RU2821918C1 - Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof for producing amino acids - Google Patents
Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof for producing amino acids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2821918C1 RU2821918C1 RU2023109998A RU2023109998A RU2821918C1 RU 2821918 C1 RU2821918 C1 RU 2821918C1 RU 2023109998 A RU2023109998 A RU 2023109998A RU 2023109998 A RU2023109998 A RU 2023109998A RU 2821918 C1 RU2821918 C1 RU 2821918C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- recombinant
- lysine
- seq
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 133
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 133
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 title claims abstract description 92
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 87
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 56
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 16
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 97
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 94
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 88
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 86
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 82
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 23
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 19
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 18
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 17
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 5-aminopentanoic acid Chemical compound [NH3+]CCCCC([O-])=O JJMDCOVWQOJGCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 16
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 14
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 9
- OSCCDBFHNMXNME-YUPRTTJUSA-N (4S)-4-hydroxy-L-isoleucine zwitterion Chemical compound C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O OSCCDBFHNMXNME-YUPRTTJUSA-N 0.000 claims description 8
- RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylpiperidin-4-one Chemical compound CS(=O)(=O)N1CCC(=O)CC1 RTBFRGCFXZNCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N anhydrous glutaric acid Natural products OC(=O)CCCC(O)=O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diamine Chemical compound CCCCC(N)N KJOMYNHMBRNCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 4
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 claims description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 9
- 101150057904 ddh gene Proteins 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-diaminopimelic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101100166134 Streptococcus thermophilus (strain ATCC BAA-491 / LMD-9) cas9-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100166135 Streptococcus thermophilus (strain ATCC BAA-491 / LMD-9) cas9-2 gene Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 4
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 101100315256 Brassica campestris PEC-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 10,10-diamino-1,6-dioxacyclotridecane-2,5,7,13-tetrone Chemical compound NC1(CCC(=O)OC(CCC(=O)OC(CC1)=O)=O)N VBNGJYNPUFWTKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 2
- IXZNKTPIYKDIGG-REOHCLBHSA-N 4-phospho-L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(=O)OP(O)(O)=O IXZNKTPIYKDIGG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 2
- -1 His Chemical compound 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 108010056578 diaminopimelate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150087770 recT gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 108010073086 succinyl-CoA-tetrahydrodipicolinate N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101710082233 2,4-diaminopentanoate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100062433 Arabidopsis thaliana DHDPS1 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710092096 Diaminopimelate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108030003594 Diaminopimelate decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108010001625 Diaminopimelate epimerase Proteins 0.000 description 1
- 101000779367 Escherichia coli (strain K12) Lysine-sensitive aspartokinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710141619 Meso-diaminopimelate D-dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 108010009197 Succinyldiaminopimelate transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940097572 chloromycetin Drugs 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009649 dapC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150000582 dapE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062988 dapF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L disodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-] OKBPCTLSPGDQBO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000006486 human diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150033534 lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000022558 protein metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- IBUIVNCCBFLEJL-UHFFFAOYSA-M sodium;phosphoric acid;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OP(O)(O)=O IBUIVNCCBFLEJL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биоинженерии, в частности, к полипептиду с аспартаткиназной активностью, рекомбинантному полипептиду, полинуклеотиду, кодирующему указанный полипептид или указанный рекомбинантный полипептид, конструкции нуклеиновой кислоты, рекомбинантному вектору экспрессии, рекомбинантной клетке-хозяину и способу получения аминокислоты.The present invention relates to the field of molecular biology and bioengineering, in particular to a polypeptide with aspartate kinase activity, a recombinant polypeptide, a polynucleotide encoding said polypeptide or said recombinant polypeptide, a nucleic acid construct, a recombinant expression vector, a recombinant host cell and a method for producing an amino acid.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
Лизин, химическое название которого – 2,6-диаминопимеловая кислота, является незаменимой аминокислотой для организма животных и человека. Его функции включают стимулирование роста, повышение иммунитета и улучшение функции тканей центральной нервной системы. Лизин включает три оптических изомера, а именно, L-форму (левовращающую), D-форму (правовращающую) и DL-форму (рацемическую), из которых только L-форма пригодна для использования с биологической точки зрения, и обычно под лизином подразумевают L-лизин. Лизин известен как первая лимитирующая аминокислота, потому что злаки – основной продукт питания человека – имеют низкое содержание лизина, а недостаток лизина может привести к дисфункции белкового обмена и неблагоприятному влиянию на рост; кроме того, лизин подвержен разрушению во время обработки. Лизин занимает очень важное место в фармацевтике, здравоохранении, пищевой, кормовой и косметической промышленности.Lysine, whose chemical name is 2,6-diaminopimelic acid, is an essential amino acid for animals and humans. Its functions include promoting growth, enhancing immunity, and improving the function of central nervous system tissues. Lysine contains three optical isomers, namely, L-form (levorotatory), D-form (dextrorotary) and DL-form (racemic), of which only the L-form is biologically useful, and lysine is generally understood to mean L -lysine. Lysine is known as the first limiting amino acid because cereals, a staple of the human diet, have low lysine content, and lysine deficiency can lead to dysfunction of protein metabolism and adverse effects on growth; in addition, lysine is susceptible to destruction during processing. Lysine occupies a very important place in the pharmaceutical, healthcare, food, feed and cosmetic industries.
На сегодняшний день существует три метода промышленного производства лизина, а именно, метод протеолиза, метод химического синтеза и метод микробиологической ферментации. Среди них метод микробиологической ферментации имеет такие преимущества, как низкая стоимость, высокая интенсивность производства, высокая специфичность и низкий уровень загрязнения окружающей среды, и поэтому он становится наиболее широко применяемым методом промышленного производства лизина. В промышленном производстве лизина широко используются бактерии Corynebacterium и Escherichia. Например, обычно используемая Escherichia представляет собой Escherichia coli, обычно используемая Corynebacterium включает Corynebacterium glutamicum из рода Corynebacterium, Brevibacterium flavum из рода Brevibacterium, и некоторые виды Arthrobacterium и некоторые виды Microbacterium. Из-за своего физиологического превосходства Corynebacterium glutamicum стал наиболее важным штаммом для производства в промышленности.Today, there are three methods for the industrial production of lysine, namely, the proteolysis method, the chemical synthesis method and the microbiological fermentation method. Among them, the microbiological fermentation method has the advantages of low cost, high production intensity, high specificity and low environmental pollution, and therefore it has become the most widely applied method for the industrial production of lysine. Corynebacterium and Escherichia bacteria are widely used in the industrial production of lysine. For example, a commonly used Escherichia is Escherichia coli, a commonly used Corynebacterium includes Corynebacterium glutamicum of the genus Corynebacterium, Brevibacterium flavum of the genus Brevibacterium, and some Arthrobacterium species and some Microbacterium species. Because of its physiological superiority, Corynebacterium glutamicum has become the most important strain for industrial production.
Corynebacterium glutamicum имеет два пути биосинтеза лизина, т. е. дегидрогеназный путь и сукцинилазный путь. В синтезе лизина посредством Corynebacterium glutamicum по дегидрогеназному пути участвуют шесть ферментов, катализирующих реакции: аспартаткиназа (AK, кодируется геном lysC), аспартаполуальдегиддегидрогеназа (ASADH, кодируется геном asd), дигидродипиколинатсинтаза (DHDPS, кодируется геном dapA), дигидродипиколинатредуктаза (DHDPR, кодируется геном dapB), диаминопимелатдегидрогеназа (DAPDH, кодируется геном ddh) и диаминопимелатдекарбоксилаза (DAPDC, кодируется геном lysA). В синтезе лизина посредством Corynebacterium glutamicum по сукцинилазному пути участвуют еще четыре фермента для синтеза мезодиаминопимелиновой кислоты: тетрагидродипиколинатсукцинилаза(кодируется геном dapD), N-сукцинилдиаминопимелатаминотрансфераза(кодируется геном dapC), сукцинилдиаминопимелатдеацилаза (кодируется геном dapE) и диаминопимелатэпимераза (кодируется геном dapF). Первойстадией пути биосинтеза L-аспарагиновой кислоты посредством Corynebacterium glutamicum является получение аспартатфосфатазы из L-аспартата, катализируемое аспартаткиназой, что также является лимитирующей стадией получения лизина. Активность аспартаткиназы ингибируется лизином по принципу обратной связи [1]. Поэтому устранение ингибирования аспартаткиназы лизином по принципу обратной связи в пути биосинтеза лизина имеет большое значение для селекции высокопродуктивных штаммов-продуцентов лизина.Corynebacterium glutamicum has two pathways for lysine biosynthesis, i.e., dehydrogenase pathway and succinylase pathway. Lysine synthesis by Corynebacterium glutamicum via the dehydrogenase pathway involves six enzymes that catalyze reactions: aspartate kinase (AK, encoded by the lysC gene), aspartate semialdehyde dehydrogenase (ASADH, encoded by the asd gene), dihydrodipicolinate synthase (DHDPS, encoded by the dapA gene), dihydrodipicoline reductase (DHDPR, encoded by the dapB gene ), diaminopimelate dehydrogenase (DAPDH, encoded by the ddh gene) and diaminopimelate decarboxylase (DAPDC, encoded by the lysA gene). Lysine synthesis by Corynebacterium glutamicum via the succinylase pathway involves four more enzymes for the synthesis of mesodiaminopimelic acid: tetrahydrodipicolinate succinylase (encoded by the dapD gene), N-succinyldiaminopimelate aminotransferase (encoded by the dapC gene), succinyldiaminopimelate deacylase (encoded by the dapE gene) and diaminopimelate epimerase ( encoded by the dapF gene). The first step in the L-aspartic acid biosynthesis pathway by Corynebacterium glutamicum is the production of aspartate phosphatase from L-aspartate, catalyzed by aspartate kinase, which is also the rate-limiting step in the production of lysine. The activity of aspartate kinase is inhibited by lysine according to the feedback principle [1]. Therefore, elimination of feedback inhibition of aspartate kinase by lysine in the lysine biosynthesis pathway is of great importance for the selection of highly productive lysine-producing strains.
В ссылочном документе 1 раскрыты мутанты аспартаткиназы, нечувствительные к ингибированию лизином. Путем случайного мутагенеза гена, кодирующего аспартаткиназу III (аспартаткиназа III, AKIII), выделенного из Escherichia coli, отбирают и получают два мутанта AK III, устраняющих ингибирование по принципу обратной связи, соответственно путем замены треонина изолейцином в положении 352 (T352I) и замены метионина изолейцином в положении 318 (M318I). Хотя эти два мутанта AK III способны устранять ингибирование аспартаткиназы лизином по принципу обратной связи, они не могут обеспечить высокопродуктивные штаммы-продуценты лизина со значительным увеличением выхода лизина из-за их низкой эффективности продукции лизина.Reference 1 discloses aspartate kinase mutants that are insensitive to lysine inhibition. By random mutagenesis of the gene encoding aspartate kinase III (aspartate kinase III, AKIII) isolated from Escherichia coli, two AK III mutants were selected and obtained that eliminated feedback inhibition, respectively by replacing threonine with isoleucine at position 352 (T352I) and replacing methionine with isoleucine in position 318 (M318I). Although these two AK III mutants are able to reverse feedback inhibition of aspartate kinase by lysine, they cannot provide high-yielding lysine-producing strains with a significant increase in lysine yield due to their low lysine production efficiency.
В ссылочном документе 2 раскрыты мутанты аспартаткиназы из Corynebacterium glutamicum, включая 279T, A279V, S301F, T308I, S301Y, G345D, R320G, T311I и S381F. Эти мутантные AK III могут устранять ингибирование аспартаткиназы лизином по принципу обратной связи, но кардинально различаются по обеспечиваемой эффективности продукции лизина. T311I представляет собой мутант, который, как сообщается, обладает наилучшей производительностью при применении для получения лизина и может значительно повысить выход продукции лизина штаммами. Получение мутанта аспартаткиназы, устраняющего ингибирование лизином по принципу обратной связи при одновременном достижении более высокой производительности в отношении продукции лизина, является задачей, требующей решения специалистом в данной области техники.Reference Document 2 discloses aspartate kinase mutants from Corynebacterium glutamicum, including 279T, A279V, S301F, T308I, S301Y, G345D, R320G, T311I, and S381F. These AK III mutants can reverse feedback inhibition of aspartate kinase by lysine, but differ dramatically in the efficiency of lysine production they achieve. T311I is a mutant that is reported to have the best performance when applied to lysine production and can significantly improve the lysine production yield of the strains. Producing an aspartate kinase mutant that eliminates feedback inhibition by lysine while achieving higher lysine production rates is a challenge to be addressed by one skilled in the art.
Ссылочные документы:Reference documents:
Ссылочный документ 1: EP1394257Reference document 1: EP1394257
Ссылочный документ 2: EP1590463A2Reference document 2: EP1590463A2
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Решаемая задачаProblem to be solved
Ввиду проблем, присущих уровню техники, таких как проблема, заключающаяся в том, что мутанты аспартаткиназы не могут продуцировать лизин стабильным и высокоэффективным образом, в настоящем изобретении предложен полипептид с аспартаткиназной активностью, который представляет собой мутант аспартаткиназы дикого типа. По сравнению с аспартаткиназой дикого типа мутантный полипептид согласно настоящему изобретению устраняет ингибирование аспартаткиназы лизином по принципу обратной связи, обладает высокой аспартаткиназной активностью и может применяться для стабильного и эффективного получения лизина.In view of problems inherent in the prior art, such as the problem that aspartate kinase mutants cannot produce lysine in a stable and highly efficient manner, the present invention provides a polypeptide with aspartate kinase activity that is a wild-type aspartate kinase mutant. Compared with wild-type aspartate kinase, the mutant polypeptide of the present invention eliminates the feedback inhibition of aspartate kinase by lysine, has high aspartate kinase activity, and can be used for stable and efficient production of lysine.
