RU97113529A

RU97113529A - MODIFIED THERMOSTABLE DNA POLYMERASE

Info

Publication number: RU97113529A
Application number: RU97113529/13A
Authority: RU
Inventors: Хэрроу Гелфенд Дейвид; Вивиан Кэлмэн Лиза; Лоренс Райхерт Фред
Original assignee: Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 1996-08-06
Filing date: 1997-08-06
Publication date: 1999-07-20

Claims

1. Термостабильная ДНК-полимераза, которая содержит аминокислотную последовательность SerGlnIleXaaLeuArgХаа (SED ID NO : 1), где "Xaa" в положении 4 этой последовательности представляет собой остаток любой аминокислоты, кроме остатка глутаминовой кислоты (Glu), а "Хаа" в положении 7 этой последовательности представляет собой остаток валина (Vа1) или остаток изолейцина (Ile).1. Thermostable DNA polymerase, which contains the amino acid sequence SerGlnIleXaaLeuArgXaa (SED ID NO: 1), where “Xaa” at position 4 of this sequence is the residue of any amino acid except glutamic acid residue (Glu), and “Haa” at position 7 this sequence is a valine residue (Va1) or an isoleucine residue (Ile).

2. Термостабильная ДНК-полимераза по п. 1, отличающаяся тем, что она представляет собой рекомбинантное производное встречающейся в естественных условиях термостабильной ДНК-полимеразы, причем эта встречающаяся в естественных условиях термостабильная ДНК-полимераза содержит аминокислотную последовательность-мотив SerGlnIleGluLeuArgХаа (SED ID NO: 2), где "Хаа" в положении 7 этой последовательности обозначает остаток валина (Vа1) или остаток изолейцина (Ilе). 2. Thermostable DNA polymerase according to claim 1, characterized in that it is a recombinant derivative of naturally occurring thermostable DNA polymerase, this naturally occurring thermostable DNA polymerase contains the amino acid sequence motif SerGlnIleGluLeuArgXaa (SED ID NO: 2), where “Haa” at position 7 of this sequence denotes the remainder of valine (Va1) or the remainder of isoleucine (Ilе).

3. Термостабильная ДНК-полимераза по п. 2, отличающаяся тем, что ее способность ограничивать включение несвойственных нуклеотидов понижена по сравнению с таковой способностью встречающейся в естественных условиях термостабильной ДНК-полимеразы. 3. Thermostable DNA polymerase according to claim 2, characterized in that its ability to limit the inclusion of unusual nucleotides is reduced compared with that of the naturally occurring thermostable DNA polymerase.

4. Термостабильная ДНК-полимераза по п. 3, отличающаяся тем, что ее способность включать несвойственный нуклеотид по сравнению со способностью соответствующей нативной формы полимеразы включать несвойственный нуклеотид возрастает по крайней мере в 20 раз. 4. Thermostable DNA polymerase according to claim 3, characterized in that its ability to include an unusual nucleotide in comparison with the ability of the corresponding native form of polymerase to include an unusual nucleotide increases by at least 20 times.

5. Термостабильная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что она имеет достаточную активность для применения в реакции секвенирования ДНК, предусматривающий использование несвойственного нуклеотида, который предпочтительно является рибонуклеозидтрифосфатом, трифосфатом, и соответствующего обычного нуклеотида при соотношении 1:1 или менее. 5. Thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that it has sufficient activity for use in the DNA sequencing reaction, involving the use of an unusual nucleotide, which is preferably ribonucleoside triphosphate, triphosphate, and the corresponding conventional nucleotide in a ratio of 1: 1 or less.

6. Термостабильная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что она имеет достаточную активность для применения в реакции секвенирования ДНК, предусматривающий использование несвойсвенного нуклеотида, который является рибонуклеозидтрифосфатом, присутствующего в концентрации менее приблизительно 100 мкМ, и соответствующего обычного нуклеотида, присутствующего в концентрации более приблизительно 100 мкМ. 6. Thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that it has sufficient activity for use in the DNA sequencing reaction, involving the use of an unspecified nucleotide, which is ribonucleoside triphosphate, present at a concentration of less than about 100 μM, and the corresponding ordinary nucleotide, present at a concentration of more than about 100 μM.

