JP7214952B2 - Ornithine decarboxylase mutant and method for producing putrescine using the same - Google Patents

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特許法第30条第2項適用 2018年7月17日に、エルスヴィア ビー ヴイのウェブサイト https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165618305522において、ジャーナル オブ バイオテクノロジーの第281巻175~182頁(2018年)において公表。Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act On July 17, 2018, Elsvia B.V. science direct. com/science/article/pii/S0168165618305522 in Journal of Biotechnology 281:175-182 (2018).

本発明は、オルニチン脱炭酸酵素変異型、オルニチン脱炭酸酵素変異型を暗号化する遺伝子、オルニチン脱炭酸酵素変異型を含む微生物及びそれを用いたプトレシン合成に関する。 The present invention relates to ornithine decarboxylase mutants, genes encoding ornithine decarboxylase mutants, microorganisms containing ornithine decarboxylase mutants, and putrescine synthesis using the same.

本願は、2018年12月27日付のPCT国際特許出願第PCT/KR2018/016764号と2018年12月28日付の台湾特許出願第107147749号に基づいた優先権の利益を主張し、当該特許出願の文献に開示されたあらゆる内容は、本明細書の一部として含まれる。 This application claims the benefit of priority based on PCT International Patent Application No. PCT/KR2018/016764 dated December 27, 2018 and Taiwanese Patent Application No. 107147749 dated December 28, 2018, Any content disclosed in the literature is included as part of this specification.

プトレシン(putrescine;1,4-diamino-butane)は、腐敗した有機体から発生する悪臭を誘発する物質であるが、4,6-ナイロン合成に活用されうるという点で工業的に生産されている。現在、プトレシンは、石油資源によって年当たり10,000トン以上が生産されているが、石油価格の頻繁な変動によって、原料需給が不安定であるという問題点がある。また、生産過程で生成される多量の毒性物質によって、環境汚染を誘発することができるという問題点がある。 Putrescine (1,4-diamino-butane) is an odor-inducing substance generated from decaying organisms, and is industrially produced in that it can be utilized in the synthesis of 4,6-nylon. . At present, more than 10,000 tons of putrescine is produced annually from petroleum resources, but there is a problem of unstable raw material supply and demand due to frequent fluctuations in petroleum prices. In addition, there is a problem in that a large amount of toxic substances generated during the production process may cause environmental pollution.

このような問題点を解決するために、最近、バイオ由来プトレシン合成についての研究が活発に進められている。例えば、バイオ由来オルニチンからプトレシンを合成するか、糖を用いて微生物からプトレシンを量産する方法に関する研究が進められている。 In order to solve these problems, researches on synthesis of bio-derived putrescine have been actively progressed recently. For example, research is being conducted on methods for synthesizing putrescine from bio-derived ornithine or mass-producing putrescine from microorganisms using sugar.

微生物からプトレシンを生産する方法において、プトレシンの生産量を増加させるための多様な生物学的エンジニアリング方法が使われた。前記方法は、例えば、プトレシン生合成に関与する酵素の活性をプロモーターで調節するか、プトレシンが細胞外に放出が容易になるように逆輸送体を過発現するか、プトレシンを分解する経路を遮断するものである。そのうちでも、微生物内のプトレシン生合成に関与する酵素の活性を調節することが、プトレシンの生産量の増加に大きく寄与することができると知られている。 In the method of producing putrescine from microorganisms, various biological engineering methods were used to increase the production of putrescine. The method includes, for example, regulating the activity of an enzyme involved in putrescine biosynthesis with a promoter, overexpressing a reverse transporter so that putrescine is easily released outside the cell, or blocking a pathway that degrades putrescine. It is something to do. Among them, it is known that regulation of the activity of enzymes involved in putrescine biosynthesis in microorganisms can greatly contribute to an increase in putrescine production.

オルニチン脱炭酸酵素は、オルニチンの末端カルボキシル基を切断してプトレシンを合成する酵素であって、プトレシン生合成で重要な役割を行う酵素の1つである。しかし、オルニチン脱炭酸酵素は、オルニチンからプトレシンを合成するだけではなく、リジンからカダベリン(1,5-diamino-pentane)に合成する活性(副反応)を同時に有するために、その活性を高める場合、プトレシンと共にカダベリンが共に生成されて、プトレシンの生産量を低下させることができる。前記カダベリンは、プトレシン精製時にも多くの問題点をもたらしうる。具体的には、微生物培養液を蒸留方法で精製する過程でプトレシン(HN(CHNH)とカダベリン(HN(CHNH)との構造が非常に類似しているために、それを選択的に精製するために、多くのコスト及び時間がかかる。 Ornithine decarboxylase is an enzyme that cleaves the terminal carboxyl group of ornithine to synthesize putrescine, and is one of the enzymes that play an important role in putrescine biosynthesis. However, ornithine decarboxylase not only synthesizes putrescine from ornithine, but also has the activity (side reaction) to synthesize cadaverine (1,5-diamino-pentane) from lysine at the same time. Cadaverine is co-produced with putrescine, which can reduce the production of putrescine. The cadaverine can also pose many problems during putrescine purification. Specifically, the structures of putrescine (H 2 N(CH 2 ) 4 NH 2 ) and cadaverine (H 2 N(CH 2 ) 5 NH 2 ) are very similar in the process of purifying the microbial culture by distillation. Therefore, it is costly and time consuming to selectively purify it.

したがって、オルニチン脱炭酸酵素の活性を調節しようとする場合、オルニチンからプトレシンを合成する活性は保持しながら、リジンからカダベリンに合成する活性(副反応)は低下させることが非常に重要である。 Therefore, when trying to regulate the activity of ornithine decarboxylase, it is very important to reduce the activity of synthesizing putrescine from ornithine to cadaverine (side reaction) while maintaining the activity of synthesizing putrescine from ornithine.

これにより、本発明者らは、新規なオルニチン脱炭酸酵素を掘り出し、前記オルニチン脱炭酸酵素は、カダベリンの合成活性は低く、プトレシンの合成活性は高いということを確認することにより、本発明を完成した。 As a result, the present inventors discovered a novel ornithine decarboxylase, and confirmed that the ornithine decarboxylase has a low cadaverine-synthesizing activity and a high putrescine-synthesizing activity, thereby completing the present invention. bottom.

本発明は、オルニチン脱炭酸酵素またはその変異型を提供する。 The present invention provides ornithine decarboxylase or variants thereof.

本発明は、また、前記オルニチン脱炭酸酵素またはその変異型をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。 The present invention also provides polynucleotides encoding said ornithine decarboxylase or variants thereof.

本発明は、前記オルニチン脱炭酸酵素またはその変異型を含むプトレシンを生産する微生物を提供することである。 An object of the present invention is to provide a putrescine-producing microorganism containing the ornithine decarboxylase or a variant thereof.

本発明の他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階を含むプトレシンの生産方法を提供することである。 Another object of the present invention is to provide a method for producing putrescine comprising culturing said microorganism in a medium.

本発明のさらに他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階を含むプトレシンの純度を増加させる方法を提供することである。 Yet another object of the present invention is to provide a method for increasing the purity of putrescine comprising culturing said microorganism in a medium.

本発明のさらに他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階を含むカダベリンに対するプトレシンの比率を増加させる方法を提供することである。 Yet another object of the present invention is to provide a method for increasing the ratio of putrescine to cadaverine comprising the step of culturing said microorganism in a medium.

また、本発明のさらに他の目的は、前記プトレシンのポリアミド系高分子合成の用途を提供することである。 Still another object of the present invention is to provide a use of said putrescine in synthesizing a polyamide-based polymer.

それを具体的に説明すれば、次の通りである。一方、本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用可能である。すなわち、本発明で開示された多様な要素のあらゆる組合わせが、本発明の範疇に属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本発明の範疇が制限されるものではない。 It is as follows if it demonstrates concretely. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention is applicable to each other description and embodiment. That is, any combination of various elements disclosed in the present invention belongs to the scope of the present invention. Moreover, the scope of the present invention is not limited by the specific descriptions described below.

本発明の1つの態様は、配列番号1のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸置換を含むプトレシン生産活性を有するオルニチン脱炭酸酵素の変異型を提供する。 One aspect of the invention provides variants of ornithine decarboxylase with putrescine-producing activity comprising one or more amino acid substitutions within the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.

具体的に、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列で、i)713番目のアミノ酸であるアラニンが他のアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたタンパク質の変異型を提供する。前記アミノ酸置換は、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファン及びグルタミンから選択されるアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されるものを含みうる。 Specifically, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, i) alanine at position 713 is substituted with another amino acid, and/or ii) glutamic acid at position 698 is substituted with another amino acid. provide a variant of the protein produced. The amino acid substitution is i) substitution of alanine, which is the 713th amino acid, with an amino acid selected from leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan, and glutamine, and/or ii) substitution of glutamic acid, which is the 698th amino acid. It may contain those substituted for aspartic acid.

本発明において、用語、「プトレシン」は、オルニチンのジカルボキシル化反応やアグマチンの加水分解によって生成される物質であって、腐敗物にも存在するが、生体に正常な成分で広く分布する。ポリアミンの一種でリボソームを構成し、細胞の生長を促進するか、RNA合成を促進する機能を有する。特に、産業的には、ナイロン4、6を含むポリアミド4、6の生産のための重要な原料物質に当該し、量産のための研究の必要性が続いている物質である。 In the present invention, the term "putrescine" is a substance produced by the dicarboxylation reaction of ornithine or the hydrolysis of agmatine, which is also present in decomposed matter, but is widely distributed among normal components in living organisms. It is a kind of polyamine that constitutes ribosomes and has the function of promoting cell growth or promoting RNA synthesis. In particular, it is an important raw material for the production of polyamide 4, 6 including nylon 4, 6 industrially, and is a substance that continues to be researched for mass production.

プトレシンは、オルニチンを基質として使用する方法で生産することができる。また、オルニチンの前駆体になる物質を基質として使用してオルニチンを合成した後、これよりプトレシンを生産することができる。オルニチンの合成は、当業者が容易に選択することができるものであれば、制限なしに使用することができる。 Putrescine can be produced by a method using ornithine as a substrate. Alternatively, putrescine can be produced from the synthesis of ornithine using a substance that is a precursor of ornithine as a substrate. Any synthesis of ornithine that can be easily selected by a person skilled in the art can be used without limitation.

本発明において、用語、「オルニチン」は、オルニチン回路で重要な役割を行う塩基性アミノ酸であって、特に、L-オルニチンは、植物、動物、微生物で広く見つけられる。一般的に、オルニチン回路を有した生体内では、尿素生産と関係して代謝上重要な役割を果たす。また、生体内でアルギニン、グルタミン酸、プロリンと互いに変換され、ケトン酸、グリオキサール酸とアミノ基の伝達を行う。オルニチン脱炭酸酵素によって、アミン(プトレシン)を生成する基質としてそれを通じてポリアミンにまで合成される。本発明では、特に、オルニチン脱炭酸酵素の基質として使われるL-オルニチンでもある。 In the present invention, the term "ornithine" is a basic amino acid that plays an important role in the ornithine cycle, especially L-ornithine is widely found in plants, animals and microorganisms. In general, in vivo having an ornithine cycle, it plays an important metabolic role in relation to urea production. It is also converted to arginine, glutamic acid, and proline in vivo, and transfers ketonic acid, glyoxalic acid, and amino groups. It is synthesized to polyamines through ornithine decarboxylase as a substrate to generate amines (putrescine). In the present invention, it is also L-ornithine which is used in particular as a substrate for ornithine decarboxylase.

本発明において、用語、「オルニチン脱炭酸酵素(ornithine decarboxylase、ODC)」は、ポリアミンを合成するに当たって、最初段階でありながら、プトレシン生産経路のうち、最終段階である下記反応式を触媒する酵素である。本発明において、オルニチン脱炭酸酵素は、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase)として混用されて使われる。ODCは、L-オルニチンを基質としてプトレシンを生産するが、ピリドキサールリン酸(Pyridoxal phosphate、PLP)が補助因子(co-factor)として作用する。
[反1]
L-オルニチン<=>プトレシン+CO
In the present invention, the term "ornithine decarboxylase (ODC)" is an enzyme that catalyzes the following reaction formula, which is the first step in polyamine synthesis and the final step in the putrescine production pathway. be. In the present invention, ornithine decarboxylase is mixed and used as ornithine decarboxylase. ODC produces putrescine using L-ornithine as a substrate, and pyridoxal phosphate (PLP) acts as a co-factor.
[Anti-1]
L-Ornithine <=> Putrescine + CO2

図1には、オルニチン脱炭酸酵素を用いてオルニチンを基質としてプトレシンを合成する過程の化学反応式を示した。また、抑制しなければならないオルニチン脱炭酸酵素の副反応であるカダベリン(cadaverine)の合成経路を示した。 FIG. 1 shows a chemical reaction formula for the process of synthesizing putrescine using ornithine decarboxylase and ornithine as a substrate. In addition, the synthesis pathway of cadaverine, which is a side reaction of ornithine decarboxylase that must be inhibited, was shown.

本発明において、ODCを確保する方法は、当該分野でよく知られた多様な方法が適用可能である。その方法の例としては、酵素発現に通常広く用いられる微生物で酵素を高効率で確保できるように、コドン最適化が含まれた遺伝子合成技術、そして、微生物の大量誘電体情報に基づいて生物情報学的方法によって有用酵素資源のスクリーニング方法を通じて確保し、これに制限されるものではない。 In the present invention, various methods well known in the art can be applied to secure ODC. Examples of such methods include gene synthesis techniques that include codon optimization to ensure high efficiency of enzymes in microorganisms commonly used for enzyme expression, and bioinformatics based on the bulk dielectric information of microorganisms. It is secured through a screening method for useful enzyme resources by a scientific method, and is not limited to this.

本発明において、配列番号1は、プトレシン生産活性を有するオルニチン脱炭酸酵素のアミノ酸配列を意味する。前記配列番号1のアミノ酸配列は、公知のデータベースであるNCBIのGenBankでその配列が得られる。一例として、オルニチン脱炭酸酵素は、ラクトバシラス属(Lactobacillus sp.)、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、または大腸菌(Escherichia coli、E.coli)由来であり、具体的に、ラクトバチルス・サエリムネリ(Lactobacillus saerimneri)由来であり得るが、これに制限されず、前記アミノ酸配列を含むタンパク質と同じ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列であれば、制限なしに含まれる。また、本発明でのプトレシン生産活性を有するオルニチン脱炭酸酵素として配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質を記載したが、配列番号1のアミノ酸配列前後への無意味な配列追加または自然的に発生する突然変異、あるいは、その潜在性突然変異(silent mutation)を除くものではなく、配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質と互いに同一または相応する活性を有する場合であれば、本発明のプトレシン活性を有するタンパク質に当該することは当業者に自明である。具体的な例を挙げて、本発明のプトレシン生産活性を有するタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列またはそれと80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列で構成されるタンパク質でもある。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明の変異対象となるタンパク質の範囲内に含まれることは自明である。 In the present invention, SEQ ID NO: 1 means the amino acid sequence of ornithine decarboxylase having putrescine-producing activity. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from GenBank of NCBI, which is a known database. As an example, ornithine decarboxylase is derived from Lactobacillus sp., Saccharomyces sp., or Escherichia coli, E. coli, specifically Lactobacillus saerimneri. ), but is not limited thereto, and includes without limitation any amino acid sequence of a protein that has the same activity as the protein comprising said amino acid sequence. In addition, although a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was described as an ornithine decarboxylase having putrescine-producing activity in the present invention, meaningless sequence additions before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or naturally occurring The putrescine activity of the present invention is present if it has the same or corresponding activity as the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, without excluding mutations or silent mutations thereof. It is obvious to those skilled in the art that this applies to proteins. As a specific example, the protein having putrescine-producing activity of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% thereof. It is also a protein composed of amino acid sequences having homology or identity of 10% or more. In addition, a protein having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted or added is also included in the present invention, as long as the amino acid sequence has such homology or identity and exhibits efficacy corresponding to the protein. It is self-evident that they are included within the scope of proteins that are subject to mutation of the invention.

すなわち、本発明において、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使われることは自明である。例えば、「配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号1に相応する配列であるか、それと同一あるいは相応する活性を有する配列である場合であれば、「配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属することができることは自明である。例えば、前記変異型タンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列前後にタンパク質の機能を変更しない配列追加、自然的に発生する突然変異、その潜在性突然変異または保存的置換を除くものではなく、このような配列追加あるいは突然変異を有する場合にも、本発明の範囲内に属することが自明である。 That is, in the present invention, even if it is described as "a protein or polypeptide having an amino acid sequence indicated by a specific SEQ ID NO" or "a protein or polypeptide comprising an amino acid sequence indicated by a specific SEQ ID NO", A protein having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted or added is also not used in the present invention, as long as it has the same or corresponding activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO. Self-explanatory. For example, a "polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1" is a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1, or a sequence having the same or corresponding activity as "the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It is self-evident that it can belong to the "polypeptide consisting of". For example, if it has the same or corresponding activity as the mutant protein, the addition of a sequence before or after the amino acid sequence that does not change the function of the protein, a naturally occurring mutation, a latent mutation, or a conservative substitution thereof. is not excluded, and it is obvious that such sequence additions or mutations are within the scope of the present invention.