Решение задачиThe solution of the problem
(1) Полипептид с аспартаткиназной активностью, выбранный из группы, состоящей из любого из (i)-(iv):(1) A polypeptide with aspartate kinase activity selected from the group consisting of any of (i)-(iv):
(i) мутант полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, где по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, мутант содержит мутацию по меньшей мере в одном или более положениях, соответствующих положениям 293, 294 и 307 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1;(i) a mutant of a polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein, compared to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the mutant contains a mutation in at least one or more positions corresponding to positions 293, 294 and 307 the sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(ii) полипептид, обладающий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью, представленной в (i), и не содержащий полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1;(ii) a polypeptide having at least 70%, at least 80%, or at least 90% sequence identity with the sequence presented in (i), and not containing a polypeptide having the sequence presented in SEQ ID NO: 1;
(iii) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, где полинуклеотид гибридизуется с полинуклеотидом, представленным в (a) или (b), в очень высокожестких условиях:(iii) a polypeptide encoded by a polynucleotide, where the polynucleotide hybridizes to the polynucleotide presented in (a) or (b) under very high stringency conditions:
(a) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в (i);(a) a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in (i);
(b) полноразмерный полинуклеотид, комплементарный (a);(b) full-length polynucleotide complementary to (a);
(iv) фрагмент полипептида, представленного в (i), (ii), (iii), где фрагмент сохраняет аспартаткиназную активность.(iv) a fragment of the polypeptide presented in (i), (ii), (iii), where the fragment retains aspartate kinase activity.
(2) Полипептид согласно (1), который представляет собой полипептид, содержащий мутацию, представленную в по меньшей мере одной из следующих групп (c)-(e):(2) The polypeptide according to (1), which is a polypeptide containing a mutation present in at least one of the following groups (c)-(e):
(c) аминокислота в положении, соответствующем положению 293 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, мутирована из изолейцина (I) в серин (S), глицин (G), глутаминовую кислоту (E), пролин (P), триптофан (W), тирозин (Y), гистидин (H), метионин (M), глутамин (Q), цистеин (C) или аргинин (R);(c) the amino acid at the position corresponding to position 293 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from isoleucine (I) to serine (S), glycine (G), glutamic acid (E), proline (P), tryptophan ( W), tyrosine (Y), histidine (H), methionine (M), glutamine (Q), cysteine (C) or arginine (R);
(d) аминокислота в положении, соответствующем положению 294 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, мутирована из аспарагиновой кислоты (D) в тирозин (Y), триптофан (W) или фенилаланин (F); (d) the amino acid at the position corresponding to position 294 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from aspartic acid (D) to tyrosine (Y), tryptophan (W) or phenylalanine (F);
(e) аминокислота в положении, соответствующем положению 307 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, мутирована из треонина (T) в тирозин (Y), глицин (G) или фенилаланин (F).(e) the amino acid at the position corresponding to position 307 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 is mutated from threonine (T) to tyrosine (Y), glycine (G) or phenylalanine (F).
(3) Полипептид согласно (1) или (2), который содержит делецию или добавление по меньшей мере одного аминокислотного остатка на N-конце или С-конце полипептида, имеющего последовательность, представленную в (i).(3) A polypeptide according to (1) or (2) that contains a deletion or addition of at least one amino acid residue at the N-terminus or C-terminus of a polypeptide having the sequence shown in (i).
(4) Рекомбинантный полипептид, содержащий полипептид согласно любому из (1)-(3) и экзогенный полипептид, слитый с указанным полипептидом; необязательно где экзогенный полипептид содержит полипептидную метку; предпочтительно где экзогенный полипептид содержит полипептидную метку и спейсерный полипептид, связывающий полипептидную метку с полипептидом с аспартаткиназной активностью.(4) A recombinant polypeptide comprising a polypeptide according to any of (1) to (3) and an exogenous polypeptide fused to said polypeptide; optionally wherein the exogenous polypeptide contains a polypeptide tag; preferably wherein the exogenous polypeptide comprises a polypeptide tag and a spacer polypeptide linking the polypeptide tag to a polypeptide with aspartate kinase activity.
(5) Выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид согласно любому из (1)-(3), или содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид согласно (4).(5) An isolated polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a polypeptide according to any of (1) to (3), or containing a nucleotide sequence encoding a recombinant polypeptide according to (4).
(6) Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид согласно (5), где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, при этом регуляторная последовательность управляет продукцией полипептидов в экспрессирующем хозяине.(6) A nucleic acid construct comprising a polynucleotide according to (5), wherein the polynucleotide is operably linked to one or more regulatory sequences, wherein the regulatory sequence controls the production of polypeptides in an expression host.
(7) Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид согласно (5) или конструкцию нуклеиновой кислоты согласно (6). (7) A recombinant expression vector containing a polynucleotide according to (5) or a nucleic acid construct according to (6).
(8) Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полипептид согласно любому из (1)-(3), рекомбинантный полипептид согласно (4), полинуклеотид согласно (5), конструкцию нуклеиновой кислоты согласно (6) или рекомбинантный вектор экспрессии согласно (7).(8) A recombinant host cell containing a polypeptide according to any of (1) to (3), a recombinant polypeptide according to (4), a polynucleotide according to (5), a nucleic acid construct according to (6), or a recombinant expression vector according to (7).
(9) Рекомбинантная клетка-хозяин согласно (8), которая относится к роду Corynebacterium, роду Brevibacterium, роду Arthrobacterium, роду Microbacterium или роду Escherichia; предпочтительно клетка-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum или Escherichia coli.(9) The recombinant host cell according to (8), which belongs to the Corynebacterium genus, Brevibacterium genus, Arthrobacterium genus, Microbacterium genus or Escherichia genus; preferably the host cell is Corynebacterium glutamicum or Escherichia coli.
(10) Применение полипептида согласно любому из (1)-(3), рекомбинантного полипептида согласно (4), полинуклеотида согласно (5), конструкции нуклеиновой кислоты согласно (6), рекомбинантного вектора экспрессии согласно (7) или рекомбинантной клетки-хозяина согласно (8) или (9) для получения аминокислоты;(10) Use of a polypeptide according to any of (1) to (3), a recombinant polypeptide according to (4), a polynucleotide according to (5), a nucleic acid construct according to (6), a recombinant expression vector according to (7) or a recombinant host cell according to (8) or (9) to obtain an amino acid;
предпочтительно где указанная аминокислота выбрана из лизина, треонина, изолейцина и производной из них аминокислоты, где производная аминокислота включает по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминовалериановой кислоты, глутаровой кислоты и гидроксиизолейцина.preferably wherein said amino acid is selected from lysine, threonine, isoleucine and an amino acid derivative thereof, wherein the derivative amino acid includes at least one of pentanediamine, 5-aminovaleric acid, glutaric acid and hydroxyisoleucine.
(11) Способ получения аминокислоты, включающий стадии получения аминокислоты с помощью полипептида согласно любому из (1)-(3), рекомбинантного полипептида согласно (4), полинуклеотида согласно (5), конструкции нуклеиновой кислоты согласно (6), рекомбинантного вектора экспрессии согласно (7) или рекомбинантной клетки-хозяина согласно (8) или (9);(11) A method for producing an amino acid, including the steps of producing an amino acid using a polypeptide according to any of (1) to (3), a recombinant polypeptide according to (4), a polynucleotide according to (5), a nucleic acid construct according to (6), a recombinant expression vector according to (7) or a recombinant host cell according to (8) or (9);
необязательно где способ дополнительно включает стадию очистки или выделения указанной аминокислоты;optionally wherein the method further includes the step of purifying or isolating said amino acid;
предпочтительно где указанная аминокислота выбрана из лизина, треонина, изолейцина и производной из них аминокислоты, где производная аминокислота включает по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминовалериановой кислоты, глутаровой кислоты и гидроксиизолейцина.preferably wherein said amino acid is selected from lysine, threonine, isoleucine and an amino acid derivative thereof, wherein the derivative amino acid includes at least one of pentanediamine, 5-aminovaleric acid, glutaric acid and hydroxyisoleucine.
ЭффектыEffects
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение раскрывает мутант аспартаткиназы дикого типа. Указанный мутант устраняет ингибирование аспартаткиназы лизином по принципу обратной связи, обладает высокой аспартаткиназной активностью и может значительно повышать выход лизина при применении для получения лизина и обеспечивать стабильное и высокоэффективное получение лизина. Кроме того, мутант аспартаткиназы согласно настоящему изобретению является высокоэффективным в отношении получения треонина, изолейцина, а также производных аминокислот, таких как пентандиамин, 5-аминовалериановая кислота, глутаровая кислота и гидроксиизолейцин.In some embodiments, the present invention discloses a wild-type aspartate kinase mutant. This mutant eliminates the feedback inhibition of aspartate kinase by lysine, has high aspartate kinase activity and can significantly increase the yield of lysine when used for the production of lysine and provide stable and highly efficient production of lysine. In addition, the aspartate kinase mutant of the present invention is highly efficient in producing threonine, isoleucine, as well as amino acid derivatives such as pentanediamine, 5-aminovaleric acid, glutaric acid and hydroxyisoleucine.
В некоторых вариантах осуществления каждый из рекомбинантного полипептида, выделенного полинуклеотида, конструкции нуклеиновой кислоты и рекомбинантного вектора экспрессии согласно настоящему изобретению включает или экспрессирует вышеупомянутый полипептид с аспартаткиназной активностью и применим для получения лизина и его производных.In some embodiments, the recombinant polypeptide, isolated polynucleotide, nucleic acid construct, and recombinant expression vector of the present invention each comprise or express the aforementioned polypeptide with aspartate kinase activity and are useful for the production of lysine and derivatives thereof.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная клетка-хозяин, полипептид с аспартаткиназной активностью, устраняющий ингибирование лизином по принципу обратной связи, и рекомбинантная клетка-хозяин согласно настоящей заявке могут накапливать избыточное количество лизина, и, таким образом, они подходят для промышленного производства лизина и его производных.In some embodiments, the recombinant host cell, polypeptide with aspartate kinase activity that eliminates feedback inhibition by lysine, and the recombinant host cell of the present application can accumulate excess amounts of lysine, and are thus suitable for industrial production of lysine and its derivatives .
В некоторых вариантах осуществления за счет использования полипептида с аспартаткиназной активностью, рекомбинантного полипептида или рекомбинантной клетки-хозяина способ получения аминокислоты согласно настоящему изобретению может обеспечивать стабильное и высокоэффективное получение аминокислоты. При применении для получения аминокислот способ согласно настоящему изобретению может обеспечивать высокий выход лизина, треонина, изолейцина и их производных.In some embodiments, by using a polypeptide with aspartate kinase activity, a recombinant polypeptide, or a recombinant host cell, the amino acid production method of the present invention can provide stable and highly efficient production of the amino acid. When used to produce amino acids, the method of the present invention can provide high yields of lysine, threonine, isoleucine and their derivatives.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
На фиг. 1 представлено схематическое изображение плазмиды pCas9gRNA-ccdB;In fig. Figure 1 shows a schematic representation of the pCas9gRNA-ccdB plasmid;
На фиг. 2 представлено схематическое изображение плазмиды pRecT.In fig. Figure 2 shows a schematic representation of the pRecT plasmid.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Определения терминовDefinitions of terms
При использовании в сочетании с термином «включающий» в формуле и/или описании изобретения слово в единственном числе может относиться к «одному» или относиться к «одному или более», «по меньшей мере одному» и «одному или более чем одному».When used in conjunction with the term “comprising” in a claim and/or description, the singular word may refer to “one” or refer to “one or more,” “at least one,” and “one or more than one.”
В контексте формулы и описания изобретения термин «включающий», «имеющий» или «содержащий» подразумевается включающим или открытым и не исключающим дополнительные или неуказанные элементы или способы и стадии.As used in the claims and description of the invention, the term “including,” “having,” or “comprising” is intended to include or be open-ended and not to exclude additional or unspecified elements or methods and steps.
Во всем тексте заявки термин «приблизительно» означает, что значение включает в себя ошибку или стандартное отклонение, вызванное устройством или методом, используемым для измерения значения.Throughout the application, the term “approximately” means that the value includes the error or standard deviation caused by the device or method used to measure the value.
К содержимому, раскрытому в настоящем документе, применимо, что термин «или» определен только как альтернативы и «и/или», но термин «или» в настоящем документе относится к «и/или», если прямо не указано, что он относится только к альтернативам, или альтернативы являются взаимоисключающими.It is applicable to the contents disclosed herein that the term “or” is defined only as the alternatives and “and/or”, but the term “or” as used herein refers to “and/or” unless expressly stated to refer to only to alternatives, or alternatives are mutually exclusive.
Выбранный/необязательный/предпочтительный «числовой диапазон», когда он используется в формуле или описании изобретения, включает не только числовые конечные точки на обоих концах диапазона, но также и все натуральные числа, находящиеся между указанными выше числовыми конечными точками по отношению к этим числовым конечным точкам.The selected/optional/preferred "numeric range", when used in a claim or description of the invention, includes not only the numeric endpoints at both ends of the range, but also all natural numbers between the above numeric endpoints with respect to those numeric endpoints points.
В контексте настоящего документа, хотя может быть использован и другой органический или неорганический катализ, термин «превращение» относится к химическому превращению одной молекулы в другую молекулу, катализируемому главным образом одним или более полипептидами (ферментами); в качестве альтернативы, данный термин может относиться к отношению (в %) молярной массы ожидаемого продукта к молярной массе лимитирующего субстрата.As used herein, although other organic or inorganic catalysis may be used, the term "conversion" refers to the chemical conversion of one molecule to another molecule catalyzed primarily by one or more polypeptides (enzymes); alternatively, the term may refer to the ratio (in %) of the molar mass of the expected product to the molar mass of the limiting substrate.
