SE417526B - Forfarande och medel for enzymatisk bestemning av glukos - Google Patents

Description

1-; O 15 .'\) \J'| 55 HO 7312284-8 plasmautdrygningsmedel på dextran-bas, då härvid grumlingar bildas D) i testblandningen. Dessutom när den för kondensationen erforder- liga kokninyen med syra bestämningen besvärlig och tidsödande.

Förutom denna s.k. o-toluidin-metod är framför allttvå enzyme- tiska förfaranden för bestämning av glukos vanliga: glukosoxidas- -metoden och hexokinas-metoden.

Vid glukosoxidasmetoden oxideras glukos under glukosoxilas- katalys med syre till glukonsyra, varvid väteperoxid bildas, som à sin sida i en katalyserad följdreaktion oxiderar en färglös kreme- gen till ett färgämne. Såsom katalysator i följdreaktionen kan exempelvis peroxidas tjäna; en ofta använd kromogen är o-dianisidin.

Glukosoxidas är i stor utsträckning specifikt för glukos, dock störs I kroppsvätskor Ytterligare följdreaktionen av ämnen, som förbrukar väteperoxid. stör speciellt urinsyra, askorbinsyra och katalas. nackdelar är den långa analystiden och det faktum, att kromogenen o-dianisidin inte är medicinskt ofarlig.

Som den mest specifika glukosbestämningen betraktas den enzy- matiska bestämningen med hexokinas/glukos-6-fosfat-dehydrogenas.

Härvid fosforyleras glukos med adenosintrifosfat/hexokinas och bil- dat glukos-6-fosfat dehydreras med glukos-6-fosfat-dehydrogenas till glukonat-6-fosfat, varvid vätet överföras till níkotinamid- -adenin-dinukleotid-fosfat (NADP); det reducerade koenzymet bestäm- mes fotometriskt. På grund av den centrala ställningen av glukos- -6-fosfat i kolhydratämnesomsättningen är testet känsligt mot stör- ningar genom främmande enzymer, såsom fosfoglukos-isomeras, fosfo- glukomutas och glukonat-6-fosfat-dehydrogenas. Det rekommenderas därför att eliminera störningsreaktionerna genom extrapolation.

(H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Anályse, 2:a upplagan, sid. 1166, 1970, Verlag Chemie, Weinheim). Därigenom blir dock be- stämningsmetoden osäker, omständlig och tidsödande (ca 20 till 50 minuter för en enstaka bestämning).

Det visade sig nu, att nackdelarna hos de hittills i praktiken använda metoderna för glukosbestämning_kan undvikas, om man använ- der ett nytt enzymatiskt medel. * Föreligëande uppfinning avser ett förfarande för enzymatisk bestämning av glukos, karakteriserat därav, att man bringar ett me- del, som består av glukosdehydrogenas med en aktivitet av minst 2 U/ml provlösning, ett pyridin-koenzym, buffertsubstanser med ett pH- värde från 6,5 till 8,5, mutarotas, varvid enzymenheternas förhållan- de av glukosdehydrogenas till mutarotas utgör ca 10:O,25-1, och eventuellt inhibitorer för oxidaser för reducerande pyridinkoenzymer s 10 20 fx! Uï p; LH #3 s 731228l+-8 och/eller alkaliklorid, att inverka på det glukoshaltiga provet, som skall undersökas, och mäter halten av bildat reducerat pyri- din-koenzym spektrofotometriskt eller fluorimetrisk .

Vidare omfattar föreliggande uppfinning ett medel för utföran- de av ovanstående förfarande medelst glukosdehydrogenasïwd aiakti- vitet av minst 2 U/ml provlösning, ett pyridin-koenzym och buffert- substanser med pH-värde från 6,5-3,5 under bildning av glukonsyra och reducerat pyridinkoenzym, karakteriserat av en halt av mutaro- tas och eventuellt inhibitorer för oxidaser för reducerade pyri- din-koenzymer och/eller alkaliklorid, varvid enzymenheternas för- hållande av glukosdehydrogenas till mutarotas utgör ca 10:O-25-1.

Det nya medlet enligt föreliggande uppfinning utmärker sig gentemot den förut kända glukosoxidasmetoden därigenom, att det specifikt mäter glukoshalten och inte störs av andra oxidations- eller reduktionsmedel. Gentemot den förut kända hexokinasmetoden har det nya medlet den fördelen, att vid användning därav endast en i stället för två enzymer vid Då inte nå- enstegsreaktion användes, varvid hexokinasmetoden här endast ett enzym är erforderligt. gon indikatorreaktion är nödvändig, är även en därigenom betingad möjlig störning utesluten, vilket betyder en väsentlig fördel gent- emot GOD- och hexokinasmetoden. I Bestämningen behöver i en lämplig utföringsform ca 5 minuter, varmed den redan är dubbelt så snabb som den för närvarande snab- baste enzymatiska glukosbestämningen (hexokinasmetoden utan extra- polation av störningsreaktioner). Omsättningstiden kan dessutom väsentligt minskas genom höjning av enzymaktiviteterna i testet, så att, förutom att testet är specifikt, även enkelheten och snabb- heten hos_föreliggande test inte uppnås av någon annan glukosbestäm- ning. ' ' I praktiken har glukosdehydrogenas tillsammans med mutarota- tionspåskyndande substanser ännu aldrig använts för bestämning av glukos. Skälet härför torde vara att söka i de ogynnsanma egenska- perna hos tillgängligt glukosdehydrogenas.

