FI65369C - Foerfarande foer framstaellning av heme-koncentrat - Google Patents

Description

65369

Menetelmä herne-tiivisteen valmistamiseksi

Teurasveri sisältää arvokkaita aineosia, nimittäin proteiinia, jolla on suuri ravintoarvo ja toiminnallisia 5 ominaisuuksia, jotka tekevät siitä käyttökelpoisen elintarvikkeiden teksturointiaineena, ja lisäksi hemeä, joka on tavoiteltu rautapitoisuutta lisäävä aine.

Hemoglobiini, joka sisältää pääosan veren proteiinista, maistuu raudalta hemen takia. Sen tähden on tärkeää 10 kehittää menetelmä hemoglobiinin lohkomiseksi raudattomaksi glöbiiniksi ja herne-tiivisteeksi, ja sellaisella tavalla, että proteiinin ja hemen toiminnalliset ominaisuudet säilyvät antaen näille tuotteille suuren arvon.

Kuten tiedetään, proteiini denaturoituu helposti 15 ja kadottaa tällöin toiminnalliset ominaisuutensa, esimerkiksi kun sitä käsitellään suuressa pH:ssa (yli 9 - 10). Denaturointia vastaan voidaan vaikuttaa toimimalla alhaises- i I o sa lämpötilassa, alle 0 C.

Jotta herne olisi käyttökelpoinen lääkeaineena, ts.

20 jotta rauta esiintyisi helposti imeytyvässä muodossa, hemen on oltava luonnollisessa muodossa. Hemoglobiinissa herne esiintyy luonnollisessa muodossa, josta rauta tunnetusti helposti imeytyy.

Tavanomaisista rautavalmisteista, kuten rautasulfaa-25 tista, imeytyy vain murto-osa raudasta, koska tietyt ruoassa esiintyvät aineet (esim. fytaatit) estävät imeytymistä.

Tätä haittaa ei esiinny herneen perustuvassa raudassa.

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä herne-tiivisteen valmistamiseksi hemoglobiinin lohkaisussa saadun hemen 30 ja veriaineen seoksesta.

Ennestään on tunnettua lohkoa hemoglobiini hemeksi ja glöbiiniksi happamassa ympäristössä uuttamalla herne esimerkiksi asetonissa tai metyylietyyliketonissa sen erottamiseksi tällä tavoin globiinista (J. Gen. Physiol., 1930, 35 13, 469, ja austraalialainen patentti 77155/75). Tämä uutto > 2 65369 suoritetaan 100-%:isella asetonilla, niin että saadaan puhdas herne ilman muuta verlainetta. Tämän hemen on kuitenkin todettu polymeroituvan ja sillä on huono liukoisuus (ks. kuvio 2).

5 Ruotsalaisesta patenttijulkaisusta 76-00020-7 on tunnettua valmistaa hemoglobiinipohjäinen rautavalmiste kytkemällä rautaporfyriini hemoglobiiniin tai globiiniin pH:ssa 8-9.

Julkaisusta J. Biochem. 4, n:o 21, 1973, ss. 259 10 - 267, on tunnettua lohkaista herne hemoglobiinista pelkistä vässä systeemissä, ilman happoa. Herne uutetaan asetonilla.

On myös mainittu, että herne voidaan uuttaa suoraan hemoglobiinista, mikäli läsnä on imidatsolia.

Saksalaisesta patenttijulkaisusta 2 526 596 on tun-15 nettua uuttaa herne hemoglobiinia denaturoimalla saadusta, hemeä ja proteiinia sisältävästä seoksesta alkoholilla, , kuten etanolilla tai metanolilla, joita käytetään suurta ylimäärää, pH:ssa noin 3.

Saksalaisesta patenttijulkaisusta 2 656 157 on 20 tunnettua lohkaista hemoglobiini etanolin läsnäollessa hap-pamissa olosuhteissa, jolloin saostuu proteiinipitoinen heme-tuote.

Julkaisusta J. Histochemistry and Cytochemistry, 22, nso 9, 1974, ss. 908 - 911, on tunnettua lohkaista he-25 moglobiini metanolilla tai etanolilla ja uuttaa herne suurilla määrillä metanolia tai etanolia pH:ssa noin 7.

Herne, rauta-herne, muodostuu raudasta ja protopor-fyriinistä (ks. esimerkiksi Textbook of Biochemistry, West ft Todd, MacMillan Co., 1961, s. 533) ja muodostaa hemoglo-30 biinin prosteettisen ryhmän; sen määrä on 3,8 paino-% laskettuna hemoglobiinista.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että mainittua hemen ja veriaineen seosta käsitellään alemmalla alkoholilla tai alkoholien seoksella, edullisesti 35 etanolilla, jonka pitoisuus on yli 40 tilavuus-%, edulli- 3 65369 sesti 60...80 tilavuus-%, jolloin mainittu käsittely tapahtuu joko a) pH:ssa 8,0 - noin 10,7, edullisesti 9,0...10,7, tai 5 b) heme-tiivisteen erotusta edistävän aineen, edul lisesti imidatsolin, läsnäollessa pH:ssa 6,0 - noin 8,5, edullisesti 6,5...8,5, ja jolloin mahdollisesti lisätään proteiinisaostu-roaa stabiloivia aineita, esimerkiksi natrium-, kalium- tai 10 aromoniumkloridia, -sulfaattia tai -sitraattia, lämpötilassa noin +25°C...-20°C, edullisesti -5°C...-20°C:ssa, minkä jälkeen kiinteä veriaine erotetaan, ja herne-tiiviste otetaan talteen jäljellä olevasta liuoksesta.

Lähtöaineena käytetään edullisesti hemen ja veriai-15 neen seosta, joka on saatu lohkomalla hemoglobiini hemeksi ja globiiniksi, eli nk. herne-tahnaa.

