- vätskor med 18 % respektive 8 % av utgångsämnets heme-innehåll.

Det tdæda utbytet heme-koncentrat var 85 %. Pastan var brun och representerade 72 % av utgångsämnets proteininnehåll.

Exempel 4 En blandning av 3 ml 96 vol-% etanol och 0,35 ml 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol av -10°C temperatur droppades under omrör- ning och kylning i 2,2 g blodkroppsblandning av -10°C tempera- tur. Efter tillsatsen var pH 10,2 och temperaturen -10°C. 2 ml isvatten, 3 ml 50 vol-% etanol och 0,15 ml l M HCl av -1000 tem- peratur tillsattes. Blandningens pH var 7,5 och temperatur -10OC. 5 ml 96 vol-% etanol, 5 ml 70 vol-% etanol och 2 ml 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol av -10°C tillsattes. Blandningens pH var 10,3, temperaturen -10°C och etanolhalten c:a 64 vol-%. Blandningen centrifugerades efter 5 minuter som i ex. 1 och gav en ovanvätska med 46 % av utgångsämnets heme-innehåll och en mörkbrun pasta. Éastan extraherades två gånger med 10 ml 65 vol-% etanol var gång vid pH 10,3 och -10°C temperatur och gav ovanvätskor med 14 % res- pektive 7 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 67 %. Pastan var brun och representerade 71 % av utgångsämnets proteininnehåll. 8002591-9 11 Exempel 5 På samma sätt som i exempel 4 höjdes pH för blodkropps- blandningen till 10,2, temperaturen hölls på OOC. En blandning av 1,5 ml isvatten, 3 ml 50 vol-% etanol, 1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol och 0,2 ml l M HCl av OOC temperatur tillsattes.

Blandningens pH var 8,2 och temperatur OOC. Härefter tillsattes 5 ml 96 vol-% etanol och 10 ml 70 vol-% etanol av 0°C temperatur.

Blandningens pH var 8,2, temperaturen OOC och etanolhalten 66 vol-%.

Blandningen centrifugerades efter 5 minuter som i exempel 1 och gav en ovanvätska med 52 % av utgångsämnets heme-innehåll och en mörkbrun pasta. Pastan extraherades två gånger med 10 ml 65 vol-% etanol och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol var gång vid pH 8,2 och OOC temperatur och gav ovanvätskor med 28 % respek- tive 12 % av utgângsämnets heme-innehåll. Det totakautbytet heme- koncentrat var 92 %. Pastan var brun och representerade 85 % av utgångsämnets proteininnehåll.

Exempel 6 En blandning av 1 ml vatten och 0,8 ml 0,5 M NaOH av +10OC temperatur droppades under omrörning i 2,2 g blodkroppsblandning av +10°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 11,0 och temperatu- ren +10°C. 4 ml 96 vol-% etanol, 1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol, 1 ml 30 % Na-citrat i vattenlösning och 0,5 ml 1 M HCl tillsattes. Blandningens pH var 7,5 och temperaturen +10°C. Här- efter tillsattes 3 ml 96 vol-% etanol och 10 ml 70 vol-% etanol.

Blandningens pH var 7,5, temperaturen +10°C och etanolhalten c:a 64 vol-%. Blandningen centrifugerades efter 5 minuter som i exem- pel 1 och gav en ovanvätska med 53 % av utgångsämnets heme-inne- håll och en mörkbrun pasta. Pastan extraherades två gånger med 10 ml 65 vol-% etanol och 0,1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol var gång vid pH 7,5 och +10OC temperatur, och gav ovanvätskor med 26 % respektive 13 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det to- tala utbytet heme-koncentrat var 92 %. Pastan var brun och rep- resenterade 74 % av utgångsämnets proteininnehåll.