Från den hithörande litteraturen (Methods in Enzymology, vol.

IX, 92-lll, Acad. Press, New York, London, 1966; R.P. Metzger m.fl., J. sioi. Chem. 239, 1769-1772 (19611) och 2140, 2767-2771 (1965) och N.G. Brink, Acta Chem. Scand. 7, 1081-1088 (1953)) var känt, att glukosdehydrogenas har en rad av ogynnsamma egenskaper, som för- hindrar en analytisk användning. Så är exempelvis ofta glukos- dehydrogenaserna bundna vid en partikel och/eller visar sig såsom 10 20 25 UI UI MO 73122811-8 H ej NAD- resp. NAD?-beroende. Vidare är känt, att glukosdehydrogenas uppvisar en ringa aktivitet och/eller en alltför ringa stabilitet.

Michaelis-konstanterna för glukosdehydrogenas till glukos utgör endast 0,007-2, dvs först i en 0,007 molar lösning är enzymet till hälften mättat med substrat. Vid den vanliga blodsockeranalysen står dock endast ca 0,000000l mol glukos till förfogande. Det följaktligen en betydande fördom i den hithörande litteraturen mot användningen av glukosdehydrogenas för den enzymatiska glukosbe- fanns stämningen.

Med föreliggande uppfinning har man lyckats, att för första gången ställa ett medel och förfarande för enzymatisk glukosbestäm- ning med hjälp av glukosdehydrogenas till förfogande, som med enkelt handhavande ger snabba och tillförlitliga resultat.

I det följande beskrives föreliggande uppfinning närmare.

Glukosdehydrogenas, som medlet enligt föreliggande uppfinning innehåller, måste vara så rent som möjligt. De i testet använda aktiviteterna hos glukosdehydrogenas rättar sig framför allt efter tiden, inom vilken reaktionens slutpunkt skall vara uppnådd. En- zymaktiviteten kan därvid lämpligen varieras inom ett område från ca 2 till 200 U/ml provlösning. Företrädesvis använder man H-20 U/ml provlösning tillsammans med enzymet'nutarotas.

Framställningen av använd glukosdehydrogenas sker ur mikro- organismer, företrädesvis ur mikroorganismer av släktet Baoillus, varvid den mikrobiella utgångsprodukten innehåller en glukosdehydro- genas-aktivitet av minst 5 U/ml råextrakt. Den vidare reningen sker exempelvis analogt med den i The Spores III, 97 (1965) beskriv- na metoden. På detta sätt är lyofilíserade glukosdehydrogenas- preparat erhållbara, som innehåller mer än 2 U/eg torrsubstans och vars goda löslíghet tillåter framställning av lösningar med mer än '20ö U/ml; den störande NADH2-oxidasaktivíteten utgör mindre än 1 °/oo av glukos-dehydrogenasaktiviteten. Först den i jämförelse med tidigare beskrivna preparat i storleksordníng bättre kvaliteten hos enzymet möjliggjorde användning därav i den enzymatiska glukosbe- stämningen.

Pyridin-koenzymerna, som medlen enligt föreliggande uppfinning innehåller, är företrädesvis nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) eller nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP), speciellt NAD.

Koenzymkoncentrationen kan varieras inom gränserna från 2,0 mM till 5 mM, utan att reaktionshastigheten påverkas. I en lämplig utfö- ringsform utgör slutkoncentrationen i testet ca 2,8 mM NAD. I v". 10 15 F.) U] 30 55 H0 _ 1 minut. s 7312284-8 stället för NAD och NADP kan även andra NAD-aktiva substanser, så- som tio-NAD eller tio-NADP användas.