Hemoglobiinin lohkominen voidaan suorittaa eri ta- voin, esimerkiksi käsittelemällä hemoglobiinia happamessa ympäristössä.

20 Lähtöaineena voi myös olla täysveri, punaiset veri solut tai hemoglobiini toisessa ympäristössä.

Erityisen edullinen lähtöaine on hemetuote, joka saadaan ruotsalaisessa patentissa 7407882-5 ja ruotsalaisessa patenttihakemuksessa 7513987-3 kuvatun menetelmän mukai-25 sesti. Tämän menetelmän mukaisesti hemoglobiini lohkotaan etanoli-vesiseoksella, jonka etanolipitoisuus on ainakin 40 tilavuus-%, pH:ssa alle 4,5. Tällöin muodostunut hemetuot-teen sakka erotetaan. Jäljellä oleva globiiniliuos on käytännöllisesti katsoen vapaa hemestä.

30 Tämä tunnettu hemetuote sisältää noin 10 paino-% hemeä loppuosan ollessa muuta veriainetta, joka on liukenemattomassa muodossa näiden prosessiolosuhteiden vallitessa. Veriaineen pääosa on proteiinia (globiinia), mutta lisäksi se saattaa sisältää lipoproteiineja, lipidejä, fosfatidyyli-35 yhdisteitä ja kolesterolia.

65369

Uuden menetelmän mukaisesti saadaan heme-tiiviste, jonka hemepitoisuus on noin 40 paino-%. Koostumusta ei tunneta. Tämä heme-tiiviste on tarkoitettu käytettäväksi lääkeaineena anemiaa vastaan ja elintarvikkeiden rautapitoi-5 suutta lisäävänä aineena.

Uusi menetelmä on teknisesti ja taloudellisesti toteutettavissa teollisessa mittakaavassa.

Uuden menetelmän mukaisesti heme-tiiviste erotetaan muusta verlaineesta, ts. pääasiassa proteiinista, muutta-10 maila heme-tiiviste liuenneeseen muotoon muun aineen ollessa läsnä liukenemattomassa muodossa.

Sopivia uuttoaineita ovat etanoli, metanoli, propa-noli, isopropanoli, etyleeniglykoli ja glyseroli. Etanoli on edullisin, koska se ei ole myrkyllistä.

15 Uuttoainepitoisuuden on oltava yli 40 paino-%, edullisesti yli 60 paino-%.

pH-arvon on imidatsolin läsnäollessa oltava ainakin 1,1 6,0, edullisesti 6,5...8,5. Muuten pH-arvon on oltava aina kin 8,0, edullisesti 9,0...10,5.

20 Proteiinin denaturoinnin estämiseksi lämpötila pi detään alhaisena, edullisesti alle -5°C.

Lämpötila ei vaikuta reaktioon, ainoastaan proteiinin denaturointiasteeseen.

Jotta estettäisiin veriaineen liukeneminen heme-25 veriaineseoksesta samanaikaisesti heme-tiivisteen kanssa uuttoliuoksessa, veriaine, pääasiassa globiini, voidaan saostaa ennen uuttoa. Saostus voidaan suorittaa esimerkiksi säätämällä seoksen pH arvoon 7-8, joka on globiinin isoelektrinen pH-alue ja/tai lisäämällä erilaisia suoloja. 30 Sopivia suoloja ovat esim. Na-, K-, NH^-, -kloridi, -sulfaatti tai -sitraatti.

Suolan lisäyksellä on tavanomainen ulossuolausvai-kutus proteiineihin, mutta sillä ei ole mitään erityistä vaikutusta heme-tiivisteen liukenemiseen.

5 65369

Suolan lisäys tulee ensisijaisesti kysymykseen, kun uutto suoritetaan herneseokselle, josta globiiniosaa ei ole sitä ennen erotettu.

Lisäksi voidaan lisätä muita herne-tiivisteen ero-5 tusta edistäviä aineita, kuten aminohappoa, esim. glysiiniä.

Glysiinin avulla voidaan suurentaa heme-tiivisteen saantoa noin 99 %:iin, ks. esimerkki 8, kun muut olosuhteet samalla ovat ihanteelliset. Ilman glysiinilisäystä saanto jää noin 93 - 95 %:iin.

10 Liukenematon aine erotetaan esimerkiksi linkoamal la tai suodattamalla.

Herne-tiiviste saostetaan jäljellä olevasta liuoksesta, ts. päällisnesteestä tai suodoksesta, alentamalla pH arvoon alle 6,5, edullisesti arvoon 4,0...6,0. Tällöin 15 muodostuu musta höytäleinen sakka. Saostus on kvantitatii-visempi, kun pH-arvo on alle 5.

1,1 Saostus on melko riippumaton lämpötilasta, mutta jotta saataisiin kvantitatiivisempi saostuminen ja jotta tiivistettä käsiteltäisiin varovasti, saostus suoritetaan 20 edullisesti lämpötilassa alle 0°C.

pH alennetaan esimerkiksi käyttäen 0,1-m HCl. Sakka erotetaan esimerkiksi linkoamalla tai suodattamalla ja pestään vapaaksi etanolista, suolasta ja imidatsolista jää-vedellä.

25 Sakka liuotetaan veteen nostamalla pH esimerkiksi arvoon 8, ja liuos voidaan pakastaa ja pakastekuivata.

Hemen saanto uuttoliuoksesta on noin 90 %.

Koska heme-tiivisteen erotus voidaan suorittaa 30 pHsssa alle 10,5 ja lämpötilassa alle 0°C, proteiini saadaan talteen denaturoimattomana tai vain osaksi denaturoituna, jolloin sen toiminnalliset ominaisuudet säilyvät. Elintarvikkeiden yhteydessä on tärkeä pyrkiä proteiineihin, joilla on teksturoivia ominaisuuksia. Proteiini on erityi-35 sen hyvää, kun se otetaan talteen pH:ssa alle noin 9.