Exempel 7 En blandning av 5,5 ml 96 vol-% etanol och 1,0 ml 1 M HCl av -1800 temperatur droppades under omrörning och kylning i en blandning av 2,2 g blodkroppsblandning, 0,1 ml l M glycin i vat- aou2s91 -9 12 tenlösning, 0,1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol och 2 ml 50 vol-% etanol av -18°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 3,0 och temperaturen -18°C. 3 ml 40-% ammoniumsulfat i vattenlös- ning tillsattes under omrörning och kylning. Efter 5 minuter tillsattes en blandning av 10 ml 96 vol-% etanol, 20 ml 70 vol-% etanol och 4 ml 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol av -18OC temperatur under omrörning och kylning. Efter tillsatsen var pH 7,5 och tem- peraturen -18°C, etanolhalten var c:a 69 vol-%. Blandningen cent- rifugerades som i Exempel 1. Pastan extraherades 2 gånger med 20 ml 70 vol-% etanol, 0,1 ml l M glycin i vattenlösning och 0,1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol var gång vid pH 7,5 och -1800 tempera- tur. Ovanvätskorna höll 69 %, 14 %,respektive 5 % av utgångsäm- nets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 88 %.

Pastan var ljusbrun och representerade 81 % av utgångsämnets pro- teininnehåll.

Exempel 8 En blandning av 8 ml 96 vol-% etanol och 0,8 ml l M HCl av -5°C temperatur droppades under omrörning och kylning i 2,2 g blodkroppsblandning av -5°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 3,1 och temperaturen -5°C. Tillsattes 0,8 ml 0,2 M Na0H i 50 vol-% etanol och 10 ml 50 vol-% etanol, pH var 3,5 och temperaturen -5°C.

Blandningen centrifugerades vid 9000 x g i 5 minuter varvid er- hölls en gul ovanvätska och en svart pasta. Ur ovanvätskan fäll- des efter tillsats av 8 ml vatten vid pH 7,5 en grå proteinfäll- ning med torrsubstansen 0,21 g. Den svarta heme-pastan rördes ut i en blandning av 30 ml 70 vol-% etanol, 0,5 ml l M glycin i vat- tenlösning, 0,5 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol och 2,5 ml 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. pH var 8,6, temperaturen -5°C och etanolhalten c:a 70 vol-%. Blandningen centrifugerades vid 3000 x g i 5 minuter och gav en ovanvätska med 72 % av utgångsämnets he- me-innehåll och en brun pasta. Pastan extraherades två gånger med 30 ml 70 vol-% etanol och 0,1 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol var gång vid pH 8,6 och -5°C temperatur och gav ovanväts- kor med 19 % respektive 8 % av utgângsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 99 %. Pastan var gråbrun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %. 8002591-9 13 Exempel 9 a) På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme-pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rör- des ut i 30 ml 50 vol-% etanol, pH justerades till 8,5 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol, temperaturen var -1OC, etanolhalten c:a 50 vol-%. Blandningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 33 % av utgångsämnets heme-innehåll och en mörk- brun pasta. Pastan extraherades 3 gånger med 30nü 50\mﬂ-% eUmxﬂ.vid pH 9,0 och temperaturen -1°C var gång och gav ovanvätskor med 24 %, 13 % respektive 9 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 79 %. Pastan var brun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %. b) På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme-pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i 30 ml 40 vol-% etanol, pH justerades till 10,7 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol, temperatur var -4°C, etanolhalten c:a 40 vol-%. Blandningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 71 % av utgångsämnets heme-innehåll och en brun pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 30 ml 40 vol-% etanol vid pH 10,7 och temperaturen -4°C var gång och gav ovanvätskor med 7,2, respektive, 4,8 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 83 %. Pastan var ljusbrun och vägde som torr 0,08 g. Det totala proteinutbytet var 85 %.

Exempel 10 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 20 ml 60 vol-% etanol, 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol och 1 ml 40 vﬂuæ% ammoniumsulfat i vattenlös- ning. pH justerades till 6,8 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol.