Då glukosdehydrogenas är specifik för @-glukos, måste den i jämvikt alltid föreliggande CK-glukosen först mutarotera, innan den cmsättes av glukosdehydrogenas, dvs vid hög glukosdehydrogenasakti- vitet reagerar i reaktionsblandníngen närvarande É-glukos snabbt, vilket visar sig i den branta extinktionsstigningen i början av reaktionen. Den långsamma mutarotationen av 0(-glukos till ß-glu- kos framträder i den fördröjda NADH2-bildningen, som är avslutad först efter mer än 30 minuter. Medlet enligt föreliggande uppfin- ning innehåller därför mutarotationspåskyndande substanser, speci- ellt mutarotas. Påskyndandet av mutarotationen genom enzymet muta- rotas är visserligen känt för glukosbestämning med glukosoxidas (J. Okuda, I. Miwa, Anal. Biochem. H3, 312 (1971)), det var dock inte nära till hands liggande, att vid tillsats av mutarotas till glukosdehydrogenas/NAD-systemet likaledes ett mycket effektivt på- skyndande inträder. En mutarotasmängd av numerärt 8 2 av glukos- dehydrogenasaktiviteten är redan tillräcklig för optimalt reaktions- påskyndande; mutarotasandelen kan dock godtyckligt höjas, utan att ett negativt inflytande på testsystemet blir märkbart.

I en lämplig utföringsform av glukosbestämningen utgör förhål- landet av glukosdehydrogenasaktiviteten till mutarotasaktiviteten ca l0:0,25-021-Ett kvantitativt reaktionsförlopp inom loppet av 5 minuter (vilket motsvarar en mer än sexfaldig acceleration gentemot det analoga testsystemet utan mutarotas) uppnår man exempelvis med aktiviteter från H U glukosdehydrogenas och 0,U enheter mutarotas per ml mätsats. Vid 20 U glukosdehydrogenas och 2 enheter mutaro- tas per ml provlösning utgör omsättningstiden ekempelvis mindre än Vid tillsats av mer än 100 U glukosdehydrogenas och 10 enheter mutarotas per ml provlösning kan omsättningstider i stor- leksordningen från l0 sekunder uppnås. Visserligen måste i detta fall enzymerna vara höggradigt renade eller de störande biaktivi- teterna måste undertryokas.

Mutarotas kan även ersättas av substanser, som utövar en mu- tarotationspåskyndande verkan på Öêglukos. Om man exempelvis an- vänder en fosfatbuffert i en koncentration av 200 mM, så utnyttjar man den mutarotationspåskyndande verkan hos fosfatet fullständigt och kan därigenom inspara mer än 60 % av mutarotasaktiviteten. Så- som ytterligare mutarotationspåskyndande substanser ifrågakommer t.ex. histidin, imidazol, glutaminsyra, asparaginsyra e1ler1X-hydr- 10 15 h) (D |\J \J'l 50 \N UI #0 7312284-e 6 oxipvridin. De användes företrädesvis i en koncentration från 20 till 100 NM i testet och påverkar inom detta koncentrationsområde inte väsentligt aktiviteten hos glukosdehydrogenas. Lämpligen an- vändes dock mutarotas.

För uppnående av en snabb och kvantitativ glukosomsättning, för undanröjande resp. undertryckande av störande biaktiviteter och för' stabilisering av glukosdehydrogenas innehåller medlet enligt förelig- gande uppfinning likaledes dessutom ytterligare beståndsdelar såsom , inhibitorer för oxidaser för reducerade pyridin-koenzymer och/eller alkaliklorid.

För att hålla pH-värdet hos satsen, som skall analyseras, inom ett område mellan ca 6,5 och 8,5, företrädesvis 7 till 8, innehåller medlet en buffert. Bufferten användes företrädesvis i en koncentra- tion från ca 50 till zoo mn. principiellt inte, såvida lösligheten hos de olika beståndsdelarna Lägre eller högre koncentrationer stör inte minskas och buffertkapaciteten är tillräcklig för att upprätt- hålla det angivna pH-området, dvs det optimala området för enzym- aktiviteten i mätsatsen. Såsom buffert ifrågakommer de vanligen använda föreningarna, som håller blandningen på angivet pH från ca 6,5-8,5, såsom fosfat, trishydroximetylaminometan, dietanolamin, trietanolamin, kollidin, borat, osv, företrädesvis fosfat- och tris- buffert. _ För mätningar med höga fordringar på noggrannhet, såsom be- stämning av glukos i kroppsvätskor, gör sig även inflytandet av en ringa andel av oxidaser för reducerade pyridin-koenzymer märkbar.

De medför att bildat reducerat pyridin-koenzym åter oxideras. Sen såsom mätstorlek tjänande extinktionen förblir därför inte kons- tant, utan minskar åter efter uppnående av ett maximalvärde. Här- _till kommer, att den mätta maximala extinktionen är mindre än det med t.ex. NADH2 som underlag för extinktionskoefficienten beräknade värdet (ca 3-5% for lågt vid 1 °¿° NAnH¿-øxidas). Av detta skal är det fördelaktigt, om medlet enligt föreliggande uppfinning even- tuellt innehåller inhibitorer för oxidaser för reducerade pyridin- koenzymer. ' Då den preparativa sänkningen av de i glukos-dehydrogenas än- nu närvarande resterna av NADH2-oxidas visat sig såsom alltför dyr, är det lämpligt att undertrycka den störande effekten genom användning av specifika inhibitorer. Man påträffar nu överraskan- de en rad inhibitorer, som i redan relativt små koncentrationer fverksamt hämmar det störande enzymet, utan att väsentligt påverka_ f» 10 30 H0 7 731228Å'8 aktiviteterna av plukosdehydrogenas eller mutarotas. Det är där- vid framför allt fråga om pyridin-, purin- och hydroxibensoesyra- derivat.