本発明において、用語「保存的置換(conservative substitution)」は、1つのアミノ酸を類似した構造的及び/または化学的性質を有するさらに他のアミノ酸に置換させることを意味する。前記変異体は、1つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば、1つ以上の保存的置換を有しうる。このようなアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/または両親媒性(amphipathic nature)での類似性に基づいて発生する。例えば、電荷を帯びる側鎖(electrically charged amino acid)を有するアミノ酸のうち、正に荷電された(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシン、及びヒスチジンを、負に荷電された(酸性)アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み;電荷を帯びない側鎖(uncharged amino acid)を有するアミノ酸のうち、非極性アミノ酸(nonpolar amino acid)は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンを含み、極性(polar)または親水性(hydrophilic)アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み、前記非極性アミノ酸のうち、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含む。 In the present invention, the term "conservative substitution" means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Said variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions generally occur on the basis of similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. For example, among amino acids with electrically charged amino acids, positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine, and negatively charged (acidic) amino acids are including glutamic acid and aspartic acid; among amino acids with uncharged amino acids, nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and Including proline, polar or hydrophilic amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, among the non-polar amino acids, aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine .

本発明において、用語、「変異型(variant)」は、1つ以上のアミノ酸が保存的置換及び/または変形(modification)において、前記列挙された配列(the recited sequence)と異なるが、前記タンパク質の機能(functions)または特性(properties)が保持されるタンパク質を称する。変異型は、数個のアミノ酸置換、欠失または付加によって識別される配列(identified sequence)と異なる。このような変異型は、一般的に前記タンパク質のアミノ酸配列のうち、1つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形されたタンパク質の特性を評価して識別される。すなわち、変異型の能力は、天然タンパク質(native protein)に比べて増加するか、変わらないか、または減少しうる。また、一部変異体は、N末端リーダー配列または膜転移ドメイン(transmembrane domain)のような1つ以上の部分が除去された変異型を含みうる。他の変異型は、成熟タンパク質(mature protein)のN及び/またはC末端から一部が除去された変異型を含みうる。前記用語「変異型」は、変異体、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語(英文表現としては、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergent、variantなど)が使われ、変異された意味として使われる用語であれば、これに制限されるものではない。本発明の目的上、前記変異型は、天然の野生型または非変型タンパク質に比べて、変異されたタンパク質の活性が増加したものであり得るが、これに制限されるものではない。 In the present invention, the term "variant" refers to a protein that differs from the recited sequence in one or more amino acids by conservative substitutions and/or modifications, but is Refers to proteins that retain their functions or properties. A variant differs from the identified sequence by a few amino acid substitutions, deletions or additions. Such variants are generally identified by altering one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the altered protein. That is, the potency of the variant may be increased, unchanged, or decreased relative to the native protein. Partial mutants may also include mutants in which one or more portions, such as the N-terminal leader sequence or the transmembrane domain, are removed. Other variants may include variants with portions removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein. The term "mutant" includes terms such as mutants, modifications, mutated proteins, mutant polypeptides, mutations (in English, modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant, etc.). is used and is not limited to any term used as a mutated meaning. For purposes of the present invention, the mutant may be, but is not limited to, a mutated protein with increased activity compared to the native wild-type or non-mutated protein.

また、変異型は、ポリペプチドの特性と2次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含みうる。例えば、ポリペプチドは、翻訳同時に(co-translationally)または翻訳後に(post-translationally)タンパク質の移転(transfer)に関与するタンパク質N末端のシグナル(または、リーダー)配列とコンジュゲートすることができる。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製、または合成できるように、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされる。 Variants may also contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide. For example, polypeptides can be conjugated to protein N-terminal signal (or leader) sequences that are involved in co-translationally or post-translationally protein transfer. The polypeptides are also conjugated with other sequences or linkers to allow identification, purification or synthesis of the polypeptides.

本発明のタンパク質変異型は、オルニチン脱炭酸酵素変異型でもある。本発明において、用語、「オルニチン脱炭酸酵素変異型」は、「変異型ODCタンパク質、ODC変異型、変異型オルニチン脱炭酸酵素、変異型オルニチンデカルボキシラーゼ、変異型ODCタンパク質、ODC変異型、変異型ODC酵素タンパク質、変異型ODC酵素」などと混用されて使われる。 The protein variants of the invention are also ornithine decarboxylase variants. In the present invention, the term "ornithine decarboxylase mutant" means "mutant ODC protein, ODC mutant, mutant ornithine decarboxylase, mutant ornithine decarboxylase, mutant ODC protein, ODC mutant, mutant ODC Enzyme Protein, Mutant ODC Enzyme" and so on.

前記変異型は、配列番号1のアミノ酸配列で713番目及び698番目のアミノ酸のうち何れか1つ以上のアミノ酸が置換前アミノ酸と他のアミノ酸に置換されたものである。 The variant is obtained by substituting one or more of the 713rd and 698th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 with the pre-substitution amino acid and another amino acid.

前記「他のアミノ酸に置換」は、置換前のアミノ酸と他のアミノ酸であれば、制限されるものではない。例えば、配列番号1のアミノ酸配列の713番目のアミノ酸であるアラニンが、アラニン以外の疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、中性アミノ酸または芳香族性アミノ酸に置換されるものを含みうる。すなわち、配列番号1のアミノ酸配列の713番目のアミノ酸であるアラニンが、アラニン以外の他のアミノ酸残基に、または698番目のアミノ酸であるグルタミン酸が、グルタミン酸以外の他のアミノ酸残基に置換されたものであれば、制限されるものではない。一方、本発明において、「特定アミノ酸が置換された」と表現する場合、他のアミノ酸に置換されたと別途に表記しないとしても、置換前のアミノ酸と他のアミノ酸に置換されることは自明である。 The aforementioned "substitution with another amino acid" is not limited as long as it is the amino acid before substitution and another amino acid. For example, alanine at position 713 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be substituted with a hydrophobic amino acid other than alanine, a basic amino acid, an acidic amino acid, a neutral amino acid, or an aromatic amino acid. That is, the 713th amino acid alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was replaced with an amino acid residue other than alanine, or the 698th amino acid glutamic acid was replaced with an amino acid residue other than glutamic acid. If it is, it is not limited. On the other hand, in the present invention, when expressing that "a specific amino acid is substituted", it is obvious that the amino acid before substitution is substituted with another amino acid, even if it is not separately indicated that the amino acid is substituted with another amino acid. .

具体的に、前記変異型は、配列番号1のアミノ酸配列で、i)713番目のアミノ酸であるアラニンが他のアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異型でもある。前記他のアミノ酸への置換は、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファン及びグルタミンから選択されるアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されるものである。より具体的に、前記変異型は、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファン及びグルタミンから選択されるアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された変異型でもある。 Specifically, the variant is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, i) the 713th amino acid alanine is replaced with another amino acid, and / or ii) the 698th amino acid glutamic acid is replaced with another amino acid. It is also a substituted variant. The substitution with other amino acids includes i) substitution of alanine at position 713 with an amino acid selected from leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan and glutamine, and/or ii) substitution with amino acid at position 698. glutamic acid is substituted with aspartic acid. More specifically, the variant comprises i) substitution of alanine at amino acid position 713 with an amino acid selected from leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan and glutamine, and/or ii) It is also a variant in which the amino acid glutamic acid is substituted with aspartic acid.

配列番号1のアミノ酸配列で、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファン及びグルタミンから選択されるアミノ酸に置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換された変異型は、配列番号4、配列番号8、配列番号9、配列番号19から配列番号23のうちから選択される何れか1つのアミノ酸配列を含むものであり、具体的には、配列番号4、配列番号8、配列番号9、配列番号19から配列番号23のうち何れか1つのアミノ酸配列で必須的に構成される(consisting essentially of)ものであり、より具体的には、配列番号4、配列番号8、配列番号9、配列番号19から配列番号23のうち何れか1つのアミノ酸配列からなるものであり得るが、これに制限されるものではない。 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, i) alanine at amino acid position 713 is substituted with an amino acid selected from leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan and glutamine, and/or ii) at amino acid position 698 A variant in which a certain glutamic acid is substituted with aspartic acid contains any one amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23, Specifically, it consists essentially of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23, and more specifically Specifically, it may consist of any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23, but is not limited thereto.

前記変異型は、配列番号1の713番目及び/または698番目の位置に相応する位置で他のアミノ酸への置換を含み、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上、100%未満の配列相同性を有し、プトレシン生産活性を有するものである。 Said variants comprise substitutions to other amino acids at positions corresponding to positions 713 and/or 698 of SEQ ID NO:1 and are at least 80%, 90%, 95%, 96% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. %, 97%, 98%, or 99% or more and less than 100% sequence homology and putrescine-producing activity.

また、前記変異型は、配列番号4、配列番号8、配列番号9、及び配列番号19から配列番号23のうち何れか1つのアミノ酸配列または前記アミノ酸配列と80%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含みうるが、これに制限されるものではない。具体的に、本発明の変異型は、配列番号4、配列番号8、配列番号9、及び配列番号19から配列番号23のうち何れか1つのアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性または同一性を有するポリペプチドを含みうる。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、713番目または698番目のアミノ酸位置の以外に、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明の範囲内に含まれることは自明である。 In addition, the variant has 80% or more homology or identity with any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23 or the amino acid sequence can include, but is not limited to, amino acid sequences having Specifically, variants of the present invention have at least 80%, 90%, 95% the amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23; Polypeptides with 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity may be included. In addition, if the amino acid sequence has such homology or identity and exhibits efficacy corresponding to the protein, a partial sequence other than the 713th or 698th amino acid position is deleted, modified, or substituted. Alternatively, it is obvious that proteins with added amino acid sequences are also included within the scope of the present invention.

本発明において、用語「相同性(homology)」または「同一性(identity)」は、2つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連した程度を意味し、百分率で表示される。用語、相同性及び同一性は、度々相互交換的に用いられうる。 In the present invention, the terms "homology" or "identity" refer to the degree of association between two given amino acid or base sequences, expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.

保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、使われるプログラムによって確立されたデフォルトギャップぺナルティーが共に用いられうる。実質的に、相同性を有するか(homologous)、または同一の(identical)配列は、一般的に配列全体または全体長さの少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%によって、中間または高い厳格な条件(stringent conditions)でのハイブリッドが可能である。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに、縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。 Sequence homology or identity for conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard sequence algorithms, with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally defined by at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the total sequence or length Hybridization under medium or high stringent conditions is possible. Hybridization also contemplates polynucleotides containing degenerate codons in place of codons in the polynucleotide.

任意の2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Pearson et al(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444でのようなデフォルトパラメータを用いて、「FASTA」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。または、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(バージョン5.0.0または以後バージョン)で行われるような、ニードルマン-ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(Needleman and Wunsch、1970,J.Mol.Biol.48:443-453)が使われて決定される(GCGプログラムパッケージ(Devereux,J.,et al,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLEC BIOL 215]:403(1990);Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073を含む)。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのBLAST、またはClustalWを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。 Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]:2444, using known computer algorithms such as the "FASTA" program, using default parameters. Alternatively, as performed in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later). are determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453) (GCG program package (Devereux, J., et al.). , Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48:1073), e.g. Homology, similarity or identity can be determined using ClustalW.

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482に公知の通りに、例えば、Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443のようなGAPコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することで決定される。要約すれば、GAPプログラムは、2つの配列のうち、さらに短いものでの記号の全体数で、類似した配列された記号(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数を割った値と定義する。GAPプログラムのためのデフォルトパラメータは、(1)二進法比較マトリックス(同一性のために、1、そして、非同一性のために、0の値を含有する)及びSchwartz and Dayhoff,eds.,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)によって開示された通りに、Gribskov et al(1986)Nucl.Acids Res.14:6745の加重された比較マトリックス(または、EDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス);(2)各ギャップのための3.0のぺナルティー及び各ギャップで各記号のための追加の0.10ぺナルティー(または、ギャップ開放ぺナルティー10、ギャップ延長ぺナルティー0.5);及び(3)末端ギャップのための無ぺナルティーを含みうる。したがって、本発明で使われたものであって、用語「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性(relevance)を示す。 Polynucleotide or polypeptide homology, similarity or identity can be determined, for example, by Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482, for example, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443 by comparing the sequence information using the GAP computer program. Briefly, the GAP program defines the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids) divided by the total number of symbols in the shorter of the two sequences. The default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds. , Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), as disclosed by Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 weighted comparison matrix (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) penalty of 3.0 for each gap and addition for each symbol at each gap; (or gap opening penalty of 10, gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for terminal gaps. Therefore, the terms "homology" or "identity" as used in the present invention indicate the relevance between sequences.

また、任意の2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することで確認し、定義される適切な混成化条件は、当該技術範囲内であり、当業者によく知られた方法(例えば、J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989;F.M.Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)で決定される。 Also, whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity or identity is confirmed by comparing the sequences by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions, Suitable hybridization conditions, as defined, are within the skill in the art and are well known to those skilled in the art (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press , Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

本発明において、用語、「オルニチン脱炭酸酵素の変異型」は、プトレシン生産能を有するオルニチン脱炭酸酵素の変異型ポリペプチド、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型ポリペプチド、オルニチン脱炭酸酵素変異型ポリペプチド、オルニチン脱炭酸酵素の変異体、オルニチン脱脱酸酵素タンパク質の変異体、変異型オルニチン脱炭酸酵素、変異型オルニチン脱炭酸酵素タンパク質などと混用されて使われる。また、前記オルニチン脱炭酸酵素は、ラクトバシラス属、サッカロミセス属、または大腸菌(E.coli)由来であり得るが、これに制限されるものではない。 In the present invention, the term "mutant of ornithine decarboxylase" includes a mutant polypeptide of ornithine decarboxylase having putrescine-producing ability, a mutant of ornithine decarboxylase protein, a mutant of ornithine decarboxylase protein. Used in combination with peptides, ornithine decarboxylase mutant polypeptides, ornithine decarboxylase mutants, ornithine decarboxylase protein mutants, mutant ornithine decarboxylase mutants, ornithine decarboxylase mutants, etc. . Also, the ornithine decarboxylase may be derived from Lactobacillus, Saccharomyces, or E. coli, but is not limited thereto.

前記オルニチン脱炭酸酵素の変異型は、配列番号1のアミノ酸配列で713番目及び/または698番目の位置で変異を含み、配列番号1にアミノ酸が付加、欠失したアミノ酸配列であるとしても、配列番号1のN末端から713番目及び/または698番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸が置換された変異型であれば、本発明の範囲に含まれる。 The mutant form of ornithine decarboxylase contains mutations at positions 713 and / or 698 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and amino acids are added or deleted from SEQ ID NO: 1. Even if it is an amino acid sequence, the sequence Variants in which amino acids at positions corresponding to amino acids 713 and/or 698 from the N-terminus of number 1 are substituted are included in the scope of the present invention.

アミノ酸残基位置と関連して、本発明に記載の用語「相応する(corresponding to)」は、タンパク質またはペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるとか、またはタンパク質またはペプチドで列挙される残基と類似または同一であるか、相同のアミノ酸残基を称する。本発明に使われた「相応領域」は、一般的に関連タンパク質またはレファレンスタンパク質での類似した位置を称する。 In relation to amino acid residue positions, the term "corresponding to" according to the invention is the amino acid residue at the position recited in the protein or peptide, or the residue recited in the protein or peptide. Refers to amino acid residues that are similar, identical, or homologous to the group. A "corresponding region" as used herein generally refers to a similar position in a related or reference protein.

前記オルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型は、配列番号1のアミノ酸配列で713番目及び/または698番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものであり、配列番号1のアミノ酸配列を含むか、野生型微生物由来変異前オルニチン脱炭酸酵素に比べて、強化された活性を有する変異型オルニチン脱炭酸酵素タンパク質でもある。このようなオルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型は、前述した配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性または同一性を有するアミノ酸で配列番号1の713番目または698番目に相応する位置のアミノ酸が変異されたことを意味する。 The mutant form of the ornithine decarboxylase protein is obtained by replacing the 713th and / or 698th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with other amino acids, and includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or wild It is also a mutant ornithine decarboxylase protein with enhanced activity compared to the pre-mutated ornithine decarboxylase derived from a type microorganism. Such ornithine decarboxylase protein variants are at least 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described above. It means that the amino acid at the position corresponding to 713rd or 698th of SEQ ID NO: 1 is mutated with amino acids having gender or identity.

前記713番目及び/または698番目のアミノ酸変異は、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファンまたはグルタミンに置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されるものである。 The 713th and / or 698th amino acid mutation is i) substitution of alanine at 713th amino acid with leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan or glutamine, and / or ii) at 698th amino acid Some glutamic acid is substituted with aspartic acid.

具体的に、前記オルニチン脱炭酸酵素の変異型は、配列番号1のアミノ酸配列で、i)713番目のアミノ酸であるアラニンがロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、トリプトファンまたはグルタミンに置換、及び/またはii)698番目のアミノ酸であるグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されたものであり、前記配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質または野生型微生物由来変異前オルニチン脱炭酸酵素タンパク質に比べて、強化された活性を有するものである。 Specifically, the mutant form of ornithine decarboxylase is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, i) alanine at position 713 is substituted with leucine, isoleucine, valine, arginine, aspartic acid, tryptophan or glutamine, and / or ii) glutamic acid at the 698th amino acid is substituted with aspartic acid, and is enhanced compared to the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the wild-type microorganism-derived pre-mutation ornithine decarboxylase protein activity.