6 65369

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadun herne-tiivisteen hemepitoisuus on tavallisesti noin 35 - 40 *; erikoistapauksissa voidaan saada tuotteita, joilla on pienempi (15 %) ja myös suurempi (aina 55 %:iin asti) hemepitoisuus.

5 Herne-tiiviste on ilmeisesti uusi kemiallinen yhdiste, eli hemen ja veriaineen, todennäköisesti globiinin, adduk-ti. Tässä "veriaineena" esitetyn osan koostumus ei ole tunnettu. Herne-tiivistettä ei voida fysikaalisesti jakaa kom-ponentteihinsä, esim. geelisuodatuksella. Ilmeisesti adduk-10 ti muodostuu olosuhteissa, jotka vallitsevat, kun herne lohkaistaan hemoglobiinista. Etanoli-vesiliuoksessa, jonka eta-nolipitoisuus on yli 40 tilavuus-% ja pH-arvo yli 6,0, tämä yhdiste vapautetaan muusta veriaineesta. Koska liukoisuus on hyvä, se on helposti erotettavissa muusta veriaineesta, 15 joka ei liukene näissä olosuhteissa.

Imidatsolin läsnäolo helpottaa heme-tiivisteen erotusta siihen tarttuvasta veriaineesta niin, että kvantita- 1,1 tiivinen erotus voidaan suorittaa jo pH-arvossa 7.

Heme-tiivisteen hyvä liukoisuus osoittaa, että herne 20 on läsnä luonnollisessa muodossa, ei polymeroituneena. Sen tähden rauta voi imeytyä herne-tiivisteestä, ja sitä voidaan tällöin käyttää elintarvikkeiden rautapitoisuutta lisäävänä aineena ja lääkeaineena anemiaa vastaan.

Heme-tiivisteen liukoisuus 25 Kuvio 2 esittää heme-tiivisteen liukoisuutta eri pH-arvoissa. Herne-tiiviste 1 edustaa keksinnön mukaisesti valmistettua tuotetta.

Kun tiivistettä käsitellään proteolyyttisellä entsyymillä, esim. trypsiinillä, tiiviste lohkotaan pienemmiksi 30 yksiköiksi ja liukoisuus paranee hieman; heme-tiiviste 2 valaisee tätä.

7 6 5 3 6 9

Vertailun vuoksi on piirretty hemiinin (valmistettu Nishida, Porphyrins and Metallorphyrins, Kevin M. Smith,1975 sivu 809 mukaan) liukoisuuskäyrä.

Kuten edellä mainittiin, hemevalmisteen on oltava 5 liukoinen pH-arvossa, joka on pienempi tai yhtä suuri kuin pH-arvo, 7,5 - 8,2, joka vallitsee suolessa, jossa raudan imeytyminen tapahtuu.

Raudan imeytyminen herne-tiivisteestä

Raudan imeytyminen määritettiin kliinisten kokeiden 10 avulla.

55

Kymmenelle koehenkilölle annettiin isotoopilla Fe ' merkityn herne-tiivisteen vesiliuosta. Vertailuaineena käy- 59 tettiin isotoopilla Fe merkittyä verta.

Imeytynyt rautamäärä määritettiin radioaktiivisella 15 mittauksella. Tulokset on esitetty taulukossa I.

Tulokset osoittavat, että raudan imeytyminen herne-tiivisteestä oli suunnilleen samaa suuruusluokkaa, usein jopa hieman suurempi kuin verestä. Tämä voidaan tulkita si- • Ί £ ten, että herne-tiiviste esiintyy luonnollisessa muodossa, 1 mikä on raudan imeytymisen edellytys.

8 65369 o

NtOhHfflO^O^OCO OO rr rOO<N<NVO<*1<NOOOf^ OP» λ «ΝΓηππττΓ^σ^νοΡ'ίο m O'

S

ad i M ·Η ad -H iNmmoo^vooinN'T r-t m o 3ti P 0) voro^fNmTrioinoom in o rr e 2 p - - -......- -- SM oooooooooo o o o

•P « H

>1 K > c >1

P

>ι·Η oOt-H-Hr-'inmr-' iNiom m ui in 0) P p-rr-^mm^rvominm tt o m ^£0) ............

™ H > OOOOOOOOOO o o o

M

e» Λ I

Q) ^ ^ ti w ή ΓθΓ^ιονοοοΓ^ιησ»ηοο ho

Μ ·ΡΦ V

•H c d> P njr^coirtvooonoiDO oh

^ 0) £2 CO H H rf H «H i—I

-j c δ -h n -s = > I £, S P Ή infnrHnomroTTiHio o o B ^ (4 •.«.H*.!»»»»»*. , v 5J 0)0) inoooomr'OonvcrHio σι h

H >C 6 > ·-( H H

„ H

O ^ .* 0) P —* omTrnjooCTNconjinxa· «,i 3 H O <*> ΤΤΤΓΤΓ·^Τ'ΤΤΤ'3·^3··>Τ'<3· H» a - 3 >i « ti · - fri £ O j* S H | ΓΜΟΟΓΜΙΝΡΙιοσιΗΓ^Ο

H Ö1 *H

^ Q £ P ΓοηττΓπιΠίη^Γ^Γ^τ^*

. C Ή p H »H rH rH H H H H *-—I H

S <d h b rd a Λ Ό o

(ti o * «J

O» C "Z, ιησ\β\οο'σιθνονοοΗ J2» H ιηνο-νιηιοοορ-οοσ'Γ-' jy

£, w «0 <#» M

Ä o O

M O ^ £ p Λ *v c OS cNcn^rinoHfno^vo r*"n.2 PO lor-'ioior-cococooor- Ä X ^ *H rH r-H rH »H »H Γ-H fH rH rH rH ^ _ H O (ti