Lämpliga'är pyridinderivat, som i 2- och/eller 3- och/eller U-ställning är substituerade med lågalkyl, fenyl, hydroxilågalkyl, halogenlågalkyl, karboxi, lågacyl, bensoyl, karbonamid och amino, varvid i 5,6-ställning en bensenkärna kan vara ankondenserad, så- som nikotinsyra, nikotinsyraamid, 2-amino-Ä-metYl~pyridin, 2~metyl- -3-(ß-hydroxietyl)-pyridin, 3-hydroximetyl~pyridin, 2-hydroximetyl- pyridin, 2-bensoyl-pyridin, kinolinsyrasåëmetylester, 3-acetylkíno- lin, kinaldinsyra, kinolyl-2-klorometan, kinaldin, 2-fenyl-kinolin~ syraamid och/eller atofan. Företrädesvis använder man 3~acetyl~ kínolin, nikotinsyra, kinolyl-2-klorometan, kinaldinsyra och/eller nikotinsyraamid, speciellt 3-acetylkinolin.

Lämpliga purinderivat är t.ex. urinsyra, koffein, teofyllin, eller puriner, som i 2- och/eller 6-ställning bär hydroxi- och/eller aminogrupper och i 7-ställning här en ribos- eller desoxiribosgrupp, såsom xantosin, 2-desoxi-guanosin, inosin, osv. Speciellt lämpliga ur denna grupp är xantosin och/eller urinsyra.

Lämpliga nydroxibensoesyraderivat är sådana, som i 2- eller 3-ställning bär en fri eller acylerad hydroxigrupp och som dessutom kan vara substituerad med en sulfonsyragrupp, varvid karboxylgrup- pen även kan föreligga såsom amid, såsom m-hydroxibensoesyra, sali- cylsyra, acetylsalicylsyra, salicylamid och/eller sulfosalicylsyra, företrädesvis 3-acetylkinolin och sulfosalícylsyra. Såsom väl läm- pade visar sin även 1-(p-klorofenylsulfonyl)-5-propylkarbamíd. Spe- ciellt är användningen av sulfosalïcylsyra lämolig på grund av den starka NADH2-oxídas-hämningen, den goda lösligheten, den relativt _ ringa påverkan av glukosdehydrogenas och mutarotas, den lätta till- gängligheten och det oproblematiska handhavandet.

Halten av NADH2-oxidas-hämmare i testsystemet är variabel, den rättar sig från fall till fall efter den föreliggande aktivite- ten av det störande enzymet i GDH-preparationen. Inhibitorerna tillsättes fördelaktigt i en koncentration från ca 0,1 till 100 mM (slutkoncentration i mëtsatsen), speciellt från ca 10 till 50 mM, Eventuellt kan medlet enligt föreliggande uppfinning dessutom innehålla alkaliklorid, såsom litium-, natrium- och/eller kalium- klorid, speciellt natriumkloríd. Det är känt, att värmestabilite~ ten av löst glukosdehydrogenas kan höjas genom natriumkloridtill- sats. Glukosdehydrogenaslösningar med en natriumkloridhalt från _ 10 h) UI u: *JA F40 7312284-8 3 M är hållbara i månader vid kylskåpslagring. Då enzymet vid pH 8,2, provsatsens pH-värde för aktivitetsbestämningen, vid natrium- kloridkoncentrationer É>0,8 M hämmas genom saltet, måste lagrade lösningar, som innehåller 3 M natriumklorid, spädas i aktivitets- bestëmningen. Härvid visade sig den överraskande effekten, att pre- parationerna, vars aktivitet redan hade starkt sjunkit, genom saltet åter reaktiverades. I det extrema fallet kunde en aktivitetsförlust av 86,H % åter upphävas. För reaktiverinpen av enzymet är det er- - forderligt, att hålla natriumkloridkoncentrationen i enzymlësningen i minst en timmes tid på 3 mol/l och därefter späda. För att uppnå maximal reaktivering av glukosdehydrogenas, inställer man koncentra- tionen lämpligen mellan 0,05 och 0,1 M natriumklorid. Företrädes- vis använder man ett glukosdehydrogenaskoncentrat, som är 2-5, spe- ciellt 3_molärt med avseende på natriumklorid. För glukosbestämning- en späder man koncentratet så, att koncentrationen av natriumklorid i mätsatsen är 0,05-0,1 molar. På detta sätt uppnås såväl den op- timala stabiliteten av enzymet vid lagring såsom även den optimala aktiviteten i provsatsen.