本発明の目的上、前記オルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型を含む微生物の場合、プトレシンの生産量が増加するか、プトレシンの純度が増加するか、プトレシン生産の選択性が増加することを特徴とする。本発明のタンパク質変異型は、天然の野生型または非変異オルニチン脱炭酸酵素に比べて、プトレシン生産能、プトレシンの純度またはプトレシン生産の選択性が増加するように遺伝子調節活性を有することを特徴とする。特に、本発明のタンパク質変異型が導入された微生物を通じてオルニチン脱炭酸酵素の副反応の1つであるカダベリンの合成を阻害し、プトレシンの生産量を増加させることができるということに意義がある。 For the purposes of the present invention, microorganisms comprising said ornithine decarboxylase protein mutants are characterized by increased putrescine production, increased putrescine purity, or increased putrescine production selectivity. do. The protein variants of the invention are characterized by having gene regulatory activity such that they have increased putrescine productivity, putrescine purity or selectivity for putrescine production relative to native wild-type or unmutated ornithine decarboxylase. do. In particular, it is significant that the microorganism introduced with the mutant protein of the present invention can inhibit the synthesis of cadaverine, one of the side reactions of ornithine decarboxylase, and increase the production of putrescine.

本発明の他の1つの態様は、前記オルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。 Another aspect of the invention provides polynucleotides encoding variants of the ornithine decarboxylase protein.

配列番号1のアミノ酸配列を含むオルニチン脱炭酸酵素タンパク質及びその変異型については、前述した通りである。 The ornithine decarboxylase protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and its variant are as described above.

本発明において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体(monomer)が共有結合によって長く鎖状に繋がったヌクレオチドの重合体(polymer)であって、一定の長さ以上のDNAまたはRNA鎖であって、より具体的には、前記変異体をコーディングするポリヌクレオチド断片を意味する。 In the present invention, the term "polynucleotide" means a polymer of nucleotides in which nucleotide units (monomers) are linked in a long chain by covalent bonds, and is a DNA or RNA chain of a certain length or more. and more specifically means a polynucleotide fragment encoding said variant.

本発明のオルニチン脱炭酸酵素の変異型をコーディングするポリヌクレオチドは、本発明のプトレシン生産活性を有する変異型ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド配列であれば、制限なしに含まれる。本発明において、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質のアミノ酸配列をコーディングする遺伝子は、例えば、speC、odc、spe1またはspeF遺伝子であり、前記遺伝子は、ラクトバシラス属、サッカロミセス属、または大腸菌(E.coli)由来であり得るが、これに制限されるものではない。また、前記遺伝子は、配列番号1、配列番号4、配列番号8、配列番号9、配列番号19から配列番号23のうち何れか1つのアミノ酸配列をコーディングする塩基配列であり、より具体的には、配列番号10、配列番号13、配列番号17、配列番号18及び配列番号24から配列番号28のうち何れか1つの塩基配列を含む配列であり得るが、これに制限されるものではない。 The polynucleotides encoding the ornithine decarboxylase mutants of the present invention are included without limitation as long as they are polynucleotide sequences that encode the mutant polypeptides having putrescine-producing activity of the present invention. In the present invention, the gene encoding the amino acid sequence of the ornithine decarboxylase protein is, for example, the speC, odc, spe1 or speF gene, and the gene is derived from Lactobacillus, Saccharomyces, or E. coli. Possible, but not limited to this. In addition, the gene is a base sequence encoding any one amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23, more specifically , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.

具体的に、本発明のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性(degeneracy)によって、または前記ポリペプチドを発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形がなされうる。具体的に、配列番号1のアミノ酸配列で713番目及び/または698番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたオルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型をコーディングするポリヌクレオチド配列であれば、制限なしに含みうる。 Specifically, the polynucleotides of the present invention are within the range that does not alter the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or taking into account the codon preferences of the organism in which the said polypeptide is to be expressed. Various modifications can be made to the coding region in . Specifically, any polynucleotide sequence encoding a variant of ornithine decarboxylase protein in which the 713rd and/or 698th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids is included without limitation. sell.

また、公知の遺伝子配列から調剤されるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下にハイブリッド化して、配列番号1のアミノ酸配列で713番目及び/または698番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたプトレシン生産活性を有するオルニチン脱炭酸酵素タンパク質をコーディングする配列であれば、制限なしに含まれる。前記「厳格な条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。このような条件は、文献(例えば、J.Sambrook et al.,上同)に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子どうし、40%以上、具体的には、90%以上、より具体的には、95%以上、さらに具体的には、97%以上、特に具体的には、99%以上の相同性または同一性を有する遺伝子どうしでハイブリッド化し、それより相同性または同一性が低い遺伝子どうしでハイブリッド化しない条件、または、通常のサザンハイブリッド化(southern hybridization)の洗浄条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、具体的には、60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より具体的には、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、具体的には、2~3回洗浄する条件を列挙することができる。 Also, a probe prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence to the whole or a part of the above base sequence, is hybridized under strict conditions, and the 713th and/or 698th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is obtained. Any sequence encoding an ornithine decarboxylase protein having putrescine-producing activity in which an amino acid is substituted with another amino acid is included without limitation. The "stringent conditions" refer to conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., supra). For example, genes with high homology or identity, 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, still more specifically 97% or more, particularly specifically , conditions that hybridize between genes with greater than 99% homology or identity and do not hybridize between genes with less homology or identity, or under normal washing conditions for southern hybridization. 60° C., 1×SSC, 0.1% SDS, specifically 60° C., 0.1×SSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1×SSC, 0 Conditions can be listed for washing once, specifically 2-3 times, at a salt concentration and temperature corresponding to .1% SDS.

混成化は、たとえ混成化の厳格度によって塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であるとしても、2つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使われる。例えば、DNAに関して、アデノシンは、チミジンに相補的であり、シトシンは、グアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似した核酸配列だけではなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。 Hybridization requires that the two nucleic acids have complementary sequences, even though the stringency of the hybridization allows for mismatches between bases. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing with each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymidine and cytosine is complementary to guanine. Thus, the present invention can also include isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence, as well as substantially similar nucleic acid sequences.

具体的に、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値で混成化段階を含む混成化条件を使用し、前述した条件を使用して探知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃または65℃であり得るが、これに制限されるものではなく、その目的によって、当業者によって適切に調節される。 Specifically, homologous or identical polynucleotides can be detected using hybridization conditions that include a hybridization step with a Tm value of 55° C., using the conditions described above. Also, the Tm value may be 60° C., 63° C. or 65° C., but is not limited thereto, and is appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.

ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は、当該技術分野によく知られている(Sambrook et al.,supra,9.50-9.51,11.7-11.8参照)。 The appropriate degree of stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, variables well known in the art (Sambrook et al., supra, 9.50-9. .51, 11.7-11.8).

本発明の他の1つの態様は、オルニチン脱炭酸酵素変異型をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。 Another aspect of the invention provides a vector comprising a polynucleotide encoding an ornithine decarboxylase variant.

配列番号1のアミノ酸配列を含むオルニチン脱炭酸酵素、その変異型及び前記ポリヌクレオチドについては、前述した通りである。 The ornithine decarboxylase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, variants thereof and the polynucleotide are as described above.

本発明で使われた用語「ベクター(vector)」は、適した宿主内で目的ポリペプチドを発現させるように、適した調節配列に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したmRNAリボソーム結合部位をコーディングする配列、及び転写及び解毒の終結を調節する配列を含みうる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと無関係に複製されるか、機能し、ゲノムそれ自体に統合される。 As used herein, the term "vector" refers to a polynucleotide encoding a polypeptide of interest operably linked to suitable regulatory sequences so as to express said polypeptide of interest in a suitable host. A DNA product containing a base sequence is meant. Said regulatory sequences include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequences for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences regulating the termination of transcription and detoxification. can contain Vectors, after transformation into a suitable host cell, replicate or function independently of the host genome and integrate into the genome itself.

本発明で使われるベクターは、特に限定されず、当業者に知られている任意のベクトルを利用することができる。通常使われるベクターの例としては、天然状態であるか、組み替えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを使用し、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを使用することができる。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを使用することができる。 The vector used in the present invention is not particularly limited, and any vector known to those skilled in the art can be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in their native or recombinant state. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A are used as phage vectors or cosmid vectors, and pBR, pUC, pBluescriptII, and pGEM are used as plasmid vectors. systems, pTZ systems, pCL systems, pET systems, and the like can be used. Specifically, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.

一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業者に知られている任意の方法、例えば、相同組替え(homologous recombination)によってなされうるが、これに限定されるものではない。前記染色体挿入如何を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含みうる。選別マーカーは、ベクターに形質転換された細胞を選別、すなわち、目的核酸分子の挿入如何を確認するためのものであって、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使われる。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、他の表現形質を表わすので、形質転換された細胞を選別することができる。 As an example, a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion in a cell. The insertion of the polynucleotide into the chromosome can be performed by any method known to those skilled in the art, such as, but not limited to, homologous recombination. It may further include a selection marker for confirming the chromosomal insertion. The selectable marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to confirm insertion of the nucleic acid molecule of interest. A marker that confers a selectable phenotype such as is used. In an environment treated with a selective agent, transformed cells can be selected because only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other phenotypic traits.

本発明のさらに他の1つの態様として、本発明は、前記オルニチン脱炭酸酵素またはその変異型を含むか、前記酵素をコーディングするポリヌクレオチドを含み、プトレシンを生産する微生物を提供することである。 In still another aspect of the present invention, the present invention provides a putrescine-producing microorganism comprising the ornithine decarboxylase or a variant thereof or a polynucleotide encoding the enzyme.

本発明において、用語「変異型ポリペプチドを含む微生物」、または「オルニチン脱炭酸酵素の変異型を含む微生物」とは、本発明のタンパク質変異型を含み、プトレシンを生産することができる微生物であれば、いずれも可能であるが、これに制限されるものではない。例えば、本発明のタンパク質変異型を含む微生物は、天然の野生型微生物またはプトレシンを生産する微生物に、本発明のタンパク質変異型が発現されて、プトレシン生産能、プトレシン生産純度またはプトレシン生産の選択性が増加した組換え微生物でもある。前記組換え微生物は、天然の野生型微生物または非変型微生物に比べて、プトレシン生産能、生産純度またはプトレシン生産の選択性が増加した微生物であり得るが、これに制限されるものではない。 In the present invention, the terms "microorganisms containing mutant polypeptides" or "microorganisms containing mutants of ornithine decarboxylase" refer to microorganisms containing the protein mutants of the present invention and capable of producing putrescine. However, it is not limited to this. For example, a microorganism containing the protein variant of the present invention can be obtained by expressing the protein variant of the present invention in a naturally occurring wild-type microorganism or a putrescine-producing microorganism to obtain putrescine-producing ability, putrescine-producing purity, or putrescine-producing selectivity. It is also a recombinant microorganism with increased The recombinant microorganism may be, but is not limited to, a microorganism having increased putrescine-producing ability, production purity, or putrescine-producing selectivity compared to a naturally occurring wild-type or unmodified microorganism.

具体的に、前記微生物は、配列番号1のアミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸変異を含むオルニチン脱炭酸酵素の変異型を発現する微生物であって、前記アミノ酸変異は、N末端から713番目及び/または698番目のアミノ酸の他のアミノ酸への置換を含むものである。また、前記微生物は、配列番号1のアミノ酸配列で713番目または698番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、プトレシン生産活性を有する変異型ポリペプチドを発現する微生物であり得るが、これに制限されるものではない。 Specifically, the microorganism is a microorganism that expresses a mutant form of ornithine decarboxylase containing one or more amino acid mutations in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid mutations are the 713rd from the N-terminus and / or substitution of the 698th amino acid with other amino acids. In addition, the microorganism can be a microorganism that expresses a mutant polypeptide having putrescine-producing activity in which the 713rd or 698th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, but is limited thereto. not something.

前記プトレシン、配列番号1のアミノ酸配列を含むオルニチン脱炭酸酵素タンパク質及びその変異型については、前述した通りである。 The putrescine, the ornithine decarboxylase protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and variants thereof are as described above.

本発明において、用語、タンパク質が「発現されるように/される」は、目的タンパク質が微生物内に導入されるか、微生物内で発現されるように変形された状態を意味する。前記目的タンパク質が微生物内に存在するタンパク質である場合、内在的または変形前に比べて、その活性が強化された状態を意味する。本発明の目的上、「目的タンパク質」は、前述したプトレシン生産能を有するオルニチン脱炭酸酵素タンパク質の変異型でもある。 In the present invention, the term "to be/is to be expressed" of a protein means a state in which a target protein is introduced into a microorganism or modified so as to be expressed within the microorganism. When the target protein is a protein present in microorganisms, it means a state in which its activity is enhanced compared to its endogenous state or before transformation. For purposes of the present invention, a "target protein" is also a mutant form of the aforementioned putrescine-producing ornithine decarboxylase protein.

具体的に、「タンパク質の導入」は、微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性を示すこと、または当該タンパク質の内在的活性または変形前活性に比べて向上した活性を示すことを意味する。例えば、特定タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されるか、特定タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入されて、その活性が表われるものである。また、「活性の強化」は、微生物が有した特定タンパク質の内在的活性または変形前活性に比べて、活性が向上したことを意味する。前記「内在的活性」は、自然的、または人為的要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前、母菌株が本来有していた特定タンパク質の活性を言う。 Specifically, "introduction of protein" means exhibiting the activity of a specific protein that the microorganism originally did not have, or exhibiting an activity that is improved compared to the intrinsic activity or pre-transformation activity of the protein. . For example, a polynucleotide encoding a specific protein is introduced into a chromosome in a microorganism, or a vector containing a polynucleotide encoding a specific protein is introduced into a microorganism to exhibit its activity. In addition, "enhanced activity" means that the activity is improved compared to the intrinsic activity or pre-transformation activity of the specific protein possessed by the microorganism. The above-mentioned "intrinsic activity" refers to the activity of a specific protein originally possessed by the mother strain before the change in traits when the traits of microorganisms are changed due to genetic variation due to natural or artificial factors.

具体的に、本発明の活性強化は、本発明のタンパク質変異型をコーディングする遺伝子の細胞内のコピー数の増加、前記タンパク質変異型を暗号化する遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質変異型を暗号化する遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列に取り替える方法、染色体上のオルニチン脱炭酸酵素の野生型タンパク質をコーディングする遺伝子を前記タンパク質変異型を暗号化する遺伝子に代替する方法、前記タンパク質変異型の活性が強化されるように、前記オルニチン脱炭酸酵素タンパク質を暗号化する遺伝子に変異を追加的に導入させる方法、及び微生物にタンパク質変異型を導入する方法からなる群から選択される何れか1つ以上の方法でなされうるが、これに制限されるものではない。 Specifically, the activity enhancement of the present invention is achieved by increasing the intracellular copy number of the gene encoding the protein variant of the present invention, a method of introducing mutations into the expression regulatory sequence of the gene encoding the protein variant, A method for replacing a gene expression regulatory sequence encoding an ornithine decarboxylase protein variant with a sequence having strong activity, a gene encoding a wild-type protein of ornithine decarboxylase on a chromosome and a gene encoding the protein variant from a method of substituting for , a method of additionally introducing a mutation in the gene encoding the ornithine decarboxylase protein such that the activity of the protein variant is enhanced, and a method of introducing the protein variant into a microorganism It can be done by any one or more methods selected from the group consisting of, but not limited to.

前記で、遺伝子のコピー数の増加は、特にこれに制限されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることで行われる。具体的に、本発明のタンパク質をコーディングするポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主と無関係に複製され、機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されるものである。または、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させることができるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されるものである。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業者に知られている任意の方法、例えば、相同組替えによってなされうる。 In the above, the increase in the copy number of the gene is not particularly limited thereto, but may be performed in the form of being operably linked to a vector or by being inserted into the chromosome of the host cell. . Specifically, a vector is introduced into the host cell in which the polynucleotide encoding the protein of the present invention can replicate and function independently of the host to which it is operably linked. Alternatively, a vector is introduced into the chromosome of the host cell capable of inserting the polynucleotide into a chromosome within the host cell to which the polynucleotide is operatively linked. The insertion of the polynucleotide into the chromosome can be by any method known to those skilled in the art, such as homologous recombination.

ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特にこれに制限されるものではないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に取り替えることによって行われる。前記発現調節配列は、特にこれに制限されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコーディングする配列、転写及び解毒の終結を調節する配列などを含みうる。 Modification of an expression control sequence to increase expression of a polynucleotide includes, but is not limited to, deletion, insertion, modification of a nucleic acid sequence so as to further enhance the activity of said expression control sequence. Conservative or conservative substitution or a combination of these may be used to induce mutations in the sequence, or replacement with a nucleic acid sequence having stronger activity. The expression control sequences may include, but are not limited to, promoters, operator sequences, sequences encoding ribosome binding sites, sequences controlling transcription and termination of detoxification, and the like.

前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに、強力なプロモーターが連結され、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例には、cj1からcj7プロモーター(大韓民国登録特許第10-0620092号)、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージPRプロモーター、PLプロモーター、tetプロモーター、gapAプロモーター、SPL7プロモーター、SPL13(sm3)プロモーター(大韓民国登録特許第10-1783170号)、O2プロモーター(大韓民国登録特許第10-1632642)、tktプロモーター及びyccAプロモーターなどがあるが、これに限定されるものではない。 A strong promoter is linked to the top of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter, but is not limited to this. Examples of known strong promoters include cj1 to cj7 promoters (Korean Patent No. 10-0620092), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter. , SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (Korea Patent No. 10-1783170), O2 promoter (Korea Patent No. 10-1632642), tkt promoter and yccA promoter, but are not limited thereto. .