7. Термостабильная ДНК-полимераза по любому из пп. 2-6, которая представляет собой рекомбинантное производное встречающейся в естественных условиях термостабильной ДНК-полимеразы из организма, выбранного из группы, включающей Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus вид Z05, Thermus вид spsl7, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax и Bacillus stearothermophilus. 7. Thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 2-6, which is a recombinant derivative of naturally occurring thermostable DNA polymerase from an organism selected from the group consisting of Thermus aquaticus, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species spsl7, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Anaerocellum thermophilum, Bacillus caldotenax and Bacillus stearothermophilus.

8. Термостабильная ДНК-полимераза по любому из пп. 2-6, которая представляет собой рекомбинантное производное встречающейся в естественных условиях термостабильной ДНК-полимеразы из видов рода Thermus, предпочтительно ДНК-полимеразы Taq или гомологичной ей полимеразы, наиболее предпочтительно термостабильной ДНК-полимеразы, которая содержит аминокислотную последовательность LeuAspTyrSerGInlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (SEQ ID NO: 5). 8. Thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 2-6, which is a recombinant derivative of a naturally occurring thermostable DNA polymerase from species of the Thermus genus, preferably Taq DNA polymerase or a homologous polymerase thereof, most preferably thermostable DNA polymerase that contains the amino acid sequence LeuAspTyrSerGInlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuAlaHis5: )

9. Термостабильная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-6, последовательность которой гомологична аминокислотной последовательности ДНК-полимеразы Taq (SEQ ID NO: 7) по крайней мере приблизительно на 39%, предпочтительно по крайней мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно на 80%. 9. Thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-6, the sequence of which is homologous to the amino acid sequence of Taq DNA polymerase (SEQ ID NO: 7) by at least about 39%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 80%.

10. Нуклеотидная последовательность, кодирующая термостабильную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-9. 10. The nucleotide sequence encoding the thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-9.

11. Вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую термостабильную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-9. 11. A vector containing the nucleotide sequence encoding the thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-9.

12. Клетка-хозяин, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую термостабильную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-9. 12. A host cell containing a nucleotide sequence encoding a thermostable DNA polymerase according to any one of claims. 1-9.

13. Способ получения термостабильной ДНК-полимеразы, включающий
(а) культивирование клетки-хозяина по п. 12 в условиях, которые усиливают экспрессию термостабильной ДНК-полимеразы; и
(б) выделение термостабильной ДНК-полимеразы из клетки-хозяина или из среды для культивирования.13. A method of obtaining a thermostable DNA polymerase, including
(a) culturing the host cell according to claim 12 under conditions that enhance the expression of thermostable DNA polymerase; and
(b) isolation of thermostable DNA polymerase from the host cell or from the culture medium.

14. Термостабильная ДНК-полимераза, полученная способом по п. 13. 14. Thermostable DNA polymerase obtained by the method according to p. 13.

15. Применение термостабильной ДНК-полимеразы по любому из пп. 1-9 для амплификации нуклеиновой кислоты или для реакции секвенирования. 15. The use of thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-9 for amplification of a nucleic acid or for a sequencing reaction.

16. Композиция для применения в реакции секвенирования ДНК, которая содержит нуклеиновую кислоту-матрицу; олигонуклеотидный праймер, комплементарный этой матрице; термостабильную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-9; смесь обычных дНТФ; и по крайней мере один несвойственный нуклеотид, причем соотношение между несвойственным нуклеотидом и соответствующим обычным нуклеотидом составляет 1 : 1 или менее. 16. A composition for use in a DNA sequencing reaction that comprises a nucleic acid matrix; an oligonucleotide primer complementary to this matrix; thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-9; a mixture of conventional dNTP; and at least one unusual nucleotide, wherein the ratio between the unusual nucleotide and the corresponding conventional nucleotide is 1: 1 or less.