Medlet enligt föreliggande uppfinning kan dessutom innehålla ytterligare beståndsdelar, som vanligen användes för ett diagnos- tiskt reagens. För förhindrande av bildning av störande små luft- blåsor i mätkyvetten eller för den snabba lösningen-av de fasta substanserna lämpar sig exempelvis tillsatsen av en detergent i en koncentration mellan 0,01 och 0,1 viktprocent. ter ifrågakommer t.ex. etoxylerad glycerol-monooleat eller lågked- Såsom detergen- jiga polyglykoletrar.

Stabiliteten hos de använda enzymerna och reagensen tillåter att man gör preparat av testsystemet, varvid nikotinamid-adenin-di- . nukleotid lämpligen frystorkas och enzymerna glukosdehydrogenas och mutarotas antingen frystorkas eller kan föreligga i lösning. Enzy- merna kan vara förblandade eller åtskilda, testförpackningen kan innehålla bufferten såsom lösning med NADH2-oxidasinhibitor och de- tergent. I denna form är testsystemet'vid kylskåpslagring hållbart i minst ett år.

För genomförande av testet bringas de i torr form föreliggande beståndsdelarna lämpligen först kort föreanvändningen genom tillsats av motsvarande mängd lösningsmedel åter i lösning. Förfarandet en- ligt föreliggande uppfinning genomföras, i det att man låter det ovan angivna beskrivna medlet inverka på det glukoshaltiga provet, som skall undersökas, och spektrofotometriskt eller flucrimetriskt mäter halten av bildat reducerat pyridin-koenzymu Därför blandas 10 h x C.) 30 55 HO 7312284-8 O / buffertlösnínren, enzymblandninpen av glukosdehydrogenas och muta- rotas samt provet i en kyvett och extinktionen El resp. _ Eutlina) någon extinktionsändring ej längre uppträder.

Blindprovet innehåller i stället för provlösningen destillerat vatten. avläses, så snart ërefter startas reaktionen genom tillsats av koenzymlös- ningen. Då extinktionen har blivit konstant, avlëses E2 resp.

E2(blínd) och ur de erhållna mätvärdena beräknas glukoshalten hos provet enligt Büchner (Eoppe-Sevler/Thierfelder, Handbuch der physio- logisch- und pathologisch-chemischen Analyse, 10:e upplagan, Springer-Verlag Eerlin/Göttingen/Heidelberg/New York, sid. 292 ff).

Mättemperaturen är inte kritisk. Det är lämpligt, att genom- föra bestämningen vid ca 20-U0°C, företrädesvis vid rumstemperatur.

Extinktionsmätninrarna sker i UV-området mellan 300 och H00 nm, fö- reträdesvis vid 366 nml I stället för extinktionsnëtningen i UV-om- rådet kan NADH2-koncentrationen även bestämmas fluorimetriskt. Här- för ges en impuls vid 366 nm eller vid 313 och 366 nm och fluores- cens-emissionen ovanför U20 nn nätes; kalibreringen sker med glukos- lösningar med känd halt.

Vid bestämningen av glukos i kroppsvätskor, såsom blod, serum eller plasma eller i andra äggvitehaltíga prov är ett föregående avlägsnande av äggvitan med de vanliga medlen för avlägsnande av äggvita lämpligt, såsom trikloroëttiksyra, perklorsyra eller uranyl- acetat/natriumklorid. Ett avlägsnande av äggvita från serum eller plasma är dock inte absolut erforderligt.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan även genomföras i analysautomater. För detta tillföres proven, som skall bestämmas, över en provsamlare ett analyssystem,'i vilket till de enstaka pro- ven beståndsdelarna i medlet enligt föreliggande uppfinning, sättes. _ Efter blandning och reaktionens utgång tillföres reaktionslösningen en spektrofotometer och mätas.

Föreliggande_medel kan även påföras på en bärare med sugförmâ- ga. Såsom bärare med sugförmåga kan alla de användas, som vanligen är i bruk för snabbtester. Mest utspridd är användningen av filt- rerpapper, dock kan även andra cellulosa- eller syntetprodukter med sugförmåga användas. Bärarna med sugförmåga, företrädesvis filtrer- papper, impregneras på i och för sig känt sätt med en eller flera impregneringslösningar, som innehåller glukosdehydrogenas, NAD och ett buffertsystem; Såsom mått för glukoshalten hos lösningen, som skall undersökas, kan man använda UV-fluorescens hos bildad NADH2, eller man kan efteråt infoga en från mutarotas kan man avstå. 10. 15 35 šO Vi UI H0 73122844 10 Lëmpligen användes härtill hydre- ringen av ett tetrazoliumsalt till motsvarande färgade formazan un- NADH2-indikerande färgreaktion. der inflytande av diaforas. Såsom lämpliga visar sig tetrazolium- salterna 2-(p-jodofenyl)-3-(p-nitrofenyl)-5-fenyl-tetrazoliumklorid (INT) och 3-(Ä,5-dimetyltiazolyl-l-2)-2,5-difenyl-tetrazoliumbro- mid (MTT).