Temperaturen var +25°C, etanolhalten c:a 60 vol-9. Blandningen \0 centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 63 0 av utgångsämnets heme-innehåll och en brunröd pasta. Pastan extra- herades 2 gånger med 60 vol-% etanol, imidazol och ammoniumsulfat i mängder som ovan vid pH 6,8 och +25°C temperatur var gång och gav ovanvätskor med 14 % respektive 8 % av utgångsämnets heme- innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 85 %. Pastan var brun och vägde som torr 0,07 g. Det totala proteinutbytet var 83 %. 8002591-9 14 Exempel'11 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 30 ml 96 vol-% etanol och 0,2 ml l M glycin i vattenlösning. pH justerades till 10,4 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -20°C, etanolhalten c:a 90 vol-%. Bland- ningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 61 % av utgångsämnets heme-innehåll och en mörkbrun pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 90 vol-% etanol och glycin i mängder .som ovan vid pH 10,4 och -20°C temperatur, var gång och gav ovan- vätskor med 20 % respektive 9 % av utgångsämnets heme-innehåll.

Det totala utbytet heme-koncentrat var 90 %. Pastan var ljusbrun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

Exempel 12 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 30 ml 40 vol-% etanol och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol. pH justerades till 7,0 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -5°C, etanolhalten c:a 42 vol-%.

Blandningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 58 % av utgångsämnets heme-innehåll och en mörkröd pasta.

Pastan extraherades 2 gånger med 70 vol-% etanol och imidazol i mängder som ovan vid pH 7 och temperaturen -5°C var gång och gav ovanvätskor med 26 % respektive 5 % av utgångsämnets heme-inne- håll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 89 %. Pastan var ljus- brun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

Exempel 13 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 20 ml 70 vol-% metanol och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol. pH justerades till 8,5 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -5°C, metanolhalten c:a 60 vol-%. Bland- ningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 67 % av utgângsämnets heme-innehåll och en brunröd pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 70 vol-% metanol och imidazol i mängder som ovan vid pH 8,5 och temperaturen -50 var gång och gav ovan- 8002591-9 15 vätskor med 18 % respektive 7 % av utgångsämnets heme-innehåll.

Det totala utbytet heme-koncentrat var 92 %. Pastan var ljusbrun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

Exempel 14 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 20 ml 70 vol-% propanol och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol. pH justerades till 8,0 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -5°C, propanolhalten c:a 60 vol-%. Bland- ningen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 66 % av utgångsämnets heme-innehåll och en brunröd pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 70 vol-% propanol och imidazol i mäng- der som ovan vid pH 8,0 och temperaturen -5oC var gång och gav ovanvätskor med 16 % respektive 9 % av utgångsämnets heme-innehåll.

Det totala utbytet heme~koncentrat var 91 %. Pastan var ljusbrun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

Exempel 15 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 20 ml 70 vol-% iso-propanol, 0,2 ml l M glycin i vattenlösning och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol. pH jus- terades till 7,5 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -10°C, iso-propanolhalten cza 60 vol-%. Blandningen centrifu- gerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 69 % av utgångs- ämnets heme-innehåll och en brunröd pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 70 vol-% iso-propanol, glycin och imidazol i mängder som ovan vid pH 7,5 och temperaturen -10°C var gång och gav ovan- vätskor med 17 % respektive 9 % av utgångsämnets heme-innehåll.

Det totala utbytet heme-koncentrat var 95 %. Pastan var ljusbrun och vägde som torr 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

Exempel 16 På samma sätt som i exempel 8 avskiljdes den svarta heme- pastan utgående från 2,2 g blodkroppsblandning. Pastan rördes ut i en blandning av 20 ml 70 vol-% etanol, 7 ml 70 vol-% glycerin och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol. pH justerades till 8,0 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -5OC, eta- nolhalten cza 52 vol-% och glycerinhalten c:a 17 vol-%. Blandnin- 80025914 r 16 gen centrifugerades som i exempel 8 och gav en ovanvätska med 64 % av utgångsämnets heme-innehåll och en brunröd pasta. Pastan extraherades 2 gånger med 70 vol-% etanol, 70 vol-% glycerin och imidazol i mängder som ovan vid pH 8,0 och temperaturen -SOC var gång och gav ovanvätskor med 14 % respektive 7 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme-koncentrat var 85 %. Pastan var brun och vägde som torr efter tvättning med vatten 0,1 g. Det totala proteinutbytet var 91 %.