В контексте настоящего документа термин «аспартаткиназа» и его аббревиатура «AK» относятся к полипептиду (ферменту), который может катализировать фосфорилирование аспарагиновой кислоты в аспартилфосфат. Как первый ключевой фермент пути биосинтеза лизина, аспартаткиназа контролирует путь биосинтеза аминокислот семейства аспартата.As used herein, the term “aspartate kinase” and its abbreviation “AK” refer to a polypeptide (enzyme) that can catalyze the phosphorylation of aspartic acid to aspartyl phosphate. As the first key enzyme in the lysine biosynthesis pathway, aspartate kinase controls the biosynthesis pathway of aspartate family amino acids.
В контексте настоящего документа термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и представляют собой полимер аминокислот любой длины. Этот полимер может быть линейным или разветвленным. Он может включать модифицированные аминокислоты и может включать вставки неаминокислот. Этот термин также включает полимеры аминокислот, которые уже были модифицированы (например, путем образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любых других манипуляций, таких как конъюгация с меченым компонентом).As used herein, the terms "polypeptide", "peptide" and "protein" are used interchangeably herein and represent a polymer of amino acids of any length. This polymer can be linear or branched. It may include modified amino acids and may include insertions of non-amino acids. The term also includes polymers of amino acids that have already been modified (eg, by formation of disulfide bonds, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation such as conjugation to a labeled moiety).
В контексте настоящего документа термин «фрагмент» означает полипептид или каталитический или углеводсвязывающий модуль, в котором с аминоконца и/или карбоксиконца зрелого пептида или домена удалена одна или более (например, несколько) аминокислот. Согласно настоящему изобретению фрагмент обладает аспартаткиназной активностью.As used herein, the term “fragment” means a polypeptide or catalytic or carbohydrate binding module in which one or more (eg, multiple) amino acids have been removed from the amino terminus and/or carboxy terminus of the mature peptide or domain. According to the present invention, the fragment has aspartate kinase activity.
В контексте настоящего документа термин «дикий тип» относится к объекту, который встречается в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме, которая может быть выделена из природного источника и не была преднамеренно модифицирована человеком в лаборатории, является встречающейся в природе. В контексте настоящего документа термины «встречающийся в природе» и «дикий тип» являются синонимами.As used herein, the term "wild type" refers to an entity that occurs in nature. For example, a polypeptide or polynucleotide sequence present in an organism that can be isolated from a natural source and has not been intentionally modified by humans in a laboratory is naturally occurring. As used herein, the terms “naturally occurring” and “wild type” are synonymous.
Термин «мутант» в контексте настоящего документа относится к полинуклеотиду или полипептиду, включающему изменение(ия) (т. е. замену, инсерцию и/или делецию) в одном или более (например, нескольких) положениях по сравнению с «диким типом» или «сравнительным» полинуклеотидом или полипептидом. Здесь замена относится к замене другого нуклеотида или аминокислоты нуклеотидом или аминокислотой, который(ая) занимает одно положение; делеция относится к удалению нуклеотида или аминокислоты, который(ая) занимает определенное положение; и вставка относится к добавлению нуклеотида или аминокислоты после нуклеотида или аминокислоты, прилегающего(ей) к занятому положению и непосредственно следующего(ей) за ним. Например, «мутант» согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид с повышенной аспартаткиназной активностью.The term “mutant” as used herein refers to a polynucleotide or polypeptide comprising change(s) (i.e., substitution, insertion and/or deletion) at one or more (e.g., multiple) positions relative to the “wild type” or "comparative" polynucleotide or polypeptide. Here, substitution refers to the replacement of another nucleotide or amino acid with a nucleotide or amino acid that occupies the same position; deletion refers to the removal of a nucleotide or amino acid that occupies a specific position; and insertion refers to the addition of a nucleotide or amino acid after the nucleotide or amino acid adjacent to and immediately following the occupied position. For example, a "mutant" according to the present invention is a polypeptide with increased aspartate kinase activity.
В контексте настоящего документа термин «аминокислотная мутация» или «нуклеотидная мутация» включает «замену, повтор, делецию или добавление одной или более аминокислот или нуклеотидов». В настоящем изобретении термин «мутация» относится к изменению нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности. В частном варианте осуществления термин «мутация» означает «замену».As used herein, the term "amino acid mutation" or "nucleotide mutation" includes "the substitution, repetition, deletion or addition of one or more amino acids or nucleotides." In the present invention, the term "mutation" refers to a change in the nucleotide sequence or amino acid sequence. In a particular embodiment, the term "mutation" means "replacement".
В некоторых вариантах осуществления «мутация» согласно настоящему изобретению включает замену аминокислот в одном или более положениях, соответствующих положениям 293, 294 и 307 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. По сравнению с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, мутант с аминокислотной заменой в вышеуказанных положениях устраняет ингибирование ферментативной активности лизином по принципу обратной связи и улучшает степень превращения аспарагиновой кислоты в аспартилфосфат, тем самым повышая продукцию лизина.In some embodiments, a “mutation” according to the present invention includes a substitution of amino acids at one or more positions corresponding to positions 293, 294, and 307 of the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Compared to a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a mutant with an amino acid substitution at the above positions eliminates the feedback inhibition of enzymatic activity by lysine and improves the conversion of aspartic acid to aspartyl phosphate, thereby increasing lysine production.
В настоящем изобретении «мутация» также включает добавление, делецию или замену аминокислот в одном или более положениях, соответствующих последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, без влияния на аспартаткиназную активность. Известно, что изменение нескольких аминокислотных остатков в какой-либо области полипептида, например, в несущественной области, по существу не повлияет на биологическую активность. Например, последовательность, полученная соответствующей заменой, добавлением или делецией некоторых аминокислот, не будет характеризоваться измененной биологической активностью[2]. Например, «мутация» согласно настоящему изобретению включает делецию или добавление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в положении, соответствующем по меньшей мере одному с С-конца и N-конца полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и мутант обладает аспартаткиназной активностью. В некоторых вариантах осуществления «мутация» согласно настоящему изобретению включает делецию или добавление с С-конца или N-конца полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, от 1 до 20 аминокислот, предпочтительно от 1 до 15 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 3 аминокислот и наиболее предпочтительно 1 аминокислоты, и мутант обладает аспартаткиназной активностью.In the present invention, "mutation" also includes the addition, deletion or substitution of amino acids at one or more positions corresponding to the sequence shown in SEQ ID NO: 1, without affecting aspartate kinase activity. It is known that changing a few amino acid residues in any region of the polypeptide, for example, in a non-essential region, will not substantially affect the biological activity. For example, a sequence obtained by appropriate substitution, addition or deletion of certain amino acids will not exhibit altered biological activity [2] . For example, a "mutation" according to the present invention includes the deletion or addition of at least one amino acid residue at a position corresponding to at least one from the C-terminus and N-terminus of a polypeptide having the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the mutant has aspartate kinase activity. In some embodiments, a "mutation" according to the present invention includes a deletion or addition from the C-terminus or N-terminus of a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, from 1 to 20 amino acids, preferably from 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids, and most preferably 1 amino acid, and the mutant has aspartate kinase activity.
В некоторых вариантах осуществления «мутация» согласно настоящему изобретению может быть выбрана из «консервативной мутации». Согласно настоящему изобретению термин «консервативная мутация» относится к мутации, при которой сохраняется нормальная функция белков. Типичным примером консервативной мутации является консервативная замена.In some embodiments, the “mutation” of the present invention may be selected from a “conservative mutation.” According to the present invention, the term "conservative mutation" refers to a mutation in which the normal function of proteins is preserved. A typical example of a conservative mutation is a conservative substitution.
В контексте настоящего документа термин «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В настоящей области техники определены семейства аминокислотных остатков со схожими боковыми цепями, включая имеющие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженную полярную боковую цепь (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин и цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин и изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан и гистидин).As used herein, the term “conservative substitution” refers to the replacement of an amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. The present art defines families of amino acid residues with similar side chains, including those having basic side chains (e.g., lysine, arginine, and histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chain (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan), β-branched side chains (e.g. threonine, valine and isoleucine) and aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine).
В контексте настоящего документа «консервативная замена» обычно включает замену одной аминокислоты в одном или более положениях белка. Такая замена может быть консервативной. Примеры замен, считающихся консервативными заменами, включают замены Ala на Ser или Thr; замены Arg на Gln, His или Lys; замены Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp; замены Asp на Asn, Glu или Gln; замены Cys на Ser или Ala; замены Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg; замены Glu на Gly, Asn, Gln, Lys или Asp; замены Gly на Pro; замены His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr; замены Ile на Leu, Met, Val или Phe; замены Leu на Ile, Met, Val или Phe; замены Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg; замены Met на Ile, Leu, Val или Phe; замены Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu; замены Ser на Thr или Ala; замены Thr на Ser или Ala; замены Trp на Phe или Tyr; замены Tyr на His, Phe или Trp; и замены Val на Met, Ile или Leu. Кроме того, консервативная мутация также включает естественные мутации, возникающие из-за индивидуальных различий, а также различий между штаммами или видами, от которых происходят гены.As used herein, a “conservative substitution” generally includes a substitution of a single amino acid at one or more positions in a protein. Such a replacement may be conservative. Examples of substitutions considered conservative substitutions include substitutions of Ala with Ser or Thr; replacing Arg with Gln, His or Lys; replacing Asn with Glu, Gln, Lys, His or Asp; replacing Asp with Asn, Glu or Gln; replacing Cys with Ser or Ala; replacing Gln with Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg; replacing Glu with Gly, Asn, Gln, Lys or Asp; replacing Gly with Pro; replacing His with Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr; replacing Ile with Leu, Met, Val or Phe; replacing Leu with Ile, Met, Val or Phe; replacing Lys with Asn, Glu, Gln, His or Arg; replacing Met with Ile, Leu, Val or Phe; replacing Phe with Trp, Tyr, Met, Ile or Leu; replacing Ser with Thr or Ala; replacing Thr with Ser or Ala; replacing Trp with Phe or Tyr; replacing Tyr with His, Phe or Trp; and replacing Val with Met, Ile or Leu. In addition, conservative mutation also includes naturally occurring mutations that occur due to individual differences as well as differences between the strains or species from which the genes originate.
В контексте настоящего документа термин «рекомбинантный полипептид» относится к экспрессии слияния двух или более полипептидов с помощью генно-инженерного подхода. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид, полученный путем слияния мутанта полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, с экзогенным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления экзогенный полипептид содержит полипептидную метку. В некоторых вариантах осуществления экзогенный полипептид содержит полипептидную метку и спейсерный полипептид, связывающий мутант с полипептидной меткой. В частности, спейсерный полипептид может иметь менее 10 спейсерных аминокислотных остатков.As used herein, the term “recombinant polypeptide” refers to the expression of a fusion of two or more polypeptides using a genetic engineering approach. In some embodiments, the recombinant polypeptide is a recombinant polypeptide obtained by fusing a mutant of the polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 with an exogenous polypeptide. In some embodiments, the exogenous polypeptide contains a polypeptide tag. In some embodiments, the exogenous polypeptide comprises a polypeptide tag and a spacer polypeptide that binds the polypeptide tag mutant. In particular, the spacer polypeptide may have less than 10 spacer amino acid residues.
Например, полипептидная метка представляет собой полипептид, имеющий последовательность метки, представленную в таблице 1.For example, a polypeptide tag is a polypeptide having the tag sequence shown in Table 1.
Таблица 1. Последовательность меткиTable 1. Label sequence
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид содержит, от N-конца к С-концу: мутант полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, спейсерный полипептид и полипептидную метку; где полипептидная метка может представлять собой полипептид, имеющий последовательность метки, представленнуюдля His6, спейсерный полипептид имеет менее 10 спейсерных аминокислотных остатков. Например, аминокислотная последовательность спейсерного полипептида представляет собой «LE».In some embodiments, the recombinant polypeptide comprises, from N-terminus to C-terminus: a mutant polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, a spacer polypeptide, and a polypeptide tag; where the polypeptide tag may be a polypeptide having a tag sequence represented for His6, the spacer polypeptide has less than 10 spacer amino acid residues. For example, the amino acid sequence of a spacer polypeptide is "LE".
В контексте настоящего документа термин «идентичность последовательностей» или «процент идентичности» при сравнении двух нуклеиновых кислот или полипептидов означает, что при сравнении и выравнивании при максимальном соответствии с помощью алгоритма выравнивания последовательностей или измерения путем визуального осмотра они одинаковы, или у них измерен определенный процент идентичности последовательностей. То есть, идентичность последовательностей нуклеотидов или аминокислотных остатков может быть определена как отношение, которое представляет собой отношение количества нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются идентичными, к общему количеству нуклеотидов или аминокислотных остатков в двух или большем количестве нуклеотидов или аминокислотных остатков, выровненных таким образом, чтобы они имели максимальное количество идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков, при необходимости с включением гэпов.As used herein, the term "sequence identity" or "percentage identity" when comparing two nucleic acids or polypeptides means that, when compared and aligned to best fit using a sequence alignment algorithm or measured by visual inspection, they are the same or a certain percentage is measured. sequence identity. That is, sequence identity of nucleotides or amino acid residues can be defined as a ratio that is the ratio of the number of nucleotides or amino acid residues that are identical to the total number of nucleotides or amino acid residues in two or more nucleotides or amino acid residues so aligned, so that they have the maximum number of identical nucleotides or amino acid residues, including gaps if necessary.