Id M Ui E

H C Λ S

M JS * O

O ΐΟΗΡ-ΟνΟΗχΤ^-'ΰ© ·^ . u

Ä 3 «NromrofomrMfnfMm adPC

ίί Z.· p ra di M 3d h <u

30 H P

c S ra ra

in m ·· (ti *H

SS O P B S

H H > >1 P H

^ rt P C O <ti •2 S cscceessee «j *e> S<T -H P (ti

S B Ai ·· >1 Id P

•Sm ra 2 d> X O

2 2 d) W S O (ti

j2 g a W H -n P

65369

Esimerkki 1

Seosta, jossa oli 4 ml 96 tilavuus-% etanolia ja 0,8 ml 1 M HCl lämpötilassa -8°C, lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen 2,2 g:aan verisoluseosta lämpöti-5 lassa -5°C. Lisäyksen jälkeen pH-arvo oli 3,1 ja lämpötila -5°C. 3 ml jäävettä ja 1,8 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa lisättiin sekoittaen ja jäähdyttäen; seoksen lämpötila oli -5°C ja pH 7,5. Viiden minuutin kuluttua seokseen lisättiin sekoittaen ja jäähdyttäen 10 ml 96-tilavuus-% 10 etanolia, 10 ml 70-tilavuus-% etanolia, 1 ml 1 M glysiiniä vesiliuoksessa ja 2,2 ml 0,5 M NaOH. Seos sisälsi nyt 67—tilavuus-% etanolia, pH oli 10,3 ja lämpötila -5°C. Seosta lingottiin, 3 000 x 5, viisi minuuttia, jolloin saatiin 38 ml punaista päällisnestettä ja ruskeanpunaista tahnaa.

15 Päällisneste sisälsi 0,18 mg hemeä/ml (61,5 % lähtöaineen hemesisällöstä). Tahna sekoitettiin 10 ml:aan 70 tilavuus-% etanolia lämpötilassa -5°C, pH säädettiin arvoon 10,3 ja " 1 seosta lingottiin kuten edellä. Päällisneste sisälsi 0,13 g hemeä/ml (11,7 % lähtöaineen hemepitoisuudesta). Tahnaa 20 käsiteltiin kolmannen kerran samalla tavoin kuin yllä, jolloin saatiin 0,06 mg hemeä/ml (5,4 % lähtöaineen hemepitoisuudesta) . Heme-tiivisteen kokonaissaanto oli 78,6 %.

Tahna oli ruskeaa ja painoa kuivana 0,27 g (proteiinisaan-to 79,5 %) .

25 Yllä mainittu verisoluseos voidaan saada seuraavalla tavalla.

Teurasverta erotettiin linkoamalla käyttäen natrium-sitraattia koaguloitumisen estoaineena, jolloin saatiin plasmaa ja punaista verisolupuuroa. Natriumkloridia ja 30 etanolia lisättiin verisolupuuroon, niin että 2,2 g verisoluseosta sisälsi 0,34 g proteiinia, 0,16 g natriumkloridia, 0,26 g 100-%:ista etanolia ja 1,44 g vettä ja veressä olevia liukoisia aineita. Proteiini, pääasiassa hemoglobiinia, määritettiin etanolilla saostamalla. 2,2 g verisolu-35 seosta sisälsi 11,1 mg hemiiniä, määritettynä pyridiinime-netelmän mukaisesti.

10 65369

Esimerkki 2

Samalla tavoin kuin esimerkissä 1, alennettiin pH arvoon 3,1 ja säädettiin sen jälkeen arvoon 7,5. Seos uutettiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta lisäksi 5 lisäämällä 1 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa. pH säädettiin arvoon 8,4. Päälllsnesteet sisälsivät 79 %, 12 % ja vastaavasti 4 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 95 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja edusti 85 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta. 10 Esimerkki 3

Seosta, jossa oli 2 ml vettä ja 0,7 ml 1 M HC1 lämpötilassa 1°C, lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen 2,2 g:aan verisoluseosta lämpötilassa -8°C. Lisäyksen jälkeen pH oli 3,2 ja lämpötila - 5°C. 4 ml 96-tilavuus-%

15 etanolia, 10 ml 70-tilavuus-% etanolia, 1 ml 1 M glysiiniä vesiliuoksessa, 1 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa ja 1,5 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa lisät-·. i tiin sekoittaen ja jäähdyttäen; seoksen lämpötila oli -5°C

ja pH 8,0, etanolipitoisuus oli n. 56 tilavuus-%. Seos lin-20 gottiin viiden minuutin kuluttua, kuten esimerkissä 1 ja antoi tulokseksi päällisnesteen, joka sisälsi 59 % lähtöaineen hemepitoisuudesta ja ruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 10 ml:11a 70-tilavuus-% etanolia, kummallakin kerralla pH:ssa 8,0 ja antoi päällisnesteitä, jotka sisälsi-25 vät 18 % ja vastaavasti 8 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 85 %. Tahna oli ruskeaa ja edusti 72 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta.

Esimerkki 4

Seosta, jossa oli 3 ml 96-tilavuus-% etanolia ja 30 0,35 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa lämpötilassa -10°C, lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen 2,2 g:aan verisoluseosta lämpötilassa -10°C.