染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に取り替えることによって行われる。 Modifications of polynucleotide sequences on chromosomes include, but are not limited to, deletions, insertions, non-conservative or conservative substitutions of nucleic acid sequences or any of these to further enhance the activity of said polynucleotide sequences. or by replacing with an improved polynucleotide sequence to have stronger activity.

このようなタンパク質活性の導入及び強化は、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型や非変型微生物菌株でのタンパク質の活性または濃度を基準にして、一般的に最小1%、10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%または500%、最大1000%または2000%まで増加するものであり得るが、これに制限されるものではない。 Such introduction and enhancement of protein activity is such that the corresponding protein activity or concentration is generally at least 1%, 10%, 25% relative to the protein activity or concentration in wild-type or unmodified microbial strains. , 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%, but is not limited thereto.

本発明において、前記オルニチン脱炭酸酵素の変異型を含むか、それをコーディングするポリヌクレオチドを含む微生物は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換によって製造される組換え微生物であり得るが、これに制限されるものではない。 In the present invention, the microorganism containing the mutant form of ornithine decarboxylase or a polynucleotide encoding it can be a recombinant microorganism produced by transformation into a vector containing the polynucleotide. It is not limited.

本発明において、用語「形質転換」は、標的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内に前記ポリヌクレオチドがコーディングするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現しうるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらいずれもを含みうる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコーディングするDNA及びRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現されるものであれば、如何なる形態で導入されるものでも関係ない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なあらゆる要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含みうる。前記発現カセットは、自体複製が可能な発現ベクターの形態でもある。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものでもあり、これに限定されるものではない。 In the present invention, the term "transformation" means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell to express the protein encoded by the polynucleotide in the host cell. Transformed polynucleotides can include any that can be expressed in the host cell, whether inserted into the chromosome of the host cell or located extrachromosomally. The polynucleotides also include DNA and RNA that encode target proteins. The polynucleotide may be introduced in any form as long as it is introduced into the host cell and expressed. For example, the polynucleotide is introduced into the host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all the elements necessary for it to be expressed itself. The expression cassette may comprise a promoter, transcription termination signals, ribosome binding sites and translation termination signals, usually operably linked to the polynucleotide. The expression cassette is also in the form of an expression vector capable of self-replication. Alternatively, the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited to this.

また、前記で、用語「作動可能に連結」されたとは、本発明の目的ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記遺伝子配列とが機能的に連結されていることを意味する。 In addition, the term "operably linked" means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding the target polypeptide of the present invention and the gene sequence are functionally linked. means

本発明の用語、「非変型微生物」は、天然型菌株自体であるか、本発明のタンパク質変異型を含まない微生物、または、本発明のタンパク質変異型をコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターに形質転換されていない微生物を意味する。 The term "unmodified microorganism" of the present invention refers to either the naturally occurring strain itself, a microorganism that does not contain the protein variant of the invention, or transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the protein variant of the invention. means microorganisms that are not

本発明の「微生物」は、プトレシンを生産することができる微生物であれば、原核微生物及び真核微生物如何なるものも含まれる。 The "microorganism" of the present invention includes any prokaryotic or eukaryotic microorganism as long as it can produce putrescine.

本発明において、用語、「プトレシンを生産する微生物」は、自然的にプトレシン生産能を有している野生型微生物や、プトレシン生産能がないか、著しく少ない母菌株に野生型または変異型の導入を通じてプトレシン生産能を有している微生物を意味する。具体的に、自然的または人為的に遺伝的変形が起こった微生物をいずれも含み、外部遺伝子が挿入されるか、内在的遺伝子の活性が強化されるか、不活性化されるなどの原因によって、特定機作が弱化または強化された微生物であって、所望のプトレシン生産のために遺伝的変異が起こったり、活性を強化させたりした微生物でもある。本発明の目的上、本発明の微生物は、本発明のタンパク質変異型を含み、所望のプトレシンの生産能、生産純度またはプトレシン生産の選択性が増加したものである。具体的に、本発明の微生物は、プトレシン生合成経路内の遺伝子一部が強化または弱化されるか、プトレシン分解経路内の遺伝子一部が強化または弱化された微生物でもある。本発明の目的上、プトレシンを生産する微生物は、前記オルニチン脱炭酸酵素の変異型を含み、培地中の炭素源から所望のプトレシンを野生型や非変型微生物と比較してプトレシンの生産量が増加するか、プトレシンの純度が増加するか、プトレシン生産の選択性が増加することを特徴とする微生物を意味する。本発明において、前記「プトレシンを生産する微生物」は、「プトレシン生産能を有する微生物」または「プトレシン生産微生物」と混用されて使われる。 In the present invention, the term “putrescine-producing microorganisms” refers to wild-type microorganisms that naturally have putrescine-producing ability, and wild-type or mutant strains introduced into mother strains that have no or extremely low putrescine-producing ability. means a microorganism capable of producing putrescine through Specifically, it includes any microorganism that has undergone genetic modification, either naturally or artificially, due to the insertion of an exogenous gene or the enhancement or inactivation of an endogenous gene. , a microorganism in which a specific mechanism is weakened or strengthened, and a microorganism in which genetic mutation has occurred or activity has been strengthened for desired putrescine production. For purposes of the present invention, the microorganisms of the present invention comprise a protein variant of the present invention and have increased productivity, purity of production or selectivity of putrescine production of the desired putrescine. Specifically, the microorganism of the present invention is also a microorganism in which a portion of the gene in the putrescine biosynthetic pathway is enhanced or weakened, or a portion of the gene in the putrescine degradation pathway is enhanced or weakened. For the purpose of the present invention, a putrescine-producing microorganism contains a mutant form of the aforementioned ornithine decarboxylase, and produces the desired putrescine from the carbon source in the medium in an increased amount of putrescine compared to a wild-type or non-mutated microorganism. or have increased purity of putrescine or increased selectivity of putrescine production. In the present invention, the above-mentioned "putrescine-producing microorganism" is used in combination with "a microorganism capable of producing putrescine" or "a putrescine-producing microorganism".

前記プトレシンを生産する微生物は、組換え微生物でもある。前記組換え微生物は、前述した通りである。 Said putrescine-producing microorganism is also a recombinant microorganism. The recombinant microorganism is as described above.

前記プトレシンを生産する微生物は、プトレシンを生産することができるならば、その種類が特に制限されるものではないが、具体的に、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エシェリキア(Escherichia)属、エンテロバクター(Enterbacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物であり、より具体的に、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属する微生物でもある。 The type of the putrescine-producing microorganism is not particularly limited as long as it can produce putrescine. Microorganisms belonging to the genus Enterbacter, Erwinia, Serratia, Providencia and Brevibacterium, more specifically belonging to the genus Corynebacterium or Escherichia Also microbes.

さらに具体的には、エシェリキア属微生物は、大腸菌であり、コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・クルジラクチス(Corynebacterium crudilactis)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアトゥム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツディノリス(Corynebacterium testudinoris)またはコリネバクテリウム・フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)などであり、コリネバクテリウム・グルタミカムであり得るが、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質が導入または強化されてプトレシンの生産量が増加するか、プトレシンの純度が増加するか、プトレシン生産の選択性が増加するコリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属する微生物は制限なしに含まれる。 More specifically, the Escherichia microorganism is Escherichia coli, and the Corynebacterium microorganism is Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium cruzilactis. crudilactis)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアトゥム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツsuch as Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens, which may be Corynebacterium glutamicum, wherein ornithine decarboxylase protein is introduced or enhanced to increase the production of putrescine; Microorganisms belonging to the genus Corynebacterium or Escherichia with increased purity of putrescine or increased selectivity of putrescine production are included without limitation.

本発明において、オルニチン脱炭酸酵素タンパク質または前記タンパク質の変異型が発現されるように変形されたプトレシンを生産する微生物の母菌株は、プトレシンを生産する微生物であれば、特に制限されるものではない。 In the present invention, the mother strain of the putrescine-producing microorganism transformed to express the ornithine decarboxylase protein or a mutant form of the protein is not particularly limited as long as it is a putrescine-producing microorganism. .

コリネバクテリウム属微生物には、プトレシン生合成経路がないが、外部からオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)を導入すれば、プトレシンが合成される。 Corynebacterium microorganisms do not have a putrescine biosynthetic pathway, but can synthesize putrescine by introducing ornithine decarboxylase (ODC) from the outside.

また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、追加的にオルニチンでアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyltransfrase、ArgF)、グルタメートの排出に関与するタンパク質(NCgl1221)が不活性化されたものである。 In addition, the putrescine-producing microorganisms are not particularly limited, but additionally include ornithine carbamoyltransferase (ArgF) involved in arginine synthesis with ornithine, protein involved in glutamate excretion (NCgl1221 ) is inactivated.

また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、例えば、グルタメートからオルニチンまでの生合成経路を強化するために、グルタメートをアセチルグルタミン酸(N-acetylglutamate)に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ(ArgJ)、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルリン酸(N-acetylglutamyl phosphate)に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ(ArgB)、アセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタメートセミアルデヒド(N-acetylglutamate semialdehyde)に転換するアセチルγグルタミルリン酸レダクターゼ(ArgC)、アセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン(N-acetylornithine)に転換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ(ArgD)の活性が内在的活性に比べて、強化されてプトレシンの生合成原料として使われるオルニチンの生産性が向上したものである。 The putrescine-producing microorganisms include, but are not limited to, acetyl glutamate that converts glutamate to acetylglutamate (N-acetylglutamate) in order to strengthen the biosynthetic pathway from glutamate to ornithine. glutamate synthase or ornithine acetyltransferase (ArgJ), which converts acetylornithine to ornithine; acetylglutamate kinase (ArgB), which converts acetylglutamate to acetylglutamyl phosphate (N-acetylglutamyl phosphate); The activity of acetyl γ-glutamyl phosphate reductase (ArgC), which converts acetylglutamate semialdehyde to N-acetylglutamate semialdehyde, and acetylornithine aminotransferase (ArgD), which converts acetylglutamate semialdehyde to N-acetylornithine, compared to the intrinsic activity It is enhanced productivity of ornithine, which is used as a biosynthetic raw material of putrescine.

また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、追加的にプトレシンアセチルトランスフェラーゼの活性が弱化されたプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物でもある。また、前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに制限されるものではないが、プトレシン排出タンパク質の活性が強化されたものであり得るが、これに制限されるものではない。 In addition, the putrescine-producing microorganism is not particularly limited thereto, but may also be a Corynebacterium microorganism having putrescine-producing ability with weakened putrescine acetyltransferase activity. In addition, the putrescine-producing microorganism is not particularly limited thereto, but may be one with enhanced putrescine efflux protein activity, but is not limited thereto.

本発明において、用語「強化/増加」は、内在的活性に比べて活性が増加することをいずれも含む概念である。 In the present invention, the term "enhancement/increase" is a concept that includes any increase in activity compared to the intrinsic activity.

このような遺伝子活性の強化または増加は、当該分野によく知られた多様な方法の適用で達成される。前記方法の例として、遺伝子の細胞内のコピー数の増加;遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法;遺伝子発現調節配列を活性が強力な配列に取り替える方法;遺伝子の活性が強化されるように、当該遺伝子に変異を追加的に導入させる方法;及び微生物に外来遺伝子を導入する方法からなる群から選択される何れか1つ以上の方法でなされ、これらの組合わせでも果たすことができるが、前記例によって、特に制限されるものではない。 Such enhancement or increase in gene activity is achieved through application of a variety of methods well known in the art. Examples of the above methods include increasing the intracellular copy number of a gene; introducing mutations into gene expression regulatory sequences; replacing gene expression regulatory sequences with sequences with strong activity; and a method for introducing a foreign gene into a microorganism; and a method for introducing a foreign gene into a microorganism. , is not particularly limited by the above examples.

本発明において、用語、「不活性化」は、内在的活性に比べて活性が弱化されるか、または活性がないことをいずれも含む概念である。 In the present invention, the term "inactivation" is a concept including both activity being weakened compared to the intrinsic activity and no activity.

このような遺伝子活性の不活性化は、当該分野によく知られた多様な方法の適用で達成される。前記方法の例として、前記遺伝子の活性が除去された場合を含み、染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法;当該タンパク質の活性が減少するように突然変異された遺伝子に、染色体上の前記タンパク質をコーディングする遺伝子を代替する方法;前記タンパク質をコーディングする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法;前記タンパク質をコーディングする遺伝子の発現調節配列を活性が弱いか、ない配列に取り替える方法(例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターよりも弱いプロモーターに取り替える方法);前記タンパク質をコーディングする染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法;前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して、前記mRNAからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスRNA)を導入する方法;前記タンパク質をコーディングする遺伝子のSD配列前端にSD配列と相補的な配列を人為的に付加して2次構造物を形成させて、リボソーム(ribosome)の付着が不可能に作る方法及び当該配列のORF(open reading frame)の3'末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するRTE(Reverse transcription engineering)方法などがあり、これらの組合わせでも果たすことができるが、前記例によって、特に制限されるものではない。本発明において、用語、「内在的活性」は、自然的、または人為的要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前、母菌株が本来有していた特定タンパク質の活性を言う。 Such inactivation of gene activity is accomplished by application of a variety of methods well known in the art. Examples of the method include a method of deleting all or part of a gene on a chromosome, including when the activity of the gene is eliminated; A method of substituting the above gene encoding the protein; a method of introducing a mutation into the expression regulatory sequence of the gene on the chromosome encoding the protein; a method of replacing the sequence (e.g., a method of replacing the promoter of the gene with a weaker promoter than the endogenous promoter); a method of deleting all or part of the gene on the chromosome that encodes the protein; a method of deleting the gene on the chromosome A method of introducing an antisense oligonucleotide (e.g., antisense RNA) that complementarily binds to a transcript and inhibits translation of said mRNA into a protein; A method of artificially adding a complementary sequence to form a secondary structure to make it impossible for ribosomes to attach, and a method of reverse transcription to the 3' end of the ORF (open reading frame) of the sequence. There are RTE (Reverse Transcription Engineering) methods of adding promoters such as , and a combination thereof can also be used, but the examples are not particularly limited. In the present invention, the term "intrinsic activity" refers to the activity of a specific protein originally possessed by the mother strain before the change in trait, when the trait of a microorganism changes due to genetic variation due to natural or artificial factors. To tell.

本発明のさらに他の1つの態様として、前記プトレシンを生産する微生物を培地で培養する段階を含むプトレシンの生産方法を提供する。 Yet another aspect of the present invention provides a method for producing putrescine, comprising the step of culturing the putrescine-producing microorganism in a medium.

前記プトレシン、配列番号1のアミノ酸配列を含むオルニチン脱炭酸酵素、その変異型、タンパク質の発現、及び微生物については、前述した通りである。 The putrescine, ornithine decarboxylase containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, variants thereof, protein expression, and microorganisms are as described above.

本発明において、用語、「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当業者に知られている適当な培地と培養条件とによってなされうる。このような培養過程は、選択される菌株によって、当業者が容易に調整して使用することができる。具体的に、前記培養は、回分式、連続式及び流加式であり得るが、これに制限されるものではない。 In the present invention, the term "culturing" means growing the microorganism under appropriately controlled environmental conditions. The culturing process of the present invention can be carried out using suitable media and culturing conditions known to those skilled in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art depending on the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous, or fed-batch, but is not limited thereto.

本発明において、用語、「培地」は、前記微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水を含めて、栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的に、本発明の微生物の培養に使われる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使われる培地であれば、特別な制限なしに如何なるものも使用することができるが、本発明の微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び/またはビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件下で温度、pHなどを調節しながら培養することができる。 In the present invention, the term "medium" means a mixture of nutrient substances required for culturing the microorganism as a main component, including water essential for survival and growth, nutrient substances and growth factors. supply etc. Specifically, the medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the present invention may be any medium without particular limitations as long as it is a medium commonly used for culturing microorganisms. The microorganism of the invention can be cultured under aerobic conditions in an ordinary medium containing suitable carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins, etc. while adjusting the temperature, pH, etc. .

前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されるものではないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行われる。この際、培養条件は、特にこれに制限されるものではないが、塩基性化合物(例:水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例:リン酸または硫酸)を使用して適正pH(例えば、pH5~pH9、具体的には、pH6~pH8、最も具体的には、pH6.8)を調節し、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を保持することができる。培養温度は、20~45℃、具体的には、25~40℃を保持し、約10~160時間培養することができるが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたプトレシンは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留することができる。 In the above method, the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method, or the like. At this time, the culture conditions are not particularly limited, but are appropriate using basic compounds (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or acidic compounds (eg phosphoric acid or sulfuric acid). The pH (eg, pH 5-pH 9, particularly pH 6-pH 8, most particularly pH 6.8) is adjusted and oxygen or oxygen-containing gas mixtures are introduced into the culture to maintain aerobic conditions. be able to. The culture temperature can be maintained at 20 to 45° C., specifically 25 to 40° C., and cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto. The putrescine produced by the culture can be secreted into the medium or remain intracellular.