Способ измерения «идентичности последовательностей» или «процента идентичности», используемый в настоящем изобретении, включает, не ограничиваясь перечисленным: Lesk, A.M. (Ed.). (1988). Computational Molecular Biology. New York: Oxford University Press.; Smith, D.W. (Ed.). (1993). Biocomputing Informatics and Genome Projects. New York: Academic Press.; Griffin, A.M. & Griffin, H.G. (Ed.). (1994). Computer Analysis of Sequence Data, Part I. New Jersey: Humana Press.; von Heinje G. (1987). Sequence Analysis in Molecular Biology. Academic Press.; Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.). (1991) Sequence Analysis Primer. New York: M Stockton Press.; и Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). Предпочтительный метод измерения идентичности требует получения максимального соответствия последовательностей. Метод измерения идентичности представлен в общедоступной компьютерной программе. Предпочтительный метод измерения идентичности двух последовательностей, реализуемый с помощью компьютерной программы, включает, не ограничиваясь перечисленным: пакет программ GCG (Devereux, J. et. al., 1984), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul, S. F. et. al., 1990). Программа BLASTX общедоступна в NCBI и других источниках (Altschul, S. et. al. BLAST Manual. NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S. et. al., 1990). Для измерения идентичности также может быть использован известный алгоритм Смита-Ватермана.The method of measuring "sequence identity" or "percentage identity" used in the present invention includes, but is not limited to: Lesk, A.M. (Ed.). (1988). Computational Molecular Biology. New York: Oxford University Press.; Smith, D.W. (Ed.). (1993). Biocomputing Informatics and Genome Projects. New York: Academic Press.; Griffin, A.M. & Griffin, H. G. (Ed.). (1994). Computer Analysis of Sequence Data, Part I. New Jersey: Humana Press.; von Heinje G. (1987). Sequence Analysis in Molecular Biology. Academic Press.; Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.). (1991) Sequence Analysis Primer. New York: M Stockton Press.; and Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). The preferred method for measuring identity requires obtaining the maximum sequence match. The method for measuring identity is presented in a publicly available computer program. The preferred method for measuring the identity of two sequences, implemented using a computer program, includes, but is not limited to: the GCG software package (Devereux, J. et. al., 1984), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F. et. al., 1990 ). The BLASTX program is publicly available from NCBI and other sources (Altschul, S. et. al. BLAST Manual. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et. al., 1990). The well-known Smith-Waterman algorithm can also be used to measure identity.
В некоторых вариантах осуществления полипептид с аспартаткиназной активностью согласно настоящему изобретению обладает по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% «идентичностью последовательности» или «процентом идентичности» аминокислотных остатков с мутантом полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В некоторых других вариантах осуществления полинуклеотид согласно настоящему изобретению для кодирования полипептида с аспартаткиназной активностью обладает по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% «идентичностью последовательности» или «процентом идентичности» нуклеотидов с полинуклеотидом, кодирующим мутант полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Определение/вычисление «идентичности последовательностей» или «процента идентичности» может быть основано на любой подходящей области последовательности, такой как область длиной по меньшей мере приблизительно 50 остатков, по меньшей мере приблизительно 100 остатков, по меньшей мере приблизительно 200 остатков, по меньшей мере приблизительно 400 остатков или по меньшей мере приблизительно 500 остатков. В некоторых вариантах осуществления последовательность по существу идентична по всей длине любого одного или двух подлежащих сравнению биополимеров (например, нуклеиновой кислоты или полипептида).In some embodiments, the polypeptide with aspartate kinase activity of the present invention has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99% "sequence identity" or "percent identity" of amino acid residues with a mutant of a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. In some other embodiments, a polynucleotide of the present invention for encoding a polypeptide with aspartate kinase activity has at least at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% “sequence identity” or “percentage identity” "nucleotides with a polynucleotide encoding a mutant of a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The determination/calculation of "sequence identity" or "percentage identity" may be based on any suitable sequence region, such as a region of at least about 50 residues, at least about 100 residues, at least about 200 residues, at least about 400 residues, or at least about 500 residues. In some embodiments, the sequence is substantially identical over the entire length of any one or two biopolymers (eg, nucleic acid or polypeptide) to be compared.
В контексте настоящего документа термин «полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидов. Полинуклеотид может иметь вид отдельного фрагмента или компонента более крупной структуры нуклеотидной последовательности, и он получен из нуклеотидной последовательности, разделенной по меньшей мере один раз по количеству или концентрации, и может быть распознан, подвергнут манипуляциям и восстановлен из последовательности и составляющих его нуклеотидных последовательностей стандартными методами молекулярной биологии (такими как использование клонирующего вектора). Когда нуклеотидная последовательность представлена последовательностью ДНК (т. е. A, T, G, C), это также включает последовательность РНК (т. е. A, U, G, C), где «U» заменяет «T». Другими словами, «полинуклеотид» относится к полимеру нуклеотидов, который был отделен от других нуклеотидов (отдельного фрагмента или целого фрагмента), или может быть составной частью или компонентом более крупной нуклеотидной структуры, такой как вектор экспрессии или полицистронная последовательность. Полинуклеотид включает последовательности ДНК, РНК и кДНК.As used herein, the term "polynucleotide" refers to a polymer composed of nucleotides. The polynucleotide may be a single fragment or component of a larger nucleotide sequence structure and is derived from the nucleotide sequence divided at least once in quantity or concentration and can be recognized, manipulated and recovered from the sequence and its constituent nucleotide sequences by standard methods molecular biology (such as the use of a cloning vector). When a nucleotide sequence is represented by a DNA sequence (i.e. A, T, G, C), it also includes an RNA sequence (i.e. A, U, G, C), where "U" replaces "T". In other words, "polynucleotide" refers to a polymer of nucleotides that has been separated from other nucleotides (either a single fragment or a whole fragment), or may be an integral part or component of a larger nucleotide structure, such as an expression vector or polycistronic sequence. A polynucleotide includes DNA, RNA and cDNA sequences.
В контексте настоящего документа термин «выделенный» относится к веществу в форме или среде, не встречающихся в природе. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают (1) любое вещество, не встречающееся в природе, (2) любое вещество, включая, не ограничиваясь перечисленным, любой фермент, мутант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, который по меньшей мере частично отделен от одного или более, или всех встречающихся в природе компонентов, связанных с его природой; (3) любое вещество, искусственным образом модифицированное по сравнению с встречающимся в природе веществом; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества относительно других компонентов, связанных с его природой (например, рекомбинантное получение в клетке-хозяине, множественные копии гена, кодирующего вещество, и использование промотора сильнее, чем промотор, естественным образом связанный с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментационного бульона. Например, клетки-хозяева могут быть генетически модифицированы для экспрессии полипептида согласно настоящему изобретению. Образец ферментационного бульона из клеток-хозяев будет содержать выделенные полипептиды. «Рекомбинантный полинуклеотид» относится к «полинуклеотиду».As used herein, the term “isolated” refers to a substance in a form or medium not found in nature. Non-limiting examples of isolated substances include (1) any substance not found in nature, (2) any substance, including, but not limited to, any enzyme, mutant, nucleic acid, protein, peptide or cofactor, which is at least partially separated from one or more, or all naturally occurring components related to its nature; (3) any substance artificially modified from a naturally occurring substance; or (4) any substance modified by increasing the amount of the substance relative to other components associated with its nature (for example, recombinant production in a host cell, multiple copies of the gene encoding the substance, and use of a promoter stronger than the promoter naturally associated with the gene , encoding the substance). The isolated substance may be present in the fermentation broth sample. For example, host cells can be genetically modified to express a polypeptide of the present invention. A fermentation broth sample from the host cells will contain the isolated polypeptides. "Recombinant polynucleotide" refers to "polynucleotide".
В контексте настоящего документа термин «рекомбинантный полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, имеющему последовательность, не связанную в природе. Рекомбинантный полинуклеотид может быть включен в подходящий вектор, который может быть трансформирован в подходящую клетку-хозяина. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный полинуклеотид, называется «рекомбинантной клеткой-хозяином». Затем полинуклеотид экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине с образованием, например, «рекомбинантного полипептида».As used herein, the term “recombinant polynucleotide” refers to a polynucleotide having a sequence that is not naturally related. The recombinant polynucleotide can be included in a suitable vector, which can be transformed into a suitable host cell. The host cell containing the recombinant polynucleotide is called a "recombinant host cell". The polynucleotide is then expressed in the recombinant host cell to form, for example, a "recombinant polypeptide".
В контексте настоящего документа термин «экспрессия» включает любую стадию, относящуюся к продукции полипептидов, включая, не ограничиваясь перечисленным: транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.As used herein, the term "expression" includes any step related to the production of polypeptides, including, but not limited to: transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification and secretion.
В контексте настоящего документа термин «вектор экспрессии» относится к линейной или кольцевой молекуле ДНК, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, причем полинуклеотид эффективно связан с регуляторной последовательностью для его экспрессии.As used herein, the term “expression vector” refers to a linear or circular DNA molecule containing a polynucleotide encoding a polypeptide, the polynucleotide being effectively linked to a regulatory sequence for its expression.
В контексте настоящего документа термин «рекомбинантный вектор экспрессии» относится к структуре ДНК для экспрессии, например, полинуклеотида, кодирующего желаемый полипептид. Рекомбинантный вектор экспрессии может включать, например, i) набор генетических элементов, регулирующих экспрессию генов, таких как промотор и энхансер; ii) структуры или кодирующие последовательности, транскрибируемые в мРНК и транслируемые в белки; и iii) субъединицы транскрипции, которые должным образом транскрибируют и транслируют последовательности инициации и терминации. Рекомбинантный вектор экспрессии может быть сконструирован любым подходящим методом. Природа вектора не важна; можно использовать любой вектор, включая плазмиду, вирус, фаг и транспозон. Возможные векторы, используемые в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, хромосомы, ахромосомы и синтезированные фрагменты ДНК, такие как бактериальная плазмида, фаговые ДНК, дрожжевые плазмиды и векторы, полученные из комбинации плазмид и фаговых ДНК, вирусные ДНК из, например, коровьей оспы, аденовируса, оспы птиц, бакуловируса, SV40 и вируса псевдобешенства.As used herein, the term “recombinant expression vector” refers to a DNA structure for expressing, for example, a polynucleotide encoding a desired polypeptide. The recombinant expression vector may include, for example, i) a set of genetic elements that regulate gene expression, such as a promoter and enhancer; ii) structures or coding sequences transcribed into mRNA and translated into proteins; and iii) transcription subunits that properly transcribe and translate initiation and termination sequences. The recombinant expression vector can be constructed by any suitable method. The nature of the vector is not important; any vector can be used, including plasmid, virus, phage and transposon. Possible vectors used in the present invention include, but are not limited to, chromosomes, achromosomes and synthesized DNA fragments such as bacterial plasmid, phage DNA, yeast plasmids and vectors derived from a combination of plasmids and phage DNA, viral DNA from, for example, bovine smallpox, adenovirus, fowlpox, baculovirus, SV40 and pseudorabies virus.
В контексте настоящего документа термин «рекомбинантный ген» относится к генам, которые не встречаются в природе. Рекомбинантный ген включает кодирующую белок последовательность, функционально связанную с последовательностью регуляции экспрессии. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным: экзогенные гены, вводимые в микроорганизмы, последовательности, кодирующие эндогенные белки, функционально связанные с гетерологичным промотором, и гены, имеющие модифицированную последовательность, кодирующую белок. Рекомбинантные гены хранятся в геномах микробиомов, плазмидах в микробиомах или фагах в микробиомах.As used herein, the term “recombinant gene” refers to genes that do not occur in nature. The recombinant gene includes a protein coding sequence operably linked to an expression control sequence. Examples include, but are not limited to: exogenous genes introduced into microorganisms, endogenous protein coding sequences operably linked to a heterologous promoter, and genes having a modified protein coding sequence. Recombinant genes are stored in microbiome genomes, plasmids in microbiomes, or phages in microbiomes.
В контексте настоящего документа термин «функционально связанный» относится к конструкции, в которой регуляторная последовательность размещена в правильном положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотида, так что регуляторная последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности. Например, регуляторная последовательность может быть выбрана из последовательности, кодирующей промотор и/или энхансер.As used herein, the term "operably linked" refers to a construct in which a regulatory sequence is placed in the correct position relative to the coding sequence of a polynucleotide such that the regulatory sequence controls expression of the coding sequence. For example, the regulatory sequence may be selected from a sequence encoding a promoter and/or enhancer.
В контексте настоящего документа термин «конструкция нуклеиновой кислоты» включает полинуклеотид, эффективно связанный с подходящей регуляторной последовательностью и кодирующий полипептид, или домен, или модуль, при этом регуляторная последовательность необходима для экспрессии полинуклеотида в выбранных клетках или штаммах. В настоящем изобретении регулятор транскрипции содержит промотор. Кроме того, он может содержать такой элемент, как энхансер, сайленсер и инсулятор.As used herein, the term “nucleic acid construct” includes a polynucleotide effectively linked to a suitable regulatory sequence and encoding a polypeptide, or domain, or module, wherein the regulatory sequence is necessary for expression of the polynucleotide in selected cells or strains. In the present invention, the transcription regulator contains a promoter. In addition, it may contain an element such as an enhancer, silencer and insulator.