Lisäyksen jälkeen pH oli 10,2 ja lämpötila -10°C. Seosta, jossa oli 2 ml jäävettä, 3 ml 50-tilavuus-% etano-35 lia ja 0,15 ml 1 M HC1, lämpötilassa -10°C lisättiin. Seoksen pH oli nyt 7,5 ja lämpötila -10°C. Seosta, jossa oli 5 ml 96-tilavuus-% etanolia, 5 ml 70-tilavuus-% etanolia 11 65369 ja 2 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa, lämpötilassa -10°C lisättiin. Seoksen pH oli 10,3, lämpötila -10°C ja etanolipitoisuus n. 64 tilavuus-%. Seosta lingottiin viiden minuutin kuluttua, kuten esimerkissä 1 ja se antoi pääl-5 lisnesteen, joka sisälsi 46 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja tummanruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 10 ml:11a * 65-tilavuus-% etanolia, kummallakin kerralla pH:ssa 10,3 ja lämpötilassa -10°C, ja se antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 10 * ja vastaavasti 7 % lähtöaineen hemepitoisuu-10 desta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 67 %. Tahna oli ruskeaa ja edusti 71 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta.

Esimerkki 5

Samalla tavoin kuin esimerkissä 4 verisoluseoksen pH nostettiin arvoon 10,2, lämpötila pidettiin 0°C:ssa. Seos-15 ta, jossa oli 1,5 ml jäävettä, 3 ml 50-tilavuus-% etanolia, 1 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa ja 0,2 ml 1 M HCl, lämpötilassa 0°C lisättiin. Seoksen pH oli 8,2 ja läm-„ , pötila 0°C. Tämän jälkeen lisättiin seosta, jossa oli 5 ml 96-tilavuus-% etanolia ja 10 ml 70-tilavuus-% etanolia läm-20 pötilassa 0°C. Seoksen pH oli 8,2, lämpötila 0°C ja etanoli-pitoisuus 66 tilavuus-%. Seosta lingottiin viiden minuutin kuluttua, kuten esimerkissä 1 ja se antoi päällisnesteen, joka sisälsi 52 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja tummanruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 10 ml:11a 65-ti-25 lavuus-% etanolia ja 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa, kummallakin kerralla pH:ssa 8,2 ja lämpötilassa 0°C ja se antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 28 % ja vastaavasti 12 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 92 %. Tahna oli ruskeaa ja 30 edusti 85 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta.

Esimerkki 6

Seosta, jossa oli 1 ml vettä ja 0,8 ml 0,5 M NaOH lämpötilassa 10°C lisättiin tipoittain sekoittaen 2,2 g:aan verisoluseosta lämpötilassa 10°C. Lisäyksen jälkeen pH oli 35 11,0 ja lämpötila 10°C.

4 ml 96-tilavuus-% etanolia, 1 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa, 1 ml 30-%:ista natriumsitraattia 12 65369 vesiliuoksessa ja 0,5 ml 1 M HC1 lisättiin. Seoksen pH oli 7,5 ja lämpötila 10°C. Sen jälkeen lisättiin 3 ml 96-tila-vuus-% etanolia ja 10 ml 70-tilavuus-% etanolia. Seoksen pH oli 7,5, lämpötila 10°C ja etanolipitoisuus 64 tilavuus-%.

5 Seosta lingottiin viiden minuutin kuluttua, kuten esimerkissä 1 ja se antoi päällisnesteen, joka sisälsi 53 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja tummanruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 10 ml:11a 65-tilavuus-% etanolia ja 0,1 ml:11a 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa, kum-10 mailakin kerralla pH:ssa 7,5 ja lämpötilassa 10°C ja se antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 26 % ja vastaavasti 13 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 92 %. Tahna oli ruskeaa ja edusti 74 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta.

15 Esimerkki 7

Seosta, jossa oli 5,5 ml 96-tilavuus-% etanolia ja 1,0 ml 1 M HCl, lämpötilassa -18°C lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen seokseen, jossa oli 2,2 g veri-soluseosta, 0,1 ml 1 M glysiiniä vesiliuoksessa, 0,1 ml 2 M 2Q imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa ja 2 ml 50-tilavuus-% etanolia, lämpötilassa -18°C. Lisäyksen jälkeen pH oli 3,0 ja lämpötila -18°C. 3 ml 40-%:ista ammoniumsulfaattia vesiliuoksessa lisättiin sekoittaen ja jäähdyttäen. Viiden minuutin kuluttua lisättiin sekoittaen ja jäähdyttäen seos-25 ta, jossa oli 10 ml 96-tilavuus-% etanolia, 20 ml 70-tila-vuus-% etanolia ja 4 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa lämpötilassa -18°C. Lisäyksen jälkeen pH oli 7,5 ja lämpötila -18°C, etanolipitoisuus oli n. 69 tilavuus-%. Seosta lingottiin kuten esimerkissä 1. Tahna uutettiin kaksi ker-30 taa 20 ml:11a 70-tilavuus-% etanolia, 0,1 ml:11a 1 M glysiiniä vesiliuoksessa ja 0,1 ml 2 M imidatsolia 70-tila-vuus-% etanolissa, kummallakin kerralla pH:ssa 7,5 ja lämpötilassa -18°C. Päällisneste sisälsi 69 %, 14 % ja vastaavasti 5 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Heme-tiivisteen ko-35 konaissaanto oli 88 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja edusti 81 % lähtöaineen proteiinipitoisuudesta.