また、使われる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物(例:グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、澱粉及びセルロース)、油脂及び脂肪(例:大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油及びココナッツ油)、脂肪酸(例:パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸)、アルコール(例:グリセロール及びエタノール)及び有機酸(例:酢酸)などを個別的に使用するか、または混合して使用することができるが、これに制限されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例:ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア)、または無機化合物(例:硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム)などを個別的に使用するか、または混合して使用することができるが、これに制限されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別的に使用するか、または混合して使用することができるが、これに制限されるものではない。また、培地には、その他の金属塩(例:硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄)、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含みうる。 In addition, the culture medium used contains sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), oils and fats (e.g. soybean oil, sunflower seed oil) as carbon sources. , peanut oil and coconut oil), fatty acids (e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (e.g. glycerol and ethanol) and organic acids (e.g. acetic acid), either individually or in combination. can be used as, but not limited to, Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptones, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea) or inorganic compounds (e.g. ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate). , ammonium carbonate and ammonium nitrate) can be used individually or in combination, but is not limited thereto. As the phosphorus source, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and corresponding sodium-containing salts can be used individually or in combination, but are limited to these. not a thing The medium may also contain essential growth promoters such as other metal salts (eg magnesium or ferrous sulfate), amino acids and vitamins.

本発明の前記培養段階で生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法によって、当該分野に公知の適した方法を用いて培養液から所望のアミノ酸を収集することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが使われ、当該分野に公知の適した方法を用いて培地または微生物から所望のプトレシンを回収することができる。前記プトレシンを回収する方法は、精製段階をさらに含みうる。 The method of recovering the putrescine produced in the culture step of the present invention can be achieved by harvesting the desired amino acid from the culture medium using any suitable method known in the art, depending on the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC can be used to recover the desired putrescine from the culture medium or microorganism using suitable methods known in the art. The method of recovering putrescine may further comprise a purification step.

本発明のさらに他の1つの態様として、前記プトレシンを生産する微生物を培養する段階を含むプトレシンの純度を高める方法を提供する。また、前記プトレシンを生産する微生物を培養する段階を含むカダベリンに対するプトレシンの比率を増加させる方法を提供する。前記プトレシン及び微生物については、前述した通りである。 Yet another aspect of the present invention provides a method for increasing the purity of putrescine, comprising culturing the putrescine-producing microorganism. Also provided is a method for increasing the ratio of putrescine to cadaverine comprising culturing said putrescine-producing microorganism. The putrescine and microorganisms are as described above.

本発明のさらに他の1つの態様として、前記プトレシンを生産する微生物を培養して製造されたプトレシンのポリアミドの製造のための用途を提供する。また、前記プトレシンを生産する微生物を含むポリアミド製造用組成物を提供する。前記プトレシン及び微生物については、前述した通りである。 Yet another aspect of the present invention provides a use of putrescine produced by culturing the putrescine-producing microorganism for production of a polyamide. Also provided is a composition for producing a polyamide containing the putrescine-producing microorganism. The putrescine and microorganisms are as described above.

前記プトレシンを生産する微生物は、配列番号1のポリペプチドを含むか、または配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換を含み、配列番号1のポリペプチドに少なくとも80%以上、100%未満の配列相同性を有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を含む。また、前記プトレシンを生産する微生物を培養する段階は、配列番号1のポリペプチドを含むか、または配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換を含み、配列番号1のポリペプチドに少なくとも80%以上、100%未満の配列相同性を有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を培養する段階を含む。 The putrescine-producing microorganism comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 1, or comprises amino acid substitutions at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1. , ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having at least 80% or more and less than 100% sequence homology to the polypeptide of SEQ ID NO:1. Also, the step of culturing the putrescine-producing microorganism comprises the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or corresponds to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1 culturing a microorganism comprising an ornithine decarboxylase comprising a polypeptide comprising amino acid substitutions at positions and having at least 80% or greater but less than 100% sequence homology to the polypeptide of SEQ ID NO:1.

前記ポリアミドは、多様な素材に活用される物質であって、アミド結合間の水素結合によって、耐熱性、耐薬品性などに優れて、多様な素材の材料として開発されている。例えば、前記ポリアミドは、繊維原料であり、具体的には、ナイロンの原料でもある。ポリアミド繊維は、高強度、耐磨耗性、ソフト性、光沢特性、染色鮮明性などにおいて、優れた特徴を有しており、パンティストッキングなどのレッグウェア(leg wear)、インナーウェア(inner wear)、スポーツウェア(sports wear)などの衣類製品に使われる。また、前記ポリアミドは、医薬品、界面活性剤、フィルム、プラスチックなどの原料でもある。例えば、ポリアミドを用いてフィルムを製造する場合、優れた光学的物性及び機械的物性を具現することができると同時に、柔軟性まで備えて、多様な成形品の材料として使われ、前記ポリアミドフィルムは、ディスプレイ用基板、ディスプレイ用保護フィルム、タッチパネル、フォルダブル機器のウィンドウカバーなどに適用可能である。 The polyamide is a material that can be used for various materials, and has been developed as a material for various materials because of its excellent heat resistance and chemical resistance due to hydrogen bonding between amide bonds. For example, the polyamide is a raw material for fibers, and more specifically, a raw material for nylon. Polyamide fibers have excellent characteristics such as high strength, abrasion resistance, softness, luster, and vividness of dyeing, and are used in leg wear such as pantyhose and inner wear. , sports wear and other clothing products. The polyamide is also a raw material for pharmaceuticals, surfactants, films, plastics, and the like. For example, when a film is produced using polyamide, it has excellent optical properties and mechanical properties, and at the same time, it has flexibility and is used as a material for various molded products. , substrates for displays, protective films for displays, touch panels, window covers for foldable devices, and the like.

本発明のオルニチン脱炭酸酵素は、プトレシンの生産性または生産効率を増大させ、副反応を抑制することができる。特に、本発明は、オルニチン脱炭酸酵素の副反応の1つであるカダベリンの合成を阻害する効果があって、プトレシン精製/分離工程の簡便化及び生産コスト節減の効果を達成する。 The ornithine decarboxylase of the present invention can increase putrescine productivity or production efficiency and suppress side reactions. In particular, the present invention has the effect of inhibiting the synthesis of cadaverine, one of the side reactions of ornithine decarboxylase, and achieves the effect of simplifying the putrescine purification/separation process and reducing the production cost.

また、本発明は、プトレシンの量産を通じて高分子前駆体、医薬品、化学添加剤などの多様な活用が可能である。 In addition, the present invention can be used in various applications such as polymer precursors, pharmaceuticals, and chemical additives through the mass production of putrescine.

本発明でオルニチンを基質としてオルニチン脱炭酸酵素を利用したプトレシン合成の図式図を示す。また、抑制しなければならないオルニチン脱炭酸酵素の副反応であるカダベリン合成経路を示す。1 shows a schematic diagram of putrescine synthesis using ornithine decarboxylase using ornithine as a substrate in the present invention. Also shown is the cadaverine synthesis pathway, a side reaction of ornithine decarboxylase that must be inhibited. 多様な由来のオルニチン脱炭酸酵素活性を確認したものであって、オルニチンを基質として使用した時の反応性及びリジンを基質として使用した時の反応性(副反応)の相対的な活性度を示す。ODC_Lbは、Lactobacillus saerimneri(inducible)から、ODC_Scは、saccharomyces cerevisiae(inducible)から、ODC_Ecは、E.coli(constitutive)から、ODC_Efは、E.coli(inducible)から由来する。Ornithine decarboxylase activities of various origins were confirmed, showing the relative activity of reactivity when ornithine was used as a substrate and reactivity (side reaction) when lysine was used as a substrate. . ODC_Lb is from Lactobacillus saerimneri (inducible), ODC_Sc is from saccharomyces cerevisiae (inducible), ODC_Ec is from E. From E. coli (constitutive), ODC_Ef is It is derived from E. coli (inducible). 精製されたラクトバシラス由来の野生型オルニチン脱炭酸酵素と、野生型オルニチン脱炭酸酵素の696番目のアラニンがグルタミン酸に(A696E)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の702番目のバリンがグリシンに(V702G)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに(A713L)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の696番目のアラニンと713番目のアラニンとがグルタミン酸とロイシンとに(A696E/A713L)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の702番目のバリンと713番目のアラニンとがグリシンとロイシンとに(V702G/A713L)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の696番目のアラニンと702番目のバリンと713番目のアラニンとがグルタミン酸とグリシンとロイシンとに(A696E/V702G/A713L)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の698番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に(E698D)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の698番目のグルタミン酸と713番目のアラニンとがアスパラギン酸とロイシンとに置換された変異型(E698D/A713L)を用いて、(ア)オルニチン固有活性度と、(イ)リジン固有活性度のそれぞれを定量後、比較した図面である。Purified lactobacillus-derived wild-type ornithine decarboxylase, alanine at position 696 of wild-type ornithine decarboxylase to glutamic acid (A696E), valine at position 702 of wild-type ornithine decarboxylase to glycine (V702G), 713th alanine of wild-type ornithine decarboxylase to leucine (A713L), 696th alanine and 713th alanine of wild-type ornithine decarboxylase to glutamic acid and leucine (A696E/A713L), wild-type ornithine The 702nd valine and 713th alanine of decarboxylase become glycine and leucine (V702G/A713L), and the 696th alanine, 702nd valine and 713th alanine of wild-type ornithine decarboxylase become glutamic acid. and glycine and leucine (A696E/V702G/A713L), glutamic acid at position 698 of wild-type ornithine decarboxylase to aspartic acid (E698D), glutamic acid at position 698 and alanine at position 713 of wild-type ornithine decarboxylase. (A) ornithine-specific activity and (b) lysine-specific activity were each quantified and compared using a mutant (E698D/A713L) in which is substituted with aspartic acid and leucine. 精製されたラクトバシラス由来の野生型オルニチン脱炭酸酵素と野生型オルニチン脱炭酸酵素の698番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に(E698D)、野生型脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに(A713L)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の698番目のグルタミン酸と713番目のアラニンとがアスパラギン酸とロイシンとに置換された変異型(E698D/A713L)を用いて、リジンとオルニチンとに対する動力学的係数を比較した図面である。Purified lactobacillus-derived wild-type ornithine decarboxylase and wild-type ornithine decarboxylase glutamic acid at position 698 to aspartic acid (E698D), wild-type decarboxylase from alanine at position 713 to leucine (A713L), wild-type Drawing comparing the kinetic coefficients for lysine and ornithine using a mutant (E698D/A713L) in which glutamic acid at position 698 and alanine at position 713 of type ornithine decarboxylase are replaced with aspartic acid and leucine (E698D/A713L) is. 多様な条件で生転換反応を比較した図面である。(ア)オルニチン基質としてプトレシン合成を定量し、精製されたラクトバシラス由来の野生型オルニチン脱炭酸酵素を0.37M濃度バッファで反応した時(●参照)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された変異型を0.37M濃度バッファで反応した時(○参照)、野生型オルニチン脱炭酸酵素を0.1M濃度バッファで反応した時(◆参照)、野生型脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された変異型を0.1M濃度バッファで反応した時(◇参照)の図面である。(イ)リジンを基質としてカダベリン合成を定量し、精製されたラクトバシラス由来の野生型オルニチン脱炭酸酵素を0.37M濃度バッファで反応した時(●参照)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された変異型を0.37M濃度バッファで反応した時(○参照)、野生型オルニチン脱炭酸酵素を0.1M濃度バッファで反応した時(◆参照)、野生型オルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された変異型を0.1M濃度バッファで反応した時(◇参照)の図面である。FIG. 4 is a diagram comparing biotransformation reactions under various conditions; FIG. (A) When putrescine synthesis was quantified as an ornithine substrate, and purified wild-type ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus was reacted with a 0.37 M concentration buffer (see ●), the 713th alanine of wild-type ornithine decarboxylase is substituted with leucine in 0.37M buffer (○), wild-type ornithine decarboxylase in 0.1M buffer (◆), wild-type decarboxylase 713 is a diagram showing the reaction of a mutant in which alanine at position 713 is substituted with leucine in a 0.1 M concentration buffer (see ◇). (b) When cadaverine synthesis was quantified using lysine as a substrate, and the purified wild-type ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus was reacted in a 0.37 M concentration buffer (see ●), the 713th position of the wild-type ornithine decarboxylase When the mutant in which leucine was substituted for alanine was reacted with a 0.37 M concentration buffer (see ○), when the wild-type ornithine decarboxylase was reacted with a 0.1 M concentration buffer (see ◆), wild-type ornithine decarboxylation was observed. It is a drawing when the mutant in which the 713th alanine of the enzyme is substituted with leucine was reacted with a 0.1M concentration buffer (see ◇). 4種の菌株から由来の組換えオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現量を示した図面である。ODC_e.coli_SpeCは、E.coli(constitutive)から、ODC_e.coli_SpeFは、E.coli(inducible)から、ODC_Lactobacillusは、Lactobacillus saerimneri(inducible)から、ODC_saccharomyces cerevisiaeは、saccharomyces cerevisiae(inducible)から由来する。Fig. 2 shows the expression levels of recombinant ornithine decarboxylase genes derived from four strains. ODC_e. coli_SpecC is E. coli_SpecC. From E. coli (constitutive), ODC_e. coli_SpeF is E. coli_SpeF. ODC_Lactobacillus from E. coli (inducible), ODC_Lactobacillus from Lactobacillus saerimneri (inducible), ODC_saccharomyces cerevisiae from saccharomyces cerevisiae (inducible).

以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されるものではなく、当業者にとって明白である。 The present invention will now be described in more detail by way of examples. However, these examples are provided for the purpose of illustratively describing the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples, and should be apparent to those skilled in the art.

実施例1.多様な由来のオルニチン脱炭酸酵素の活性比較遂行
4種の微生物から由来するオルニチン脱炭酸酵素の基質反応性を比較した。ラクトバチルス・サエリムネリ(Lactobacillus saerimneri(inducible))、サッカロミセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae(inducible))、イコライ(E.coli(constitutive))、イコライ(E.coli(inducible))から由来の野生型のオルニチン脱炭酸酵素を対象とし、それをそれぞれODC_Lb、ODC_Sc、ODC_Ec、ODC_Efと表記した。前記酵素に該当する遺伝子をpET24maベクターに挿入後、大腸菌BL21(DE3)を用いて0.1MM IPTG及び18℃の条件でタンパク質を発現した。以後、10%細胞抽出物を用いて45℃で初期反応速度を比較した。基質として4mMオルニチンを使用した場合と4mMリジンを使用した場合とをそれぞれ比較した。
Example 1. Activity comparison of ornithine decarboxylase from various sources The substrate reactivity of ornithine decarboxylase from 4 kinds of microorganisms was compared. Wild type ornithine from Lactobacillus saerimneri (inducible), Saccharomyces cerevisiae (inducible), E. coli (constitutive), E. coli (inducible) The target was carbonic enzyme, which was denoted as ODC_Lb, ODC_Sc, ODC_Ec, and ODC_Ef, respectively. After inserting the gene corresponding to the enzyme into the pET24ma vector, the protein was expressed using Escherichia coli BL21 (DE3) under conditions of 0.1 MM IPTG and 18°C. Initial reaction rates were then compared at 45° C. using 10% cell extracts. A comparison was made between 4 mM ornithine and 4 mM lysine as substrates.

図2に、前記4種の微生物由来のODC酵素の活性を示した。具体的に、オルニチンを基質として使用してプトレシンを生産したものであるオルニチン脱炭酸酵素活性と、リジンを基質として使用してカダベリンを生産したものであるリジン脱炭酸酵素活性と、を示した。リジン脱炭酸酵素活性は、いずれも類似しているが、オルニチン脱炭酸酵素活性は、ラクトバシラス由来のオルニチン脱炭酸酵素(ODC_Lb)が最も優れた。すなわち、ODC_Lbにおいて、オルニチン脱炭酸酵素活性に対するリジン脱炭酸酵素活性、すなわち、副反応の生成比率が最も低く表われるので、このような内容に基づいて変異型製作を行った。 FIG. 2 shows the activities of the ODC enzymes derived from the four microorganisms. Specifically, the ornithine decarboxylase activity produced putrescine using ornithine as a substrate and the lysine decarboxylase activity produced cadaverine using lysine as a substrate were shown. The lysine decarboxylase activity was similar to each other, but the ornithine decarboxylase activity of Lactobacillus-derived ornithine decarboxylase (ODC_Lb) was the best. That is, in ODC_Lb, the ratio of lysine decarboxylase activity to ornithine decarboxylase activity, that is, the production ratio of side reactions, was the lowest.

実施例2.オルニチン脱炭酸酵素の変異位置の選択
ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素は、結晶構造が知られており、構造分析を通じて基質が酵素に出入りするトンネル予測が可能である。予測されたトンネル部分のうち、飽和変異を行う機能的残基(functional residues)を選択するために、生物情報学の配列情報を利用した多数配列整列(multiple sequence alignment)を行い、本発明で利用するオルニチン脱炭酸酵素アミノ酸配列のN末端からA696、V702、A713、E698の位置を変異位置として選定した。
Example 2. Selection of mutation positions in ornithine decarboxylase The crystal structure of Lactobacillus ornithine decarboxylase is known, and it is possible to predict the tunnel through which the substrate enters and exits the enzyme through structural analysis. Among the predicted tunnel portions, in order to select functional residues that perform saturation mutation, multiple sequence alignment using bioinformatic sequence information is performed and used in the present invention. Positions A696, V702, A713, and E698 from the N-terminus of the ornithine decarboxylase amino acid sequence were selected as mutation positions.