Термин «клетка-хозяин» в контексте настоящего документа относится к любому типу клеток, которые можно легко трансформировать, трансфицировать или трансдуцировать мутантным полипептидом согласно настоящему изобретению, полинуклеотидом, кодирующим мутантный полипептид, или рекомбинантным вектором экспрессии. Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» охватывает клетку-хозяина, которая отличается от родительских клеток после введения полинуклеотида, кодирующего мутантный полипептид, или рекомбинантного вектора экспрессии. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению может быть прокариотической клеткой или эукариотической клеткой при условии, что она является клеткой, в которую можно ввести полинуклеотид, кодирующий полипептид, и рекомбинантный полипептид с аспартаткиназной активностью согласно настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин относится к прокариотической клетке. Более конкретно, клетка-хозяин происходит из микробиомов, пригодных для получения аминокислот путем ферментации, таких как род Corynebacterium, род Brevibacterium, род Microbacterium или род Escherichia. Предпочтительно клетка-хозяин происходит от Corynebacterium glutamicum рода Corynebacterium или происходит от Escherichia coli рода Escherichia.The term “host cell” as used herein refers to any cell type that can be readily transformed, transfected, or transduced with a mutant polypeptide of the present invention, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide, or a recombinant expression vector. The term "recombinant host cell" covers a host cell that is different from the parent cells after introduction of a polynucleotide encoding a mutant polypeptide or a recombinant expression vector. The host cell of the present invention may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, provided that it is a cell into which the polynucleotide encoding the polypeptide and the recombinant polypeptide with aspartate kinase activity of the present invention can be introduced. In one embodiment, the host cell is a prokaryotic cell. More specifically, the host cell is derived from microbiomes suitable for producing amino acids by fermentation, such as the Corynebacterium genus, Brevibacterium genus, Microbacterium genus or Escherichia genus. Preferably, the host cell is derived from Corynebacterium glutamicum of the genus Corynebacterium or is derived from Escherichia coli of the genus Escherichia.
Термины «трансформация, трансфекция, трансдукция» в контексте настоящего документа имеют значение, под которым они обычно понимаются специалистом в данной области техники, т. е. процесс введения экзогенной ДНК в хозяина. Методы трансформации, трансфекции и трансдукции включают любой метод введения нуклеиновой кислоты в клетку. Эти методы включают, не ограничиваясь перечисленным, электропорацию, осаждение с фосфатом кальция (CaPO4), осаждение с хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, метод с полиэтиленгликолем (PEG), метод с DEAE-декстраном, метод с катионными липосомами и метод с лития ацетатом в ДМСО.The terms "transformation, transfection, transduction" as used herein have the meaning by which they are commonly understood by one skilled in the art, that is, the process of introducing exogenous DNA into a host. Transformation, transfection and transduction methods include any method of introducing a nucleic acid into a cell. These methods include, but are not limited to, electroporation, calcium phosphate ( CaPO4 ) precipitation, calcium chloride ( CaCl2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and lithium acetate in DMSO.
В настоящем изобретении клетки-хозяева могут быть культивированы общепринятыми методами в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, культуру в луночных планшетах, культуру в шейкере, периодическую культуру, непрерывную культуру, культуру с подпиткой и т. д. Кроме того, различные условия культивирования, такие как температура, время и значение pH среды, могут быть надлежащим образом отрегулированы в соответствии с реальными ситуациями.In the present invention, the host cells can be cultured by conventional methods in the art, including, but not limited to, well plate culture, shaker culture, batch culture, continuous culture, fed-batch culture, etc. In addition, various conditions cultivation, such as temperature, time and pH value of the medium can be properly adjusted according to actual situations.
В контексте настоящего документа термин «высокожесткие условия» означает, что в соответствии со стандартными процедурами блоттинга ДНК зонд длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов подвергается предварительной гибридизации или гибридизации в течение от 12 до 24 часов при 42 °C в 5X SSPE (хлорид натрия-фосфат натрия-ЭДТА), 0,3% SDS, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамида. Наконец, векторный материал трижды промывают при 65 °C с помощью 2X SSC и 0,2% SDS, каждый раз в течение 15 мин.As used herein, the term “high stringency conditions” means that, according to standard DNA blotting procedures, a probe of at least 100 nucleotides in length is prehybridized or hybridized for 12 to 24 hours at 42°C in 5X SSPE (sodium chloride phosphate sodium-EDTA), 0.3% SDS, 200 µg/ml digested and denatured salmon sperm DNA and 50% formamide. Finally, the vector material is washed three times at 65°C with 2X SSC and 0.2% SDS, each time for 15 min.
В контексте настоящего документа термин «очень высокожесткие условия» означает, что в соответствии со стандартными процедурами блоттинга ДНК зонд длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов подвергается предварительной гибридизации или гибридизации в течение от 12 до 24 часов при 42 °C в 5X SSPE (хлорид натрия-фосфат натрия-ЭДТА), 0,3% SDS, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося и 50% формамида. Наконец, векторный материал трижды промывают при 70 °C с помощью 2X SSC и 0,2% SDS, каждый раз в течение 15 мин.As used herein, the term “very high stringency conditions” means that, in accordance with standard DNA blotting procedures, a probe of at least 100 nucleotides in length is prehybridized or hybridized for 12 to 24 hours at 42°C in 5X SSPE (sodium chloride sodium phosphate-EDTA), 0.3% SDS, 200 µg/ml digested and denatured salmon sperm DNA and 50% formamide. Finally, the vector material is washed three times at 70°C with 2X SSC and 0.2% SDS, each time for 15 min.
Если иное не определено или четко не указано в общей информации, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же значения, под которыми они обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение.Unless otherwise defined or clearly stated in the general information, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by one skilled in the art to which this invention relates.
Мутанты аспартаткиназыAspartate kinase mutants
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения создана библиотека мутантов гена LysC, кодирующих аспартаткиназу в Corynebacterium glutamicum, посредством сайт-направленного мутагенеза. Из библиотеки были отобраны мутанты, которые могли устранять ингибирование лизином по принципу обратной связи и, таким образом, повысить аспартаткиназную активность.In some embodiments of the present invention, a library of LysC gene mutants encoding aspartate kinase in Corynebacterium glutamicum is generated through site-directed mutagenesis. Mutants were selected from the library that could eliminate feedback inhibition by lysine and thus increase aspartate kinase activity.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения положения мутаций в мутантах, устраняющие ингибирование лизином по принципу обратной связи, включают аминокислоты, замененные в одном или более положениях, соответствующих положениям 293, 294 и 307 последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1.In some embodiments of the present invention, the mutation positions in the mutants that eliminate lysine feedback inhibition include amino acids replaced at one or more positions corresponding to positions 293, 294, and 307 of the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Например, мутация в положении 293 включает аминокислоту, мутированную из изолейцина (I) в серин (S), глицин (G), глутаминовую кислоту (E), пролин (P), триптофан (W), тирозин (Y), гистидин (H), метионин (M), глутамин (Q), цистеин (C) или аргинин (R).For example, a mutation at position 293 involves an amino acid mutated from isoleucine (I) to serine (S), glycine (G), glutamic acid (E), proline (P), tryptophan (W), tyrosine (Y), histidine (H ), methionine (M), glutamine (Q), cysteine (C) or arginine (R).
Мутация в положении 294 включает аминокислоту, мутированную из аспарагиновой кислоты (D) в тирозин (Y), триптофан (W) или фенилаланин (F).The mutation at position 294 involves an amino acid mutated from aspartic acid (D) to tyrosine (Y), tryptophan (W), or phenylalanine (F).
Мутация в положении 307 включает аминокислоту, мутированную из треонина (T) в тирозин (Y), глицин (G), фенилаланин (F).The mutation at position 307 involves an amino acid mutated from threonine (T) to tyrosine (Y), glycine (G), phenylalanine (F).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду с аспартаткиназной активностью, обладающему по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичностью последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и имеющему аминокислотную последовательность, отличную от SEQ ID NO: 1.In some embodiments, the present invention provides a polypeptide with aspartate kinase activity having at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence identity with a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептиду с аспартаткиназной активностью, включающему добавление или делецию аминокислот по меньшей мере с одного из N-конца и С-конца мутанта аспартаткиназы.In some embodiments, the present invention provides a polypeptide with aspartate kinase activity comprising the addition or deletion of amino acids from at least one of the N-terminus and the C-terminus of an aspartate kinase mutant.
В некоторых частных вариантах осуществления мутант аспартаткиназы имеет делецию или добавление от 1 до 20 аминокислот, предпочтительно от 1 до 15 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 3 аминокислот и наиболее предпочтительно 1 аминокислоты по меньшей мере с одного из N-конца и C-конца, и обладает аспартаткиназной активностью.In some particular embodiments, the aspartate kinase mutant has a deletion or addition of 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 3 amino acids, and most preferably 1 amino acid from at least one of N-terminus and C-terminus, and has aspartate kinase activity.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему мутант аспартаткиназы, где полинуклеотид кодирует мутант полипептида, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. В частности, полинуклеотид представляет собой мутант гена LysC с высокой продукцией лизина, который был отобран из библиотеки мутантов гена LysC. Нуклеотидная последовательность гена LysC представлена в SEQ ID NO: 2.In some embodiments, the present invention provides a polynucleotide encoding a mutant of aspartate kinase, wherein the polynucleotide encodes a mutant of a polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Specifically, the polynucleotide is a high lysine production mutant of the LysC gene that was selected from a library LysC gene mutants. The nucleotide sequence of the LysC gene is shown in SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 293, выбрана из любой из следующих групп: TCC; GGC; GAA; CCA; TGG; TAC; CAC; ATG; CAA; TGC; CGC. Предпочтительно соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 293, выбрана из любой из следующих групп: TCC; GGC; GAA; CCA; TGG; TAC; CAC; ATG; CAA.In some embodiments, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 293 is selected from any of the following groups: TCC; GGC; GAA; CCA; TGG; TAC; CAC; ATG; CAA; TGC; C.G.C. Preferably, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 293 is selected from any of the following groups: TCC; GGC; GAA; CCA; TGG; TAC; CAC; ATG; CAA.
В некоторых вариантах осуществления соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 294, выбрана из любой из следующих групп: TAC; TGG; TTC. Предпочтительно соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 294, выбрана из любой из следующих групп: TGG; TTC.In some embodiments, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 294 is selected from any of the following groups: TAC; TGG; TTC. Preferably, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 294 is selected from any of the following groups: TGG; TTC.
В некоторых вариантах осуществления соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 307, выбрана из любой из следующих групп: TAC; GGC; TTC. Предпочтительно соответствующая нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего аминокислоту в положении 307, выбрана из любой из следующих групп: TAC; GGC.In some embodiments, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 307 is selected from any of the following groups: TAC; GGC; TTC. Preferably, the corresponding nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the amino acid at position 307 is selected from any of the following groups: TAC; GGC.
Конструирование библиотеки мутантов гена LysCConstruction of a library of LysC gene mutants
Используя плазмиду pCas9[3] в качестве матрицы и cas9-1/cas9-2 в качестве праймеров для амплификации, амплифицировали амплифицированный фрагмент 1, содержащий Cas9, при этом в праймеры cas9-1/cas9-2 была введена мутация оператора lacO и мутация RBS.Using plasmid pCas9 [3] as a template and cas9-1/cas9-2 as primers for amplification, amplified fragment 1 containing Cas9 was amplified, while the lacO operator mutation and the RBS mutation were introduced into the cas9-1/cas9-2 primers .
Используя pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdBTS [4] в качестве матрицы и гРНК-1/гРНК-2 в качестве праймеров для амплификации, амплифицировали амплифицированный фрагмент 2, содержащий кассету экспрессии gRNA-ccdB и термочувствительную точку начала репликации.Using pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS [4] as template and gRNA-1/gRNA-2 as amplification primers, amplified fragment 2 containing the gRNA-ccdB expression cassette and the temperature-sensitive origin of replication was amplified.
Амплифицированный фрагмент 1 и амплифицированный фрагмент 2 были рекомбинантно связаны с получением плазмиды pCas9gRNA-ccdB. Полученная плазмида pCas9gRNA-ccdB имела карту плазмидного вектора, представленную на фиг. 1, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.Amplified fragment 1 and amplified fragment 2 were recombinantly linked to produce plasmid pCas9gRNA-ccdB. The resulting plasmid pCas9gRNA-ccdB had the plasmid vector map shown in FIG. 1, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3.
Используя геном Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы и Pddh-1/ Pddh-2 в качестве праймеров, амплифицировали мутант промотора, содержащий ген ddh, в качестве амплифицированного фрагмента 3.Using the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and P ddh -1/ P ddh -2 as primers, a promoter mutant containing the ddh gene was amplified as amplified fragment 3.
Используя геном Escherichia coli MG1655 в качестве матрицы и recT-1/recT-2 в качестве праймеров, амплифицировали ген recT в качестве амплифицированного фрагмента 4.Using the Escherichia coli MG1655 genome as a template and recT-1/recT-2 as primers, the recT gene was amplified as amplified fragment 4.
Используя плазмиду pEC-XK99E в качестве матрицы и rrnB-1/rrnB-2 в качестве праймеров, амплифицировали терминатор rrnB в качестве амплифицированного фрагмента 5.Using plasmid pEC-XK99E as template and rrnB-1/rrnB-2 as primers, the rrnB terminator was amplified as amplified fragment 5.
Используя плазмиду pEC-XK99E в качестве матрицы и PEC-1/ PEC-2 в качестве праймеров, амплифицировали фрагмент плазмидного остова, из которого был нокаутирован ген per, в качестве амплифицированного фрагмента 6.Using plasmid pEC-XK99E as a template and PEC-1/PEC-2 as primers, a fragment of the plasmid backbone from which the per gene was knocked out was amplified as amplified fragment 6.
Амплифицированный фрагмент 3, амплифицированный фрагмент 4, амплифицированный фрагмент 5 и амплифицированный фрагмент 6 были рекомбинантно связаны с получением плазмиды pRecT, экспрессирующей RecT. Плазмида pRecT имела карту плазмидного вектора, представленную на фиг. 2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.Amplified fragment 3, amplified fragment 4, amplified fragment 5 and amplified fragment 6 were recombinantly linked to produce the RecT expressing plasmid pRecT. Plasmid pRecT had the plasmid vector map shown in FIG. 2, and the sequence shown in SEQ ID NO: 5.