13 65369

Esimerkki 8

Seosta, jossa oli 8 ml 96-tilavuus-% etanolia ja 0,8 ml 1 M HC1 lämpötilassa -5°C, lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen 2,2 g:aan verisoluseosta lämpöti-5 lassa -5°C. Lisäyksen jälkeen pH oli 3,1 ja lämpötila -5°C. 0,8 ml 0,2 M NaOH 50-tilavuus-% etanolissa ja 10 ml 50-ti-lavuus-% etanolia lisättiin, pH oli 3,5 ja lämpötila -5°C. Seosta lingottiin, 9 000 x g, viisi minuuttia, jolloin saatiin keltainen päällisneste ja musta tahna. Päällisnestees-10 tä saostettiin sen jälkeen, kun oli lisätty 8 ml vettä pH:ssa 7,5, harmaa proteiinisakka, joka sisälsi 0,21 g kuiva-ainetta. Musta hemetahna sekoitettiin seokseen, jossa oli 30 ml 70-tilavuus-% etanolia, 0,5 ml 1 M glysiiniä vesiliuoksessa 0,5 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etano-15 lissa ja 2,5 ml 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. pH oli 8,6, lämpötila -5°C ja etanolipitoisuus n. 70 tilavuus-%. Seosta lingottiin, 3 000 x g, viisi minuuttia ja se antoi päällisrestieen, joka sisälsi 72 % lähtöaineen hemepitoisuu-desta, ja ruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 30 ml:11a 20 70-tilavuus-% etanolia ja 0,1 ml:11a 2 M imidatsolia 70-ti-lavuus-% etanolissa, kummallakin kerralla pH:ssa 8,6 ja lämpötilassa -5°C ja se antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 19 % ja vastaavasti 8 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Hema-tiivisteen kokonaissaanto oli 99 %. Tahna oli har-25 maanruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokonaisproteiinisaan-to oli 91 %.

Esimerkki 9 a) Samalla tavoin kuin esimerkissä 8, erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 9 verisoluseosta. 30 Tahna sekoitettiin 30 mitään 50-tilavuus-% etanolia ja pH säädettiin arvoon 8,5 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa, lämpötilassa -1°C. Etanolipitoisuus oli n.

50 tilavuus-%. Seosta lingottiin, kuten esimerkissä 8, ja se antoi päällisnesteen, joka sisälsi 33 % lähtöaineen he-35 mepitoisuudesta, ja tummanruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kolme kertaa 30 ml:11a 50-tilavuus-% etanolia, kummallakin kerralla pH:ssa 9,0 ja lämpötilassa -1°C ja se antoi 14 65369 päällisnesteitä, jotka sisälsivät 24 %, 13 % ja vastaavasti 9 % lähtöaineen hemepitoisuudesta._Heme-tiivisteen kokonaissaanto oli 79 %. Tahna oli ruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokonaisprotelinisäänto oli 91 %.

5 b) Samalla tavoin kuin esimerkissä 8, erotettiin mus ta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna sekoitettiin 30 ml:aan 40-tilavuus-% etanolia ja pH säädettiin arvoon 10,7 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -4°C ja etanolipitoisuus n. 40 ti-10 lavuus-%. Seosta lingottiin, kuten esimerkissä 8, ja se antoi päällisnesteen, joka sisälsi 71 % lähtöaineen hemepi-toisuudesta, ja ruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 30 ml:11a 40-tilavuus-% etanolia, kuminallakin kerralla pH:ssa 10,7 ja lämpötilassa -4°C, ja se antoi päällisnestei-15 tä, jotka sisälsivät 7,2 % ja vastaavasti 4,8 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 83 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja painoi kuivana 0,08 g.

" 1 Kokonaisproteiinisaanto oli 85 %.

Esimerkki 10 20 Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna sekoitettiin seokseen, jossa oli 20 ml 60-tilavuus-% etanolia, 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa ja 1 ml 40-paino-% ammoniumsulfaattia vesiliuoksessa. pH 25 säädettiin arvoon 6,8 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli 25°C ja etanolipitoisuus n.

60 tilavuus-%. Seosta lingottiin kuten esimerkissä 8, ja se antoi päällisnesteen, joka sisälsi 65 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin 30 kahdesti 60-tilavuus-% etanolilla, imidatsolilla ja ammoniumsulfaatilla yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pH:ssa 6,8 ja lämpötilassa 25°C, ja se antoi päällis-nesteitä, jotka sisälsivät 14 % ja vastaavasti 8 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 35 85 %. Tahna oli ruskeaa ja painoi kuivana 0,07 g. Kokonais- proteiinisaanto oli 83 %.

15 65369

Esimerkki 11

Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Seos sekoitettiin seokseen, jossa oli 30 ml 96-tilavuus-S etano-5 lia ja 0,2 ml 1 M glysiiniä vesiliuoksessa.' pH säädettiin arvoon 10,4 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -20°C, etanolipitoisuus n. 90 tilavuus-%. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8, ja antoi päällisnesteen, joka sisälsi 61 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja tumman-10 ruskeaa tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 90-tilavuus-% etanolilla ja glysiinlllä yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pH:ssa 10,4 ja lämpötilassa -20°C, ja antoi pääl-lisnesteet, jotka sisälsivät 20 % ja vastaavasti 9 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto 15 oli 90 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja paino! kuivana 0,1 g. Kokonaisproteiinisaanto oli 91 %.

Esimerkki 12 Ί * Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna 20 sekoitettiin seokseen, jossa oli 30 ml 40-tilavuus-% etanolia ja 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa. pH säädettiin arvoon 7,0 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -5°C, etanolipitoisuus n. 42 tilavuus-%. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8 ja antoi pääl-25 lisnesteen, joka sisälsi 58 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja tummanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin kaksi kertaa 70-tilavuus-% etanolilla ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pH:ssa 7 ja lämpötilassa -5°C ja antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 26 % ja vastaa-30 vasti 5 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Heme-tilvisteen kokonaissaanto oli 89 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokonaisproteiinisaanto oli 91 %.

Esimerkki 13

Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta 35 hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna sekoitettiin seokseen, jossa oli 20 ml 70-tllavuus-% metanolia ja 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa.

ie 65369 pH säädettiin arvoon 8,5 käyttäen 0,5 NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -5°C, metanolipitoisuus n. 60 ti-lavuus-%. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8 ja antoi pääl-lisnesteen, joka sisälsi 67 % lähtöaineen hemepitoisuudes-5 ta, ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 70-tilavuus-% metanolilla ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pH:ssa 8,5 ja lämpötilassa -5°C ja antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 18 % ja vastaavasti 7 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Heme-tiivis-10 teen kokonaissaanto oli 92 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokona!sproteiinisaanto oli 91 %.