タンパク質構造内に特定位置のアミノ酸残基を保存している残基は、そのタンパク質において、構造と機能上、非常に重要な役割を行い、特に、触媒過程において、直接的な役割を行う可能性が高いために、これらは、変異残基として排除した。 Residues that conserve amino acid residues at specific positions within the protein structure may play very important structural and functional roles in the protein, especially in catalytic processes. These were excluded as mutated residues due to the high .

実施例3.オルニチン脱炭酸酵素の機能的残基に対する飽和変異遂行及び変異型探索
飽和変異(saturation mutagenesis)は、遺伝子の指定された位置に多様な塩基配列の変化を導入することを言う。飽和変異は、鋳型鎖に結合する相補的な配列のプライマー(primer)上に、変異させようとする配列の代わりに、NNKコドン(codon)を挿入してPCRを通じて変異を挿入させることを言う。この際、NNKコドンで、Nは、ヌクレオチドのA、T、G、Cを意味し、Kは、T、Gを意味する。
Example 3. Saturation Mutagenesis and Mutant Search for Functional Residues of Ornithine Decarboxylase Saturation mutagenesis refers to the introduction of various nucleotide sequence changes at designated positions in a gene. Saturation mutagenesis refers to inserting a NNK codon instead of a sequence to be mutated into a complementary sequence primer that binds to a template strand to insert a mutation through PCR. At this time, in the NNK codon, N means nucleotides A, T, G, and C, and K means T, G.

選択された機能的残基に対してNNKコドンを使用して飽和変異を行った後、変異型ライブラリーに対してスクリーニングを行った。あらゆるライブラリーは、1次及び2次スクリーニングを前細胞反応を通じて進行した。前記前細胞反応は、特定酵素を含む細胞を破砕して細胞内容物を利用するか、または酵素を分離精製せずに、完全な細胞全体を利用した反応を意味する。1次スクリーニングは、オルニチン前細胞反応を通じて進行し、野生型と比較した時、類似しているか、さらに速い活性を示す変異型を吸光度の変化で選択した。2次スクリーニングは、リジン前細胞反応を通じて進行し、1次で選別された変異型に対して、リジンに対する反応性が野生型よりも低ければ、選択した。 After saturation mutation using NNK codons for selected functional residues, screening was performed against a mutant library. All libraries proceeded through the precellular reaction for primary and secondary screening. The pre-cell reaction refers to a reaction that utilizes cell contents by disrupting cells containing a specific enzyme, or a reaction that utilizes whole cells without isolating and purifying the enzyme. The primary screen proceeded through the ornithine procellular response and selected mutants showing similar or even faster activity when compared to the wild type by change in absorbance. A secondary screen proceeded through the lysine pre-cell reaction, selecting for the mutants selected in the first order if they were less reactive to lysine than the wild type.

選別された変異型酵素に対して、オルニチンまたはリジンを基質として使用した時の固有活性度を測定した。固有活性度(specific activity)は、酵素精製を通じて不純物及び他のタンパク質を除去した純粋なタンパク質の単位量当たり活性を示すことであって、通常1分間に1μmolの基質変化を触媒する酵素の量を1単位として1mg当たり単位数で表示する。具体的に、ラクトバシラス由来野生型及び変異型のオルニチン脱炭酸酵素を大腸菌BL21(DE3)に形質転換して50mLの培養体積でインデューサであるIPTGを用いて発現した以後、Ni-NTAカラムを用いて純粋タンパク質のみを精製した。まず、タンパク質発現以後、音波破砕機で細胞を破砕し、遠心分離後、細胞抽出液を得た。300mM塩化ナトリウムが添加された50mMホスフェート(phosphate)緩衝溶液(pH8.0)で平衡化させたカラムに細胞抽出液を入れて、0℃で1時間ニッケル樹脂(resin)と結合させた。以後、樹脂に結合することができなかったタンパク質を流し、50mMイミダゾールが含まれたトリス緩衝溶液で非特異的に結合された他のタンパク質を除去した。最後に、250mMイミダゾールが含まれたトリス緩衝溶液で所望のタンパク質のみを溶出した。溶出されたタンパク質からイミダゾールを除去するために、濾過カラムを利用した脱塩過程を行って、最終的に活性があるタンパク質のみを得た。以後、ブラッドフォード(Bradford)タンパク質定量キットを使用してタンパク質量を測定し、同量のタンパク質を使用して固有活性度を測定した。 Intrinsic activity was measured for the screened mutant enzymes when ornithine or lysine were used as substrates. Specific activity indicates the activity per unit amount of pure protein after removing impurities and other proteins through enzymatic purification. It is indicated by the number of units per 1 mg as 1 unit. Specifically, wild-type and mutant ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus were transformed into E. coli BL21 (DE3) and expressed using IPTG as an inducer in a culture volume of 50 mL. to purify pure protein only. First, after protein expression, the cells were crushed with a sonicator and centrifuged to obtain a cell extract. The cell extract was applied to a column equilibrated with 50 mM phosphate buffer solution (pH 8.0) supplemented with 300 mM sodium chloride and allowed to bind with nickel resin at 0° C. for 1 hour. Thereafter, proteins that could not bind to the resin were washed away, and non-specifically bound proteins were removed with a Tris buffer solution containing 50 mM imidazole. Finally, only the desired protein was eluted with a Tris buffer solution containing 250 mM imidazole. To remove imidazole from the eluted protein, a desalting process using a filtration column was performed to finally obtain only the active protein. Thereafter, protein amount was determined using the Bradford protein quantitation kit, and intrinsic activity was determined using the same amount of protein.

オルニチンまたはリジンを基質として使用した時のラクトバシラス由来野生型及び変異型のオルニチン脱炭酸酵素の固有活性度は、HPLC(High-performance liquid chromatography)分析技法を通じて測定した。反応は、50℃で30~300分間行って、三回の実験の平均値で求めた。10~25%の転換収率を示した時の初期反応速度を測定した。陽イオン交換カラムを使用し、移動相は、0.6g/Lクエン酸、4g/L酒石酸、1.4g/Lエチルジアミン、5%メタノール及び95%水で構成した。使われたpHのバッファ溶液は、pH5.0の場合、クエン酸塩緩衝液(citric-sodium citrate buffer)を使用した。野生型及び変異型のオルニチン脱炭酸酵素の固有活性度は、図3に示した。 The intrinsic activities of wild-type and mutant ornithine decarboxylase from Lactobacillus when ornithine or lysine was used as substrates were measured through high-performance liquid chromatography (HPLC) analytical techniques. Reactions were carried out at 50° C. for 30-300 minutes and averaged from three experiments. The initial reaction rate was measured at 10-25% conversion yield. A cation exchange column was used and the mobile phase consisted of 0.6 g/L citric acid, 4 g/L tartaric acid, 1.4 g/L ethyldiamine, 5% methanol and 95% water. The pH buffer solution used was citric-sodium citrate buffer when pH was 5.0. The intrinsic activities of wild-type and mutant ornithine decarboxylase are shown in FIG.

図3の(ア)及び図3の(イ)に示されているように、野生型及び変異型(A696E、V702G、A713L、A696E/A713L、V702G/A713L、A696E/V702G/A713L、E698D及びE698D/A713L)酵素の固有活性度を確認した結果、前記機能的残基(A696、V702、A713、E698)は、いずれも活性部位(active site)または基質接近トンネルに位置することを確認した。 As shown in FIG. 3 (a) and FIG. /A713L) As a result of confirming the intrinsic activity of the enzyme, it was confirmed that the functional residues (A696, V702, A713, E698) are all located in the active site or the substrate access tunnel.

具体的に、オルニチンを基質として使用した時、変異型(A696E、V702G、A713L、A696E/A713L、V702G/A713L、A696E/V702G/A713L、E698D、E698D/A713L)の固有活性度は、野生型の固有活性度に対して、それぞれ19.9%、4.3%、89.4%、12.8%、4.9%、0.1%、75.6%、74.4%と確認された(図3の(ア))。 Specifically, when ornithine was used as a substrate, the intrinsic activity of the mutants (A696E, V702G, A713L, A696E/A713L, V702G/A713L, A696E/V702G/A713L, E698D, E698D/A713L) 19.9%, 4.3%, 89.4%, 12.8%, 4.9%, 0.1%, 75.6%, and 74.4%, respectively, for intrinsic activity. ((a) in FIG. 3).

リジンを基質として使用した時、変異型(A696E、V702G、A713L、A696E/A713L、V702G/A713L、A696E/V702G/A713L、E698D、E698D/A713L)酵素の固有活性度は、野生型酵素の固有活性度に対して、それぞれ16.9%、0.6%、42.4%、4.4%、0.9%、0.7%、50.8%、29.2%であって、副反応が抑制されることを確認した(図3の(イ))。 The intrinsic activity of the mutant (A696E, V702G, A713L, A696E/A713L, V702G/A713L, A696E/V702G/A713L, E698D, E698D/A713L) enzymes when lysine was used as substrate degree, respectively 16.9%, 0.6%, 42.4%, 4.4%, 0.9%, 0.7%, 50.8%, 29.2% It was confirmed that the reaction was suppressed ((a) in FIG. 3).

実施例4.オルニチン脱炭酸酵素の機能的残基に対する動力学的係数確認
前記実施例3で使われたオルニチン脱炭酸酵素の変異型のうち、70%以上の固有活性度を有する変異型であるA713L、E698D、及びE698D/A713Lの特性をさらに綿密に確認しようとした。前記変異型及び野生型の動力学的係数(Kinetic parameter)を比較するために、多様な濃度条件のリジンを利用した。動力学的係数は、互いに異なる濃度を有した基質溶液を用いて酵素の基質親和度及び基質転換能力数値を示す。
Example 4. Confirmation of kinetic coefficients for functional residues of ornithine decarboxylase Mutants A713L, E698D, which are mutants having an intrinsic activity of 70% or more among the mutants of ornithine decarboxylase used in Example 3, and tried to more closely examine the characteristics of E698D/A713L. Various concentrations of lysine were used to compare the kinetic parameters of the mutant and wild-type. The kinetic coefficient indicates the substrate affinity and substrate conversion capacity of an enzyme using substrate solutions with different concentrations.

具体的に、タンパク質精製を済ませた野生型及び変異型のオルニチン脱炭酸酵素のリジンに対する動力学的係数を確認するために、0.45~140mMのリジン濃度を使用した。pHのバッファ溶液は、pH5.0クエン酸塩緩衝液を使用し、反応体積は、200μlで進行した。分析は、前記明示されたHPLC分析方法を通じて進行し、三回の実験の平均値で求めた。野生型及び変異型のリジン脱炭酸酵素の動力学的係数は、図4に示した。 Specifically, lysine concentrations of 0.45-140 mM were used to determine the kinetic coefficients of protein-purified wild-type and mutant ornithine decarboxylase on lysine. The pH buffer solution used pH 5.0 citrate buffer and the reaction volume proceeded at 200 μl. Analysis proceeded through the HPLC analytical method specified above and was determined as the average of three experiments. The kinetic coefficients of wild-type and mutant lysine decarboxylase are shown in FIG.

図4に示すように、野生型に比べて、変異型(A713L)のリジンに対するkcat値が2.16倍低くなったことを確認した。kcat値の減少によって、変異型(A713L)のリジンに対するkcat/K値が野生型に比べて、1.93倍減ったことを確認した。結論的に、変異型(A713L)がリジン脱炭酸酵素活性を減らしうるということを確認した。変異型E698D及びE698D/A713Lも、野生型に比べて、リジンに対するkcat値が2.08倍と2.59倍とにそれぞれ減ることを確認し、リジンに対するkcat/K値が1.28倍及び1.67倍減少することを確認した。すなわち、前記変異型は、副反応を低減させることができるということを確認した。 As shown in FIG. 4, it was confirmed that the k cat value for lysine of the mutant (A713L) was 2.16 times lower than that of the wild type. The decrease in k cat value confirmed that the k cat /K M value for lysine of the mutant (A713L) was 1.93 times lower than that of the wild type. In conclusion, it was confirmed that the mutant (A713L) could reduce lysine decarboxylase activity. Mutants E698D and E698D/A713L were also confirmed to have 2.08-fold and 2.59-fold reductions in k cat values for lysine compared to the wild type, respectively, with a k cat /K M value for lysine of 1.0-fold. A 28-fold and 1.67-fold reduction was confirmed. That is, it was confirmed that the mutant can reduce side reactions.

実施例5.変異型オルニチン脱炭酸酵素の特性分析
変異型のうち、最も高いオルニチン固有活性度を有する変異型であるオルニチン脱炭酸酵素(A713L)が、プトレシンまたはカダベリンの生成に及ぼす影響を調べようとした。高い濃度51.5g/L(0.39M)のオルニチンを基質として使用した場合と、濃度2.57g/L(17.6mM)のリジンを基質として使用した場合と、をそれぞれ進行した。2種の基質条件で反応を進行するに当って、適当な反応条件を取るために、pHを適正するバッファ濃度を2種の条件(0.1Mまたは0.37M)で進行した。
Example 5. Characterization of Mutant Ornithine Decarboxylase Of the mutants, the mutant with the highest ornithine intrinsic activity, ornithine decarboxylase (A713L), was sought to examine its effect on the production of putrescine or cadaverine. A high concentration of 51.5 g/L (0.39 M) of ornithine was used as the substrate and 2.57 g/L (17.6 mM) of lysine was used as the substrate. In order to obtain appropriate reaction conditions when proceeding with the reaction under two substrate conditions, two buffer concentrations (0.1 M or 0.37 M) were used to adjust the pH.

具体的に、タンパク質精製を済ませた野生型及び変異型酵素0.1mgを反応に使用した。基質として0.39Mのオルニチンまたは17.6mMのリジンを使用し、バッファとして0.1または0.37Mのクエン酸塩緩衝液(pH5.0)を使用した。0.1mM PLP助酵素が使われ、反応は、50℃で進行し、反応体積は、2mLで進行した。これに対する結果は、図5に示した。 Specifically, 0.1 mg of protein-purified wild-type and mutant enzymes were used in the reaction. 0.39 M ornithine or 17.6 mM lysine was used as substrate and 0.1 or 0.37 M citrate buffer (pH 5.0) was used as buffer. 0.1 mM PLP coenzyme was used, the reaction proceeded at 50° C. and the reaction volume was 2 mL. The results for this are shown in FIG.

図5の(ア)は、51.5g/L(0.39M)のオルニチンを基質として使用した場合である。オルニチンをプトレシンに変換する場合、0.37Mのバッファを使用した時(図5の(ア)の●及び○参照)、4時間以後、野生型及び変異型(A713L)でプトレシンをそれぞれ33.0g/L及び31.6g/L生成した。また、低い濃度のバッファ(0.1M)を使用した時(図5の(ア)の◆及び◇参照)、7時間後、野生型及び変異型(A713L)は、それぞれプトレシンを20.2g/L及び20.7g/L生成した。野生型及び変異型(A713L)のプトレシンの生産能力が類似していることを確認し、高濃度バッファ(0.37M)を使用したことが反応性に有益なことを確認した。 (a) of FIG. 5 is the case of using 51.5 g/L (0.39 M) ornithine as a substrate. When converting ornithine to putrescine, 33.0 g of putrescine was added to each of the wild-type and mutant (A713L) after 4 hours when using a 0.37 M buffer (see ● and ○ in FIG. 5(a)). /L and 31.6 g/L were produced. In addition, when a low concentration of buffer (0.1 M) was used (see ◆ and ◇ in (a) of FIG. 5), after 7 hours, the wild type and mutant type (A713L) each received 20.2 g/g of putrescine. L and 20.7 g/L were produced. It was confirmed that wild-type and mutant (A713L) putrescine production capacities were similar, and that the use of high concentration buffer (0.37 M) was beneficial for reactivity.

図5の(イ)は、2.57g/L(17.6mM)のリジンを基質として使用した場合である。リジンをカダベリンに変換する場合、0.37Mのバッファを使用した時(図5の(イ)の●及び○参照)、4時間後、野生型及び変異型(A713L)でそれぞれ0.03g/L及び0.007g/Lのカダベリンを生成した。また、0.1Mのバッファを使用した時(図5の(イ)の◆及び◇参照)、カダベリンが生成される副反応が増加し、7時間後、野生型及び変異型(A713L)でそれぞれ0.59g/L及び0.38g/Lのカダベリンを副反応で生成した。これにより、変異型(A713L)でカダベリンを生成する副反応が抑制されることを確認し、この副反応の抑制効果は、高い濃度のバッファ(0.37M)を使用した時、さらに目立つことを確認した。 FIG. 5(a) is the case of using 2.57 g/L (17.6 mM) of lysine as a substrate. When converting lysine to cadaverine, when using a 0.37 M buffer (see ● and ○ in FIG. 5 (a)), 0.03 g/L for wild type and mutant type (A713L) after 4 hours, respectively. and 0.007 g/L of cadaverine. In addition, when 0.1 M buffer was used (see ◆ and ◇ in (b) of FIG. 5), the side reaction in which cadaverine was produced increased, and after 7 hours, wild-type and mutant (A713L) Side reactions produced 0.59 g/L and 0.38 g/L of cadaverine. As a result, it was confirmed that the side reaction that produces cadaverine was suppressed in the mutant (A713L), and that this side reaction suppression effect was even more pronounced when a high concentration buffer (0.37M) was used. confirmed.