På samma sätt som ovan gjordes extraktion med 70 vol-% ety- lenglykol i stället för glycerin. Resultatet var detsamma som ovan.

Exempel 17 En blandning av 6 ml 96 vol-% etanol och 1 ml 1 M HCl av -8°C temperatur droppades under omrörning och kylning i 2,7 g hel- blod av +0,5°C temperatur. Efter tillsatsen var pH 3,0 och tempe- raturen -5°C. Härefter tillsattes 2 ml 40 % ammoniumsulfat i vat- tenlösning, och en blandning av 20 ml 70 vol-% etanol, 0,2 ml l M glycin i vattenlösning och 0,2 ml 2 M imidazol i 70 vol-% etanol av -8°C temperatur under omrörning och kylning. pH justerades till 8,0 med 0,5 M NaOH i 70 vol-% etanol. Temperaturen var -8°C och etanolhalten c:a 65 vol-%. Blandningen centrifugerades som i exem- pel 8 och gav en ovanvätska med 66 % av utgångsämnets heme-inne- håll och en brunröd pasta. Pastan extraherades Zgàtæm med 70 vol-% etanol, ammoniumsulfat och imidazol i mängder som ovan vid pH 8,0 och -8°C temperatur var gång och gav ovanvätskor med 16 % respek- tive 7 % av utgångsämnets heme-innehåll. Det totala utbytet heme- koncentrat var 89 %. Pastan var gråbrun efter tvättning med 50vol-% etanol och representerade 85 % av den totala proteinhalten.

Exempel 18 _ Extraktion av heme-pasta utgående från 22 g blodkroppsblæxk ning gav vid pH 10,4, -5°C temperatur och 70 vol-% etærﬂ extrak- tionslösning 1 på 199 ml med heme-halten 0,38 mg heme per ml rep- resenterande 68,1 % av utgângsämnets heme-innehåll, extraktions- lösning 2 med motsvarande data 121 ml, 0,17mg heme/ml, 18,6 Q och extraktionslösning 3 med 118 ml, 0,08 mg heme/ml, 8,5 %. \0 Extraktionslösningarna förenades och surgynﬁes till DH 5,1 med 87 ml 0,1 M HCl, temperatur var -5OC. Den härvid bildade svarta flockiga fällningen avskiljdes i centrifug vid 3000 x g och vägde 8002591 *9 17 4,5 g. Pastan tvättades 3 gånger i 15 ml isvatten var gång, sus- penderades i 15 ml isvatten, pH justerades till 8,2 med 3 ml 0,2 M NaOH, frystes ned och frystorkades. Härvid erhölls 265 mg svart pulver med heme-halten 36 %. Det totala utbytet heme-koncentrat var 86 %. Analys: C 46,17 %, H 5,30 %, Cl 10,53 %, P 2,8 %, Fe 3,57 %, N 9,6 %, K 3,5 % och Na 4,1 %.

Exemgel 19 Extraktion av heme-pasta utgående från 50 g blodkroppsblandning gav vid pH 8,2, +1°C temperatur och ned 60 vol-% etanol och 4 nd 2 M imidazol i 70 vol-% eta nol och extraktionslösning 1 på 494 nd ned heme-halten 0,32 nglzeme per ml representerande 62,8 % av utgångsämnets heme-innehåll, extrak- tionslösning 2 med motsvarande data 467 ml, 0,11 mg/heme/ml, 20,4 % och extraktionslösning 3 med 479 ml, 0,06 mg heme/ml, 11,4 %. Extraktionslösningarna förenades och surgjordes till pH 4,0 med 240 ml 0,1 M HCl, temperaturaavar-H°C. Fällningen avskilj- des som ovan och vägde 8,5 g. Pastan tvättades 3 gånger i 25 ml isvatten var gång, suspenderades i 25 ml isvatten, pH justerades till 8,5, frystes ned och frystorkades. Härvid erhölls 510 mg svart pulver med heme-halten 42 %. Det totala utbytet heme-koncen- trat var 85 %.