Плазмиды pCas9gRNA, нацеленные соответственно на положения 293/294 и 307 гена lysC, были сконструированы методом клонирования Goldengate, где целевая ДНК-связывающая область гРНК-1 представляла собой TGCAGAAATCAACATTGACA, целевая ДНК-связывающая область гРНК-2 представляла собой GCAGGTGAAGGTGATGTCGG. А именно, lysC-F1/lysC-R1, lysC-F2/lysC-R2 денатурировали и отжигали, а затем подвергали клонированию по Goldengate вместе с плазмидой pCas9gRNA-ccdB, соответственно, с получением плазмиды pCas9gRNA-lysC1 и плазмиды pCas9gRNA-lysC2.pCas9gRNA plasmids targeting positions 293/294 and 307 of the lysC gene, respectively, were constructed by the Goldengate cloning method, where the target DNA-binding region of gRNA-1 was TGCAGAAATCAACATTGACA, the target DNA-binding region of gRNA-2 was GCAGGTGAAGGTGATGTCGG. Namely, lysC-F1/lysC-R1, lysC-F2/lysC-R2 were denatured and annealed, and then subjected to Goldengate cloning together with plasmid pCas9gRNA-ccdB, respectively, to obtain plasmid pCas9gRNA-lysC1 and plasmid pCas9gRNA-lysC2.
Плазмиду pRecT подвергали электротрансформации в Corynebacterium glutamicum ATCC13032 с получением штамма ATCC13032 (pRecT). Были сконструированы одноцепочечные ДНК с 293-1 по 293-9, с 294-1 по 294-9 и одноцепочечные ДНК с 307-1 по 307-9 соответственно в качестве рекомбинационных матриц для конструирования мутантов. Плазмиду pCas9gRNA-lysC1 и одноцепочечные ДНК с 293-1 по 293-9, с 294-1 по 294-9, а также плазмиду pCas9gRNA-lysC2 и одноцепочечные ДНК с 307-1 по 307-9 соответственно вводили в компетентные клетки ATCC13032 (pRecT). Компетентные клетки, трансфицированные плазмидами и одноцепочечными ДНК, соответственно наносили на планшет. Моноклональные штаммы, содержащие аминокислотные мутации в положениях 293, 294, 307, подвергали скринингу с получением библиотеки мутантов гена LysC.Plasmid pRecT was electrotransformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to obtain strain ATCC13032 (pRecT). ssDNA 293-1 to 293-9, 294-1 to 294-9, and ssDNA 307-1 to 307-9 were designed, respectively, as recombination templates for constructing mutants. Plasmid pCas9gRNA-lysC1 and ssDNA 293-1 to 293-9, 294-1 to 294-9, as well as plasmid pCas9gRNA-lysC2 and ssDNA 307-1 to 307-9, respectively, were introduced into ATCC13032 competent cells (pRecT ). Competent cells transfected with plasmids and ssDNA were plated on the plate, respectively. Monoclonal strains containing amino acid mutations at positions 293, 294, 307 were screened to obtain a library of LysC gene mutants.
В некоторых вариантах осуществления компетентные клетки, трансфицированные целевой ДНК, добавляли в 1 мл жидкой среды TSB, предварительно нагретой до 46 °C, подвергали тепловому шоку при 46 °C в течение 6 мин, инкубировали при 30 °C в течение 3 ч, наносили на планшеты с TSB, добавляли 5 мкг/мл хлорамфеникола и 0,05 мМ IPTG и инкубировали в течение 2 дней для выращивания сотен клонов, которые подвергали скринингу для получения библиотеки мутантов по аминокислотным положениям 293, 294, 307.In some embodiments, competent cells transfected with target DNA are added to 1 ml of liquid TSB medium prewarmed to 46 °C, heat shocked at 46 °C for 6 min, incubated at 30 °C for 3 h, applied to TSB plates were supplemented with 5 μg/ml chloramphenicol and 0.05 mM IPTG and incubated for 2 days to grow hundreds of clones, which were screened to obtain a library of mutants at amino acid positions 293, 294, 307.
Ингредиенты (г/л) жидкой среды TSB были следующими: глюкоза, 5 г/л; сухие дрожжи, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; МОПС (3-[N-морфолино]пропансульфоновая кислота), 20 г/л. В твердую среду добавляли 15 г/л порошка агара.The ingredients (g/L) of TSB liquid medium were as follows: glucose, 5 g/L; dry yeast, 5 g/l; soy peptone, 9 g/l; urea, 3 g/l; succinic acid 0.5 g/l; K 2 HPO 4 3H 2 O, 1 g/l; MgSO 4 7H 2 O, 0.1 g/l; biotin 0.01 mg/l; vitamin B1, 0.1 mg/l; MOPS (3-[N-morpholino]propanesulfonic acid), 20 g/l. 15 g/L agar powder was added to the solid medium.
Конкретная использованная Corynebacterium glutamicum представляет собой Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Gene ID: 2830649).The specific Corynebacterium glutamicum used was Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Gene ID: 2830649).
Процесс получения аминокислотThe process of obtaining amino acids
(1) Моноклональные штаммы с высоким уровнем продукции лизина подвергали скринингу в библиотеке мутантов гена LysC с аминокислотными мутациями в положениях 293, 294, 307 методом, который воспроизводимо давал результаты скрининга,и использовали в качестве рекомбинантных клеток-хозяев для получения аминокислот.(1) Monoclonal strains with high levels of lysine production were screened against a library of LysC gene mutants with amino acid mutations at positions 293, 294, 307 by a method that reproducibly produced screening results, and were used as recombinant host cells for amino acid production.
(2) Рекомбинантные клетки-хозяева подвергали ферментационному культивированию. Аминокислоты собирали из рекомбинантных клеток-хозяев или культурального бульона рекомбинантных клеток-хозяев, тем самым завершая получение аминокислот.(2) The recombinant host cells were subjected to fermentation culture. Amino acids were collected from the recombinant host cells or the culture broth of the recombinant host cells, thereby completing the production of amino acids.
Во время описанного выше процесса получения аминокислот мутантные гены LysC, содержащиеся в рекомбинантных клетках-хозяевах, могли кодировать аспартаткиназу, устраняющую ингибирование лизином. Рекомбинантные клетки-хозяева могли накапливать огромное количество лизина, обеспечивая стабильное и высокоэффективное получение лизина, треонина, изолейцина и их производных.During the amino acid production process described above, the mutant LysC genes contained in the recombinant host cells could encode an aspartate kinase that relieves lysine inhibition. Recombinant host cells could accumulate huge amounts of lysine, providing stable and highly efficient production of lysine, threonine, isoleucine and their derivatives.
Что касается полученных аминокислот, полученные аминокислоты выбраны из лизина, треонина, изолейцина и производной из них аминокислоты, где производная из них аминокислота включает по меньшей мере одно из пентандиамина, 5-аминовалериановой кислоты, глутаровой кислоты и гидроксиизолейцина.As for the resulting amino acids, the resulting amino acids are selected from lysine, threonine, isoleucine and an amino acid derived therefrom, wherein the amino acid derived therefrom includes at least one of pentanediamine, 5-aminovaleric acid, glutaric acid and hydroxyisoleucine.
Что касается рекомбинантных клеток-хозяев, рекомбинантная клетка-хозяин может также содержать другие ферменты, связанные с синтезом аминокислот. Например, ферменты, связанные с синтезом аминокислот, включают комбинацию одного или двух из: аспартаткиназы, аспартатполуальдегиддегидрогеназы, аспартат-аммоний-лиазы, дигидродипиколинатсинтазы, дигидродипиколинатредуктазы, сукцинилдиаминопимелатаминотрансферазы, тетрагидродипиколинатсукцинилазы, сукцинилдиаминопимелатдеацилазы, эпимеразы диаминопимелиновой кислоты, деацилазы диаминопимелиновой кислоты, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, транспортера лизина, транскетолазы, диаминопимелатдегидрогеназы и пируваткарбоксилазы.With regard to recombinant host cells, the recombinant host cell may also contain other enzymes associated with amino acid synthesis. For example, enzymes associated with amino acid synthesis include a combination of one or two of: aspartate kinase, aspartate semialdehyde dehydrogenase, aspartate ammonium lyase, dihydrodipicolinate synthase, dihydrodipicoline reductase, succinyldiaminopimelate aminotransferase, tetrahydrodipicolinate succinylase, succinyldiaminopimelate deacylase, diamine epimerase nopimelic acid, diaminopimelic acid deacylase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, lysine transporter, transketolase, diaminopimelate dehydrogenase and pyruvate carboxylase.
В некоторых вариантах осуществления активность или экспрессия фермента, связанного с синтезом аминокислот, может быть усилена с помощью генной инженерии, например, путем введения сильных промоторов или посредством экспрессии свободными плазмидами для увеличения интенсивности экспрессии генов, кодирующих ферменты, связанные с синтезом аминокислот, или путем хромосомной интеграции для интеграции генов от других видов, кодирующих ферменты, связанные с синтезом аминокислот, обладающие более высокой ферментативной активностью.In some embodiments, the activity or expression of an enzyme associated with amino acid synthesis can be enhanced through genetic engineering, for example, by introducing strong promoters or through expression with free plasmids to increase the intensity of expression of genes encoding enzymes associated with amino acid synthesis, or by chromosomal integration to integrate genes from other species encoding enzymes associated with amino acid synthesis that have higher enzymatic activity.
В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляла собой Corynebacterium glutamicum. В некоторых других вариантах осуществления клетка-хозяин представляла собой Escherichia coli. Оба из Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli являются важными штаммами для получения лизина. Путем экспрессии мутанта аспартаткиназы, устраняющего ингибирование лизином по принципу обратной связи в Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli, можно реализовать высокоэффективное получение лизина и его производных.In some embodiments, the host cell is Corynebacterium glutamicum. In some other embodiments, the host cell is Escherichia coli. Both Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are important strains for lysine production. By expressing an aspartate kinase mutant that eliminates feedback inhibition by lysine in Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli, highly efficient production of lysine and its derivatives can be realized.
В некоторых вариантах осуществления условия скрининга рекомбинантных клеток-хозяев были следующими: штаммы инокулировали зубочистками в 96-луночный планшет, содержащий 200 мкл ферментационной среды в каждой лунке, и культивировали при 30 °С в течение 24 ч. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин.In some embodiments, the recombinant host cell screening conditions were as follows: strains were inoculated with toothpicks into a 96-well plate containing 200 μl of fermentation medium in each well and cultured at 30°C for 24 hours. The plate shaker rotation speed was 800 rpm. min.
В некоторых вариантах осуществления условия ферментационного культивирования были следующими: рекомбинантные клетки-хозяева инокулировали в жидкую среду TSB и культивировали в течение 6-8 ч. Культуры инокулировали в виде посевов в 24-луночный планшет, содержащий 600 мкл ферментационной среды в каждой лунке, с исходной OD600 (оптическая плотность при 600 нм), контролируемой на уровне приблизительно 0,1, и культивировали при 30 °C в течение 17 ч. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. Для каждого штамма готовили по три образца. После ферментации измеряли OD600 и выход лизина.In some embodiments, the fermentation culture conditions were as follows: the recombinant host cells were inoculated into liquid TSB medium and cultured for 6-8 hours. The cultures were inoculated as plates into a 24-well plate containing 600 μl of fermentation medium in each well, with the original OD 600 (optical density at 600 nm) was controlled at approximately 0.1 and cultured at 30 °C for 17 h. The plate shaker rotation speed was 800 rpm. Three samples were prepared for each strain. After fermentation, OD 600 and lysine yield were measured.
Ингредиенты ферментационной среды были следующими: глюкоза, 80 г/л; сухие дрожжи, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина 8 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45 г/л; FeSO4·7H2O, 0,05 г/л; биотин 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; МОПС, 40 г/л; и начальный рН 7,2.The fermentation medium ingredients were as follows: glucose, 80 g/L; dry yeast, 1 g/l; soy peptone, 1 g/l; NaCl, 1 g/l; ammonium sulfate, 1 g/l; urea 8 g/l; K 2 HPO 4 3H 2 O, 1 g/l; MgSO 4 7H 2 O, 0.45 g/l; FeSO 4 7H 2 O, 0.05 g/l; biotin 0.4 mg/l; vitamin B1, 0.1 mg/l; MOPS, 40 g/l; and initial pH 7.2.
В некоторых вариантах осуществления для извлечения аминокислот из рекомбинантных клеток-хозяев или культурального бульона рекомбинантных клеток можно использовать обычный метод в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию и ВЭЖХ.In some embodiments, conventional methods in the art, including, but not limited to, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, and HPLC, can be used to extract amino acids from recombinant host cells or recombinant cell culture broth.
Ферменты, катализирующие некоторые или все реакции, описанные в настоящем изобретении, могут быть экспрессированы в неприродных, сконструированных гетерологичных организмах. В частности, гены, кодирующие фермент для пути синтеза, могут быть выделены, вставлены в векторы экспрессии организмов, используемых для получения трансформации, и включены в геном, и непосредственно экспрессируют фермент. В данной области техники известен метод подвергания микроорганизмов манипуляциям, например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology (Online ISBN: 9780471142720, John Wiley and Sons, Inc.), Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Qiong Cheng Ed., Springer), и Systems Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Hal S. Alper Ed., Springer).Enzymes catalyzing some or all of the reactions described in the present invention can be expressed in non-natural, engineered heterologous organisms. In particular, genes encoding an enzyme for a synthesis pathway can be isolated, inserted into expression vectors of the organisms used to produce the transformation, and incorporated into the genome and directly expressing the enzyme. A method for subjecting microorganisms to manipulation is known in the art, for example as described in Current Protocols in Molecular Biology (Online ISBN: 9780471142720, John Wiley and Sons, Inc.), Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Qiong Cheng Ed., Springer) , and Systems Metabolic Engineering: Methods and Protocols (Hal S. Alper Ed., Springer).