実施例6.コリネ菌株で組換えODC遺伝子の発現量の比較測定
実施例1で言及された4種の微生物由来オルニチン脱炭酸酵素ODC_Lb、ODC_Sc、ODC_Ec、ODC_Efを発現させるための組換え遺伝子の製作方法は、次の通りである。
Example 6. Comparative Measurement of Recombinant ODC Gene Expression Levels in Corynebacterium strains A method for constructing recombinant genes for expressing the four microbial ornithine decarboxylase ODC_Lb, ODC_Sc, ODC_Ec, and ODC_Ef mentioned in Example 1 is as follows. is as follows.

具体的に、Lactobacillus saerimneri(ACCESSION no.P43099)、Saccharomyces cerevisiae(ACCESSION no.J02777.1)、及びEscherichia coli str.K-12(ACCESSION no.BAA35349)誘電体情報を用いてオルニチン脱炭酸酵素遺伝子を表1に明記された遺伝子配列でPCRによる遺伝子コーディング領域増幅後、PCR生成物に制限酵素を処理してプラスミドに挿入した。

Figure 0007214952000001
Specifically, Lactobacillus saerimneri (ACCESSION no. P43099), Saccharomyces cerevisiae (ACCESSION no. J02777.1), and Escherichia coli str. K-12 (ACCESSION no. BAA35349) dielectric information was used to amplify the gene coding region of the ornithine decarboxylase gene by PCR with the gene sequence specified in Table 1, and then the PCR product was treated with a restriction enzyme to form a plasmid. inserted.
Figure 0007214952000001

組み替えられた遺伝子は、タンパク質C末端にHis-tagを追加翻訳することができるように製作した。大腸菌DH5 alphaをDNA操作のための宿主菌株として使用し、大腸菌BL21(DE3)をC末端His6-タグODC遺伝子発現のための宿主菌株として使用した。組換え大腸菌BL21を50mg/mLのカナマイシンを含有する50mL LB培地で37℃で成長させた。培養液がOD600条件で0.8に到達した時、0.2mM IPTGを培養液に添加した。18~30℃でタンパク質発現を誘導した後、細胞を収穫した。細胞を溶解緩衝液に再懸濁し、超音波処理して細胞を破壊させた。得られた組換えODCを4℃でQuiagen(Hilden、Germany)のNi-NTAアガロース樹脂で精製した。組換えタンパク質は、100kDaの分子質量カットオフ(cut off)と共にCentriplus YM-30(Millipore、Bedford、MA)を使用して収得した。発現結果は、図6のようである。 The recombined gene was designed to allow additional translation of a His-tag at the C-terminus of the protein. E. coli DH5 alpha was used as the host strain for DNA manipulations and E. coli BL21(DE3) was used as the host strain for C-terminal His6-tagged ODC gene expression. Recombinant E. coli BL21 was grown at 37° C. in 50 mL LB medium containing 50 mg/mL kanamycin. When the culture reached OD 600 condition of 0.8, 0.2 mM IPTG was added to the culture. Cells were harvested after inducing protein expression at 18-30°C. Cells were resuspended in lysis buffer and sonicated to disrupt cells. The resulting recombinant ODC was purified on Ni-NTA agarose resin from Quiagen (Hilden, Germany) at 4°C. Recombinant proteins were obtained using a Centriplus YM-30 (Millipore, Bedford, Mass.) with a molecular mass cut off of 100 kDa. Expression results are shown in FIG.

SDS-PAGE gel上で30℃発現誘導条件の結果を分析すれば、組換えODC_LbとODC_Ecとの発現量がODC_Sc、ODC_Efに比べて、高いことを確認することができる。但し、ODC_Ecの場合、中温条件発現時に、可溶性タンパク質量が著しく落ちることが確認された。追加的に、37℃発現を進行した時、ODC_Ecの可溶性タンパク質量は、さらに減少した。 Analysis of the results of the 30° C. expression induction condition on SDS-PAGE gel confirmed that the expression levels of recombinant ODC_Lb and ODC_Ec were higher than those of ODC_Sc and ODC_Ef. However, in the case of ODC_Ec, it was confirmed that the amount of soluble protein was remarkably decreased when expressed under mesothermal conditions. Additionally, the soluble protein amount of ODC_Ec was further reduced when the 37° C. expression proceeded.

コリネ菌株でODC_LbとODC_Ec遺伝子を発現させて、可溶性タンパク質で発現される量を比較評価しようとした。ODC_Lb遺伝子及びODC_Ec遺伝子の開始コドン前にCJ7プロモーター(KCCM10617、大韓民国登録特許第10-0620092号)を導入した。まず、CJ7プロモーター配列を含む遺伝子を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のゲノムDNAを鋳型として表2の明記されたプライマー対を利用したPCRを行った。PCR反応は、95℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング及び72℃で30秒の伸張過程を30回繰り返して実施した。

Figure 0007214952000002
The ODC_Lb and ODC_Ec genes were expressed in Corynebacterium strains to compare and evaluate the amount of soluble protein expressed. A CJ7 promoter (KCCM10617, Korean Patent No. 10-0620092) was introduced before the initiation codons of the ODC_Lb gene and the ODC_Ec gene. First, in order to obtain a gene containing the CJ7 promoter sequence, PCR was performed using the primer pairs specified in Table 2 using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template. The PCR reaction was performed by repeating 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds and extension at 72°C for 30 seconds.
Figure 0007214952000002

1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動後、400basepair(bp)のサイズを有するPCR核酸結果物を確認した。得られたPCR結果物は、PCR prep kit(GeneAll、ソウル)を用いて精製した。精製されたPCR産物とpSCECベクター溶液サンプルとにBamHIとXbaIとを入れ、37℃、4時間反応で制限酵素処理し、1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動後、400bpのサイズを有するPCR核酸産物バンドとベクターサイズのバンドとをカッティング(cutting)後、Gel prep kit(GeneAll、ソウル)を用いて核酸断片を収得した。精製された各1mgのCJ7プロモーター断片とベクターをT4 ligaseを用いてライゲーション(ligation)後、E.coli DH5 alpha菌株にエレクトロポレーション(electrophoration)した。エレクトロポレーションは、2500Vで加えた。回収された菌株を50μg/Lスペクチノマイシン(spectinomycin)を含んだLB平板培地に塗抹して、37℃で1日培養した後、耐性を示す菌株を選別した。18個の菌株を選別して、配列番号9及び配列番号10でコロニーPCR後、400bpのサイズを有するPCR結果物を確認することができた。コロニーPCR結果からCJ7プロモーターを有するpSCEC_cj7の製作を確認した。 After electrophoresis using 1.5% agarose gel, a PCR nucleic acid product with a size of 400 basepair (bp) was confirmed. The resulting PCR product was purified using a PCR prep kit (GeneAll, Seoul). BamHI and XbaI were added to the purified PCR product and the pSCEC vector solution sample, treated with restriction enzymes at 37° C. for 4 hours, and after electrophoresis using 1.5% agarose gel, PCR having a size of 400 bp was performed. After cutting the nucleic acid product band and the vector size band, nucleic acid fragments were obtained using Gel prep kit (GeneAll, Seoul). After ligation of each 1 mg of the purified CJ7 promoter fragment and the vector using T4 ligase, E. E. coli DH5 alpha strain was electroporated. Electroporation was applied at 2500V. The collected strains were smeared on an LB plate medium containing 50 μg/L spectinomycin, cultured at 37° C. for 1 day, and strains exhibiting resistance were selected. After selecting 18 strains and performing colony PCR with SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, a PCR product with a size of 400 bp was confirmed. The colony PCR results confirmed the construction of pSCEC_cj7 with the CJ7 promoter.

得られたpSCEC_cj7ベクターに基づいて表3に明記されたプライマーを用いてODC_LbとODC_Ec 2個の遺伝子をPCRを通じて増幅した。

Figure 0007214952000003
Based on the resulting pSCEC_cj7 vector, two genes ODC_Lb and ODC_Ec were amplified by PCR using the primers specified in Table 3.
Figure 0007214952000003

前記得られたPCR産物及びpSCEC_cj7ベクターを制限酵素XbaIとSalIとに処理した。制限酵素処理された核酸をgel prepして、ODC_Lb、ODC_Ec、そして、pSCEC_cj7核酸断片をライゲーションし、E.coli DH5 alpha菌株に挿入した。挿入が確認された選別された菌株からpSCEC_cj7_ODC_Lb及びpSCEC_cj7_ODC_Ecをそれぞれ収得し、プトレシン生産コリネバクテリウム属微生物KCCM11240Pに2500Vでそれぞれエレクトロポレーションした。 The obtained PCR product and pSCEC_cj7 vector were treated with restriction enzymes XbaI and SalI. Gel prep the restriction enzyme digested nucleic acid and ligate the ODC_Lb, ODC_Ec, and pSCEC_cj7 nucleic acid fragments; E. coli DH5 alpha strain. pSCEC_cj7_ODC_Lb and pSCEC_cj7_ODC_Ec were obtained from selected strains in which insertion was confirmed, and electroporated into putrescine-producing Corynebacterium genus KCCM11240P at 2500 V, respectively.

50μg/Lスペクチノマイシンを含んだBHIS平板培地(Braine heart infusion 37g/L、ソルビトール91g/L、寒天2%)に、前記菌株を塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。前記選別された菌株が、50μg/Lスペクチノマイシンを含んだCM培地(glucose 10g/L、polypeptone 10g/L、yeast extract 5g/L、beef extract 5g/L、NaCl 2.5g/L、Urea 2g/L、pH6.8)で振盪培養が可能であることを確認した。製作された2種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を3mL培養後、遠心分離して菌体を確保した。得られた菌体を超音波処理方法で細胞破砕後、遠心分離して可溶性タンパク質が含まれた溶液を確保した。 The strain was smeared on a BHIS plate medium (Brain heart infusion 37 g/L, sorbitol 91 g/L, agar 2%) containing 50 μg/L spectinomycin and cultured to form colonies. The selected strain is a CM medium containing 50 μg/L spectinomycin (glucose 10 g/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, beef extract 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, Urea 2 g /L, pH 6.8). After culturing 3 mL of the produced two kinds of Corynebacterium glutamicum mutant strains, they were centrifuged to secure the cells. The obtained cells were disrupted by ultrasonication and then centrifuged to obtain a solution containing soluble proteins.

Ni-NTA Spin Columns(Hilden、Germany)を用いてHis-tagが含まれたODC_Lb、ODC_Ecタンパク質をそれぞれ精製した。Nano dropを用いて収得してタンパク質の濃度を測定した。測定値の基盤で計算された組換えタンパク質の濃度は、それぞれODC_Lb:1.282g/L、ODC_Ec:0.039g/Lであって、コリネ菌株でODC_Ecに比べて、ODC_Lbが30倍以上の可溶性タンパク質を確保することを確認した。 His-tag-containing ODC_Lb and ODC_Ec proteins were purified using Ni-NTA Spin Columns (Hilden, Germany), respectively. The concentration of protein was measured using a Nano drop. The concentrations of the recombinant proteins calculated on the basis of the measured values were ODC_Lb: 1.282 g/L and ODC_Ec: 0.039 g/L, respectively, and ODC_Lb was 30 times more soluble than ODC_Ec in Corynebacterium strains. Make sure you have enough protein.

ODC_Lbは、中温条件で大腸菌とコリネ菌株とを宿主として使用して発現させる時、高い発現量と正常なタンパク質折り曲げで高い可溶性タンパク質の生産が可能であることを確認することができた。 It was confirmed that ODC_Lb was able to produce a high soluble protein with a high expression level and normal protein folding when expressed using E. coli and Corynebacterium strains as hosts at a moderate temperature.

実施例7.変異型オルニチン脱炭酸酵素が導入されたコリネ型プトレシン生産菌株の製造及びプトレシン生産能の測定
本発明のオルニチン脱炭酸酵素変異型が、プトレシンの生産に及ぼす影響を調べるために、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物に、前記オルニチン脱炭酸酵素変異型を導入した菌株を製作した。
Example 7. Production of coryneform putrescine-producing strain introduced with mutant ornithine decarboxylase and measurement of putrescine-producing ability Putrescine-producing ability was improved in order to examine the effect of the mutant ornithine decarboxylase of the present invention on putrescine production. A strain was prepared by introducing the aforementioned ornithine decarboxylase mutant into the Corynebacterium genus microorganism.

具体的に、前記プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物として、特許出願(大韓民国特許公開第2013-0082478号)に開示されたプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物(KCCM11240P)が使われた。前記プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物(KCCM11240P)は、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から製造された微生物(ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD:P(CJ7)-speC(Ec):KCCM11138P(大韓民国特許公開第2012-0064046号))内のNCgl1469が欠損した微生物である。 Specifically, as the Corynebacterium genus microorganism with improved putrescine-producing ability, the Corynebacterium genus microorganism (KCCM11240P) having the putrescine-producing ability disclosed in the patent application (Korea Patent Publication No. 2013-0082478) is used. rice field. The Corynebacterium microorganism (KCCM11240P) having putrescine-producing ability is a microorganism produced from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (ATCC 13032 ΔargF ΔNCgl1221 P(CJ7)-argCJBD bioAD: P(CJ7)-speC(Ec): KCCM11138P (Korea Patent Publication No. 2012-0064046)) is a microorganism lacking NCgl1469.

前記プトレシン生産微生物内のオルニチン脱酸山酵素を前記ラクトバシラス由来のラクトバシラス由来のオルニチン脱炭酸酵素変異型に置換するためのベクターを製作した。より具体的には、前記実施例1及び実施例3で製作したラクトバシラス由来のオルニチン脱炭酸酵素変異型のDNAを下記表4に開示したODC_Lb_start(EcoRV)_5、ODC_Lb_stop(MfeI)_3プライマーを用いて増幅した。具体的には、前記製作したpET24maベクターに野生型及び変異型(E698D、A713L)のラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素を挿入して、それをそれぞれ鋳型とし、下記表4に開示したL-odc_start(EcoRV)_5、L-odc_stop(MfeI)_3の2つのプライマーを使用してPCRを行った。

Figure 0007214952000004
A vector was constructed for replacing the ornithine decarboxylase in the putrescine-producing microorganism with the lactobacillus-derived ornithine decarboxylase mutant. More specifically, the Lactobacillus-derived ornithine decarboxylase mutant DNA prepared in Examples 1 and 3 was isolated using ODC_Lb_start (EcoRV)_5 and ODC_Lb_stop (MfeI)_3 primers disclosed in Table 4 below. amplified. Specifically, wild-type and mutant (E698D, A713L) lactobacillus ornithine decarboxylase were inserted into the pET24ma vector prepared above, and used as templates, respectively, to generate L-odc_start (EcoRV) disclosed in Table 4 below. PCR was performed using two primers:_5, L-odc_stop(MfeI)_3.
Figure 0007214952000004

PCR増幅を通じて得た遺伝子断片は、EcoRVとMfeI制限酵素で処理(37℃、3時間)して、大韓民国特許公開第2012-0064046号に開示された方法と同じ方法を用いて製作したpDZ-bioAD-P(CJ7)ベクターにラクトバシラス由来野生型及び変異型(E698D、A713L)オルニチン脱炭酸酵素の遺伝子断片を挿入した。前記方法には、EcoRVとMfeI制限酵素が使われた。前記方法で製作された染色体挿入用組換えベクター(pDZ-ODC_Lb、pDZ-ODC_Lb_E698D、pDZ-ODC_Lb_A713L)は、配列分析で確認した。 The gene fragment obtained through PCR amplification was treated with EcoRV and MfeI restriction enzymes (37° C., 3 hours), and pDZ-bioAD was constructed using the same method as disclosed in Korean Patent Publication No. 2012-0064046. A gene fragment of Lactobacillus-derived wild-type and mutant (E698D, A713L) ornithine decarboxylase was inserted into the -P(CJ7) vector. EcoRV and MfeI restriction enzymes were used in the method. The recombinant vectors for chromosome insertion (pDZ-ODC_Lb, pDZ-ODC_Lb_E698D, pDZ-ODC_Lb_A713L) prepared by the above method were confirmed by sequence analysis.

ラクトバシラス由来野生型及び変異型オルニチン脱炭酸酵素が、染色体内に挿入されたコリネ菌株を得るために、前記で製作されたpDZ-ODC_Lb、pDZ-ODC_Lb_E698D、pDZ-ODC_Lb_A713L組換えベクターのそれぞれをKCCM11240P菌株に電気穿孔法を用いて形質注入した後、BHIS平板培地(brainheart infusion 37g/L、sorbitol 91g/L、agar 2%、1L基準+kanamycin 25μg/ml)に塗抹した。 To obtain Corynebacterium strains in which wild-type and mutant ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus are inserted into the chromosome, each of the pDZ-ODC_Lb, pDZ-ODC_Lb_E698D, and pDZ-ODC_Lb_A713L recombinant vectors prepared above was used in the KCCM11240P strain. were transfected using electroporation and plated on BHIS plates (brainheart infusion 37 g/L, sorbitol 91 g/L, agar 2%, 1 L reference + kanamycin 25 μg/ml).

成功的なベクターの染色体内の挿入は、X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド)を含んだ固体培地で青色を示すかの如何で判別した。1次染色体挿入された菌株を栄養培地で振盪培養(30℃、8時間)した後、それぞれ連続希釈(serial dilution)して、X-galを含んでいる固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を帯びるが、一方、低い比率で白色のコロニーを選別し、選別したコロニーは、2次交差(cross over)によって最終ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素変異型が染色体に導入された菌株が得られた。最終的に、菌株は、変異型の配列分析によって確認した。確認された菌株をKCCM11240P::ODC_Lb、KCCM11240P::ODC_Lb_E698D、KCCM11240P::ODC_Lb_A713Lと名付けた。 Successful intrachromosomal insertion of the vector was determined by its blue color on solid medium containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside). After shaking culture (30° C., 8 hours) in a nutrient medium, the primary chromosome-inserted strain was serially diluted and plated on a solid medium containing X-gal. Most of the colonies are blue, while a small percentage of white colonies are selected, and the selected colonies are strains in which the final lactobacillus ornithine decarboxylase variant has been introduced into the chromosome by a second crossover. Got. Finally, strains were confirmed by sequence analysis of mutants. The confirmed strains were named KCCM11240P::ODC_Lb, KCCM11240P::ODC_Lb_E698D, KCCM11240P::ODC_Lb_A713L.