Exemgel 20 På samma sätt som i exempel 18 extraherades lösningarna 1, 2 och 3. Lösning 3 surgjordes separat till pH 5,1 och gav en mindre mängd fällning, som efter frystorkning gav heme-koncentrat med heme-halten 17,7 %. Analys: C 29,43 %, H 3,52 %, Cl 23,77 %, P 1,2 %, Fe 2,28 %, N 8,8 %, K 13,4 % och Na 15,7 %.

Exempel 21 På samma sätt som i exempel 19 extraherades lösning 1.

Lösning 1 surgjordes separat till pH 4,0 och gav en svart fäll- ning, som avskiljdes, tvättades och frystorkades på likadant sätt som i exempel 19. Heme-koncentratet som sålunda erhölls höll en heme-halt på 55 %.

Claims

-8002591-9 18 Patentkrav:

1. Förfarande för framställning av ett heme- koncentrat ur en blandning av heme och blodsubstans erhållen - vid spaltning av hemoglobin, k ä n n e t e c k n a t därav, att nämnda heme~blodsubstans-blandning extraheras med en 1 lägre alkohol eller en blandning av lägre alkoholer, lämp- ligen etanol i en koncentration av över 40 vol-%, före- trädesvis 60-80 vol-%, vilken extraktion sker antingen a) vid ett pH av 8,0 - 10,7, lämpligen 9,0 - 10,5, eller b) i närvaro av ett separeringen av heme-koncentrat och blodsubstans underlättande ämne, i form av imidazol eller derivat därav, vid ett pH av 6,0 - 8,5, lämpligen 6,5 - 8,5, ' och varvid eventuellt tillsättes proteinfällning stabiliserande medel, t.ex. natrium-, kalium- eller ammonium- klorid, -sulfat, -fosfat, -citrat eller -äntrat, vid en temperatur mellan +25° och -20°C, lämpligen mellan -5 och -20°C, varefter den olösta, fasta blodsubstansen avskiljes, och heme-koncentratet tillvaratages ur den resterande lösningen.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t därav, att heme-blodsubstans-blandningen är en heme-pasta erhâllen genom spaltning av hemoglobin- substans och avskiljning av globinlösningen på i och för sig känt sätt.

3. Förfarande enligt patentkraven 1-2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att såsom separeringen underlättande medel dessutom.tillsättes aminosyror, lämpligen glycin, glutamin eller lysin.

4. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t därav, att pH i nämnda blandning för ut- fällning av blodsubstans först regleras till 7 - 8, eller, i fall att ett separeringen underlättande ämne användes, till 6,5 - 8, och därefter tillsätts en lägre alkohol, lämp- ligen etanol, och pH höjes, och/eller separeringen 8002591 -9 19 av heme-koncentrat och blodsubstans underlättande ämne tillsättes. '

5. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t därav, att nämnda blandning först tillsättes ett eller flera salter, såsom natrium-, kalium- eller ammoniumklorid, -sulfat, -fosfat, -citrat eller -tartrat, varefter en lägre alkohol lämpligen etanol tillsättes och pH regleras till över 6,0 eller, i fall att separering underlättande medel ej tillsättes, till över 8,0.

6. Förfarande enligt patentkraven 1-5, k ä n n e - t e c k n a t därav, att den lägre alkoholen är etanol, metanol, etylenglykol, glycerol, propanol, isopropanol, butanol eller isobutanol, eller en blandning av dessa.