ПримерыExamples
Дополнительные предметы, признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из последующего подробного описания. Однако следует принимать во внимание, что подробное описание и конкретные примеры (хотя и раскрывающие конкретные варианты осуществления настоящего изобретения) приведены только в иллюстративных целях. На основании подробного описания специалистам в данной области техники станут очевидны различные изменения и модификации в рамках сущности и объема настоящего изобретения.Additional objects, features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description. However, it should be appreciated that the detailed description and specific examples (although revealing specific embodiments of the present invention) are provided for illustrative purposes only. Based on the detailed description, various changes and modifications will become apparent to those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the present invention.
Все методики эксперимента и методы эксперимента, использованные в примерах, если не указано иное, представляют собой общепринятые методики и методы, например, методы эксперимента, для которых в следующих примерах не указаны конкретные условия, обычно осуществляли в соответствии с общепринятыми условиями, такими как описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или рекомендованными производителями. Все материалы, реагенты и т.д., использованные в примерах, если не указано иное, являются коммерчески доступными.All experimental procedures and experimental methods used in the examples, unless otherwise noted, are generally accepted procedures and methods, for example, experimental methods for which specific conditions are not specified in the following examples were generally carried out in accordance with generally accepted conditions, such as those described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), or recommended by the manufacturer. All materials, reagents, etc. used in the examples, unless otherwise noted, are commercially available.
Пример 1. Конструирование библиотеки мутантов гена lysC Corynebacterium glutamicumExample 1. Construction of a library of mutants of the lysC gene of Corynebacterium glutamicum
Основываясь на последовательности и структурных характеристиках LysC Corynebacterium glutamicum и на понимании авторами изобретения его функций, было высказано предположение, что мутации аминокислот в положениях 293, 294, 307 могут устранять ингибирование лизином по принципу обратной связи LysC и повышать выход L-лизина Corynebacterium glutamicum.Based on the sequence and structural characteristics of Corynebacterium glutamicum LysC and the inventors' understanding of its functions, it was hypothesized that mutations of amino acids at positions 293, 294, 307 could reverse the lysine feedback inhibition of LysC and increase the yield of Corynebacterium glutamicum L-lysine.
Для быстрой сайт-направленной мутации Corynebacterium glutamicum в настоящем изобретении сначала была создана система редактирования генома CRISPR/Cas9 на основе одноцепочечной рекомбинации. Используя плазмиду pCas9 [3] в качестве матрицы и cas9-1/cas9-2 в качестве праймеров, в праймеры вводили мутацию оператора lacO (TGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACA мутирована в TGTGTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTTCACACA) и мутацию RBS (AAAGGAGTTGAGA мутирована в AAAGGCACCCGAT) для амплификации фрагментов, содержащих cas9; затем, используя плазмиду pnCas9(D10A)-AID‐gRNA‐ccdBTS[4] в качестве матрицы и гРНК-1/гРНК-2 в качестве праймеров, амплифицировали фрагмент плазмидного остова, содержащий кассету экспрессии gRNA‐ccdB и термочувствительную точку начала репликации. Вышеупомянутые 2 фрагмента лигировали с помощью набора One Step Cloning Kit от Vazyme для получения высокоэффективно сконструированной плазмиды pCas9gRNA-ccdB. Плазмида имела карту плазмидного вектора, представленную на фиг. 1, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. Используя геном Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы и Pddh-1/ Pddh-2 в качестве праймеров, амплифицировали мутантный промотор гена ddh (ATGCATCTC мутирована в ACAAAAGGT), последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4; используя геном Escherichia coli MG1655 в качестве матрицы, амплифицировали ген recT; используя плазмиду pEC-XK99E в качестве матрицы и rrnB-1/rrnB-2 в качестве праймеров, амплифицировали фрагмент терминатора rrnB; используя плазмиду pEC-XK99E в качестве матрицы и PEC-1/ PEC-2 в качестве праймеров, амплифицировали фрагмент плазмидного остова, из которого был нокаутирован ген per. Вышеупомянутые 4 фрагмента лигировали с помощью набора One Step Cloning Kit от Vazyme для получения плазмиды pRecT, экспрессирующей RecT. Плазмида имела карту плазмидного вектора, представленную на фиг. 2, и последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.For rapid site-directed mutation of Corynebacterium glutamicum, the present invention first established a CRISPR/Cas9 genome editing system based on single-stranded recombination. Using plasmid pCas9 [3] as a template and cas9-1/cas9-2 as primers, the lacO operator mutation (TGTGTGGAATTGTGAGCG GATA ACAATTTCACACA mutated to TGTGTGGAATTGTGAGCG CTC ACAATTTCACACA) and the RBS mutation (AAAGGAGTTGAGA mutated to AAAGGCACCCGAT) were introduced into the primers to amplify fragments, containing cas9; then, using the plasmid pnCas9(D10A)-AID-gRNA-ccdB TS[4] as a template and gRNA-1/gRNA-2 as primers, a fragment of the plasmid backbone containing the gRNA-ccdB expression cassette and the temperature-sensitive origin of replication was amplified. The above 2 fragments were ligated using the One Step Cloning Kit from Vazyme to obtain the highly efficiently constructed plasmid pCas9gRNA-ccdB. The plasmid had a plasmid vector map shown in FIG. 1, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3. Using the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and P ddh -1/ P ddh -2 as primers, a mutant ddh gene promoter (ATGCATCTC mutated to ACAAAAGGT) was amplified, the sequence of which is shown as follows: in SEQ ID NO: 4; using the genome of Escherichia coli MG1655 as a template, the recT gene was amplified; using plasmid pEC-XK99E as a template and rrnB-1/rrnB-2 as primers, the rrnB terminator fragment was amplified; using plasmid pEC-XK99E as a template and PEC-1/PEC-2 as primers, a fragment of the plasmid backbone from which the per gene was knocked out was amplified. The above 4 fragments were ligated using the One Step Cloning Kit from Vazyme to obtain the RecT expression plasmid pRecT. The plasmid had a plasmid vector map shown in FIG. 2, and the sequence shown in SEQ ID NO: 5.
Две плазмиды pCas9gRNA, нацеленные соответственно на положения 293/294 и 307 гена lysC, были сконструированы методом клонирования Goldengate[4], описанным в литературе. Целевая ДНК-связывающая область гРНК1 представляла собой TGCAGAAATCAACATTGACA, целевая ДНК-связывающая область гРНК2 представляла собой GCAGGTGAAGGTGATGTCGG. Праймеры lysC-F1/lysC-R1, lysC-F2/lysC-R2 денатурировали и отжигали, соответственно, а затем подвергали клонированию по Goldengate вместе с плазмидой pCas9gRNA-ccdB с получением плазмиды pCas9gRNA-lysC1 и pCas9gRNA-lysC2, соответственно.Two pCas9gRNA plasmids targeting positions 293/294 and 307 of the lysC gene, respectively, were constructed by the Goldengate cloning method [4] described in the literature. The target DNA binding region of gRNA1 was TGCAGAAATCAACATTGACA, the target DNA binding region of gRNA2 was GCAGGTGAAGGTGATGTCGG. Primers lysC-F1/lysC-R1, lysC-F2/lysC-R2 were denatured and annealed, respectively, and then subjected to Goldengate cloning along with plasmid pCas9gRNA-ccdB to obtain plasmids pCas9gRNA-lysC1 and pCas9gRNA-lysC2, respectively.
На основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9 на основе одноцепочечной рекомбинации была сконструирована библиотека мутантов гена lysC в аминокислотных положениях 293, 294 и 307. Плазмиду pRecT подвергали электротрансформации в Corynebacterium glutamicum ATCC13032 с получением штамма ATCC13032 (pRecT). Компетентные клетки [5] получали из штамма ATCC13032 (pRecT) по методике, описанной в литературе. Для осуществления 19 мутаций, отличных от мутаций дикого типа, в аминокислотных положениях 293, 294 и 307 гена lysC, были сконструированы одноцепочечные ДНК с 293-1 по 293-9, с 294-1 по 294-9 и с 307-1 по 307-9 в качестве рекомбинационных матриц для конструирования мутантов. Компетентные клетки ATCC13032 (pRecT) подвергали электротрансформации соответственно 1-2 мкг плазмиды pCas9gRNA-lysC1 и 10 мкг одноцепочечных ДНК эквимолярной концентрации теоретических 19 мутантов с 293-1 по 293-9, 1-2 мкг плазмиды pCas9gRNA-lysC1 и 10 мкг одноцепочечных ДНК эквимолярной концентрации теоретических 19 мутантов с 294-1 по 294-9, и 1-2 мкг плазмиды pCas9gRNA-lysC2 и 10 мкг одноцепочечных ДНК эквимолярной концентрации теоретических 19 мутантов с 307-1 по 307-9, а затем добавляли в 1 мл культуральной среды TSB, предварительно нагретой до 46 °C, подвергали тепловому шоку при 46 °C в течение 6 мин, инкубировали при 30 °C в течение 3 ч, наносили на планшеты с TSB, добавляли 5 мкг/мл хлорамфеникола и 0,05 мМ IPTG и инкубировали в течение 2 дней для выращивания сотен клонов, с получением библиотеки мутантов по аминокислотным положениям 293, 294 и 307, соответственно. Ингредиенты (г/л) жидкой среды TSB были следующими: глюкоза, 5 г/л; сухие дрожжи, 5 г/л; соевый пептон, 9 г/л; мочевина, 3 г/л; янтарная кислота 0,5 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,1 г/л; биотин 0,01 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; МОПС, 20 г/л. В твердую среду добавляли 15 г/л порошка агара FO. Последовательности использованных выше праймеров приведены в таблице 2.Based on the single-strand recombination-based CRISPR/Cas9 genome editing system, a library of mutants of the lysC gene at amino acid positions 293, 294 and 307 was constructed. Plasmid pRecT was electrotransformed into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to obtain strain ATCC13032 (pRecT). Competent cells [5] were obtained from strain ATCC13032 (pRecT) according to the method described in the literature. Single-stranded DNAs 293-1 to 293-9, 294-1 to 294-9, and 307-1 to 307 were constructed to implement 19 non-wild-type mutations at amino acid positions 293, 294, and 307 of the lysC gene. -9 as recombination templates for constructing mutants. ATCC13032 competent cells (pRecT) were electrotransformed with 1-2 μg of pCas9gRNA-lysC1 plasmid and 10 μg of equimolar ssDNA of the theoretical 19 mutants 293-1 to 293-9, 1-2 μg of pCas9gRNA-lysC1 plasmid and 10 μg of equimolar ssDNA. concentrations of the theoretical 19 mutants 294-1 to 294-9, and 1-2 μg of plasmid pCas9gRNA-lysC2 and 10 μg of single-stranded DNA equimolar concentration of the theoretical 19 mutants 307-1 to 307-9, and then added to 1 ml of TSB culture medium , prewarmed to 46 °C, heat shocked at 46 °C for 6 min, incubated at 30 °C for 3 h, applied to TSB plates, 5 μg/ml chloramphenicol and 0.05 mM IPTG were added and incubated for 2 days to grow hundreds of clones, obtaining a library of mutants at amino acid positions 293, 294 and 307, respectively. The ingredients (g/L) of TSB liquid medium were as follows: glucose, 5 g/L; dry yeast, 5 g/l; soy peptone, 9 g/l; urea, 3 g/l; succinic acid 0.5 g/l; K 2 HPO 4 3H 2 O, 1 g/l; MgSO 4 7H 2 O, 0.1 g/l; biotin 0.01 mg/l; vitamin B1, 0.1 mg/l; MOPS, 20 g/l. 15 g/L FO agar powder was added to the solid medium. The sequences of the primers used above are shown in Table 2.
Таблица 2table 2
Пример 2. Скрининг и секвенирование библиотеки мутантов гена lysC Corynebacterium glutamicumExample 2. Screening and sequencing of a library of mutants of the lysC gene of Corynebacterium glutamicum
Для скрининга библиотеки мутантов гена lysC Corynebacterium glutamicum из библиотеки мутантов отбирали по 60 клонов по каждому из положений 293, 294 и 307 и подвергали ферментации для скрининга мутантов с высоким выходом L-лизина. Ингредиенты ферментационной среды были следующими: глюкоза, 80 г/л; сухие дрожжи, 1 г/л; соевый пептон, 1 г/л; NaCl, 1 г/л; сульфат аммония, 1 г/л; мочевина 8 г/л; K2HPO4·3H2O, 1 г/л; MgSO4·7H2O, 0,45 г/л; FeSO4·7H2O, 0,05 г/л; биотин 0,4 мг/л; витамин B1, 0,1 мг/л; МОПС, 40 г/л; и начальный рН 7,2. Штаммы инокулировали зубочистками в 96-луночный планшет, содержащий 200 мкл ферментационной среды в каждой лунке, и культивировали при 30 °С в течение 24 ч. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. После завершения ферментации измеряли выход L-лизина. Все клоны из библиотеки мутантов по положению 293 имели выход выше 0,5 г/л; некоторые клоны из библиотеки мутантов по положению 294 и мутантов по положению 307 имели выход выше 0,5 г/л, что свидетельствует о том, что мутанты с мутациями в вышеуказанных положениях могут устранять ингибирование лизином по принципу обратной связи и повышать продукцию лизина. Мутанты, для которых был получен выход лизина выше 0,5 г/л, и некоторые мутанты из библиотеки мутантов по положению 294 и мутантов по положению 307, не продуцировавших лизин, подвергали секвенированию с помощью ПЦР-амплификации целевой полосы с использованием праймеров lysC-C1/ lysC-C2 (таблица 2). Выход мутантов и результаты секвенирования приведены в таблице 3. Некоторые клоны имели идентичные мутации. Наконец, 11 мутантов были получены из мутантов по положению 293, 6 – из мутантов по положению 294 и 5 – из мутантов по положению 307.To screen a library of Corynebacterium glutamicum lysC gene mutants, 60 clones were selected from the mutant library at each of positions 293, 294, and 307 and fermented to screen for mutants with high L-lysine yield. The fermentation medium ingredients were as follows: glucose, 80 g/L; dry yeast, 1 g/l; soy peptone, 1 g/l; NaCl, 1 g/l; ammonium sulfate, 1 g/l; urea 8 g/l; K 2 HPO 4 3H 2 O, 1 g/l; MgSO 4 7H 2 O, 0.45 g/l; FeSO 4 7H 2 O, 0.05 g/l; biotin 0.4 mg/l; vitamin B1, 0.1 mg/l; MOPS, 40 g/l; and initial pH 7.2. The strains were inoculated with toothpicks into a 96-well plate containing 200 μl of fermentation medium in each well and cultured at 30 °C for 24 h. The plate shaker rotation speed was 800 rpm. After completion of fermentation, the yield of L-lysine was measured. All clones from the library of mutants at position 293 had yields above 0.5 g/L; some clones from the library of position 294 mutants and position 307 mutants had yields higher than 0.5 g/L, indicating that mutants with mutations at the above positions can reverse feedback inhibition by lysine and increase lysine production. Mutants that produced lysine yields greater than 0.5 g/L and some mutants from the library of position 294 mutants and position 307 mutants that did not produce lysine were sequenced by PCR amplification of the target band using primers lysC-C1 /lysC-C2 (Table 2). The yield of mutants and sequencing results are shown in Table 3. Some clones had identical mutations. Finally, 11 mutants were derived from position 293 mutants, 6 from position 294 mutants, and 5 from position 307 mutants.