17. Композиция по п. 16, где несвойственный нуклеотид представляет собой рибонуклеотид, причем этот рибонуклеотид предпочтительно присутствует в концентрации ниже приблизительно 100 мкМ, а соответствующий обычный нуклеотид присутствует в концентрации выше приблизительно 100 мкМ. 17. The composition according to p. 16, where the unusual nucleotide is a ribonucleotide, and this ribonucleotide is preferably present at a concentration below about 100 μM, and the corresponding ordinary nucleotide is present at a concentration above about 100 μM.

18. Композиция по п. 17, отличающаяся тем, что несвойственный нуклеотид является немеченым. 18. The composition according to p. 17, characterized in that the unusual nucleotide is unlabeled.

19. Способ секвенирования нуклеиновой кислоты-мишени, включающий следующие стадии
(а) подготовку несвойственного нуклеотида и соответствующего обычного нуклеотида для реакции секвенирования ДНК, причем несвойственный и соответствующий обычный нуклеотиды присутствуют в соотношении менее приблизительно 1:1;
(б) обработку реакционной смеси со стадии (а) в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы по любому из пп. 1-9 в условиях, пригодных для удлинения праймера, с получением продуктов удлинения праймера, содержащих этот несвойственный нуклеотид;
(в) обработку продуктов удлинения праймера со стадии (б) в условиях, пригодных для гидролиза этих продуктов удлинения праймера;
(г) разделение продуктов реакции со стадии (в); и
(д) определение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.19. A method for sequencing a target nucleic acid, comprising the following steps
(a) preparing an unusual nucleotide and a corresponding conventional nucleotide for a DNA sequencing reaction, wherein the unusual and corresponding conventional nucleotides are present in a ratio of less than about 1: 1;
(b) treating the reaction mixture from step (a) in the presence of a thermostable DNA polymerase according to any one of claims. 1-9 under conditions suitable for primer extension, to obtain primer extension products containing this unusual nucleotide;
(c) processing the primer extension products from step (b) under conditions suitable for hydrolysis of these primer extension products;
(d) separation of reaction products from step (c); and
(e) determining the sequence of the target nucleic acid.

20. Способ секвенирования по п. 19, где несвойственный нуклеотид представляет собой рибонуклеотид, предпочтительно присутствующий в концентрации приблизительно 0,1 мкМ-100 мкМ. 20. The sequencing method according to claim 19, where the unusual nucleotide is a ribonucleotide, preferably present in a concentration of approximately 0.1 μm-100 μm.

21. Способ секвенирования по п. 19, где соответствующий обычный нуклеотид предпочтительно присутствует в концентрации приблизительно 50-500 мкМ. 21. The sequencing method of claim 19, wherein the corresponding conventional nucleotide is preferably present at a concentration of about 50-500 μM.

22. Набор для секвенирования нуклеиновой кислоты, содержащий термостабильную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-9 и необязательно дополнительные реагенты, используемые в таком методе секвенирования, такие, как, например, один или несколько олигонуклеотидных праймеров, смесь обычных дНТФ и по крайней мере один несвойственный нуклеотид, причем соотношение между несвойственным нуклеотидом и соответствующим обычным нуклеотидом предпочтительно меньше 1. 22. A kit for sequencing a nucleic acid containing thermostable DNA polymerase according to any one of paragraphs. 1-9 and optionally additional reagents used in such a sequencing method, such as, for example, one or more oligonucleotide primers, a mixture of conventional dNTPs and at least one unusual nucleotide, the ratio between the unusual nucleotide and the corresponding ordinary nucleotide being preferably less than 1.

23. Изобретение, как оно представлено в данном описании. 23. The invention, as presented in this description.