Förutom bestämningen av glukos i biologiska vätskor, såsom blod, serum, plasma, urin, OSV, är föreliggande medel och förfaran- de av stor betydelse även för industrin, speciellt livsmedelsindust- rin- Glukosbestämningar är exempelvis av intresse vid analysen av honung, frukter, marmelader, sötsaker, fruktsafter, restsötma i vin, osv samt i sockerfabrikationen.

Föreliggande uppfinning belyses närmare genom efterföljande ekempel.

Exempel 1. I 0,1 ml serum avlägsnas ëggvitan med 1 ml 3-procentig trikloroättiksyralösning. 0,2 ml av överskiktet sättes i en kyvett till 2 ml 0,1 M trisbuffert (pH 355), som innehåller 0,5 mh 5-acet- ;flkíno1ín. Därefter pipetteras därtill 0,1 ml enzymblandning, som innehåller 120 U GDH/ml och 12 enheter mutarotas/ml i 0,05 M citrat- buffert (pH 6,5)/BM natriumklorid. Blindprovet innehåller i stäl- let för provlösningen 0,2 ml av medlet för avlägsnande av äggvita.

Analysprov och blindprov genomblandas och extinktionerna vid 560 nm avläses, så snart några extinktionsändringar ej längre uppträder (pa l-2 minuter).

Reaktionen startas sedan genom tillsats av 0,02 ml av den vat- tenhaltiga koenzymlösningen, som innehåller 0,58 M NAD. Efter ca 5 minuter är reaktionen avslutad och extinktionerna avläsas. Ur den mätta extinktionsdífferensen ÅÄE = 0,326 vid 366 nn beräknas en glukoshalt av 227 mg/100 ml serum.

Samma resultat erhålles om man använder en 0,1 M trisbuffert, som i stället för 0,05 mM 3-acetyfldnolin innehåller H5 mM nikotin- syra, 1,6 mM nikotinsyraamid, 0,H mM kinaldinsyra eller 0,13 mM kinolyl-2-klorometan. 0 De i testet angivna mutarotas-enheterna bestämdes på följande sätt: I en kyvett pipetteras 3 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7), inne- hållande 100 U peroxidas/ml buffert, 0,05 ml o-dianisidinlösning (10 mg/ml vatten), 0,1 ml glukosoxidaslösning (600 U/ml vatten) och 0,05 ml mutarotaslösning med obekant aktivitet. Genom tillsats av Qlmlnyberedd Qfglukoslösning (0,3 mg/ml vatten) startas reaktio- LO p; \.T| ,, 7312284-s nen.- Vid 25°C och H36 nm registreras extinktionsökningen per mi- På samma sätt bestämmes ett blindvärde, varvid i stället för De för blindvärdet och mätvär- nut. mutarotaslösningen vatten användes. det erhållna extinktionsökningarna per minut ÄÄE resp Älšblind insättes i följande heräkningsfornel: ÅÄE "¿ÄEb1ina mutarotas-enheter/ml enzymlösníng = 0.0: ß .I Exempel 2. 0,02 ml serum tillsättes direkt i reaktionen. Genomfö- randet av bestämnineen sker analogt med exempel 1, varvid följande beståndsdelar användes i den ordningsföljd de tillsättes: 2 ml 0,2 M trisbuffert (DH 7,3), innehållande 5 mM koffein, 0,02 ml serum resp. vatten vid blindprovet, 0,1 ml enzymblandning, framställd genom lösning av ett lyofilisat i citratbuffert (pH 6,5), så att 120 U GDH/ml och 12 enheter mutarotas/ml föreligger; 0,02 ml vattenhaltig koenzymlösning, innehållande 0,52 M NAD.

Efter reaktionens förl0PP (ca 5 minuter) uträknas ur den mätta extinktionsdifferensen ÅÄE = 0,15U en glukoshalt av 96 mg/100 ml serum.

Samma resultat erhålles, om man använder en buffertlösning, som i stället för 3 mfl koffein innehåller 0,35 mM urinsyra, 21 mfl teofyllin, 2,6 mW desoxiguanosin, 30 mM inosín eller 50 nä xantosin.