Таблица 3Table 3
Примечание: Note:
–: лизин не был продуцирован; +: выход лизина от 0,5 до 1,0 г/л; ++: выход лизина от 1,0 до 2,0 г/л; +++: выход лизина от 2,0 до 3,0 г/л; ++++: выход лизина от 3,0 до 4,0 г/л.–: lysine was not produced; +: lysine yield from 0.5 to 1.0 g/l; ++: lysine yield from 1.0 to 2.0 g/l; +++: lysine yield from 2.0 to 3.0 g/l; ++++: lysine yield from 3.0 to 4.0 g/l.
Пример 3. Оценка продукции лизина мутантами гена lysC Corynebacterium glutamicumExample 3. Evaluation of lysine production by mutants of the lysC gene of Corynebacterium glutamicum
Поскольку штаммы, ранее использованные для скрининга мутантов по выходу лизина, включали pRecT и плазмиду pCas9gRNA-lysC1 или pCas9gRNA-lysC2, в этом примере вышеуказанные плазмиды были удалены, и были получены штаммы, имеющие в геноме только мутации, и оценен выход лизина для этих штаммов. Относительно высокопродуктивные со штамма 293-M1 по штамм 293-M9, со штамма 293-M1 по штамм 293-M3, со штамма 307-M1 по штамм 307-M2 культивировали в среде TSB, не содержащей хлормицетин, с удалением двух плазмид, с получением соответственно мутантных штаммов с ZCgLJ1 по ZCgLJ9, с ZCgLJ11 по ZCgLJ13, с ZCgLJ14 по ZCgLJ15 с удаленными плазмидами. С целью сравнения эффектов одновременно было сконструировано огромное количество мутантов lysCT311I, описанных в литературе, которые эффективно устраняют ингибирование лизиномпо принципу обратной связи. Такие штаммы получали путем введения аминокислотной мутации T311I (т. е. оснований, мутированных из ACC в ATC) в ген lysC, кодирующий аспартаткиназу Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (ссылочный документ 2). Кроме того, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 дикого типа использовали в качестве контрольного штамма (WT). Для оценки продукции лизина штаммами использовали 24-луночный планшет. Штаммы сначала инокулировали в жидкую среду TSB и культивировали в течение 6-8 ч. Культуры инокулировали в виде посевов в 24-луночный планшет, содержащий 600 мкл ферментационной среды в каждой лунке (такой же, как в примере), с исходной OD600, контролируемой на уровне приблизительно 0,1, и культивировали при 30 °C в течение 17 ч. Скорость вращения планшетного шейкера составляла 800 об/мин. Для каждого штамма готовили по три образца. После ферментации измеряли выход лизина. Результаты приведены в таблице 4. Все 11 мутантов с мутацией в положении 293 имели более высокий выход, чем контрольный мутант T311I. Мутанты D294F (штамм ZCgLJ13) с мутацией в положении 294 и мутанты T307G (ZCgLJ15) с мутацией в положении 307 также имели более высокий выход, чем контрольный мутант T311I. Мутации в этих аминокислотных положениях были более перспективны в отношении применения для получения аминокислот и их производных, чем T311I, в частности, при получении лизина, треонина и изолейцина и их производных, таких как пентандиамин, 5-аминовалериановая кислота, глутаровая кислота, гидроксиизолейцин, всем из которых необходим LysC для катализа реакций.Since strains previously used to screen for lysine yield mutants included pRecT and plasmid pCas9gRNA-lysC1 or pCas9gRNA-lysC2, in this example the above plasmids were removed and strains having only mutations in the genome were obtained and lysine yield was assessed for these strains . Relatively highly productive from strain 293-M1 to strain 293-M9, from strain 293-M1 to strain 293-M3, from strain 307-M1 to strain 307-M2 were cultivated in TSB medium not containing chloromycetin, with the removal of two plasmids, obtaining respectively, mutant strains from ZCgLJ1 to ZCgLJ9, from ZCgLJ11 to ZCgLJ13, from ZCgLJ14 to ZCgLJ15 with deleted plasmids. In order to compare the effects, a huge number of lysC T311I mutants described in the literature were simultaneously constructed, which effectively eliminate feedback inhibition by lysine. Such strains were obtained by introducing the amino acid mutation T311I (ie bases mutated from ACC to ATC) into the lysC gene encoding the aspartate kinase of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Ref. 2). In addition, wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was used as a control strain (WT). A 24-well plate was used to evaluate lysine production by the strains. The strains were first inoculated into liquid TSB medium and cultured for 6-8 hours. Cultures were inoculated as inoculum into a 24-well plate containing 600 μl of fermentation medium in each well (same as in the example), with an initial OD of 600 controlled at a level of approximately 0.1, and cultured at 30 °C for 17 h. The plate shaker rotation speed was 800 rpm. Three samples were prepared for each strain. After fermentation, the lysine yield was measured. The results are shown in Table 4. All 11 mutants with the mutation at position 293 had higher yields than the control mutant T311I. Mutants D294F (strain ZCgLJ13) with a mutation at position 294 and mutants T307G (ZCgLJ15) with a mutation at position 307 also had higher yields than the control mutant T311I. Mutations at these amino acid positions were more promising for the production of amino acids and their derivatives than T311I, in particular in the production of lysine, threonine and isoleucine and their derivatives, such as pentanediamine, 5-aminovaleric acid, glutaric acid, hydroxyisoleucine, all of which LysC is required to catalyze reactions.
Таблица 4Table 4
Все технические признаки, раскрытые в настоящем документе, могут быть объединены в любую комбинацию. Каждый признак, раскрытый в настоящем документе, может быть заменен признаком, выполняющим идентичную, эквивалентную или схожую функцию. Следовательно, если не указано иное, каждый признак, раскрытый в настоящем документе, является просто практическим примером ряда эквивалентных или схожих признаков.All technical features disclosed herein may be combined in any combination. Each feature disclosed herein may be replaced by a feature that performs an identical, equivalent, or similar function. Therefore, unless otherwise indicated, each feature disclosed herein is merely a practical example of a number of equivalent or similar features.
Кроме того, из приведенного выше описания настоящего изобретения специалисту в данной области техники ясно известны ключевые признаки настоящего изобретения. Не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения, в изобретение может быть внесен ряд изменений для адаптации к различным целям и условиям применения. Следовательно, предполагается, что такие изменения также входят в объем прилагаемой формулы изобретения.Moreover, from the above description of the present invention, one skilled in the art will clearly understand the key features of the present invention. Without departing from the spirit and scope of the present invention, a number of modifications may be made to the invention to adapt to different purposes and conditions of use. It is therefore intended that such modifications also be included within the scope of the appended claims.
Цитируемые источникиSources cited
[1] Bearer CF, Neet KE; Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G., Robichon-Szulmajster, H. (1961). “Feed-back Inhibition and Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae”. J. Biol. Chem.[1] Bearer CF, Neet KE; Stadtman, E. R., Cohen, G. N., LeBras, G., Robichon-Szulmajster, H. (1961). “Feed-back Inhibition and Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.” J Biol. Chem.
[2] Watson et. al. (1987) Molecular Biology of the Gene. Fourth Edition. Benjamin/Cummings Pub. Co. P224.[2] Watson et. al. (1987) Molecular Biology of the Gene. Fourth Edition. Benjamin/Cummings Pub. Co. P224.
[3] LIU, Jiao, et al. “Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum”. Microbial cell factories, 2017, 16.1: 205.[3] LIU, Jiao, et al. “Development of a CRISPR/Cas9 genome editing toolbox for Corynebacterium glutamicum.” Microbial cell factories, 2017, 16.1: 205.
[4] WANG, Yu, et al. “Expanding targeting scope, editing window, and base transition capability of base editing in Corynebacterium glutamicum”. Biotechnology and bioengineering, 2019, 116: 3016-3029.[4] WANG, Yu, et al. “Expanding targeting scope, editing window, and base transition capability of base editing in Corynebacterium glutamicum.” Biotechnology and bioengineering, 2019, 116: 3016-3029.
[5] Ruan Y, Zhu L, Li Q. “Improving the electro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakening its cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity”. Biotechnol Lett. 2015; 37: 2445–52.[5] Ruan Y, Zhu L, Li Q. “Improving the electro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakening its cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity.” Biotechnol Lett. 2015; 37:2445–52.
Claims (19)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011110184.9 | 2020-10-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2821918C1 true RU2821918C1 (en) | 2024-06-27 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004069996A2 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-19 | Degussa Ag | Bacteria and process for producing chemical compounds by said bacteria |
| US7345220B2 (en) * | 1999-12-21 | 2008-03-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Aspartate kinase |
| RU2535973C2 (en) * | 2010-06-15 | 2014-12-20 | Пайк Кванг Индастриал Ко., Лтд. | Method of producing amino acids of asparate family with application of microorganisms |
| CN104334728A (en) * | 2011-12-21 | 2015-02-04 | Cj第一制糖株式会社 | Method for producing L-lysine using microorganisms having ability to produce L-lysine |
| CN106062176A (en) * | 2014-01-02 | 2016-10-26 | 特雷里斯公司 | Compositions and methods for biological production of amino acids in hydrogenotrophic microorganisms |
| CN104099308B (en) * | 2013-04-03 | 2019-05-31 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | One kind having the active polypeptide of aspartokinase and its application |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7345220B2 (en) * | 1999-12-21 | 2008-03-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Aspartate kinase |
| WO2004069996A2 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-19 | Degussa Ag | Bacteria and process for producing chemical compounds by said bacteria |
| RU2535973C2 (en) * | 2010-06-15 | 2014-12-20 | Пайк Кванг Индастриал Ко., Лтд. | Method of producing amino acids of asparate family with application of microorganisms |
| CN104334728A (en) * | 2011-12-21 | 2015-02-04 | Cj第一制糖株式会社 | Method for producing L-lysine using microorganisms having ability to produce L-lysine |
| CN104099308B (en) * | 2013-04-03 | 2019-05-31 | 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 | One kind having the active polypeptide of aspartokinase and its application |
| CN106062176A (en) * | 2014-01-02 | 2016-10-26 | 特雷里斯公司 | Compositions and methods for biological production of amino acids in hydrogenotrophic microorganisms |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11667936B2 (en) | Modified polypeptide with attenuated activity of citrate synthase and method for producing L-amino acid using the same | |
| KR102055874B1 (en) | A Novel Isopropylmalate Synthase Variant and a Method of Producing L-Leucine Using the Same | |
| KR100526316B1 (en) | Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method | |
| JPWO2006035831A1 (en) | Process for producing L-arginine, L-ornithine or L-citrulline | |
| US20230399667A1 (en) | Polynucleotide Having Promoter Activity and Application of Polynucleotide in Producing Amino Acid | |
| KR102277407B1 (en) | Novel glutamate synthase subunit alpha variant and a method for producing L-glutamic acid using the same | |
| RU2669996C2 (en) | Novel mutant ornithine decarboxylase protein and use thereof | |
| CN111411092A (en) | Corynebacterium glutamicum with high L-lysine yield and application thereof | |
| US20230332116A1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof in production of amino acid | |
| CN110872593B (en) | Serine hydroxymethyl transferase mutant and application thereof | |
| CN111133105B (en) | D-amino acid dehydrogenase | |
| KR100830860B1 (en) | Novel enzymes and genes coding for the same derived from Methylophilus methylotrophus | |
| RU2821918C1 (en) | Polypeptide with aspartate kinase activity and use thereof for producing amino acids | |
| CN111051508A (en) | D-amino acid dehydrogenase | |
| KR102527895B1 (en) | GlxR protein variant or threonine production method using the same | |
| JP7214952B2 (en) | Ornithine decarboxylase mutant and method for producing putrescine using the same | |
| KR20220152728A (en) | Microorganism having inhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase and uses thereof | |
| EP2397545B1 (en) | Method for producing amino acid | |
| RU2805253C1 (en) | New modified polypeptide with reduced citrate synthase activity and method for producing l-amino acid using it | |
| CN117264034B (en) | BBD29_09715 gene mutant and application thereof in preparation of L-glutamic acid | |
| KR102527102B1 (en) | Isopropylmaleate synthase variant and a method of producing L-leucine using the same | |
| KR102031886B1 (en) | Novel promoter and uses thereof | |
| CN114835783B (en) | NCgl2747 gene mutant and application thereof in preparation of L-lysine | |
| RU2797843C9 (en) | Microorganism producing lysine and a method of producing lysine | |
| JP2022130759A (en) | Ornithine decarboxylase mutant and production method of putrescine using the same |