Esimerkki 14

Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tah-15 na sekoitettiin seokseen, jossa oli 20 ml 70-tilavuus-% propanolia ja 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa. pH säädettiin arvoon 8,0 käyttäen 0,5 M NaOH 70-ti-lavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -5°C, propanolipitoi-suus n. 60 tilavuus-%. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8 20 ja antoi päällisnesteen, joka sisälsi 66 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin kaksi kertaa 70-tilavuus-% propanolilla ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kuromallakin kerralla pH:ssa 8,0 ja lämpötilassa -5°C ja antoi päällisnesteitä, jotka 25 sisälsivät 16 % ja vastaavasti 9 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 91 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokonaispro-teiinisaanto oli 91 %.

Esimerkki 15 3Q Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna sekoitettiin seokseen, jossa oli 20 ml 70-tilavuus-% isopropanolia, 0,2 ml 1 M glysiiniä ja 0,2 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa. pH säädettiin arvoon 7,5 35 käyttäen 0,5 M NaOH 70-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -10°C, isopropanolipitoisuus n. 60 tilavuus-*. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8 ja antoi päällisnesteen, 17 65369 joka sisälsi 69 % lähtöaineen hemepitoisuudesta ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 70-tilavuus-% isopropanolilla, glysiinillä ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pH:ssa 7,5 ja lämpöti-5 lassa -10°C ja antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 17 % ja vastaavasti 9 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 95 %. Tahna oli vaaleanruskeaa ja painoi kuivana 0,1 g. Kokonaisproteiinisaanto oli 91 %.

Esimerkki 16 10 Samalla tavoin kuin esimerkissä 8 erotettiin musta hemetahna käyttäen lähtökohtana 2,2 g verisoluseosta. Tahna sekoitettiin seokseen, jossa oli 20 ml 70-tilavuus-% etanolia, 7 ml 70-tilavuus-% glyserolia ja 0,2 ml 2-m imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa. pH säädettiin arvoon 15 8,0 käyttäen 0,5 M NaOH 70 tilavuus-% etanolissa. Lämpöti la oli -5°C, etanolipitoisuus n. 52 tilavuus-* ja glyserii-4 nipitoisuus n. 17 tilavuus-*. Seos lingottiin kuten esimer kissä 8 ja antoi päällisnesteen, joka sisälsi 64 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna 20 uutettiin kahdesti 70-tilavuus-* etanolilla, 70-tilavuus-% glyseriinillä ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kummallakin kerralla pHrssa 8,0 ja lämpötilassa -5°C ja antoi päällisnesteitä, jotka sisälsivät 14 % ja vastaavasti 7 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen koko-25 naissaanto oli 85 %. Tahna oli ruskeaa ja paino kuivana vedellä pesun jälkeen 0,1 g. Kokonaisproteiinisaanto oli 91 %.

Samalla tavoin kuin yllä, suoritettiin uutto käyttäen 70 tilavuus-* etyleeniglykolia glyserolin sijasta.

30 Tulos oli sama kuin yllä.

Esimerkki 17

Seosta, jossa oli 6 ml 96-tilavuus-% etanolia ja 1 ml IM HC1 lämpötilassa -8°C, lisättiin tipoittain sekoittaen ja jäähdyttäen 2,7 g:aan täysverta lämpötilassa 0,5°C. 35 Lisäyksen jälkeen pH oli 3,0 ja lämpötila -5°C. Tämän jälkeen lisättiin 2 ml 40-%:ista ammoniumsulfaattia vesiliuoksessa ja seosta, jossa oli 20 ml 70-tilavuus-% etanolia.

ie 65369 0,2 ml 1 H glysiiniä vesiliuoksessa ja 0,2 ml 2 H imidatso-lia 70-tilavuus-% etanolissa lämpötilassa -8°C sekoittaen ja jäähdyttäen. pH säädettiin arvoon 8,0 käyttäen 0,5 M NaOH 7Q-tilavuus-% etanolissa. Lämpötila oli -8°C ja etano-5 lipitoisuus n. 65 tilavuus-%. Seos lingottiin kuten esimerkissä 8 ja antoi päällisnesteen, joka sisälsi 66 % lähtöaineen hemepitolsuudesta, ja ruskeanpunaista tahnaa. Tahna uutettiin kahdesti 70-tilavuus-% etanolilla, ammoniumsulfaatilla ja imidatsolilla yllä mainittuina määrinä, kummal-10 lakin kerralla pH:ssa 8,0 ja lämpötilassa -8°C ja antoi päälld^snesteitä, jotka sisälsivät 16 % ja vastaavasti 7 % lähtöaineen hemepitoisuudesta. Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 89 %. Tahna oli harmaanruskeaa 50-tilavuus-% etanolilla suoritetun pesun jälkeen ja edusti 85 % kokonaispro-15 teiinipitoisuudesta.