Om man i stället för ovan angivna enzymer använder en häggra- digt renad enzymblandning med 2500 U GDH/ml och 250 enheter mutaro- tas/ml, så är reaktionen redan avslutad efter 10 sekunder. Resul- tatet är detsamma som ovan. _ Exempel 3. Urin spädes med dubbeldestillerat H,0 i förhållandet 1:11 och 0,2 ml av den erhållna provlösninçen användes i reaktio- nen. Genomförandet av bestämninyen sker analogt med exempel l, var- vid följande beståndsdelar användes i den ordningsföljd de tillsät- tes:. 2 mi 0,1 M rosfacbuffert (pH 6.5), innehållande ho mn eniro- salicylsyra, 0,2 ml utspädd urin resp. vatten vid blindprovet, 0,1 ml enzymblandninz, innehållande 300 U GDH/ml och 30 enheter mutarotas/ml, löst i 0,05 M citratbuffert (pH 6,5), som är 3% med avseende på natriumklorid, 0,02 ml vattenhaltig koenzymlösning, in- nehâllande 0,25 M NAD.

Efter ca två minuter är reaktionen slut. differensŧ,E = 0,305 ger som resultat en glukoshalt av 212 mg/IO0 ml urin. I Beräknad extinktions- 10 IV CJ 25 BO 35 Ä0, '7312284-8 12 'Samma resultat erhålles, om man använder en buffertlösning, som i stället för H0-mM sulfosalicylsyra innehåller l mM m-hydroxiben-' soesyra, 0,5 mM salicylsyra, 0,7 mM acetylsalicylsyra, 10 mä sali- cylamid eller 50 mM_l~(p-klorofenylsulfonyl)-3-propylkarbamid.

Exempel Ä. Ett prov av 5H,0 g honung löses i dubbeldestillerat vat- -ten, kompletteras_till 100 ml och 0,2 ml härav användes för glukos-' bestämning. Genomförandet sker analogt med exempel 1, varvid föl- jande beståndsdelar användes i den ordningsföljd de tillsättes: 2 ml 0,2 M fosfatbuffert (pH 7,3), innehållande H0 mn sulfo- salicylsyra, 0,2 ml.av lösningen, som skall undersökas, resp. vat- ten vid blindprovet, 0,1 ml enzymblandning, innehållande 300 U GDH/ml och 20 enheter mutarotas/ml, 0,02 ml vattenhaltig koenzym- lösning, innehållande 0,32 M NAD eller motsvarande mängd NADP.

Efter reaktionens förlopp (ca 2 minuter) erhålles en extink- tionsdifferens av ÄÄE = 0,338. Därur beräknas en halt av 2l,ü mg g1ukos_per 100 ml undersökningslösning; honungen innehåller följ- aktligen 39,6 5 glukos. _ Exempel 5. En testförpackníng för enzymatisk bestämning av glukos, tillräcklig för ca 90 bestämningar och 10 blindvärden, innehåller följande beståndsdelar: mu_ 1. 110 ml av ett medel för avlägsnande av äggvita, som är fär- digt att användas, närmare bestämt antingen en 3-procentíg lösning av trikloro-ättiksyra eller en 2-procentig vattenhaltig lösning av perklorsyra. ' 2. 220 ml buffert färdig att användas med pH 7,5, närmare be- stämt antingen 200 mM fosfatbuffert eller 100 mM trishydroximetyl-' aminometan. ' 3. ll ml av en lösning färdig att användas av GDH och mutarotas i 50 mm citratbuffert (pH 6,5)/5 M natríumklorid eller en lyofili- serad enzymblandning av GDH och mutarotas, som för förbrukningen löses i ll ml 50 mM citratbuffert, varvid i bäda fallen 120 U GDE1m1 och_l2 enheter mutarotas/ml är närvarande.

N. Lyofiliserad NAD eller NADP, som för användningen löses i 2,2 ml dubbeldestillerat vatten, varvid en molaritet av 330 mM blir resultatet.

Glukosbestämningen med denna testförpackning utföres såsom be- skrives i.de ovan angivna exemplen.

Exempel 6. För framställning av testremsor för halvkvantitativ_ glukosbestämning löses 2150 U diaforas (bestämd enligt H.U. Berg- meyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2:a upplagan, sid N06, 10 15 20 25 50 HO _ en och torkas vid 2500 i luftström. “ minut.beddmes den bildade färgen med hjälp av en färgskala. 7312284-'8 Verlag Chemie, weinheim (1970)), 1200 U GDH, 0,13 mmol NAD, 20 mg 2-(p~jodofenyl)-3-(p-nitrofenyl)~5-fenyltetrazoliumklorid (INT) (resp 14 mg 3-(M,5-dimetyltiazolyl-l-2)-2,5-difenyltetrazoliumbro- mid (MTT) i 20 ml 0,01 M fosfathuffert (pH 6,5) och lösningens Filtrerpapper 13 pH-värde justeras efteråt eventuellt till 6,5. (âchleicher och Schüll nr lü50 CV) impregneras med reagenslösning- På så sätt erhållet impregne- rat filtrerpapper skëres i små kvadrater av ca'6 x 6 mm och påföres Det är lämpligt att redan innan impregneringen påsvetsa bäraren med sugförmåga på på plastremsor av 6 x 60 mm vid den undre änden. en bärarfolie.