ラクトバシラス由来野生型及び変異型オルニチン脱炭酸酵素の導入によるプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の影響を確認するために、プトレシン生産能を評価した。 The putrescine-producing ability of the putrescine-producing strain was evaluated in order to confirm the influence of the introduction of the wild-type and mutant ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus on the putrescine-producing ability of the strain.

具体的に、前記で製作された菌株を1mMアルギニンが含まれたCM平板培地(ブドウ糖1%、polypeptone 1%、酵母抽出物0.5%、beef extract 0.5%、NaCl 0.25%、urea 0.2%、50% NaOH 100μl、agar 2%、pH6.8、1L基準)で30℃で16時間培養した後、下記表5の組成を有する25ml力価培地に1白金耳程度接種した後、それを30℃で200rpmで24時間振盪培養した。製作されたあらゆる菌株に対して、発酵時に、培地に1mMアルギニンを添加して培養した。

Figure 0007214952000005
Specifically, the strain prepared above was placed on a CM plate medium containing 1 mM arginine (glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 μl, agar 2%, pH 6.8, 1 L standard) and cultured at 30° C. for 16 hours, and then inoculated into a 25 ml titer medium having the composition shown in Table 5 below at about 1 platinum loop. After that, it was shake-cultured at 30°C and 200 rpm for 24 hours. For all engineered strains, 1 mM arginine was added to the medium during fermentation and cultured.
Figure 0007214952000005

その結果、表6から見るように、培養12時間後、ラクトバシラス由来変異型(A713L)オルニチン脱炭酸酵素を導入した菌株で、大腸菌オルニチン脱炭酸酵素を有する菌株(KCCM11240P)に比べて、プトレシンの生産量が約115%Pほど増加した。また、A713Lオルニチン脱炭酸酵素を導入した菌株でラクトバシラス由来野生型オルニチン脱炭酸酵素を有する菌株(KCCM11240P::ODC_Lb)に比べて、約40%P増加する態様を示した。 As a result, as seen from Table 6, after 12 hours of culture, putrescine production in the strain into which the Lactobacillus-derived mutant (A713L) ornithine decarboxylase was introduced was higher than that in the strain (KCCM11240P) having E. coli ornithine decarboxylase. The amount increased by about 115% P. In addition, the strain into which A713L ornithine decarboxylase was introduced increased P by about 40% compared to the strain (KCCM11240P::ODC_Lb) having wild-type ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus.

また、A713Lオルニチン脱炭酸酵素を導入した菌株(KCCM11240P::ODC_Lb_A713L)は、KCCM11240Pに比べて、プトレシンの生産時に、副反応によるカダベリンの生産が約48%P減少し、培養液内の残留ブドウ糖の濃度で見て、同一時間内の糖消耗量が増加して、生産性が共に増加するということが分かる。

Figure 0007214952000006
In addition, in the strain introduced with A713L ornithine decarboxylase (KCCM11240P::ODC_Lb_A713L), the production of cadaverine due to a side reaction during the production of putrescine decreased by about 48% compared to KCCM11240P, and the amount of residual glucose in the culture medium decreased. In terms of concentration, it can be seen that the consumption of sugar in the same period of time increases, and the productivity also increases.
Figure 0007214952000006

前記のような結果は、ラクトバシラス由来変異型オルニチン脱炭酸酵素が導入されることによって、プトレシン生産菌株で糖消耗に比べて、既存よりも高い濃度のプトレシンを生産するだけではなく、カダベリンの低減及び生産性向上の効果を有することを示す。 The above results show that the introduction of the Lactobacillus-derived mutant ornithine decarboxylase not only produces putrescine at a higher concentration than the existing putrescine-producing strains, but also reduces cadaverine and It shows that it has the effect of improving productivity.

実施例8.ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の713番目のアミノ酸残基に対する飽和変異の影響性予測
選択された変異のうち、ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された機能的残基(A713L)に対して、アラニン及びロイシンを除いた他のアミノ酸に置換した後、プトレシン生産菌株KCCM11240Pに導入して、プトレシンの生産に及ぼす影響を調べた。
Example 8. Prediction of influence of saturation mutation on amino acid residue 713 of Lactobacillus ornithine decarboxylase On the other hand, after substituting amino acids other than alanine and leucine, they were introduced into putrescine-producing strain KCCM11240P, and the effect on putrescine production was examined.

具体的に、配列番号1のアミノ酸配列で、N末端から713番目のアミノ酸を疎水性アミノ酸を含んだ他のアミノ酸に置換した形態の変異型をプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物(KCCM11240P)の染色体内の大腸菌由来野生型オルニチン脱炭酸酵素の代わりに、置換させた変異菌株を製作した。さらに具体的に、疎水性アミノ酸の1つであるバリン、塩基性アミノ酸の1つであるアルギニン、酸性アミノ酸の1つであるアスパラギン酸、中性アミノ酸の1つであるグルタミン、芳香族性アミノ酸の1つであるトリプトファンに置換するベクターをそれぞれ製作するために、実施例7で製作したpDZ-ODC_Lbベクターを鋳型として、前記表4と下記表7とに開示されたプライマーを使用してPCRを行った。1次としては、変異を起こそうとする部位を中心に前側部分(5')と裏側部分(3')とに対して、それぞれPCRを進行した後、2次で2つのPCR断片を合わせるPCRを行った。例えば、713番目のアミノ酸をアラニンからバリンに置換する変異(A713V)の場合、前側部分ODC_Lb_start(EcoRV)_5とODC_Lb_A713V_3プライマーを使用してPCRで増幅し、裏側部分は、ODC_Lb_A713V_5とODC_Lb_stop(MfeI)_3プライマーを使用してPCRで増幅した。1次PCRを通じて得た2つのPCR断片を2次PCRの鋳型として使用し、ODC_Lb_start(EcoRV)_5とODC_Lb_stop(MfeI)_3プライマーを使用してPCRを進行した。最終的に得られたラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の変異型A713V遺伝子断片は、実施例7と同じ方法でpDZ-bioAD-P(CJ7)ベクターに挿入した。それ以外の残りの変異型A713R、A713D、A713W、A713Qも、表7に開示されたプライマーを使用して、前記と同じ方法でPCRを進行してpDZ-bioAD-P(CJ7)ベクターに挿入した。製作された染色体挿入用組換えベクター(pDZ-ODC_Lb_A713V、pDZ-ODC_Lb_A713R、pDZ-ODC_Lb_A713D、pDZ-ODC_Lb_A713W、pDZ-ODC_Lb_A713Q)は、配列分析で確認した。

Figure 0007214952000007
Specifically, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a Corynebacterium genus microorganism with improved putrescine-producing ability (KCCM11240P ) in which the E. coli-derived wild-type ornithine decarboxylase in the chromosome was replaced with a mutant strain. More specifically, valine is one of the hydrophobic amino acids, arginine is one of the basic amino acids, aspartic acid is one of the acidic amino acids, glutamine is one of the neutral amino acids, and aromatic amino acids PCR was performed using the pDZ-ODC_Lb vector prepared in Example 7 as a template and the primers disclosed in Table 4 above and Table 7 below in order to prepare each tryptophan-substituting vector. rice field. First, PCR is performed on the front part (5') and the back part (3') centering on the site to be mutated, and then the two PCR fragments are combined in the second PCR. did For example, in the case of a mutation (A713V) that replaces amino acid 713 from alanine to valine, the front part ODC_Lb_start (EcoRV)_5 and ODC_Lb_A713V_3 primers are used to amplify by PCR, and the back part is ODC_Lb_A713V_5 and ODC_Lb_stop (MfeI)_3. Amplified by PCR using primers. Two PCR fragments obtained through primary PCR were used as templates for secondary PCR, and PCR was performed using primers ODC_Lb_start(EcoRV)_5 and ODC_Lb_stop(MfeI)_3. The finally obtained mutant A713V gene fragment of lactobacillus ornithine decarboxylase was inserted into the pDZ-bioAD-P(CJ7) vector in the same manner as in Example 7. The remaining mutants A713R, A713D, A713W, and A713Q were also inserted into the pDZ-bioAD-P(CJ7) vector by PCR in the same manner as described above using the primers disclosed in Table 7. . The recombinant vectors for chromosome insertion (pDZ-ODC_Lb_A713V, pDZ-ODC_Lb_A713R, pDZ-ODC_Lb_A713D, pDZ-ODC_Lb_A713W, pDZ-ODC_Lb_A713Q) were confirmed by sequence analysis.
Figure 0007214952000007

ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンが、疎水性アミノ酸を含んだ他のアミノ酸に置換した形態の変異型が染色体内に挿入された菌株を得るために、前記で製作されたpDZ-ODC_Lb_A713V、pDZ-ODC_Lb_A713R、pDZ-ODC_Lb_A713D、pDZ-ODC_Lb_A713W、pDZ-ODC_Lb_A713Q組換えベクターのそれぞれを実施例7のような方法でKCCM11240P菌株に形質注入し、選別して最終ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素変異型が染色体に導入された菌株が得られた。最終的に、菌株は、変異型の配列分析によって確認された。確認された菌株をKCCM11240P::ODC_Lb_A713V、KCCM11240P::ODC_Lb_A713R、KCCM11240P::ODC_Lb_A713D、KCCM11240P::ODC_Lb_A713Q、KCCM11240P::ODC_Lb_A713Wと名付けた。 pDZ-ODC_Lb_A713V prepared above to obtain a strain in which the 713th alanine of Lactobacillus ornithine decarboxylase is replaced with another amino acid containing a hydrophobic amino acid and the mutant is inserted into the chromosome; Each of the pDZ-ODC_Lb_A713R, pDZ-ODC_Lb_A713D, pDZ-ODC_Lb_A713W, and pDZ-ODC_Lb_A713Q recombinant vectors was transfected into the KCCM11240P strain in the same manner as in Example 7, and screened to ensure that the final lactobacillus ornithine decarboxylase mutant was transferred to the chromosome. An introduced strain was obtained. Finally, strains were confirmed by sequence analysis of mutants. The confirmed strains were named KCCM11240P::ODC_Lb_A713V, KCCM11240P::ODC_Lb_A713R, KCCM11240P::ODC_Lb_A713D, KCCM11240P::ODC_Lb_A713Q, KCCM11240P::ODC_Lb_A713W.

ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンが、疎水性アミノ酸を含んだ他のアミノ酸に置換された形態の変異型の導入によるプトレシン生産菌株のプトレシン生産能の影響を確認するために、前記実施例7のような方法でプトレシン生産能を評価した。

Figure 0007214952000008
In order to confirm the influence of the putrescine-producing ability of the putrescine-producing strain by introducing a mutant in which the alanine at position 713 of Lactobacillus ornithine decarboxylase is replaced with another amino acid containing a hydrophobic amino acid, the above-mentioned example was carried out. The putrescine-producing ability was evaluated by a method similar to 7.
Figure 0007214952000008

その結果、表8から見るように、疎水性を含んだ他のアミノ酸に置換した形態のラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素変異型を導入した菌株も、培養12時間後、大腸菌由来野生型のオルニチン脱炭酸酵素を有する菌株(KCCM11240P)に比べて、プトレシンの生産量が平均約86%Pほど増加した。また、ラクトバシラス由来野生型のオルニチン脱炭酸酵素を有する菌株に比べて、平均約21%P増加する態様を示した。 As a result, as can be seen from Table 8, the strain introduced with the Lactobacillus ornithine decarboxylase mutant in the form of substitution with other amino acids containing hydrophobicity also showed that the wild-type ornithine decarboxylase derived from E. coli after 12 hours of culture Compared to the strain (KCCM11240P) with In addition, compared with the strain having wild-type ornithine decarboxylase derived from Lactobacillus, P increased by about 21% on average.

また、プトレシンの生産時に、副反応によるカダベリンの生産が約41%P減少し、培養液内の残留ブドウ糖の濃度で見て、同一時間内の糖消耗量が増加して、生産性が共に増加するということが分かる。 In addition, during the production of putrescine, the production of cadaverine due to a side reaction is reduced by about 41%P, and the concentration of residual glucose in the culture medium increases the consumption of sugar in the same time period, increasing productivity. I know that it does.

前記のような結果は、ラクトバシラスオルニチン脱炭酸酵素の713番目のアラニンがロイシンに置換された変異型以外にも、他の疎水性アミノ酸の1つであるバリン、塩基性アミノ酸の1つであるアルギニン、酸性アミノ酸の1つであるアスパラギン酸、中性アミノ酸の1つであるグルタミン、芳香族性アミノ酸の1つであるトリプトファンに置換されることによって、プトレシン生産菌株で糖消耗に比べて、既存よりも高い濃度のプトレシンを生産するだけではなく、カダベリンの低減及び生産性向上の効果を有することを示す。 The above results show that, in addition to the mutant in which alanine at position 713 of Lactobacillus ornithine decarboxylase is substituted with leucine, valine, which is one of hydrophobic amino acids, and arginine, which is one of basic amino acids, , aspartic acid, one of the acidic amino acids, glutamine, one of the neutral amino acids, and tryptophan, one of the aromatic amino acids. It is shown that this not only produces a high concentration of putrescine, but also has the effect of reducing cadaverine and improving productivity.

以上の説明から、当業者は、本発明のその技術的思想や必須的な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態で実施可能であるということを理解できるであろう。それと関連して、前述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないということを理解せねばならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その等価概念から導出されるあらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されねばならない。 From the above description, those skilled in the art will understand that the present invention can be embodied in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In that regard, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all respects and not restrictive. The scope of the present invention is determined by the meaning and scope of the claims set forth below rather than the foregoing detailed description, and any modifications or variations derived from the equivalent concepts thereof are intended to be included within the scope of the present invention. must be interpreted.

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Claims (12)

配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換を含み
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
オルニチン脱炭酸酵素の変異型。
comprising an amino acid substitution at a position corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1 ;
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
Mutant form of ornithine decarboxylase.
前記オルニチン脱炭酸酵素の変異型は、配列番号4、配列番号8、配列番号9、及び配列番号19から配列番号23のうちから選択されるポリペプチドを含む、請求項1に記載のオルニチン脱炭酸酵素の変異型。 2. The ornithine decarboxylase of claim 1, wherein the ornithine decarboxylase variant comprises a polypeptide selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 23. A variant of the enzyme. 請求項1または2に記載のオルニチン脱炭酸酵素の変異型をコーディングする、ポリヌクレオチド。 3. A polynucleotide encoding the ornithine decarboxylase variant of claim 1 or 2. 配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含み、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
微生物。
ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having an amino acid substitution at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1;
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
microbes.
前記微生物は、エシェリキア属またはコリネバクテリウム属である、請求項4に記載の微生物。 5. The microorganism according to claim 4, wherein the microorganism belongs to the genus Escherichia or Corynebacterium. 配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を培養する段階を含み、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
プトレシンの生産方法。
culturing a microorganism comprising an ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having amino acid substitutions at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1;
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
A method of producing putrescine.
培地内にプトレシンを蓄積する段階を含む、請求項6に記載のプトレシンの生産方法。 7. The method for producing putrescine according to claim 6, comprising the step of accumulating putrescine in the medium. 培養された微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含む、請求項6に記載のプトレシンの生産方法。 7. The method for producing putrescine according to claim 6, comprising recovering putrescine from the cultured microorganism or medium. 配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を培養する段階を含み、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
プトレシンの純度を増加させる方法。
culturing a microorganism comprising an ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having amino acid substitutions at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1;
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
A method for increasing the purity of putrescine.
配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を培養する段階を含み、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
カダベリンに対するプトレシンの比率を増加させる方法。
culturing a microorganism comprising an ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having amino acid substitutions at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1;
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
A method for increasing the ratio of putrescine to cadaverine.
プトレシンでポリアミドを製造する方法であって、前記プトレシンは、配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を培養して製造され、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
ポリアミドの製造方法。
A method of producing a polyamide with putrescine, said putrescine comprising a polypeptide having an amino acid substitution at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1 Manufactured by culturing microorganisms containing ornithine decarboxylase,
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
A method for producing a polyamide.
配列番号1のa)713番目、b)698番目、またはc)713番目及び698番目に相応する位置でアミノ酸置換有するポリペプチドを含むオルニチン脱炭酸酵素を含む微生物を含み、
前記713番目の位置のアミノ酸置換は、A713LA713V、A713R、A713D、A713W、またはA713Qであり、
前記698番目の位置のアミノ酸置換は、E698Dである、
ポリアミド製造用組成物。
A microorganism comprising an ornithine decarboxylase comprising a polypeptide having amino acid substitutions at positions corresponding to a) 713, b) 698, or c) 713 and 698 of SEQ ID NO: 1,
the amino acid substitution at position 713 is A713L , A713V, A713R, A713D, A713W, or A713Q;
the amino acid substitution at position 698 is E698D;
Compositions for the production of polyamides.
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