Esimerkki 18

Hemetahnan uutto käyttäen lähtökohtana 22 g veriso-, luseosta antoi pH:ssa 10,4, lämpötilassa -5°C ja 70-tila- vuus-% etanolissa ensimmäisen uuttoliuoksen 199 ml, jonka 20 hemepitoisuus oli 0,38 mg hemeä/ml edustaen 68,1 % lähtöaineen hemepitoisuudesta, toisen uuttoliuoksen 121 ml, jonka hemepitoisuus oli 0,17 mg hemeVml edustaen 18,6 % hemepitoisuudesta, ja kolmannen uuttoliuoksen 118 ml, jonka hemepitoisuus oli 0,08 mg hemeä/ml edustavan 8,5 % heme-25 pitoisuudesta. Uuttoliuokset yhdistettiin ja hapotettiin pH-arvoon 5,1 87 ml:11a 0,1 M HC1 lämpötilassa -5°C. Muo dostunut musta höytäleinen sakka erotettiin lingossa, 3 000 x g, ja painoi 4,5 g. Tahna pestiin kolme kertaa 15 mlsssa jäävettä kullakin kerralla, suspendoitiin 15 ml:aan 30 jäävettä, pH säädettiin arvoon 8,2 3 ml:11a 0,2 M NaOH, pakastettiin ja pakastekuivattiin. Tällöin saatiin 265 mg mustaa jauhetta, jonka hemepitoisuus oli 36 %. Hemetiivis-teen kokonaissaanto oli 86 %. Analyysi: C 46,17 *, H 5,30 %, Cl 10,53 %, P 2,8 *, Fe 3,57 %, N 9,6 %, K 3,5 % ja Na 4,1 %. 35 Esimerkki 19

Hemetahnan uutto käyttäen lähtökohtana 50 g veri-soluseosta antoi pH:ssa 8,2, lämpötilassa 1°C ja käyttäen 19 65369 6Q-tilavuus-% etanolia ja 4 ml 2 M imidatsolia 70-tilavuus-% etanolissa ensimmäisen uuttoliuoksen 494 ml, jonka hemepi-toisuus oli 0,32 hemeä/ml edustaen 62,8 % lähtöaineen herne-pitoisuudesta, toisen uuttoliuoksen, jonka vastaavat tiedot 5 olivat 467 ml, 0,11 mg hemeä/ml, 20,4 % ja kolmannen uuttoliuoksen, jonka vastaavat tiedot olivat 479 ml, 0,06 mg hemeä/ml, 11,4 %. Uuttoliuokset yhdistettiin ja hapotettiin pH-arvoon 4,0 käyttäen 240 ml 0,1 M HC1 lämpötilassa 1°C. Sakka erotettiin kuten yllä ja paino! 8,5 g. Tahna pestiin 10 kolme kertaa 25 ml:ssa jäävettä kullakin kerralla, suspen-doitiin 25 ml:aan jäävettä, pH säädettiin arvoon 8,5, ja suspensio pakastettiin ja pakastekuivattiin. Tällöin saatiin 510 mg mustaa jauhetta, jonka hemepitoisuus oli 42 %.

Herne-tiivisteen kokonaissaanto oli 85 %.

15 Esimerkki 20

Samalla tavoin kuin esimerkissä 18 saatiin kolme uuttoliuosta. Kolmas uuttoliuos hapotettiin erikseen pH-ar-" 1 voon 5,1 ja antoi pienemmän määrän sakkaa, joka pakaste- kuivauksen jälkeen antoi herne-tiivisteen, jonka hemepitoi-20 suus oli 17,7 %. Analyysi: C 29,42 %, H 3,52 %, Cl 23,77 %, P 1,2 %, Fe 2,28 %, N 8,8 %, K 13,4 % ja Na 15,7 %.

Esimerkki 21

Samalla tavoin kuin esimerkissä 19 saatiin yksi uuttoliuos. Uuttoliuos hapotettiin erikseen pH-arvoon 4,0 ja 25 antoi mustan sakan, joka erotettiin, pestiin ja pakaste-kuivattiin samalla tavoin kuin esimerkissä 19. Näin saadun herne-tiivisteen hemepitoisuus oli 55 %.

Claims (6)

20 65369

1. Menetelmä herne-tiivisteen valmistamiseksi hemoglobiinin lohkaisussa saadun hemen ja veriaineen seoksesta, 5 tunnettu siitä, että mainittua hemen ja veriaineen seosta käsitellään alemmalla alkoholilla tai alkoholien seoksella, edullisesti etanolilla, jonka pitoisuus on yli 40 tilavuus-%, edullisesti 60...80 tilavuus-%, jolloin mainittu käsittely tapahtuu joko 10 a) pH:ssa 8,0 - noin 10,7, edullisesti 9,0...10,7, tai b) herne-tiivisteen erotusta edistävän aineen, edullisesti imidatsolin, läsnäollessa pH:ssa 6,0 - noin 8,5, edullisesti 6,5...8,5, 15 ja jolloin mahdollisesti lisätään proteiinisaostu- maa stabiloivia aineita, esimerkiksi natrium-, kalium- tai ammoniumkloridia, -sulfaattia tai -sitraattia, lämpötilassa noin +25°C...-20°C, edullisesti -5°C...-20°C:ssa, minkä jälkeen kiinteä veriaine erotetaan, ja herne-tiiviste otetaan 20 talteen jäljellä olevasta liuoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineena käytetään hemoglobiini-ainetta lohkomalla ja globiiniliuosta sinänsä tunnetulla tavalla erottamalla saatua hemen ja veriaineen seosta, eli nk. 25 herne-tahnaa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herne-tiivisteen erotusta edistävinä aineina haluttaessa lisätään aminohappoja, edullisesti glysiiniä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että seoksen pH ensin säädetään arvoon 7...8 tai, mikäli käytetään herne-tiivisteen erotusta edistävää ainetta, arvoon 6,5...8, ja sen jälkeen lisätään alempi alkoholi, edullisesti etanoli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mentelmä, tun nettu siitä, että seokseen ensin lisätään yhtä tai 21 65369 useita suoloja, kuten natrium-, kalium- tai ammoniumklori-dia, -sulfaattia tai -sitraattia, minkä jälkeen lisätään alempi alkoholi, ja pH säädetään arvoon yli 6,0, tai mikäli heme-tiivisteen erotusta edistävää ainetta ei lisätä, 5 arvoon yli 8,0.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alempi alkoholi on etanoli, metanoli, etyleeniglykoli, glyseroli, propa-noli tai isopropanoli, tai näiden seos. n 1 22 65369