I urinproven av olika glukoshalt neddoppas de på så sätt fram- ställda små undersökningsstavarna i precis 5 sekunder och efter en Under det att vid proven utan glukos inte någon färgning uppträder, vi- sar sig glukoskoncentrationer från 50 till 100 mgß genom svag rosa- färgning (resp. gråblå färgning vid användning av MTT) inom omrâ- det från 250 mg% genom intensiv rosafärgning (resp. blåfërgning) och ovanför 500 mgñ genom röd- (resp. mörkblå-)färgning. _ Exempel 7. Ur 0,1 ml helblod avlägsnas äggvita ned 1,0 nl perklor- syra (2,0 viktprocent i duhbeldestillerat vatten), på analogt sätt blandas 0,1 ml av en vattenhaltig glukos-standardlösning (100 mgß) med 1,0 ml av medlet för avlägsnande av äggvita. Med hjälp av ett mekaniserat analyssystem företagas fdljande pipetteringar.

Vardera 2,0 ml i förväg blandad buffert-enzym-blandning, pH 7,6, innehållande 0,12 M fosfatjoner,_0,l5 M NaCl, 20 U GDH/nl och 2 enheter mutarotas/ml blandas med 0,2 ml prov, där äggvitan avlägs- nats, (analys) resp. 0,2 ml perklorsur standardlösning (standard) resp, 0,2 ml medel för avlägsnande av äggvita (blindprov) och reak- tionen startas för vardera med 0,02 ml vattenhaltig NAD-lösning (0,2? M). Efter justering av utslaget med blindprovet till 0 be- stëmmes efter en inkubationstid av 5 minuter vid 366 nm extinktio- nen av standarden ES och analysen EA.

De mätta extinktionsvärdena ES = 0,150 och EA = 0,ü39 uttryck- es; på känt sätt beräknar man därur glukoskoncentrationen hos pro- vet till 293 mgß.

Samma resultat erhåller man vid genomförandet av analysen i anordningar, som arbetar efter flödesprincipen (continous flow) eller med centrifugalkraft. Beräkning av glukoskoncentrationen'i provet sker här med hjälp av en kalibreringskurva, som man framstäl- ler genom analys av en serie standardlösningar av olika koncentra- tion. _...-_.._-.-_..__..-

Claims (6)

731228#'8 11+ Patentkrav A

1. Förfarande för enzymatisk bestämning av glukos, k ä n n e t e c k n a t därav, att man bringar ett medel, som består av glukosdehydrogenas med èn aktivitet av minst 2 U/ml provlösning, ett pyridin-koenzym, buffertsubstanser med ett pH- värde från 6,5 till 8,5, mutarotas, varvid enzymenheternas för- I hållande av glukosdehydrogenas till mutarotas utgör ca 10:0,25-1, och eventuellt inhibitorer för oxidaser för reducerade pyridin- koenzymer och/eller alkalikloríd, att inverka på det glukoshaltiga provet, som skall-undersökas, och mäter halten av bildat reduce- rat pyridin-koenzym spektrofotometriskt eller fluorimetriskt.

2; Medel för utförande av förfarandet enligt krav 1 medelst glukosdehydrogenas med en aktivitet av minst 2 U/ml provlösning,/ ett nyridin-koenzym och buffertsubstanser med ett pH-värde från 6,5 till 8,5 under bildning av glukonsyra och reducerat pyridin- koenzym, k å n n e t e c k n a_t av en halt av mutarotas och eventuellt inhibitorer för oxidaser för reducerade pyridin-koen- zymer och/eller alkalíklorid, varvid enzymenheternas fömüälande av glukosdehydrogenas till mutarotas utgör ca 10:O,25-1.

3. Medel för enzymatisk bestämning av glukos enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att pyridin-koenzymerna är nikotina- mid-adenin-dinukleotid (NAD) eller nikotinamid-adenin-dinukleo- tid-fosfat (NADP).

4. Medel för enzymatisk bestämning av glukos enligt krav 2-3, k ä n n e t e c k n a t' av att de eventuellt ingående inhibítorerna för oxidaser för reducerade pyridin-koenzymer är pyridin-, pyrin- och/eller hydroxibensoesyraderívat.

5. Medel för enzymatisk bestämning av glukos enligt krav 2-H, k ä n n e t e c k n a t av att de eventuellt ingående inhí- bitorerna för oxidaser för reducerade pyridin-koenzymer är 3-acetyl-kinolin och/eller sulfosalicylsyra.

6..Medel för enzymatisk bestämning av glukos enligt krav 2-5, k ä n n e t e c k n a t av att den eventuellt innehållna alkalikloriden är natriumklorid. -___-..~__-__ “ ANFöRnA PuaL1| Anal. Biochem. 43 (1971) 312-15. ' cum chim. Acta 37 (1972S, 538-40.